本發(fā)明屬于角蛋白的制備方法領(lǐng)域，尤其是涉及一種通過多級逆流萃取低溫美拉德反應(yīng)、合酶酶解與離子交換純化工藝相結(jié)合的方式制備魚鱗角蛋白的方法。

背景技術(shù)：

魚制品在加工過程中會產(chǎn)生魚鱗、內(nèi)臟等下腳料，這部分下腳料占魚體總重量的10％-15％，其中魚鱗大約占3％-5％。我國對這部分資源缺少有效的利用手段，魚鱗中的營養(yǎng)功能性物質(zhì)未能被充分利用，附加值相對來說比較低。

魚鱗中含有豐富的粗蛋白和灰分，粗蛋白含量占干物質(zhì)的39.90-78.60％。魚鱗中的蛋白質(zhì)以膠原蛋白和硬蛋白為主。魚鱗硬蛋白含量占干物質(zhì)的4.454-8.29％，魚鱗硬蛋白主要是角蛋白。角蛋白具有優(yōu)異的生物學(xué)特性和良好的材料力學(xué)性能，可廣泛應(yīng)用于材料、醫(yī)學(xué)、生物等方面。角蛋白是一種不能直接為畜禽吸收利用的硬蛋白，它必須經(jīng)高溫、高壓、酸、堿或酶處理，變成短肽或游離氨基酸，才能被利用。其蛋白質(zhì)含量及必需氨基酸含量極高，氨基酸組成相對穩(wěn)定，是一種公認(rèn)的具有較高營養(yǎng)價值，質(zhì)量穩(wěn)定的潛在優(yōu)質(zhì)蛋白源。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種魚鱗角蛋白的制備方法，采用控制熱致溶解技術(shù)，加熱溶解過程中分多次加入脫灰魚鱗，提高了角蛋白的純度，極大地減少了副產(chǎn)物的生成，分子量小于1000Da的膠原肽得率大于85％。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：

魚鱗角蛋白的制備方法，包括如下步驟：

1)將魚鱗清洗后加鹽酸溶液脫灰處理后，去離子水沖洗至中性，獲得脫灰魚鱗；

2)在1-2重量份的脫灰魚鱗中，加入6-8重量份的去離子水，加熱到90-100℃后保溫1-2h；

3)繼續(xù)加入1-2重量份的脫灰魚鱗，90-100℃繼續(xù)保溫1-4h；

4)分離獲得膠原蛋白溶液和固體殘渣；

5)向1重量份的固體殘渣中加入3-5重量份的水混合后加入復(fù)合蛋白酶，在50-55℃條件下水解2-4h，獲得魚鱗角蛋白粗品；

6)魚鱗角蛋白粗品經(jīng)提純后，噴霧干燥獲得魚鱗角蛋白。

美拉德反應(yīng)又稱為“非酶棕色化反應(yīng)”，是法國化學(xué)家L.C.Maillard在1912年提出的。所謂美拉德反應(yīng)是廣泛存在于食品工業(yè)的一種非酶褐變，是羰基化合物(還原糖類)和氨基化合物(氨基酸和蛋白質(zhì))間的反應(yīng)，經(jīng)過復(fù)雜的歷程最終生成棕色甚至是黑色的大分子物質(zhì)類黑精或稱擬黑素，所以又稱羰氨反應(yīng)。美拉德反應(yīng)是一個十分復(fù)雜的反應(yīng)過程，中間產(chǎn)物眾多，終產(chǎn)物結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，完全抑制美拉德反應(yīng)相當(dāng)困難，又由于美拉德反應(yīng)影響因素眾多，有效抑制美拉德反應(yīng)必須是多種因素協(xié)同作用的結(jié)果。

現(xiàn)有技術(shù)魚鱗角蛋白和魚鱗膠原蛋白加熱分離過程中，通常容易出現(xiàn)美拉德反應(yīng)，導(dǎo)致膠原蛋白和角蛋白產(chǎn)率降低，造成膠原蛋白和角蛋白的損失。本發(fā)明研究人員在實驗過程中發(fā)現(xiàn)魚鱗膠原蛋白和魚鱗角蛋白的提取分離的過程中，將溫度控制在90-100℃，分多次將脫灰魚鱗加入到膠原蛋白溶液中繼續(xù)循環(huán)提取，可以有效的抑制美拉德反應(yīng)，角蛋白的純度和含量，減少副產(chǎn)物的生產(chǎn)，提高整個魚鱗中角蛋白的得率。

所述步驟3)分兩步進行：加入0.5-1.5重量份的脫灰魚鱗，90-100℃繼續(xù)保溫1-2h后，繼續(xù)加入0.5-1重量份的脫灰魚鱗，90-100℃繼續(xù)保溫1-2h。

