本發(fā)明涉及芳香2-丁醇類化合物，其光學(xué)異構(gòu)體及其藥學(xué)可接受的鹽。本發(fā)明還涉及制備式I化合物的方法、含有上述化合物的藥用組合物以及所述化合物用于抗結(jié)核桿菌的用途。

背景技術(shù)：

繼艾滋病之后，結(jié)核病又是一危害世界的重大感染性疾病，每年造成2-3百萬的患者死亡。世界上已有1100萬人綜合感染了愛滋病毒和結(jié)核桿菌，艾滋病患者發(fā)病同時(shí)，由于免疫力低下，此前一度休眠的結(jié)核桿菌便大肆泛濫，而且隨著感染艾滋病毒的人數(shù)的與日俱增，結(jié)核的感染率又了抬頭的趨勢(shì)。由于種種原因，近40年來沒有任何上市的藥物。雖然現(xiàn)有的一線抗結(jié)核用藥能很大程度上遏制著結(jié)核桿菌的蔓延，但是隨著耐藥性菌株的增多以及交叉耐藥出現(xiàn)，前景不容樂觀。此外，現(xiàn)用于臨床的抗結(jié)核藥物的治療周期都在6個(gè)月以上，如此長(zhǎng)的治療時(shí)間不但患者很難堅(jiān)持下來，而且使得耐藥菌株的數(shù)量不斷增多，因此必須要有快速治療的抗結(jié)核藥物。鑒于此，本技術(shù)領(lǐng)域需要發(fā)展全新結(jié)構(gòu)和作用于新靶點(diǎn)的抗結(jié)核藥物。

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的傳染性疾病。全球約有1/3的人口感染有結(jié)核桿菌，大多數(shù)的受感染者沒有病癥，稱為潛伏結(jié)核感染，但其中10％左右的潛伏感染后期會(huì)發(fā)展成為活動(dòng)性結(jié)核。隨著近年來出現(xiàn)越來越多的多重耐藥結(jié)核(MDR-TB)和廣泛耐藥結(jié)核(XDR-TB)，市面上現(xiàn)有的抗結(jié)核藥物已經(jīng)顯得無能為力，這導(dǎo)致結(jié)核病的發(fā)病率與致死率在逐漸上升，開始嚴(yán)重威脅人類的健康。 因此，研發(fā)一種具有全新作用靶點(diǎn)的抗結(jié)核藥物，從而對(duì)耐藥結(jié)核菌有效的藥物，是有必要而且急迫的。

ATP合成酶作為一個(gè)全新的抗結(jié)核靶點(diǎn)，有著很好的應(yīng)用前景。新型芳香2-丁醇類化合物就是針對(duì)此靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的抗結(jié)核桿菌化合物。Bedaquiline，是由強(qiáng)生公司研發(fā)，并與2012年得到美國(guó)FDA授權(quán)用于治療MDR-TB的藥物，它作用于結(jié)核桿菌的ATP合成酶的c亞基，通過擾亂結(jié)核桿菌的能量代謝過程而達(dá)到殺死結(jié)核菌的目的。通過科學(xué)家們對(duì)Bedaquiline的構(gòu)效關(guān)系研究，并沒有數(shù)據(jù)表明喹啉環(huán)是其抗結(jié)核生物活性所必須的結(jié)構(gòu)，因此我們嘗試將喹啉環(huán)改變?yōu)檩镰h(huán)，以試圖探究喹啉環(huán)是否為必需基團(tuán)。早期結(jié)果(專利CN102249935B)表明我們所設(shè)計(jì)的芳香2-丁醇類化合物具有良好的抗結(jié)核生物活性，即喹啉環(huán)并不是抗結(jié)核生物活性所必需的基團(tuán)，因此我們想進(jìn)一步研究芳香2-丁醇類化合物的不同光學(xué)異構(gòu)體對(duì)抗結(jié)核生物活性的影響。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是開發(fā)出具有高光學(xué)純度的如通式I所示的芳香2-丁醇類小分子化合物，用于治療結(jié)核病，尤其是耐藥結(jié)核病。本發(fā)明人經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供的不對(duì)稱合成方法能夠得到高光學(xué)純度的所述化合物，而且生物活性數(shù)據(jù)顯示，所述化合物具有良好的抗結(jié)核桿菌的作用。本發(fā)明基于上述發(fā)現(xiàn)而得以完成。

