本發(fā)明涉及一種環(huán)肽的制備方法，具體涉及卡貝縮宮素的固相合成方法。
背景技術(shù)：
卡貝縮宮素(Carbetocin)是一種合成的具有激動(dòng)劑性質(zhì)的長(zhǎng)效催產(chǎn)素九肽類(lèi)似物。硬膜外或腰麻下剖腹產(chǎn)術(shù)后可以立即單劑量靜脈給藥，以預(yù)防子宮張力不足和產(chǎn)后出血。
卡貝縮宮素的臨床和藥理特性與天然產(chǎn)生的催產(chǎn)素類(lèi)似。像催產(chǎn)素一樣，卡貝縮宮素與子宮平滑肌的催產(chǎn)素受體結(jié)合，引起子宮的節(jié)律性收縮，在原有的收縮基礎(chǔ)上，增加其頻率和增加子宮張力。在非妊娠狀態(tài)下，子宮的催產(chǎn)素受體含量很低，在妊娠期間增加，分娩時(shí)達(dá)高峰。因此卡貝縮宮素對(duì)非妊娠的子宮沒(méi)有作用，但是對(duì)妊娠的子宮和剛生產(chǎn)的子宮具有有效的子宮收縮作用。
研究表明，當(dāng)硬膜外或腰麻下剖腹產(chǎn)術(shù)后立即單劑量靜脈給予卡貝縮宮素100ug，在預(yù)防子宮張力不足和減少產(chǎn)后出血方面，卡貝縮宮素明顯優(yōu)于安慰劑。在產(chǎn)后的早期給予卡貝縮宮素也可以促進(jìn)子宮的復(fù)舊。
卡貝縮宮素具有以下結(jié)構(gòu)：
用氨基酸縮寫(xiě)表示為：
卡貝縮宮素及其類(lèi)似物的制備方法早期主要是液相合成工藝，操作復(fù)雜，不利于工業(yè)生產(chǎn)、應(yīng)用價(jià)值不高；目前在國(guó)外卡貝縮宮素申報(bào)的專(zhuān)利合成方面的也不多，其中包括一家西班牙公司的ES2115543，是固液相結(jié)合的合成方法，主要方法是：用常規(guī)固相多肽合成，采用HOBt/DIC體系得到 4-chlorobutyl-Tyr(OMe)-Ile-Gln-Asn-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-PAL-Nle-pMBHA,然后用TFA/1-Dodecanethiol/H2O＝8:1:1裂解2小時(shí)(注：1-Dodecanethiol十二硫醇)，得到線形肽4-chlorobutyl-Tyr(OMe)-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly－NH2，線性肽用1：1的乙腈和水作溶劑，用1M NaOH調(diào)pH＝9，環(huán)化得到卡貝縮宮素。其所用的堿還包括LiOH，NaHCO3，DIEA，DMAP。
捷克專(zhuān)利CS：8605461，先用固相多肽合成方法合成肽樹(shù)脂再裂解得到Z-Ile-Gln-Asn-Cys(Bzl)-Pro-Leu-Gly-NH2，再氫化得到Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2再跟4-Bromobutyric acid反應(yīng)，得到Ile-Gln-Asn-Cys(C3H6COOH)-Pro-Leu-Gly-NH2再跟X-Tyr(OMe)-OH反應(yīng)，脫保護(hù)，環(huán)化得到卡貝縮宮素。
在這些專(zhuān)利描述的方法中，都以液相方法進(jìn)行環(huán)合，國(guó)內(nèi)專(zhuān)利用液相環(huán)合的還有杭州和錦的專(zhuān)利(申請(qǐng)?zhí)枺?01010560715.4)，上海蘇豪逸明制藥的專(zhuān)利(申請(qǐng)?zhí)枺?01110001400.0)以及蘇州天馬的專(zhuān)利(申請(qǐng)?zhí)?01510001735.0)，這種方法需要反應(yīng)原料在極稀溶液中反應(yīng)，且副反應(yīng)較多，在規(guī)?；a(chǎn)中需大量溶劑，隨即產(chǎn)生大量廢液。本發(fā)明利用固相假稀釋原理，開(kāi)發(fā)了固相高效環(huán)合方法，反應(yīng)時(shí)間縮短至2～3小時(shí)，反應(yīng)廢液降為液相反應(yīng)的1/10以下。并且能有效減少副反應(yīng)，提高粗肽純度，進(jìn)而提高收率。
