本發(fā)明屬于微生物益生菌應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一株枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)及其飼料添加劑的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中，抗生素等抗菌藥物能有效的減少畜禽的發(fā)病率，提高畜禽等動(dòng)物的生長效率而被廣泛應(yīng)用在畜禽的飼料中。同時(shí)由于人類長期濫用抗生素等藥物，也嚴(yán)重影響了畜禽產(chǎn)品的發(fā)展。例如耐藥性病原菌增加，畜禽產(chǎn)品的藥物殘留異常嚴(yán)重等問題。為食品安全和消費(fèi)者的身體健康造成了一定程度的危害。對此歐盟已全面禁止飼料中使用抗生素促生長飼料添加劑。為了應(yīng)對這些問題，采用益生菌微生物制劑來替代抗生素已成為當(dāng)前畜禽養(yǎng)殖的熱點(diǎn)。因此尋求安全、無殘留的抗生素替代品迫在眉睫。通過研究發(fā)現(xiàn)益生菌飼料添加劑是一種十分理想的抗生素替代品，而且益生菌飼料添加劑具有天然無公害、無污染、質(zhì)量穩(wěn)定及效果明顯等優(yōu)點(diǎn)。特別是芽孢桿菌作為益生菌，其在生長代謝過程能產(chǎn)生多種酶，并且某些優(yōu)良菌株還具有抑制有害菌的作用。但是，目前益生菌的研究和開發(fā)最關(guān)鍵的問題是優(yōu)良菌株的選育，特別是優(yōu)良芽孢桿菌的分離和篩選。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決上述問題，本發(fā)明提供一株優(yōu)良特性的枯草芽孢桿菌及其在畜禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一株枯草芽孢桿菌，該菌株從仔豬糞便中分離經(jīng)過初篩復(fù)篩得到，在LB培養(yǎng)基上菌落形態(tài)為菌落乳白色，圓形，濕潤，表面光滑，邊緣不整齊，不透明。菌體桿狀，單個(gè)或成短鏈排 列存在，革蘭氏染色陽性菌株，產(chǎn)芽孢。利用細(xì)菌通用引物對篩選出的菌株進(jìn)行16srDNAPCR擴(kuò)增后鑒定，經(jīng)NCBI序列比對結(jié)果相似性最高(100％)的是枯草芽孢桿菌，故分子鑒定DZS11為枯草芽孢桿菌。將該菌株命名為枯草芽孢桿菌DZS11(BacillussubtilisDZS11)，于2015年8月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為：CGMCCNo.11261。本發(fā)明還提供包含該枯草芽孢桿菌的菌劑。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，所述菌劑為菌粉，所述菌粉還含有保護(hù)劑和/或載體。其中，所述菌劑的制備方法如下：將所述枯草芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)得到發(fā)酵液，所得菌液與保護(hù)劑和載體混合，在進(jìn)風(fēng)溫度170-200℃，出風(fēng)溫度60-90℃的條件下，高溫噴霧干燥得到菌劑。本發(fā)明還提供一種所述枯草芽孢桿菌的發(fā)酵方法，其包括如下步驟：按體積比為1％-5％的接種量向發(fā)酵培養(yǎng)基中接入培養(yǎng)16-22h的所述枯草芽孢桿菌種子液，發(fā)酵過程中控制pH7.0-7.5，發(fā)酵溫度35-40℃，轉(zhuǎn)速200-300rpm，通氣比1:0.4，罐壓0.05MPa。其中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基含有下述重量百分比的組分：玉米粉0.5％、豆餅粉1％、蔗糖0.4％、魚粉0.6％、碳酸鈣0.1％、磷酸二氫鉀0.1％、硫酸鎂0.2％、硫酸亞鐵0.025％、硫酸錳0.025％。本發(fā)明還提供了含有所述的枯草芽孢桿菌的飼料添加劑。其中，所述枯草芽孢桿菌的的添加量為1×108-11CFU/g。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌在用于飼料添加劑中，主要用于畜、禽或水產(chǎn)養(yǎng)殖的飼料添加劑，如：雞、鴨、豬、牛、羊和魚等的飼料添加劑。本發(fā)明還提供包含所述枯草芽孢桿菌的預(yù)混料或配合料。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌DZS11，該菌株耐酸、耐膽鹽，具有很高的產(chǎn)酶能力，特別是在淀粉酶能力測定中，與其他菌株相比具有明顯的優(yōu)勢，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其能有效促進(jìn)畜禽的生產(chǎn)性能，可作為飼料添加劑和發(fā)酵劑應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖中，應(yīng)用前景廣闊。