本發(fā)明的第一方面涉及通式I所示的芳香2-丁醇類小分子化合物，及其藥學(xué)可接受的鹽、溶劑合物：

其中：

R₁表示氫或者選自下列的基團(tuán)：鹵素(例如氟、氯、溴、碘)、羥基、烷氧基、甲氧基、硝基、氨基、烷基；

R₂表示氫或者表示1至5個(gè)(例如1-4個(gè)、1-3個(gè)、1-2個(gè))各自獨(dú)立地選自下列的基團(tuán)：鹵素(例如氟、氯、溴、碘)、羥基、烷氧基、甲氧基、硝基、氨基、烷基；

R₃表示苯基、萘基和雜環(huán)基，所述苯基、萘基和雜環(huán)基未被取代或被1-5個(gè)(例如5個(gè)、4個(gè)、3個(gè)、2個(gè)或1個(gè))各自獨(dú)自地選自下列的取代基取代：鹵素(例如氟、氯、溴、碘)、羥基、烷氧基、甲氧基、硝基、氨基、烷基；

在本發(fā)明中，術(shù)語“烷基”在單獨(dú)提及時(shí)，可以是指具有任何碳原子數(shù)的直鏈或支鏈烷基，特別是指包含1-20個(gè)碳原子(例如1-15個(gè)、1-10個(gè)、1-3個(gè))的直鏈或支鏈烷基。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述術(shù)語“烷基”在單獨(dú)提及時(shí)，是指包含1-8個(gè)碳原子(例如1-6個(gè)，1-3個(gè))的直鏈或支鏈烷基。

在本發(fā)明第一方面的一個(gè)實(shí)施方案中，通式I化合物，及其可藥用鹽和溶劑化物，優(yōu)選如下的化合物：

R₁表示溴，R₂表示氫，R₃表示1-萘基，即1-苯基-2-(1-萘基)-1-[2-(7-溴-3-甲氧基)萘基]-4-(N，N-二甲氨基)-2-丁醇。其4個(gè)光學(xué)異構(gòu)體分別記為：(1R，2S)異構(gòu)體為TM-05-a，(1R，2R)異構(gòu)體為TM-05-b，(1S，2R)異構(gòu)體為TM-05-c，(1S，2S)異構(gòu)體為TM-05-d。

在本發(fā)明第一方面的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物鹽類為藥學(xué)上可接受的鹽，優(yōu)選鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽和硫酸鹽。

其中：

R₁表示氫或者選自下列的基團(tuán)：鹵素(例如氟、氯、溴、碘)、羥基、烷氧基、甲氧基、硝基、氨基、烷基；

R₂表示氫或者表示1至5個(gè)(例如1-4個(gè)、1-3個(gè)、1-2個(gè))各自獨(dú)立地選自下列的基團(tuán)：鹵素(例如氟、氯、溴、碘)、羥基、烷氧基、甲氧基、硝基、氨基、烷基；

R₃表示苯基、萘基和雜環(huán)基，所述苯基、萘基和雜環(huán)基未被取代或被1-5個(gè)(例如5個(gè)、4個(gè)、3個(gè)、2個(gè)或1個(gè))各自獨(dú)自地選自下列的取代基取代：鹵素(例如氟、氯、溴、碘)、羥基、烷氧基、甲氧基、硝基、氨基、烷基；

在本發(fā)明中，術(shù)語“烷基”在單獨(dú)提及時(shí)，可以是指具有任何碳原子數(shù)的直鏈或支鏈烷基，特別是指包含1-20個(gè)碳原子(例如1-15個(gè)、1-10個(gè)、1-3個(gè))的直鏈或支鏈烷基。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述術(shù)語“烷基”在單獨(dú)提及時(shí)，是指包含1-8個(gè)碳原子(例如1-6個(gè)，1-3個(gè))的直鏈或支鏈烷基。