國(guó)內(nèi)專(zhuān)利中有多篇也使用固相方法環(huán)化，根據(jù)先成硫醚鍵還是先成酰胺鍵可分為兩類(lèi)：第一類(lèi)是先將溴代丁酸通過(guò)酰胺偶聯(lián)與肽鏈的酪氨酸氨基偶聯(lián)，再用堿(如DIPEA、NMM、LiCl、DMAP)作用下消除溴化氫形成硫醚鍵而關(guān)環(huán)。采用該方法的專(zhuān)利有深圳翰宇藥業(yè)的專(zhuān)利(申請(qǐng)?zhí)?00910106889.0)和杭州湃肽的專(zhuān)利(申請(qǐng)?zhí)?01410461695.3)；另一類(lèi)是先將羧基保護(hù)的丁酸連接到半胱氨酸的巰基上，偶聯(lián)完所有殘基后脫除丁酸羧基保護(hù)基，再通過(guò)酰胺偶聯(lián)與肽鏈上的酪氨酸氨基偶聯(lián)環(huán)合，采用該方法的專(zhuān)利有深圳健元藥業(yè)的專(zhuān)利(申請(qǐng)?zhí)?01010544419.5)，成都圣諾科技的專(zhuān)利(申請(qǐng)?zhí)?01110151928.6)，無(wú)錫凱利的專(zhuān)利(申請(qǐng)?zhí)?01210255959.0)，成都天臺(tái)山藥業(yè)的專(zhuān)利(申請(qǐng)?zhí)?01410331088.5)。
采用片段偶聯(lián)的專(zhuān)利國(guó)內(nèi)也有兩篇。杭州諾泰的專(zhuān)利(申請(qǐng)?zhí)?01310412014.X)，單獨(dú)將碳端的谷氨酰胺作為一個(gè)片段，其余8個(gè)殘基作為一個(gè)片段，環(huán)化采用液相方法進(jìn)行。海南雙成的專(zhuān)利(申請(qǐng)?zhí)?01410076731.4)采用將碳端的Pro-Leu-Gly作為一個(gè)片段，其余6個(gè)殘基作為一個(gè)片段，采用溴丁酸為丁酸殘基原料，固相環(huán)化的堿采用DIPEA、TEA或LiOH。
以液相方法進(jìn)行環(huán)合的方法需要反應(yīng)原料在極稀溶液中反應(yīng)，且副反應(yīng)較多，在規(guī)?；a(chǎn)中需大量溶劑，隨即產(chǎn)生大量廢液。本發(fā)明利用固相假稀釋原理，開(kāi)發(fā)了固相高效環(huán)合方法，反應(yīng)時(shí)間縮短至2～3小時(shí)，反應(yīng)廢液降為液相反應(yīng)的1/10以下。并且能有效減少副反應(yīng)，提高粗肽純度，進(jìn)而提高收率。
采用片段合成，可以解決按次序逐個(gè)偶聯(lián)造成的粗產(chǎn)物純度不高。片段法可 以選擇分段的位點(diǎn)有三處，為Cys-Pro-Leu-Gly之間的三個(gè)位點(diǎn)。選擇Cys-Pro之間(如201410076731.4)，則Cys為片段的起始連接氨基酸，由于Fmoc-Cys(Mmt)-OH在與Wang樹(shù)脂偶聯(lián)時(shí)容易出現(xiàn)消旋，使Cys對(duì)映體雜質(zhì)明顯增大(見(jiàn)對(duì)比例1)，而Cys對(duì)映體雜質(zhì)對(duì)純化影響很大，會(huì)大幅降低精肽收率。選擇Leu-Gly之間的位點(diǎn)(如201310412014.X)，則單獨(dú)一個(gè)甘氨酸作為片段，會(huì)造成偶聯(lián)對(duì)接時(shí)，反應(yīng)位阻較大，產(chǎn)物中缺甘氨酸雜質(zhì)升高，給純化帶來(lái)不便。因此本申請(qǐng)選擇Pro-Leu之間的位點(diǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明一個(gè)方面涉及1、一種卡貝縮宮素的固相片段制備方法，其包括以下步驟：
