本發(fā)明涉及一種開發(fā)沙冬青植物基因組簡單重復(fù)序列(下稱SSR或SSRs，Simple Sequence Repeats，由1-6個(gè)核苷酸不斷重復(fù)構(gòu)成，又稱之為微衛(wèi)星DNA)分子標(biāo)記方法，尤其是蒙古沙冬青基因組分子標(biāo)記的方法。

背景技術(shù)：

DNA分子標(biāo)記是遺傳標(biāo)記的一種，是在基因組水平上的標(biāo)記，能反映生物個(gè)體或種群間基因組中某種差異的特異性DNA片段。DNA分子標(biāo)記數(shù)量多、遍及整個(gè)基因組、多態(tài)性高、遺傳穩(wěn)定，并且不受環(huán)境及基因表達(dá)與否的限制。它包括RFLP、RAPD、AFLP、SSRs和ISSR等。

SSRs(Simple Sequence Repeats)即簡單重復(fù)序列，又稱之為微衛(wèi)星DNA，由1-6個(gè)核苷酸不斷重復(fù)構(gòu)成，同一類SSRs可分布于整個(gè)基因組的不同位置上，每個(gè)座位上重復(fù)單位的數(shù)目存在差異，因而造成了每個(gè)座位上的多態(tài)性。SSRs在植物基因組中非常豐富，因此被廣泛應(yīng)用在基因定位、親緣分析、遺傳圖譜構(gòu)建等，被認(rèn)為是目前最好的分子標(biāo)記之一。

蒙古沙冬青[Ammopiptanthus mongolicus(Maxim.)Chengf.]系豆科蝶形花亞科。沙冬青屬超旱生常綠灌木，在中國主要分布于西北(新疆、寧夏、甘肅)及內(nèi)蒙古(阿拉善戈壁區(qū)東南端)，屬國家重點(diǎn)保護(hù)植物。沙冬青具有很強(qiáng)的抗旱、抗寒及耐鹽堿特性，也具有藥用價(jià)值。沙冬青抗逆性的分子機(jī)制研究成為近年來的研究熱點(diǎn)，目前已有將蒙古沙冬青抗旱基因轉(zhuǎn)入甜菜植株的報(bào)道，轉(zhuǎn)基因甜菜的抗旱性要高于非轉(zhuǎn)基因甜菜植株，體現(xiàn)了沙冬青的應(yīng)用價(jià)值。但是，目前人們對(duì)沙冬青的基因組水平認(rèn)識(shí)有限，限制了沙冬青這一優(yōu)良種質(zhì)資源的進(jìn)一步應(yīng)用。

與水稻、小麥等常規(guī)植物相比，現(xiàn)有沙冬青SSRs標(biāo)記的數(shù)量很少，不能滿足研究需要，因此批量開發(fā)沙冬青的SSRs序列，有利于沙冬青遺傳圖譜構(gòu)建、重要性狀基因定位等研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種開發(fā)沙冬青植物基因組SSRs分子標(biāo)記的方法， 提高標(biāo)記開發(fā)效率，增加標(biāo)記數(shù)量。

為此，本發(fā)明提出一種開發(fā)沙冬青植物基因組簡單重復(fù)序列分子標(biāo)記的方法，其特征在于包括下列步驟：S1、來自第一產(chǎn)地的蒙古沙冬青的基因組測序：對(duì)采樣自第一產(chǎn)地的物種樣品的基因組DNA建立初級(jí)測序文庫，構(gòu)建好基因組文庫之后，使用測序儀進(jìn)行高通量測序，獲得Short Reads短序列測序數(shù)據(jù)；S2、對(duì)測序下機(jī)的基因組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，過濾之后進(jìn)行序列組裝得到Contigs；S3、SSRs的識(shí)別：對(duì)上述Contigs序列中的SSRs序列進(jìn)行識(shí)別。

進(jìn)一步地，還包括如下步驟：S4、利用NCBI公開的來自第二產(chǎn)地的蒙古沙冬青的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)；S5、進(jìn)行SSRs的驗(yàn)證，通過上述兩個(gè)產(chǎn)地的同一物種的SSRs相互比較，即：將上述SSRs在來自第二產(chǎn)地的蒙古沙冬青的Unigene序列中進(jìn)行驗(yàn)證，篩選具有多態(tài)性的SSRs。

本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn)和積極效果：

相比之前已經(jīng)報(bào)道的開發(fā)蒙古沙冬青SSRs的方法，我們的方法更先進(jìn)，結(jié)果更全面，而且所得數(shù)據(jù)通量高。例如，我們通過蒙古沙冬青全基因組DNA的高通量測序組裝Contigs并進(jìn)行SSRs識(shí)別，最終找到274790個(gè)SSRs，不僅包括基因編碼區(qū)的SSRs，也包括了非編碼區(qū)的SSRs。