在本發(fā)明第一方面的一個(gè)實(shí)施方案中，通式I化合物，及其可藥用鹽和溶劑化物，優(yōu)選如下的化合物：

(1R，2S)-1-苯基-2-(1-萘基)-1-[2-(7-溴-3-甲氧基)萘基]-4-(N，N-二甲氨基)-2-丁醇與(1R，2R)-1-苯基-2-(1-萘基)-1-[2-(7-溴-3-甲氧基)萘基]-4-(N，N-二甲氨基)-2-丁醇

(1S，2R)-1-苯基-2-(1-萘基)-1-[2-(7-溴-3-甲氧基)萘基]-4-(N，N- 二甲氨基)-2-丁醇與(1S，2S)-1-苯基-2-(1-萘基)-1-[2-(7-溴-3-甲氧基)萘基]-4-(N，N-二甲氨基)-2-丁醇

光學(xué)1-苯基-2-(1-萘基)-1-[2-(3-甲氧基)萘基]-4-(N，N-二甲氨基)-2-丁醇

光學(xué)1-(4-氯苯基)-2-(1-萘基)-1-[2-(7-溴-3-甲氧基)萘基]-4-(N，N-二甲氨基)-2-丁醇

光學(xué)1-(4-氯苯基)-2-(1-萘基)-1-[2-(3-甲氧基)萘基]-4-(N，N-二甲氨基)-2-丁醇

光學(xué)1-(4-氯苯基)-2-(3-溴苯基)-1-[2-(7-溴-3-甲氧基)萘基]-4-(N，N-二甲氨基)-2-丁醇

光學(xué)1-苯基-2-(1-萘)-1-[2-(7-溴-3-甲氧基)萘]-4-(N，N-二甲氨基)-2-

丁醇

光學(xué)1-(4-氯苯基)-2-(1-萘)-1-[2-(3-甲氧基)萘]-4-(N，N-二甲氨基)-2-丁醇鹽酸鹽

本發(fā)明第二方面，提供了制備通式I化合物的高純度光學(xué)異構(gòu)體的方法：

以化合物1-苯基-2-(1-萘基)-1-[2-(7-溴-3-甲氧基)萘基]-4-(N，N-二甲氨基)-2-丁醇為例。本發(fā)明以3-羥基-2-萘酸為原料，經(jīng)過溴雙取代，選擇性脫溴還原，甲基化，四氫鋰鋁還原酯基為醇再氧化為醛，通過Horner-Wadsworth-Emmons反應(yīng)成烯后脫酯生成Sharpless不對(duì)稱環(huán)氧化的標(biāo)準(zhǔn)底物。Sharpless不對(duì)稱環(huán)氧化的手性選擇性非常高，生成的高光學(xué)純度的產(chǎn)物，經(jīng)過區(qū)域選擇性開環(huán)，鄰二醇羥基斷裂，用格氏試劑引入第三個(gè)芳香基團(tuán)，再引入烯丙基的側(cè)鏈，最后通過多步反應(yīng)將烯丙基側(cè)鏈替換為N，N-二甲胺基乙基側(cè)鏈，再通過硅膠柱色譜分離得到高光學(xué)純度的目標(biāo)化合物，即TM-05-a，TM-05-b，TM-05-c和TM-05-d。Sharpless不對(duì)稱環(huán)氧化一步時(shí)，采用L-(+)-DIPT為配體，得到的終產(chǎn)物是TM-05-a和TM-05-b；采用D-(-)-DIPT為配體，得到的終產(chǎn)物是TM-05-c和TM-05-d。這四個(gè)光學(xué)異構(gòu)體的絕對(duì)構(gòu)型，可以通過比較量子計(jì)算和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的電子圓二色譜圖而確定，并且通過圓二色譜、核磁和X單晶 衍射技術(shù)的綜合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得以證實(shí)。

在本發(fā)明第二方面的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物鹽類的合成是在上述合成基礎(chǔ)上，進(jìn)一步如下反應(yīng)：

其中HX代表鹽酸，氫溴酸，氫碘酸鹽和硫酸鹽。

本發(fā)明第三方面涉及藥物組合物，其包含通式I所示的化合物，或其異構(gòu)體、可藥用鹽及溶劑化物，以及藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。

本發(fā)明第四方面涉及第一方面所述通式I所示的化合物或其異構(gòu)體、可藥用鹽及溶劑化物，和第三方面的藥物組合物在制備用于治療和/或預(yù)防與結(jié)核桿菌感染有關(guān)的疾病或病癥的藥物中的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述與結(jié)核桿菌感染有關(guān)的疾病是結(jié)核病。