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1枯草芽孢桿菌DZS11的篩選1、初篩采集仔豬糞便樣品10份，分別稱取10g土樣，加入90mL無菌水制成菌懸液，經(jīng)過80℃水浴中處理20min，于180r/min振蕩30min，梯度稀釋至合適梯度，涂布于LB培養(yǎng)基上，培養(yǎng)獲得86株疑似芽孢桿菌。牛奶培養(yǎng)基(蛋白酶初篩用)：5g脫脂牛奶溶于50ml蒸餾水中；1.5g瓊脂溶于50ml蒸餾水中，兩液分別滅菌，待冷至45－50℃時(shí)，將兩液混勻倒平板，即成牛奶平板。將平板倒置過夜，使表面水分干燥，然后將菌種點(diǎn)接在平板上混合倒板，過夜待用。配制該培養(yǎng)基時(shí)，切勿將牛奶和瓊脂混合滅菌，以防牛奶凝固。淀粉水解平板(淀粉酶初篩用)：LB培養(yǎng)基，其中加入0.2％的可溶性淀粉，滅菌后倒平板。生理鹽水的配置方法是：0.85％的氯化鈉，高壓蒸汽滅菌后備用。人工胃液的配置方法是：1％胃蛋白酶，0.85％的氯化鈉，用鹽酸調(diào)節(jié)pH到2.0，過濾除菌備用。LB固體培養(yǎng)基制作方法是：蛋白胨10g，氯化鈉10g，酵母膏5g，瓊脂2％，pH7.0，高壓蒸汽滅菌后備用。LB液體培養(yǎng)基制作方法是：蛋白胨10g，氯化鈉10g，酵母膏5g，pH7.0，高壓蒸汽滅菌后備用。人工膽鹽的配置方法是：在LB液體培養(yǎng)基中添加0.3％的豬膽鹽，高壓蒸汽滅菌后備用。2、復(fù)篩(1)平板菌落計(jì)數(shù)法檢測DZS11菌粉的活菌數(shù)約為1010CFU/g。(2)菌株DZS11產(chǎn)淀粉酶能力測定將通過初篩過程得到的目標(biāo)菌株點(diǎn)接于淀粉水解平板，37℃培養(yǎng)24h，加入路哥氏碘液染色1min后觀察透明圈直徑與菌體直徑比，初步測定淀粉酶活力。將淀粉酶較高菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基37℃振蕩培養(yǎng)24-48h，取2到3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的發(fā)酵培養(yǎng)液離心取上清液檢測淀粉酶和糖化酶活力，對菌株的淀粉酶活力進(jìn)行復(fù)篩。淀粉酶活力測定方法用GB/T18932.16-2003進(jìn)行測定。經(jīng)過初篩獲得一株透明圈直徑與菌體直徑比最大的菌株，命名為DZS11。經(jīng)過淀粉酶活力定量測定菌株DZS11的淀粉酶活力為3285.87U(淀粉酶在40℃下每ml菌液1h內(nèi)水解1ml的1％淀粉，定義為1個(gè)淀粉酶活力單位)。(3)菌株DZS11產(chǎn)蛋白酶能力測定將通過初篩過程得到的目標(biāo)菌株點(diǎn)接于牛奶平板，37℃培養(yǎng)24h，菌落周圍出現(xiàn)透明圈，直接觀察透明圈直徑與菌體直徑比，初步測定蛋白酶活力。將蛋白酶較高菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基37℃振蕩培養(yǎng)24-48h，取2到3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的發(fā)酵培養(yǎng)液離心取上清液檢測蛋白酶活力，對菌株的蛋白酶活力進(jìn)行復(fù)篩。蛋白酶活力測定方法用GB/T28715-2012進(jìn)行測定。同時(shí)經(jīng)過蛋白酶初篩比較發(fā)現(xiàn)，DZS11菌株的蛋白酶活力也比較高。經(jīng)過蛋白酶活力定量測定菌株DZS11的中性蛋白酶活力為65.9U(蛋白酶在pH7.2時(shí)，40℃下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生lug酪氨酸，定義為1個(gè)蛋白酶活力單位)，酸性蛋白酶活力為41.6U(蛋白酶在pH3.0時(shí)，40℃下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生lug酪氨酸，定義為1 個(gè)蛋白酶活力單位)。此菌株和實(shí)驗(yàn)室其他有效益生菌株及某些國內(nèi)外產(chǎn)品分離菌株(國內(nèi)3-1是從蔚藍(lán)某產(chǎn)品分離得到的，國外K1是從科漢森某產(chǎn)品分離得到的)的產(chǎn)淀粉酶活力及產(chǎn)蛋白酶活力比較如下表1所示：表1：部分實(shí)驗(yàn)室枯草芽孢桿菌菌株酶活測定(4)人工胃液的耐受能力測定將1gDZS11菌粉溶于9ml滅菌的生理鹽水中，振蕩混勻后，用稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)。