1)以固相合成樹(shù)脂為載體，通過(guò)連接受保護(hù)的氨基酸，脫除氨基保護(hù)基，再連接受保護(hù)的氨基酸的方法依次連接氨基和側(cè)鏈經(jīng)過(guò)保護(hù)的脯氨酸(Pro)、半胱氨酸(Cys)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、異亮氨酸(Ile)、酪氨酸(Tyr)，得到末端氨基經(jīng)過(guò)保護(hù)的線性六肽片段樹(shù)脂；
2)脫除末端氨基保護(hù)后，連接4-氯丁酸，得到全保護(hù)七肽片段樹(shù)脂；
3)脫除半胱氨酸巰基保護(hù)基，得到裸露巰基的七肽片段樹(shù)脂；
4)在堿性條件下，在縮合劑作用下，末端氯基團(tuán)與半胱氨酸側(cè)鏈巰基偶聯(lián)成環(huán)，得到環(huán)七肽片段樹(shù)脂；
5)裂解環(huán)七肽片段樹(shù)脂，得到環(huán)七肽片段；
6)以固相合成樹(shù)脂為載體，通過(guò)連接受保護(hù)的氨基酸，脫除氨基保護(hù)基，再連接受保護(hù)的氨基酸的方法依次連接氨基經(jīng)過(guò)保護(hù)的甘氨酸(Gly)和亮氨酸(Leu)，得到二肽樹(shù)脂；
7)將步驟5)所得環(huán)七肽片段連接到二肽樹(shù)脂上，得到卡貝縮宮素肽樹(shù)脂；
8)裂解卡貝縮宮素肽樹(shù)脂，得到卡貝縮宮素。
進(jìn)一步地，其中所述氨基和側(cè)鏈經(jīng)過(guò)保護(hù)的脯氨酸選自Fmoc-Pro-OH；所述氨基和側(cè)鏈經(jīng)過(guò)保護(hù)的半胱氨酸選自Fmoc-Cys(Mmt)-OH；所述氨基和側(cè)鏈經(jīng)過(guò)保護(hù)的天冬酰胺選自Fmoc-Asn(Trt)-OH；所述氨基和側(cè)鏈經(jīng)過(guò)保護(hù)的谷氨酰胺選自Fmoc-Gln(Trt)-OH；所述氨基和側(cè)鏈經(jīng)過(guò)保護(hù)的異亮氨酸選自Fmoc-Ile-OH；所述氨基和側(cè)鏈經(jīng)過(guò)保護(hù)的酪氨酸選自Fmoc-Tyr(Me)-OH；所述氨基經(jīng)過(guò)保護(hù)的甘氨酸選自Fmoc-Gly-OH；所述氨基經(jīng)過(guò)保護(hù)的亮氨酸選自Fmoc-Leu-OH。
進(jìn)一步地，步驟1)和/或步驟7)中所述的固相合成方法是Fmoc固相多肽合成方法，選用的偶聯(lián)劑為DIPCDI+A或者DIPEA+A+B，其中A選自HOBt或HOAt，B選自PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU、TBTU中的一種或多種；優(yōu)選地，偶聯(lián)劑中各成分的比例以摩爾比例計(jì)為DIPCDI:A＝1.1～1.5:1.0～1.4，DIPEA:A:B＝1.8～2.2:1.0～1.4:0.95～1.05；更優(yōu)選為DIPCDI:A＝1.3:1.2， DIPEA:A:B＝2.0:1.2:1.0。
進(jìn)一步地，步驟3)的脫除試劑為三氟乙酸和三異丙基硅烷的二氯甲烷溶液，三氟乙酸濃度為2～5％，三異丙基硅烷濃度為3～8％。
進(jìn)一步地，步驟4)所用的堿為DBU或LiCl/DIPEA組合，優(yōu)選DBU；步驟4)所述溶劑優(yōu)選為DMF或N-甲基吡咯烷酮，反應(yīng)終點(diǎn)采用Ellman反應(yīng)檢測(cè)。