發(fā)明詳述：

下面對(duì)本發(fā)明的各個(gè)方面和特點(diǎn)作進(jìn)一步的描述。

本發(fā)明使用的各種術(shù)語和短語具有本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的一般含義，即便如此，本發(fā)明仍然希望在此對(duì)這些術(shù)語和短語作更詳盡的說明和解釋，提及的術(shù)語和短語如有與公知含義不一致的，以本發(fā)明所表述的含義為準(zhǔn)。下面是本發(fā)明所用多種術(shù)語的定義，這些定義適用于本申請(qǐng)整個(gè)說明書中所用的術(shù)語，除非在具體情況下另作說明。

在本發(fā)明上下文中，例如在通式化合物或具體化合物中所描繪的，某個(gè)原子團(tuán)可以鏈接若干個(gè)氫原子，使該原子團(tuán)可以滿足化學(xué)價(jià)的要求，盡管相應(yīng)原子團(tuán)上的氫原子可以在結(jié)構(gòu)式中不給予繪出。

術(shù)語“烷氧基”是指烷基-O-，其中的烷基如本發(fā)明所述。

如本文所述的，術(shù)語“鹵”、“鹵素”、“鹵素原子”、“鹵代”等表示氟、氯、溴或碘，特別是表示氟、氯或溴。

如本文所述的，術(shù)語“烷基”是指具有指定數(shù)目碳原子數(shù)的烷基，其為直鏈或支鏈的烷基，并且其可包括其子基團(tuán)，例如提及“C_1-6烷基”時(shí)，其還可以包括C_1-5烷基、C_1-4烷基、C_2-6烷基、C_2-4烷基等表示的子范圍的基團(tuán)，以及具體基團(tuán)例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基。

在本文的通式I化合物中，當(dāng)一個(gè)取代基通過一個(gè)鍵連接到一個(gè)環(huán)的內(nèi)部時(shí)，其表示該取代基可以在該環(huán)的任一個(gè)可以取代的位置進(jìn)行取代，例如對(duì)于R₂取代基及其所在的環(huán)其中一個(gè)或多個(gè)R₂取代基可以位于該環(huán)的2-、3-、4-、5-或6-位。

如本文所述的，術(shù)語“藥物組合物”，其還可以是指“組合物”，其可用于在受試者特別是哺乳動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)治療或預(yù)防本發(fā)明所述疾病或病癥。

如本文所述的，術(shù)語“受試者”可以指患有或者其它接受本發(fā)明式I化合物或其藥物組合物以治療或預(yù)防本發(fā)明所述疾病或病癥的動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物，例如人、狗、猴、牛、馬等。

如本文所述的，如為特別指明，“％”是指重量/重量的百分比，特別是在描述固體物質(zhì)的情況下。當(dāng)然，在描述液體物質(zhì)的時(shí)候，該“％”可以指重量/體積的百分比(對(duì)于固體溶于溶液的情形)，或者可以指體積/體積百分比(對(duì)于液體溶于液體的情形)。

如本文所述的，術(shù)語“藥學(xué)可接受的”或者與其可互換使用的“可藥用的”， 例如在描述“藥學(xué)可接受的鹽”時(shí)，表示該鹽其不但是受試者生理學(xué)上可接受，而且還可指在藥學(xué)上有使用價(jià)值的合成物質(zhì)，例如在為進(jìn)行手性拆分時(shí)所形成的作為中間體的鹽，雖然這種中間體的鹽并不能直接給予受試者，但該鹽可在為獲得本發(fā)明終產(chǎn)物中起作用。

本發(fā)明化合物的藥物組合物，可以以以下上面的任意方式施與：口服、噴霧吸入、直腸給藥、鼻腔給藥、陰道給藥、局部給藥、非腸道給藥如皮下、靜脈、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、胸骨內(nèi)或顱內(nèi)注射或輸入，或借助一種外植的儲(chǔ)器用藥，其中優(yōu)選口服、肌注、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)用藥方式。