進(jìn)一步地，本發(fā)明使用生物信息學(xué)的分析方法，直接比較不同地區(qū)的蒙古沙冬青的基因組SSRs的多態(tài)性，效率高，節(jié)約時(shí)間和資金。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例SSRs識(shí)別流程圖。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例多態(tài)性的SSRs篩選流程圖。

具體實(shí)施方式

名詞解釋

為了便于理解，現(xiàn)將下文中出現(xiàn)的一些名詞解釋如下：

bp：DNA分子片段大小單位，bp：base pair，堿基對(duì)；kb：kilo-base pair千堿基對(duì)，即1000堿基對(duì)；mb：mega-base pair百萬堿基對(duì)。

SOAP denovo軟件：基于Illumina二代測序的短序列拼接軟件。

Contigs：即“序列重疊群”，指彼此可以通過末端的重疊序列相互連接形成大片段的一組DNA短序列。高通量測序時(shí)，在芯片上的每個(gè)反應(yīng)，會(huì)讀出一條序列，是比較短的，叫read，它們是原始數(shù)據(jù)；有很多reads通過片段重疊，能夠組裝成一個(gè)更大的片段，稱為contig，即序列重疊群。多個(gè)contigs通過片段重疊，組成一個(gè)更長的scaffold；一個(gè)contig被組成出來之后，鑒定發(fā)現(xiàn)它是編碼蛋白質(zhì)的基因，就叫singleton；多個(gè)contigs組裝成scaffold之后，鑒定發(fā)現(xiàn)它編碼蛋白質(zhì)的基因，叫unigene。

MISA軟件：一種批量開發(fā)SSRs標(biāo)記軟件。

QTL：quantitative trait locus，數(shù)量性狀基因座，指控制數(shù)量性狀的基因在基因組中的位置。

K-mer：將一條read，連續(xù)切割，挨個(gè)堿基劃動(dòng)得到的一系列長度為K的核苷酸序列。

FASTA格式：又稱為Pearson格式，是一種基于文本用于表示核苷酸序列或氨基酸序列的格式。

Trinity：是由Broad Institute開發(fā)的轉(zhuǎn)錄組denovo組裝軟件，由三個(gè)獨(dú)立的軟件模塊組成：Inchworm，Chrysalis和Butterfly。

本實(shí)施例闡述了一種開發(fā)蒙古沙冬青基因組SSRs分子標(biāo)記的方法，概括來說，該方法包括如下步驟：

(1)對(duì)采樣自甘肅武威市的蒙古沙冬青樣品的基因組DNA建立了180bp的初級(jí)測序文庫；使用Illumina HiSeq 2000測序儀的100PE模式進(jìn)行高通量測序，獲得了60Gb的Short Reads(短序列)測序數(shù)據(jù)；

(2)對(duì)測序下機(jī)的Reads過濾之后使用SOAP denovo軟件進(jìn)行序列組裝得到Contigs；

(3)對(duì)Contigs序列使用MISA軟件進(jìn)行SSRs識(shí)別；

(4)將上述SSRs在來自寧夏中衛(wèi)市的蒙古沙冬青Unigene序列中進(jìn)行驗(yàn)證，篩選到具有多態(tài)性的SSRs。

本方法是一種高通量發(fā)現(xiàn)沙冬青植物SSRs分子標(biāo)記的方法，可以應(yīng)用在沙冬青植物遺傳圖譜構(gòu)建、QTL定位和遺傳多樣性分析等研究中。

更具體地說，本方法包括下列步驟：

(1)蒙古沙冬青(甘肅武威市)的基因組測序：對(duì)采樣自甘肅武威市的蒙古沙冬青樣品進(jìn)行DNA提取之后，通過Covaris^TM超聲波破碎儀將基因組DNA隨機(jī)打斷成為180bp的片段，經(jīng)末端修復(fù)、加A尾、加測序接頭、純化、PCR擴(kuò)增等步驟完成整個(gè)文庫制備；構(gòu)建好的文庫使用Illumina HiSeq 2000測序儀的100PE模式進(jìn)行高通量測序，共獲得60Gb Short Reads測序數(shù)據(jù)。