進(jìn)一步地，步驟1)所用的樹(shù)脂為wang樹(shù)脂、2-CTC樹(shù)脂，步驟6)所用的樹(shù)脂為Rink Amide樹(shù)脂、Rink Amide-AM樹(shù)脂，Rink Amide-MBHA樹(shù)脂，優(yōu)選地，步驟1)為wang樹(shù)脂，步驟6)為Rink Amide樹(shù)脂。，步驟6)所用的樹(shù)脂為Rink Amide樹(shù)脂，優(yōu)選地，步驟6)中所述樹(shù)脂替代度為0.2-0.9mmol/g，更優(yōu)選0.4～0.6mmol/g。
進(jìn)一步地，步驟5)和/或步驟8)獲得產(chǎn)物，還包括純化步驟，優(yōu)選所述純化步驟選自重結(jié)晶、反相高壓液相方法；更優(yōu)選地，重結(jié)晶方法為將粗肽溶于THF，然后向其中加入MTBE。
進(jìn)一步地，步驟5)采用的裂解試劑為T(mén)FA：TIS：H2O＝85～95:2～8:2～8(V:V)。
本發(fā)明的反應(yīng)流程如下所示：
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1：制備Fmoc-Pro-Wang樹(shù)脂
稱(chēng)取替代度為1.166mmol/L的Wang樹(shù)脂11.949g(13.9mmol)，DMF洗滌2次，用DMF溶脹樹(shù)脂30分鐘。稱(chēng)取DMAP 0.183g(1.39mmol)加入反應(yīng)柱中。稱(chēng)取29.69g(83.4mmol)Fmoc-Pro-OH，加適量DCM溶解，冰水浴冷卻下加入8.7ml(55.6mmol)DIPCDI,活化3分鐘后將此溶液加入反應(yīng)柱中，氮?dú)夤呐莘磻?yīng)3h。抽除反應(yīng)液，DMF洗滌3次，加23ml吡啶和28ml乙酐進(jìn)行封閉反應(yīng)過(guò)夜。抽除反應(yīng)液，DMF洗滌3次，甲醇收縮樹(shù)脂3次，抽干樹(shù)脂，得到Fmoc-Pro-Wang樹(shù)脂22.51g,檢測(cè)替代度為0.627mmol/g。
實(shí)施例2：七肽環(huán)肽的制備
稱(chēng)取實(shí)施例1所得的Fmoc-Pro-Wang樹(shù)脂15.959g(10mmol)，加入到固相反應(yīng)柱中，用DMF洗滌2次，用DMF溶脹樹(shù)脂30分鐘后，DBLK脫保護(hù)6min+8min，DMF洗滌6次。稱(chēng)取18.47g(30mmol)Fmoc-Cys(Mmt)-OH和4.46g(33mmol)HOBT用DMF/DCM(V:V＝1:1)溶解，冰水浴下加入5.2mL(36mmol)DIPCDI活化3min后，將混合液加入到反應(yīng)柱中，室溫反應(yīng)2小時(shí)，以茚三酮檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)(如樹(shù)脂無(wú)色透明則終止反應(yīng)；如樹(shù)脂顯色則延長(zhǎng)反應(yīng)1小時(shí))。
反應(yīng)結(jié)束，用DMF洗滌樹(shù)脂3次，加入DBLK脫保護(hù)5min+7min，DMF洗滌樹(shù)脂6次，茚三酮檢測(cè)樹(shù)脂有顏色。稱(chēng)取17.90g(30mmol)Fmoc-Asn(Trt)-OH和4.46g(33mmol)HOBT用DMF/DCM(V:V＝1:1)溶解，冰水浴下加入5.2mL(36mmol)DIPCDI活化3min后，將混合液加入到反應(yīng)柱中，室溫反應(yīng)2小時(shí)，以茚三酮檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)(如樹(shù)脂無(wú)色透明則終止反應(yīng)；如樹(shù)脂顯色則延長(zhǎng)反應(yīng)1小時(shí))。
按同樣方法依次偶聯(lián)Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(Me)-OH.