本發(fā)明化合物或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥。給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型。液體劑型可以是真溶液類、膠體類、微粒劑型、乳劑劑型、混旋劑型。其他劑型例如片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、栓劑、凍干粉針劑、包合物、填埋劑、貼劑、擦劑等。

本發(fā)明的藥物組合物中還可以含有常用的載體，這里所述可藥用載體包括但不局限于：離子交換劑，氧化鋁，硬脂酸鋁，卵磷脂，血清蛋白如人血清蛋白，緩沖物質(zhì)如磷酸鹽，甘油，山梨酯，山梨酸鉀，飽和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，鹽或電解質(zhì)，如硫酸魚精蛋白，磷酸氫二鈉，磷酸氫鉀，氯化鈉，鋅鹽，膠態(tài)氧化硅，三硅酸鎂，聚乙烯吡咯烷酮，纖維素物質(zhì)，聚乙二醇，羧甲基纖維素鈉，聚丙烯酸酯，蜂蠟，羊毛酯等。載體在藥物組合物中的含量可以是1重量％-98重量％，通常大約占到80重量％。為方便起見，局部麻醉劑，防腐劑，緩沖劑等可直接溶于載體中。

口服片劑和膠囊可以含有賦形劑如粘合劑，如糖漿，阿拉伯膠，山梨醇，黃 芪膠，或聚乙烯吡咯烷酮，填充劑，如乳糖，蔗糖，玉米淀粉，磷酸鈣，山梨醇，氨基乙酸，潤(rùn)滑劑，如硬脂酸鎂，滑石，聚乙二醇，硅土，崩解劑，如馬鈴薯淀粉，或可接受的增潤(rùn)劑，如月桂醇鈉硫酸鹽。片劑可以用制藥學(xué)上公知的方法包衣。

口服液可以制成水和油的懸浮液，溶液，乳濁液，糖漿，也可以制成干品，用前補(bǔ)充水或其它合適的媒質(zhì)。這種液體制劑可以包含常規(guī)的添加劑，如懸浮劑，山梨醇，纖維素甲醚，葡萄糖糖漿，凝膠，羥乙基纖維素，羧甲基纖維素，硬脂酸鋁凝膠，氫化的食用油脂，乳化劑，如卵磷脂，山梨聚糖單油酸鹽，阿拉伯樹膠；或非水載體(可能包含可食用油)，如杏仁油，油脂如甘油，乙二醇，或乙醇；防腐劑，如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或丙酯，山梨酸。如需要可添加調(diào)味劑或著色劑。

栓劑可包含常規(guī)的栓劑基質(zhì)，如可可黃油或其它甘油酯。

對(duì)于胃腸外投藥，液態(tài)劑型通常由化合物和一種消毒的載體制成。載體首選水。依照所選載體和藥物濃度的不同，化合物既可溶于載體中也可制成懸浮溶液，在制成注射用溶液時(shí)先將化合物溶于水中，過濾消毒后裝入封口瓶或安瓿中。

必須認(rèn)識(shí)到，通式I化合物的最佳給藥劑量和間隔是由化合物性質(zhì)和諸如給藥的形式、路徑和不為以及所治療的特定哺乳動(dòng)物等外部條件決定的，而這一最佳給藥劑量可用常規(guī)的技術(shù)確定。同時(shí)也必須認(rèn)識(shí)到，最佳的療程，即同時(shí)I化合物在額定的時(shí)間內(nèi)每日的劑量，可用本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法確定。

附圖說明

圖1是中間體10a在水/丙酮體系中進(jìn)行單晶培養(yǎng)，得到了兩種構(gòu)型的外消旋體晶體，這是其中的(2R，3R)構(gòu)型的ORTEP圖。

圖2是中間體10a在水/丙酮體系中進(jìn)行單晶培養(yǎng)，得到了兩種構(gòu)型的外消旋體晶體，這是其中的(2S，3S)構(gòu)型的ORTEP圖。

圖3是計(jì)算所得的化合物TM-05中(1R，2S)、(1S，2R)構(gòu)型的ECD譜圖與實(shí)測(cè)的化合物TM-05-a與TM-05-c的ECD譜圖，其中(1R，2S)構(gòu)型與TM-05-a、(1S，2R)與TM-05-c表現(xiàn)出了很好的一致性。