分兩次將脫灰魚鱗加入到膠原蛋白溶液中，循環(huán)提取不但提高了角蛋白的得率，還減少了水用量，節(jié)約用水，降低了生產(chǎn)成本。

所述步驟3)分兩步進行：加入1重量份的脫灰魚鱗，90-100℃繼續(xù)保溫1-2h后，繼續(xù)加入1重量份的脫灰魚鱗，90-100℃繼續(xù)保溫1-2h。

本發(fā)明研究人員經(jīng)過長期大量實驗發(fā)現(xiàn)，在步驟3)中分兩次加入1重量份的脫灰魚鱗，所得到的固體殘渣中角蛋白含量最高，副產(chǎn)物最少。

所述步驟2)中在1重量份的脫灰魚鱗中，加入6-8重量份的去離子水，加熱到90-100℃后保溫1-2h。

所述步驟2)中在1重量份的脫灰魚鱗中，加入6-8重量份的去離子水，加熱到90-95℃后保溫1-2h。

提取膠原蛋白的溫度過高，會發(fā)生美拉德反應(yīng)，導(dǎo)致副產(chǎn)物含量增加，影響膠原蛋白和角蛋白的得率和純度；提取膠原蛋白的溫度過低，膠原蛋白和角蛋白就不能從魚鱗中充分分離，也影響角蛋白的得率。本發(fā)明研究人員經(jīng)過長期大量實驗發(fā)現(xiàn)，在90-95℃的溫度條件下提取膠原蛋白，不但能有效的抑制美拉德反應(yīng)，還能夠盡可能的提高角蛋白的得率，將魚鱗中的角蛋白完全提出。

所述步驟3)分兩步進行：加入1重量份的脫灰魚鱗，90-95℃繼續(xù)保溫1-2h后，繼續(xù)加入1重量份的脫灰魚鱗，90-95℃繼續(xù)保溫1-2h。

所述步驟5)中，復(fù)合蛋白酶的加酶量為角蛋白和水總質(zhì)量的1.5‰-3‰。

所述步驟1)中將清洗后的魚鱗加入到質(zhì)量濃度為3-5％的鹽酸溶液中脫灰處理。

采用3-5％鹽酸溶液脫灰處理后的脫灰魚鱗，能夠?qū)Ⅳ~鱗中的鈣完全析出，得到得脫灰魚鱗灰分含量小于0.5％。

采用3-5％鹽酸溶液脫灰處理后的脫灰魚鱗，灰分含量小，且在分離膠原蛋白和角蛋白的過程中加熱溫度較低，能夠避免美拉德反應(yīng)，副產(chǎn)物少，角蛋白產(chǎn)率高。

所述脫灰處理為將1重量份的魚鱗加入到8-10重量份的鹽酸溶液中，室溫條件下250-300r/min攪拌1-2h。

所述步驟1)中將清洗后的魚鱗加入到質(zhì)量濃度為4％的鹽酸溶液中脫灰處理。

所述步驟(2)和步驟(3)中，在加熱的過程中需要攪拌，攪拌速率為2000-4000r/min。

所述步驟6)中的提純包括：活性炭吸附和離子交換樹脂吸附。

所述活性炭吸附為向魚鱗角蛋白粗品中加入魚鱗角蛋白粗品質(zhì)量0.5-1％的活性炭，在60℃吸附40min，進行脫色脫腥處理；

本發(fā)明魚鱗角蛋白粗品經(jīng)過活性炭吸附脫色脫腥處理后，再經(jīng)過離子交換樹脂脫鹽、除重金屬離子，所獲得的魚鱗角蛋白純度可達(dá)到99％以上。

本發(fā)明具有的優(yōu)點和積極效果是：

1)采用鹽酸溶液脫灰處理魚鱗，獲得的脫灰魚鱗灰分含量小于0.5％；

2)膠原蛋白和角蛋白的分離過程中，分多次向膠原蛋白溶液中加入脫灰魚鱗，有效的抑制了美拉德反應(yīng)，所制備的固體殘渣中角蛋白的含量和純度高；

3)采用復(fù)合蛋白酶水解角蛋白，所獲得的魚鱗角蛋白水解率高、品質(zhì)好的，分子量小于1000Da的魚鱗角蛋白得率大于85％；

4)經(jīng)提純噴霧干燥后所得魚鱗角蛋白純度可達(dá)99％以上。

具體實施方式

實施例1

將1重量份的魚鱗清洗后，加入到8重量份的質(zhì)量濃度為3％的鹽酸溶液中，室溫條件下250r/min攪拌2h，去離子水沖洗至中性，獲得脫灰魚鱗；將1重量份的脫灰魚鱗加入到6重量份的去離子水中，加熱到100℃后保溫1h后；繼續(xù)加入1重量份的脫灰魚鱗， 繼續(xù)100℃后保溫2h，獲得帶有固體殘渣的膠原蛋白溶液；離心分離獲得固體殘渣，向1重量份的固體殘渣中加入3重量份的水后，加入固體殘渣和水總重量3‰的復(fù)合蛋白酶，在55℃條件下水解2h，獲得魚鱗角蛋白粗品；魚鱗角蛋白粗品中加入魚鱗角蛋白粗品質(zhì)量0.5％的活性炭，在60℃吸附40min，進行脫色脫腥處理，然后用離子交換樹脂脫鹽、除重金屬離子后，噴霧干燥獲得魚鱗角蛋白。

