本發(fā)明屬于海洋生物活性物質(zhì)制備技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是涉及一種離心法結(jié)合陰離子交換層析介質(zhì)制備高純度藻紅蛋白的方法。

背景技術(shù)：

藻膽蛋白(phycobiliprotein，PBP)是存在于藍(lán)藻、紅藻、隱藻和少數(shù)甲藻中的一類捕光色素蛋白。根據(jù)紫外吸收光譜的特點(diǎn)，人們將藻膽蛋白分為三類：藻藍(lán)蛋白(phycoeyanin，PC)、別藻藍(lán)蛋白(allophycoeyanin，APC)和藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)。藻紅蛋白主要分布于海洋紅藻中，它是由脫輔基蛋白和色基組成，其脫輔基蛋白是一類寡聚蛋白，基本單位為α和β亞基，有些藻紅蛋白中還有少量的γ亞基。由于色素分子的存在，藻紅蛋白在可見光區(qū)480～570nm處有較強(qiáng)的光吸收，并且具有強(qiáng)烈的熒光。藻紅蛋白用途非常廣泛，它既可以作為天然色素應(yīng)用于食品、化妝品等行業(yè)，還可制成熒光試劑，用于生物醫(yī)學(xué)分析和免疫化學(xué)等領(lǐng)域。藻紅蛋白也是一種重要的生理活性物質(zhì)，具有抗腫瘤，抗病毒，增強(qiáng)免疫力等，它還是一種具有開發(fā)潛力的光敏劑，可制成光敏劑應(yīng)用于腫瘤光動(dòng)力學(xué)治療。藻紅蛋白的純度通常用(A₅₄₅/A₂₈₀)來表示，等級(jí)劃分為0.7<食品級(jí)<3.0<反應(yīng)級(jí)<4.0<分析級(jí)，藻紅蛋白的純度越高，價(jià)格越高。目前人們主要采用硫酸按分級(jí)沉淀、羥基磷灰石柱層析、凝膠過濾層析等相結(jié)合的方法制備藻紅蛋白，現(xiàn)有的制備工藝流程存在操作復(fù)雜，生產(chǎn)成本高，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，且難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的大規(guī)模的生產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明就是針對(duì)上述問題，提供一種操作簡(jiǎn)便、成本低廉且易于大規(guī)模制備高純度藻紅蛋白的方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的制備方案為

（1) 離心收集新鮮培養(yǎng)的紫球藻，將藻泥與磷酸鹽緩沖液按1:5～1:10比例混合，得細(xì)胞懸液；

（2) 將細(xì)胞懸液在0～4?C條件下進(jìn)行超聲波處理，得到破壁液；將破壁液冷凍離心，收集上清液；

（3) 室溫下將上清液超濾，得到藻紅蛋白粗提液；

(4) 向所得的藻紅蛋白粗提液加入用磷酸鹽緩沖液預(yù)處理的強(qiáng)陰離子層析介質(zhì)，充分混勻，冷凍離心，取沉淀；接著向沉淀中加入2倍體積含有0.1mol/LNaCl的磷酸鹽緩沖液，充分混勻，冷凍離心，取上清，得到純化的藻紅蛋白。

以上步驟所用的磷酸鹽緩沖液pH為6.5～7.0，濃度為0.01～0.02mol/L。

步驟（2)中所述的破碎條件為輸出功率為300～500W，破碎4～6s、間歇4～6s，破碎時(shí)間為5～8min。

步驟(3)中所述的將上清液用分子截留量為50～60kD的膜包超濾，超濾4～6次。

步驟(4)中所述的強(qiáng)陰離子交換介質(zhì)為source15Q或source30Q。

本發(fā)明的有益效果:

本發(fā)明采用的離心技術(shù)結(jié)合陰離子層析介質(zhì)制備藻紅蛋白的方法，與傳統(tǒng)技術(shù)相比省去了柱層析的步驟，操作方法簡(jiǎn)便易行，成本低廉，純度高，回收率高，并且經(jīng)過了實(shí)驗(yàn)室放大設(shè)備的驗(yàn)證。本發(fā)明采用了超聲破碎、超濾以及加入層析介質(zhì)離心的方法，得到的藻紅蛋白純度A₅₄₅/A₂₈₀>4.0，為藻紅蛋白應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)分析和免疫化學(xué)等領(lǐng)域奠定了基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的純化后藻紅蛋白的全波長(zhǎng)掃描圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的純化后藻紅蛋白的SDS-PAGE電泳圖（泳道1，標(biāo)準(zhǔn)蛋白；泳道2, 純化的藻紅蛋白）。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

（1) 離心收集新鮮培養(yǎng)的紫球藻5g，將藻泥與磷酸鹽緩沖液(pH 6.8，0.02mol/L)按1:6比例混合，得細(xì)胞懸液；

（2) 將細(xì)胞懸液在0～4?C條件下在進(jìn)行超聲處理，輸出功率為500W，破碎4s、間歇4s，破碎時(shí)間為6min；得到破壁液；將破壁液冷凍離心，收集上清液；

（3) 室溫下將上清液經(jīng)分子截留量為50kD膜包超濾，超濾5次，收集濾液，得藻紅蛋白粗提液；

(4) 向所得藻紅蛋白粗提液加入用磷酸鹽緩沖液(pH 6.8，0.02mol/L)預(yù)處理的層析介質(zhì)Source15Q（0.2g），充分混勻，冷凍離心，取沉淀；接著向沉淀中加入2倍體積含有0.1mo/LNaCl的磷酸鹽緩沖液，充分混勻，冷凍離心，取上清，得到純化的藻紅蛋白（見圖1和圖2）。

從圖2可以看出，純化的藻紅蛋白在可見光區(qū)545nm和565nm處有2個(gè)吸收峰，在498nm處有1個(gè)吸收肩峰。藻紅蛋白純度（A₅₄₅/A₂₈₀）>4.0；用536nm熒光激發(fā)，發(fā)射峰位于578nm；純化后的藻紅蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜見圖2，在分子量為30kD處的條帶為γ亞基，在分子量為19kD處的條帶為α和β亞基，由于這兩種亞基的分子量接近，所以在圖譜中出現(xiàn)了重疊現(xiàn)象，該結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道一致。

實(shí)施例2

（1) 離心收集新鮮培養(yǎng)的紫球藻50g，將藻泥與磷酸鹽緩沖液(pH 6.8，0.01mol/L)按1:8比例混合，得細(xì)胞懸液；

（2) 將細(xì)胞懸液在0～4?C條件下進(jìn)行超聲處理，輸出功率為500W，破碎3s、間歇3s，破碎時(shí)間為8min，得到破壁液；將破壁液低溫離心，收集上清液；

（3) 室溫下將上清液經(jīng)分子截留量為60kD膜包超濾，超濾4次，收集濾液，得藻紅蛋白粗提液；

(4) 向所得藻紅蛋白粗提液加入用磷酸鹽緩沖液(pH 6.8，0.01mol/L)預(yù)處理的層析介質(zhì)Source15Q（2g），充分混勻，冷凍離心，取沉淀；接著向沉淀中加入2倍體積含有0.1 mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液（pH 6.8，0.01mol/L），充分混勻，冷凍離心，取上清，得到純化的藻紅蛋白，制備的藻紅蛋白純度（A₅₄₅/A₂₈₀）>4.0，回收率為42.6%。