圖4是計(jì)算所得的化合物TM-05中(1R，2R)、(1S，2S)構(gòu)型的ECD譜圖與實(shí)測(cè)的化合物TM-05-b與TM-05-d的ECD譜圖，其中(1R，2R)構(gòu)型與TM-05-b、(1S，2S)與TM-05-d表現(xiàn)出了很好的一致性。

圖5是TM-05-c和TM-05-d的原子編號(hào)及其在CDCl₃中的一維核磁氫譜數(shù)據(jù)峰歸屬。

圖6是對(duì)化合物TM-05-c不同化學(xué)位移處質(zhì)子氫照射后的1D NOESY譜圖。

圖7是對(duì)化合物TM-05-d不同化學(xué)位移處質(zhì)子氫照射后的1D NOESY譜圖。

圖8是化合物TM-05-c的2D NOESY譜圖。

圖9是化合物TM-05-d的2D ROESY譜圖。

圖10是測(cè)定TM-05-a光學(xué)純度的高效液相色譜圖，分析條件為I 2000 RSP(250mm×4.6mm，5μ)，甲醇∶(50μM CH₃COONH₄aqueous solution)＝80％∶20％，flow＝0.8mL，T＝20℃，λ＝225nm.

圖11是測(cè)定TM-05-c光學(xué)純度的高效液相色譜圖，分析條件為I 2000 RSP(250×4.6mm，5μ)，甲醇∶(50μM CH₃COONH₄aqueous solution)＝80％∶20％，flow＝0.8mL，T＝20℃，λ＝225nm.

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

質(zhì)譜由Micromass ZabSpec高分辨質(zhì)譜儀(分辨率1000)測(cè)定。¹H NMR由JNM-ECA-400超導(dǎo)NMR儀測(cè)定，工作頻率¹H NMR 400MHz，¹³C NMR 100MHz。

實(shí)施例1：(1R，2S)-1-苯基-2-(1-萘基)-1-[2-(7-溴-3-甲氧基)萘基]-4-(N，N-二甲氨基)-2-丁醇與(1R，2R)-1-苯基-2-(1-萘基)-1-[2-(7-溴-3-甲氧基)萘基]-4-(N，N-二甲氨基)-2-丁醇的制備

第1步：

1L的三頸瓶中，加入3-羥基-2-萘酸(50g，0.27mol)以及600mL冰醋酸，攪拌溶解。將溴素(34mL，0.67mol)用100mL冰醋酸稀釋，慢慢滴加進(jìn)反應(yīng)液，保持溫度20-30℃。滴加完畢，升溫至120℃，回流3h。停止加熱，自然冷卻至室溫，將反應(yīng)液倒入到3000mL冰水中，析出大量黃色固體，過濾，濾餅用水洗，烘箱干燥，得中間體2固體84g，收率91％。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ＝3.63(br.s)，7.84(dd，J＝9.2，2.0Hz，1H)，7.98(d，J＝9.0Hz，1H)，8.41(d，J＝2.0Hz，1H)，8.63(s，1H)ppm.HRMS(ESI)：[M-H]^-，實(shí)測(cè)值344.859 C₁₁H₅Br₂O₃^-計(jì)算值344.8585。

第2步：

2L的三頸瓶中，加入中間體2(70g，202mmol)以及800mL冰醋酸，攪拌均勻，再依次加入錫粉(23.9g，202mmol)、250mL濃鹽酸，升溫至120℃，加熱回流3h。停止加熱，自然冷卻至室溫，將反應(yīng)液倒入到1000mL冰水中，析出大量黃色固體，過濾，濾餅用水洗，烘箱干燥，得中間體3固體50g，收率93％。 ¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ＝3.37(br.s)，7.37(s，1H)，7.64(dd，J＝9.0，2.0Hz，1H)，7.76(d，J＝9.0Hz，1H)，8.28(d，J＝2.0Hz，1H)，8.54(s，1H)ppm.HRMS(ESI)：[M-H]^-，實(shí)測(cè)值264.9502.C₁₁H₆BrO₃^-計(jì)算值264.9500。