取上述菌液1ml加入9ml人工胃液中，37℃靜置2小時(shí)，稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)，殘存活菌濃度與原菌濃度之比為90.2％，從上述實(shí)驗(yàn)可以看出該菌能較好地在人工胃液中生存。(5)人工膽鹽的耐受能力測定將1gDZS11菌粉溶于9ml滅菌的生理鹽水中，振蕩混勻后，用稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)。取上述菌液1ml加入9ml人工膽鹽中，37℃靜置2小時(shí)，稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)，殘存活菌濃度與原菌濃度之比為91.6％，從上述實(shí)驗(yàn)可以看出該菌能較好地在人工膽鹽中生存。實(shí)施例3枯草芽孢桿菌DZS11的發(fā)酵和菌粉的制備枯草芽孢桿菌DZS11的發(fā)酵：所用發(fā)酵培養(yǎng)基配制為：玉米粉0.5％、豆餅粉1％、蔗糖0.4％、魚粉0.6％、碳酸鈣0.1％、磷酸二氫鉀0.1％、硫酸鎂0.2％、硫酸亞鐵0.025％、硫酸錳0.025％。按比例 配制成發(fā)酵液，然后調(diào)節(jié)pH到7.2。經(jīng)121℃30min滅菌，降溫至37℃，向其中接入菌齡為16h的種子液，接種量為3％，37℃，保持轉(zhuǎn)速300rpm，通氣比1:0.4，罐壓0.05。培養(yǎng)至18h為發(fā)酵終點(diǎn)，放罐，得到枯草芽孢桿菌DZS11活菌數(shù)為6.21×109CFU/mL。將發(fā)酵液中加入噴干保護(hù)劑(甘油0.8％，谷氨酸鈉0.2％，玉米淀粉19％)，再經(jīng)高溫噴干得到枯草芽孢桿菌菌粉，活菌數(shù)約為45億/g。實(shí)施例5枯草芽孢桿菌DZS11菌液耐熱性能測定枯草芽孢桿菌經(jīng)30L發(fā)酵罐發(fā)酵18h后，對發(fā)酵液做若干處理后，分別測定其淀粉酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶。測定結(jié)果如表2所示：表2枯草芽孢桿菌DZS11酶活耐熱結(jié)果通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液在進(jìn)風(fēng)溫度185℃，出風(fēng)溫度80℃的條件下噴干后，三種酶活相比于原發(fā)酵液基本上沒有變化，說明噴干工藝對酶活基本上不會(huì)造成損失。其酸性蛋白酶，無論各種條件下處理，較原發(fā)酵液下降的都不多，這說明其酸性蛋白酶對熱穩(wěn)定性較強(qiáng)。另外，80℃5min處理后，其淀粉酶損失29％，中性蛋白酶損失67％。80℃10min處理后，其淀粉酶損失77％，中性蛋白酶損失72％。90℃處理后，淀粉酶損失量已在90％以上，中性蛋白酶損失基本上保持在73％。實(shí)施例5枯草芽孢桿菌DZS11作為飼料添加劑在雞上的應(yīng)用采購1日齡羅氏450白羽肉公雞，分為兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對照組，每個(gè)處理組10個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15只雞，試驗(yàn)期為35天，其中對照組飼喂普通商品日糧，實(shí)驗(yàn)組1飼喂添加了枯草芽孢桿菌DZS11菌粉的普通商品日糧，添加劑量為1×109CFU/Kg；實(shí)驗(yàn)組2飼喂添加了國內(nèi)的(3-1)枯草芽孢桿菌菌粉的普通商品日糧，添加劑量為1×109CFU/Kg；添加測量試驗(yàn)過程中采食量、料重比、體重的變化情況，試驗(yàn)結(jié)果如表3所示：表3肉雞生產(chǎn)性能統(tǒng)計(jì)結(jié)果由表3數(shù)據(jù)分析可知，試驗(yàn)期內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組1肉雞料肉比比對照組降低0.07，與對照組差異顯著(P<0.05)。并且與國內(nèi)產(chǎn)品分離菌株相比也有明顯優(yōu)勢。測試指標(biāo)中，實(shí)驗(yàn)組1日增重、料肉比、育肥指數(shù)效果均優(yōu)于對照組和實(shí)驗(yàn)組2。表明飼料中添加的枯草芽孢桿菌DZS11起了很好作用，較好的改善了肉雞的生產(chǎn)性能，而且降低了養(yǎng)殖成本，從而獲得了較好的經(jīng)濟(jì)效益。