魚鱗角蛋白的純度為99.7％；其中分子量小于1000Da的魚鱗角蛋白得率為85.4％。

實施例2

將2重量份的魚鱗清洗后，加入到10重量份的質(zhì)量濃度為5％的鹽酸溶液中，室溫條件下300r/min攪拌1h，去離子水沖洗至中性，獲得脫灰魚鱗；將2重量份的脫灰魚鱗加入到8重量份的去離子水中，加熱到100℃后保溫1h后；繼續(xù)加入1重量份的脫灰魚鱗，繼續(xù)100℃后保溫1h，獲得帶有固體殘渣的膠原蛋白溶液；繼續(xù)加入1重量份的脫灰魚鱗，繼續(xù)100℃后保溫2h，獲得帶有固體殘渣的膠原蛋白溶液；離心分離獲得固體殘渣，向1重量份的固體殘渣中加入3重量份的水后，加入固體殘渣和水總重量1.5‰的復(fù)合蛋白酶，在50℃條件下水解4h，獲得魚鱗角蛋白粗品；魚鱗角蛋白粗品中加入魚鱗角蛋白粗品質(zhì)量1％的活性炭，在60℃吸附40min，進行脫色脫腥處理，然后用離子交換樹脂脫鹽、除重金屬離子后，噴霧干燥獲得魚鱗角蛋白。

魚鱗角蛋白的純度為99.2％；其中分子量小于1000Da的魚鱗角蛋白得率為85.0％。

實施例3

將2重量份的魚鱗清洗后，加入到9重量份的質(zhì)量濃度為4％的鹽酸溶液中，室溫條件下250r/min攪拌2h，去離子水沖洗至中性，獲得脫灰魚鱗；將1重量份的脫灰魚鱗加入到8重量份的去離子水中，加熱到100℃后保溫2h后；繼續(xù)加入1重量份的脫灰魚鱗，繼續(xù)100℃后保溫1h，獲得帶有固體殘渣的膠原蛋白溶液；繼續(xù)加入1重量份的脫灰魚鱗，繼續(xù)100℃后保溫2h，獲得帶有固體殘渣的膠原蛋白溶液；離心分離獲得固體殘渣，向1重量份的固體殘渣中加入5重量份的水后，加入固體殘渣和水總重量2.5‰的復(fù)合蛋白酶，在55℃條件下水解3h，獲得魚鱗角蛋白粗品；魚鱗角蛋白粗品中加入魚鱗角蛋白粗品質(zhì)量0.8％的活性炭，在60℃吸附40min，進行脫色脫腥處理，然后用離子交換樹脂脫鹽、除重金屬離子后，噴霧干燥獲得魚鱗角蛋白。

魚鱗角蛋白的純度為99.4％；其中分子量小于1000Da的魚鱗角蛋白得率為85.8％。

實施例4

將2重量份的魚鱗清洗后，加入到9重量份的質(zhì)量濃度為3％的鹽酸溶液中，室溫條件下250r/min攪拌2h，去離子水沖洗至中性，獲得脫灰魚鱗；將1.5重量份的脫灰魚鱗加入到7重量份的去離子水中，加熱到100℃后保溫2h后；繼續(xù)加入1.5重量份的脫灰魚鱗，繼續(xù)100℃后保溫2h，繼續(xù)加入0.5重量份的脫灰魚鱗，繼續(xù)100℃后保溫2h；獲得帶有固體殘渣的膠原蛋白溶液；離心分離獲得固體殘渣，向1重量份的固體殘渣中加入4重量份的水后，加入固體殘渣和水總重量1.5‰的復(fù)合蛋白酶，，在55℃條件下水解3h，獲得魚鱗角蛋白粗品；魚鱗角蛋白粗品中加入魚鱗角蛋白粗品質(zhì)量0.5％的活性炭，在60℃吸附40min，進行脫色脫腥處理，然后用離子交換樹脂脫鹽、除重金屬離子后，噴霧干燥獲得魚鱗角蛋白。

魚鱗角蛋白的純度為99.8％；其中分子量小于1000Da的魚鱗角蛋白得率為85.9％。

以上對本發(fā)明的實施例進行了詳細(xì)說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實施例，不能被認(rèn)為用于限定本發(fā)明的實施范圍。凡依本發(fā)明申請范圍所作的均等變化與改進等，均應(yīng)仍歸屬于本發(fā)明的專利涵蓋范圍之內(nèi)。