第3步：

將中間體3(200g，750mmol)溶于2000ml丙酮，然后依次加入無水K₂CO₃(754g，5468mmol)與硫酸二甲酯(236g，1872mmol)，機(jī)械攪拌，加熱回流10h。停止加熱，自然冷卻至室溫，過濾除去K₂CO₃，用乙酸乙酯洗滌。母液先減壓旋出丙酮，然后加入乙酸乙酯與水萃取3次，合并有機(jī)層，用飽和食鹽水洗一次，用無水硫酸鈉干燥，過濾減壓旋蒸得中間體4白色粗品(190g，86％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ＝3.95(s，3H)，3.99(s，3H)，7.17(s，1H)，7.57(dd，J＝8.7，2.0Hz，1H)，7.61(d，J＝8.7Hz，1H)，7.96(d，J＝2.0Hz，1H)，8.18(s，1H)ppm.HRMS(ESI)：[M+Na]⁺，實(shí)測(cè)值316.9785.C₁₃H₁₁BrO₃Na⁺計(jì)算值316.9789。

第4步：

N₂保護(hù)，溶劑無需重蒸除水。將LiAlH₄(8.36g，220mmol)混懸于100ml THF中，攪拌20min，將中間體4(59g，200mmol)溶于500ml THF后逐滴加入，加完繼續(xù)攪拌8h，反應(yīng)完全后逐滴加入20ml水劇烈攪拌1小時(shí)，過濾后，母液加入無水硫酸鈉干燥，過濾加壓旋蒸得中間體5白色粗品(46g，78％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ＝3.97(s，3H)，4.82(s，2H)，7.09(s，1H)，7.50(dd，J＝8.8，2.0Hz，1H)，7.60(d，J＝8.8Hz，1H)，7.65(d，J＝2.0Hz，1H)，7.9(s，1H)ppm.GC-MS m/z：266(M⁺)。

第5步：

將中間體5(10g，37.4mmol)溶于150mL二氯甲烷中，緩慢加入戴斯馬丁氧化劑(24g，56.2mmol)，室溫?cái)嚢?小時(shí)，反應(yīng)完全后，加入50mL飽和Na₂S₂O₃溶液與50mL飽和NaHCO₃溶液淬滅，攪拌1小時(shí)后，溶液變澄清，水層用二氯甲烷萃取三遍，合并有機(jī)層用飽和食鹽水洗一遍后，無水硫酸鎂干燥，過濾加壓旋蒸后柱色譜(PE∶EA＝10∶1)得中間體6黃色固體(9.4g，95％)。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ＝4.01(s，3H)，7.58(s，1H)，7.72(dd，J＝8.8，2.0Hz，1H)，7.86(d，J＝8.8Hz，1H)，8.35(m，2H)，10.46(s，1H)ppm.GC-MS m/z：264(M⁺)。

第6步：

N₂保護(hù)，溶劑無需重蒸除水。將磷酰基乙酸三乙酯(6.78g，30.3mmol)溶于10mL THF中，攪拌，0℃下緩慢加入NaHMDS，加完室溫?cái)嚢?0min，然后滴加中間體6(5g，19mmol)的10mL THF溶液。室溫?cái)嚢?小時(shí)，反應(yīng)完全后，加約20mL水淬滅，水層用乙酸乙酯萃取三遍，合并有機(jī)層用飽和食鹽水洗一遍，無水硫酸鎂干燥，過濾加壓旋蒸后得中間體7淡黃色粗品(5.5g，87％)。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ＝1.28(t，J＝7.2Hz，3H)，3.98(s，3H)，4.22(q，J＝7.0Hz，2H)，6.78(d，J＝16.2Hz，1H)，7.47(s，1H)，7.62(dd，J＝8.7，2.0Hz，1H)，7.81(d，J＝8.7Hz，1H)，7.94(d，J＝16.2Hz，1H)，8.10(d，J＝2.0Hz，2H)，8.33(s，1H)ppm.HRMS(ESI)：[M+Na]⁺，實(shí)測(cè)值357.0096.C₁₆H₁₅BrO₃Na⁺計(jì)算值357.0102。