實(shí)施例6枯草芽孢桿菌DZS11作為飼料添加劑在仔豬上的應(yīng)用本試驗(yàn)研究了不同芽孢桿菌對斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響。選擇了國內(nèi)外市售的兩種芽孢桿菌產(chǎn)品，及公司現(xiàn)有芽孢桿菌產(chǎn)品與實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的芽孢桿菌新產(chǎn)品進(jìn)行了比較。采用360頭40±3日齡杜洛克×長白×大約克健康斷奶仔豬隨機(jī)分到6個(gè)處理中，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)12頭豬，每個(gè)欄作為一個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)采用完全隨機(jī)化設(shè)計(jì)，共設(shè)6個(gè)處理組，分別為對照組，K組(國外產(chǎn)品)，W組(國內(nèi)產(chǎn)品)，D組(公司現(xiàn)有產(chǎn)品)，7組 (DZS11菌粉)和M組(D和7復(fù)合)。試驗(yàn)進(jìn)行28天。添加芽孢桿菌與不添加芽孢桿菌的日糧均由河南確山大北農(nóng)飼料有限公司生產(chǎn)。芽孢桿菌添加量平均為1×109cfu/kg。日糧粗蛋白質(zhì)含量為19.5％(實(shí)測值)。試驗(yàn)豬飼養(yǎng)于仔豬舍中，水泥地面，早中晚各加一次料，觀察各欄仔豬采食量，采取區(qū)別加料的策略，保證各種采食量的仔豬都能完全自由采食和飲水。按照常規(guī)程序和方法進(jìn)行驅(qū)蟲、免疫；專人管理，各組均給予相同的飼養(yǎng)管理和環(huán)境條件(溫度、濕度)；試驗(yàn)豬發(fā)病，應(yīng)在不影響試驗(yàn)結(jié)果的條件下依常規(guī)處理。試驗(yàn)豬在試驗(yàn)開始和試驗(yàn)?zāi)r(shí)，早晨8:00空腹稱重(前一天20:00斷料)，然后按下式計(jì)算日增重：平均日增重ADG(kg)＝[末欄重(kg)-始欄重(kg)]/[每欄仔豬頭數(shù)×飼養(yǎng)天數(shù)(d)]以欄為單位記錄每天的投料量與剩料量，求出試驗(yàn)期間每欄總的投料量與剩料量，然后計(jì)算日采食量：日采食量ADFI(kg)＝[投料量(kg)-剩料量(kg)]/[每欄仔豬頭數(shù)×飼養(yǎng)天數(shù)(d)]飼料轉(zhuǎn)化率F/G＝ADFI(kg)/ADG(kg)數(shù)據(jù)采用SAS8.0程序GLM過程進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多重比較用鄧肯法(Duncan)，以p<0.05為顯著水平，P<0.01為極顯著。由表4可知，與對照組相比，日糧中添加不同的芽孢桿菌不同程度地降低了斷奶仔豬日增重、個(gè)體重和日采食量。其中7組(DZS11菌粉)與對照組相比個(gè)體重?zé)o顯著差異，且降低了仔豬料重比0.08(1.68VS1.76)，提高飼料轉(zhuǎn)化率4.5％。表4不同芽孢桿菌對斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響項(xiàng)目CKKWD7MSEMP值日增重ADG,g321.1283.5303.6290.7309.4299.014.30.904日采食量ADFI,g563.7509.8504.3532.2541.2535.919.30.877飼料轉(zhuǎn)化率FCR1.761.791.761.771.681.780.0510.598個(gè)體重,kg19.718.619.218.819.319.00.4170.982由表5可知，每噸飼料添加80g的7組(DZS11菌粉)芽孢桿菌，飼料成本增加3.2元。表5成本計(jì)算項(xiàng)目7組添加量g/t)80菌粉價(jià)格(元/kg)40增加成本(元/t)3.2由表6可知，與對照組相比，飼喂7組(DZS11菌粉)芽孢桿菌，每頭仔豬試驗(yàn)期間節(jié)約飼料成本4.2元(106.4VS110.6)。表6節(jié)約成本項(xiàng)目對照組7組耗料(kg/頭)15.815.2飼料價(jià)格(元/kg)77.0032飼料成本(元/頭)110.6106.4飼喂實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的7組(DZS11菌粉)芽孢桿菌新產(chǎn)品降低仔豬料肉比0.08，提高飼料轉(zhuǎn)化率4.5％。本試驗(yàn)結(jié)果表明7組(DZS11菌粉)芽孢桿菌新產(chǎn)品優(yōu)于現(xiàn)有及市售的兩種芽孢桿菌產(chǎn)品。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3