反應(yīng)結(jié)束，用DMF洗滌樹(shù)脂3次，加入DBLK脫保護(hù)5min+7min，DMF洗滌樹(shù)脂3次，DCM洗滌樹(shù)脂3次，茚三酮檢測(cè)樹(shù)脂有顏色。稱(chēng)取12.26g(100mmol)4-氯丁酸用DCM溶解，冰水浴下加入7.2ml(50mmol)DIPCDI活化3min后，將混合液加入到反應(yīng)柱中，室溫反應(yīng)2.5小時(shí)，以茚三酮檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)(如樹(shù)脂無(wú)色透明則終止反應(yīng)；如樹(shù)脂顯色則延長(zhǎng)反應(yīng)0.5小時(shí))。所得即為全保護(hù)七肽樹(shù)脂。
脫除Mmt保護(hù)基：用DCM洗滌樹(shù)脂6次,將DCM：TFA：TIS＝93:2:5的脫保護(hù)液加入固相反應(yīng)柱中，氮?dú)夤臍夥磻?yīng)10分鐘后，抽掉，再加入脫保護(hù)液氮?dú)夥磻?yīng)10分鐘，抽掉，再重復(fù)兩次脫保護(hù)反應(yīng)。
固相環(huán)化：脫Mmt保護(hù)反應(yīng)結(jié)束后，用DCM洗滌3次，DMF洗滌3次。稱(chēng)取22.4g(147mmol)DBU用適量DMF溶解加入固相反應(yīng)柱中，室溫反應(yīng)2小時(shí)后，以DTNB檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)(如樹(shù)脂無(wú)色透明則終止反應(yīng)；如樹(shù)脂顯色則延長(zhǎng)反應(yīng)0.5小時(shí)，直至樹(shù)脂無(wú)色)。
反應(yīng)結(jié)束，抽干反應(yīng)液，DMF洗滌樹(shù)脂3次，抽干液體。甲醇收縮樹(shù)脂3次， 肽樹(shù)脂真空干燥得到七肽環(huán)肽樹(shù)脂25.12g。
將七肽環(huán)肽樹(shù)脂加入到500ml三口瓶中，氮?dú)獗Ｗo(hù)。加入預(yù)先配制好的TFA：TIS：H2O＝90:5:5(V:V)250ml，室溫反應(yīng)2小時(shí)，過(guò)濾樹(shù)脂，收集濾液。用少量TFA洗滌樹(shù)脂，合并濾液。將濾液緩慢加入2500ml冰乙醚中沉淀、離心，乙醚洗滌2次，減壓干燥得到粗肽8.0克，HPLC純度88.3％。
將所得8.0g七肽環(huán)肽粗肽用40mlTHF攪拌溶解，邊攪拌邊滴加240mlMTBE，冰水浴攪拌1小時(shí)后，過(guò)濾，濾餅真空干燥，得到七肽環(huán)肽為白色固體7.3g,HPLC純度98.1％。合成收率89.3％。
實(shí)施例3：卡貝縮宮素肽樹(shù)脂的制備
稱(chēng)取替代度為0.557mmol/g的Rink Amide樹(shù)脂5.40g(3.0mmol)，加入到固相反應(yīng)柱中，用DMF洗滌2次，用DMF溶脹樹(shù)脂30分鐘后，DBLK脫保護(hù)6min+8min，DMF洗滌6次。稱(chēng)取2.68g(9mmol)Fmoc-Gly-OH和1.34g(9.9mmol)HOBT用DMF溶解，加入1.55mL(10.8mmol)DIPCDI活化3min后，將混合液加入到反應(yīng)柱中，室溫反應(yīng)2小時(shí)，以茚三酮檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)(如樹(shù)脂無(wú)色透明則終止反應(yīng)；如樹(shù)脂顯色則延長(zhǎng)反應(yīng)1小時(shí))。