(2)對(duì)測序下機(jī)的數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾和組裝：由于高通量測序得到的原始數(shù)據(jù)存在一定的錯(cuò)誤率，同時(shí)DNA上含有人工接頭，過濾就是去掉那些有測序錯(cuò)誤產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，以及過濾掉含有測序接頭的Reads。過濾之后使用SOAP denovo(http://soap.genomics.org.cn/soapdenovo.html)軟件進(jìn)行序列組裝，參數(shù)設(shè)定為Kmer＝41。得到名為Contigs.fasta的蒙古沙冬青基因組Contigs序列，保存格式是FASTA格式的文本文件。一般而言Kmer越小則組裝結(jié)果準(zhǔn)確性越好，但是Contig越短；Kmer越大則Contig可能越長，但是錯(cuò)誤率也更高。為了平衡準(zhǔn)確度和Contig長度，我們選擇了較居中的參數(shù)Kmer＝41。

(3)SSRs的識(shí)別：使用MISA軟件(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)對(duì)蒙古沙冬青Contigs序列中包含的SSRs序列進(jìn)行識(shí)別，程序命令為：perl misa.pl Contigs.fasta；采用該程序默認(rèn)參數(shù)：單核苷酸重復(fù)次數(shù)≥10，二核苷酸重復(fù)次數(shù)≥6，三核苷酸重復(fù)次數(shù)≥5，四核苷酸重復(fù)次數(shù)≥5，五核苷酸重復(fù)次數(shù)≥5，六核苷酸重復(fù)次數(shù)≥5；運(yùn)行之后得到名為Contigs.fasta.misa的SSRs結(jié)果文件。表1是蒙古沙冬青的SSRs類型及數(shù)目統(tǒng)計(jì)，從中可見單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸是主要的重復(fù)單元，SSRs的總數(shù)目為274790。

表1.蒙古沙冬青的SSRs類型及數(shù)目統(tǒng)計(jì)

(4)蒙古沙冬青(寧夏中衛(wèi)市)的轉(zhuǎn)錄組序列組裝：從NCBI網(wǎng)站的SRA數(shù)據(jù)庫下載蒙古沙冬青轉(zhuǎn)錄組測序原始數(shù)據(jù)集SRR1035932，該數(shù)據(jù)集是對(duì)采集自寧夏中衛(wèi)市的蒙古沙冬青的葉片提取RNA之后，富集mRNA并且建立180bp的文庫，使用Illumina HiSeq 2000的90PE模式得到的5.6Gb測序數(shù)據(jù)。對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾之后，使用Trinity軟件(Trinity是專門針對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)特點(diǎn)而設(shè)計(jì)的一種組裝方法)進(jìn)行序列組裝，使用Trinity的默認(rèn)參數(shù)運(yùn)行，結(jié)果共得到92222條Unigene序列，總長度64Mb，以FASTA格式存儲(chǔ)在Trinity.fasta文件中。使用與步驟(3)中同樣的MISA軟件和參數(shù)在Trinity.fasta中識(shí)別SSRs，結(jié)果存儲(chǔ)在Trinity.fasta.misa。

上述步驟(4)中蒙古沙冬青轉(zhuǎn)錄組測序原始數(shù)據(jù)集SRR1035932下載地址是：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/？term＝SRR1035932。

上述步驟(4)中對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾的命令是：iTools Fqtools filterV2-InFq1 raw.1.fq-InFq2 raw.2.fq-OutFq1 1.fq.gz-OutFq2 2.fq.gz-OffN 0.02-LowQ5-OffLowQ 0.4-MinBaseQ@，其中iTools軟件(深圳華大基因研究院開發(fā)的一款分析工具，A Toolkit for analyzing next-generation DNARe-Sequencing data)的下載地址是https://github.com/BGI-shenzhen/Reseqtools，其中raw.1.fq和raw.2.fq分別是Illumina HiSeq 2000測序儀的Pair End測序所得的Forward Read和Reverse Read原始數(shù)據(jù)集，1.fq.gz和2.fq.gz則是上述二個(gè)數(shù)據(jù)集過濾的結(jié)果。

上述步驟(4)中使用Trinity軟件在Linux平臺(tái)進(jìn)行Unigene序列組裝的命令是：Trinity.pl--seqType fq--JM 40G--left 1.fq.gz--right 2.fq.gz--CPU 8 --no_cleanup，其中Trinity軟件的下載地址是http://trinityrnaseq.github.io/。

(5)SSRs的驗(yàn)證：將步驟(4)得到的SSRs在來自甘肅武威市的蒙古沙冬青基因組Contigs序列中進(jìn)行驗(yàn)證，篩選到具有多態(tài)性的SSRs。具體的驗(yàn)證方法是，取步驟(4)中的SSRs的二側(cè)各20bp的序列作為待驗(yàn)證序列，使用BLAST比對(duì)法將該序列比對(duì)到步驟(2)中的Contigs，如果SSRs重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)不同，則說明二者具有多態(tài)性。比如在寧夏中衛(wèi)市的蒙古沙冬青中一個(gè)SSR序列(TAA)及其側(cè)翼序列是：