反應(yīng)結(jié)束，用DMF洗滌樹(shù)脂3次，加入DBLK脫保護(hù)5min+7min，DMF洗滌樹(shù)脂6次，茚三酮檢測(cè)樹(shù)脂有顏色。稱(chēng)取3.18g(9mmol)Fmoc-Leu-OH和1.34g(9.9mmol)HOBT用DMF/DCM(V:V＝1:1)溶解，冰水浴下加入1.55mL(10.8mmol)DIPCDI活化3min后，將混合液加入到反應(yīng)柱中，室溫反應(yīng)2小時(shí)，以茚三酮檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)(如樹(shù)脂無(wú)色透明則終止反應(yīng)；如樹(shù)脂顯色則延長(zhǎng)反應(yīng)1小時(shí))。
反應(yīng)結(jié)束，用DMF洗滌樹(shù)脂3次，加入DBLK脫保護(hù)5min+7min，DMF洗滌樹(shù)脂6次，茚三酮檢測(cè)樹(shù)脂有顏色。稱(chēng)取7.3g(8.9mmol)七肽環(huán)肽和1.34g(9.9mmol)HOAT用DMF/DCM(V:V＝1:1)溶解，冰水浴下加入2.86g(8.9mmol)TBTU和3.1ml(18mmol)DIPEA活化3min后，將混合液加入到反應(yīng)柱中，室溫反應(yīng)2小時(shí)，以茚三酮檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)(如樹(shù)脂無(wú)色透明則終止反應(yīng)；如樹(shù)脂顯色則延長(zhǎng)反應(yīng)1小時(shí))。
反應(yīng)結(jié)束，抽干反應(yīng)液，DMF洗滌樹(shù)脂3次，抽干液體。甲醇收縮樹(shù)脂3次，肽樹(shù)脂真空干燥得到g卡貝縮宮素肽樹(shù)脂7.72，樹(shù)脂增重2.32g,理論增重2.30g，增重率101％。
實(shí)施例4：卡貝縮宮素精肽的制備
將實(shí)施例3得到的卡貝縮宮素肽樹(shù)脂7.72克加入到125ml三口瓶中，氮?dú)獗Ｗo(hù)。加入預(yù)先配制好的TFA：TIS：H2O＝90:5:5(V:V)78ml，室溫反應(yīng)2小時(shí)，過(guò)濾樹(shù)脂，收集濾液。用少量TFA洗滌樹(shù)脂，合并濾液。將濾液緩慢加入780ml冰 乙醚\中沉淀、離心，乙醚洗滌2次，減壓干燥得到粗肽2.83克，HPLC純度96.23％。經(jīng)過(guò)高壓液相制備純化，凍干得到卡貝縮宮素精肽2.53g，純度99.12％，最大單雜0.15％。理論產(chǎn)量2.96g，總收率85.5％。
對(duì)比例：制備6環(huán)肽
投料12.49g Wang樹(shù)脂，按照實(shí)施例1的方法制備Fmoc-Cys(Mmt)-Wang樹(shù)脂，得樹(shù)脂29.4g，替代度為0.26mmol/g。按照實(shí)施例2的方法依次偶聯(lián)Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(Me)-OH和4-氯丁酸，脫除Mmt保護(hù)基，DBU固相環(huán)化，裂解后未經(jīng)重結(jié)晶檢測(cè)，粗肽純度64％，消旋雜質(zhì)14％。與實(shí)施例2中的片段粗肽純度88.3％有明顯差異。