AAATTACATCAAGTTGATGG-(TAA)₅-ACCACCCGAGCATCAACCA，在甘肅武威市的蒙古沙冬青中對(duì)應(yīng)的序列是：

AAATTACATCAAGTTGATGG-(TAA)₇-ACCACCCGAGCATCAACCA，數(shù)字下標(biāo)表示SSR序列(TAA)的重復(fù)次數(shù)，分別為5次和7次重復(fù)，證明本發(fā)明得到的SSRs在不同地區(qū)的蒙古沙冬青植株中具有多態(tài)性(見表2)，表中一共列出20對(duì)具有多態(tài)性的SSRs。

表2.具有多態(tài)性的蒙古沙冬青SSRs

工作原理：

在對(duì)蒙古沙冬青(甘肅武威市)的基因組測序中，Illumina HiSeq 2000的高通量測序技術(shù)一次實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的60Gb數(shù)據(jù)相當(dāng)于覆蓋沙冬青的基因組60倍。SOAP denovo的原理是把測序得到的大量Reads數(shù)據(jù)分成Kmer＝41bp的均一序列，依據(jù)Kmer序列之間的Overlap(兩組或多組特征數(shù)據(jù)同時(shí)覆蓋到的序列長度)關(guān)系構(gòu)建De Bruijn圖(一種基因拼接算法)，進(jìn)一步消除圖中的Bubble(De Bruijn圖中存在的錯(cuò)誤路徑的一種)從而得到基因組Contigs序列。在對(duì)蒙古沙冬青(寧夏中衛(wèi)市)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析中，Trinity軟件進(jìn)行組裝的原理是，首先把測序得到的大量Reads數(shù)據(jù)分成Kmer＝25bp的均一序列，然后依據(jù)Kmer序列之間的Overlap關(guān)系組裝基因的序列。得到兩個(gè)采集自不同地點(diǎn)的蒙古沙冬青序列之后，分別使用MISA軟件進(jìn)行SSRs識(shí)別，并在二者之間進(jìn)行比較，驗(yàn)證具有多態(tài)性的SSRs分子標(biāo)記。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn)和積極效果：

(1)在目前公開的資料中，研究人員一般是采用蒙古沙冬青的ESTs(表達(dá)序列標(biāo)簽)或者轉(zhuǎn)錄組的測序數(shù)據(jù)，來尋找SSRs，例如通過ESTs測序共找到155個(gè)SSRs(Liu et al.2013)和通過轉(zhuǎn)錄組測序共找到1827個(gè)SSRs(Zhou et al.2012)，這些方法中使用的技術(shù)較為常規(guī)，需時(shí)比較長，而且只能鑒定到位于基因編碼區(qū)的SSRs，因此鑒定到的蒙古沙冬青SSRs數(shù)目有限。我們通過蒙古沙冬青全基因組DNA的高通量測序組裝Contigs并進(jìn)行SSRs識(shí)別，最終找到274790個(gè)SSRs，不僅包括基因編碼區(qū)的SSRs，也包括了非編碼區(qū)的SSRs，相比之前已經(jīng)報(bào)道的蒙古沙冬青SSRs，我們的方法更先進(jìn)，結(jié)果更全面，而且所得數(shù)據(jù)通量高。

(2)傳統(tǒng)方法驗(yàn)證SSRs多態(tài)性是在基因組的SSRs位置兩側(cè)設(shè)計(jì)PCR引物，如果該物種不同種群相應(yīng)SSRs重復(fù)單位數(shù)目不一樣，經(jīng)過PCR擴(kuò)增會(huì)得到不同長度的PCR產(chǎn)物，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，就能夠呈現(xiàn)出差異性。而我們使用生物信息學(xué)的分析方法，直接比較甘肅武威市和寧夏中衛(wèi)市兩個(gè)地區(qū)的蒙古沙冬青的基因組SSRs的多態(tài)性，效率高，節(jié)約時(shí)間和資金。

本發(fā)明的潛在市場和用途：

首先，本發(fā)明中使用的方法思路可以運(yùn)用在其他物種的SSRs識(shí)別與鑒定之中。例如，本發(fā)明中使用的方法可以直接用于蒙古沙冬青的近緣種——新疆沙冬青的SSRs識(shí)別與鑒定。其次，本發(fā)明所得SSRs可以應(yīng)用在蒙古沙冬青和新疆沙冬青遺傳圖譜構(gòu)建、QTL定位和遺傳多樣性分析等研究中。