第7步：

N₂保護(hù)，溶劑無需重蒸除水。將中間體7(60g，180mmol)溶于400mL二氯甲烷中，在0℃下逐滴加入DIBAL-H(360ml，360mmol，1M于甲苯中)，室溫下反應(yīng)2小時(shí)，然后降溫至0℃，緩慢滴加300mL飽和酒石酸鉀鈉水溶液，劇烈攪拌4小時(shí)。反應(yīng)液過濾，用乙酸乙酯萃取水層3次，合并有機(jī)層用飽和食鹽水洗滌一次，無水硫酸鎂干燥，過濾加壓旋蒸后柱色譜(PE∶EA＝5∶1)得中間體8淡黃色固體(40g，76％)。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ＝3.92(s，3H)，4.18(m，2H)，4.96(t，J＝5.6Hz，1H)，6.53(dt，J＝5.0，16.0Hz，1H)，6.91(d，J＝16.0 Hz，1H)，7.36(s，1H)，7.51(dd，J＝2.0，8.7Hz，1H)，7.75(d，J＝8.7Hz，1H)，7.99(s，1H)，8.08(d，J＝2.0Hz，1H)ppm。

第8步：

N₂保護(hù)，溶劑重蒸除水，保證中間體8在反應(yīng)液中的濃度為0.1M。在500mL三口瓶中加入30ml無水CH₂Cl₂，降溫至-20℃，趁熱加入5g現(xiàn)烘的粉末狀分子篩，攪拌10min后，加入Ti(OiPr)₄(2.43g，8.5mmol)。攪拌5min后加入(+)-DIPT(2.4g，10.2mmol，先溶于10mL無水二氯甲烷中)，攪拌30min后，緩慢加入中間體8(5g，17mmol，先溶于120mL無水二氯甲烷中)，攪拌40min后，加入無水叔丁醇過氧化氫(5.5M in nonane，12.4ml，68.3mmol)后，繼續(xù)攪拌2h反應(yīng)完全。過濾除去分子篩，在-20℃冷卻下，加入1M NaOH溶液34mL，攪拌1h后，乙酸乙酯萃取水層3次，用飽和食鹽水洗滌有機(jī)層至中性。有機(jī)層減壓旋蒸用中性氧化鋁拌樣過硅膠柱色譜(PE∶EA＝5∶1)得中間體9白色固體(87％e.e.，3.1g，60％)。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ＝3.10(m，1H)，3.58(m，1H)，3.80(ddd，J＝2.8，5.6，12.6Hz，1H)，3.95(s，3H)，4.16(d，J＝1.7Hz，1H)，5.05(t，J＝5.9Hz，1H)，7.40(s，1H)，7.56(dd，J＝2.0，8.8Hz，1H)，7.63(s，1H)，7.79(d，J＝8.8Hz，1H)，8.11(d，J＝2.0Hz，1H)ppm.HRMS(ESI)：[2M+Na]⁺，實(shí)測(cè)值640.9968.C₂₈H₂₆Br₂O₆Na⁺計(jì)算值640.9973。測(cè)定e.e.值的分析條件：HPLC[Chiralpak IC(250×4.6mm，5μ)，IPA/hexane＝30％∶70％，flow＝1.0mL，T＝20℃，λ＝225nm]。

第9步：

N₂保護(hù)，無水操作，保證PhMgBr在反應(yīng)液中的濃度為1M。-20℃，于250ml四口瓶中加入現(xiàn)純化的CuI(6g，32mmol)與34mL THF，攪拌5min后，用注射器加入PhMgBr(22mL，3M于Et₂O中)，機(jī)械攪拌1h后，加入中間體9a(2g，6.5mmol)的10mL的THF溶液，機(jī)械攪拌反應(yīng)3h。反應(yīng)完全后，用50mL飽和氯化銨溶液淬滅，同時(shí)自然升至室溫，攪拌30min后過濾，母液分層，水層用乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)層用飽和食鹽水洗滌一次后，無水硫酸鎂干燥，過濾減壓旋蒸柱色譜(PE∶EA＝5∶1)得中間體10a白色固體(1.5g，60％)。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ＝3.20(m，1H)，3.32(m，1H)，3.83(s，3H)，4.38(m，1H)，4.53(d，J＝9.5Hz，1H)，7.10-7.33(m，6H)，7.50(dd，J＝2.0，8.7Hz，1H)，7.71(d，J＝9.0Hz，1H)，8.08(d，J＝2.0Hz，1H)，8.12(s，1H)ppm.HRMS(ESI)：[M+Na]⁺，實(shí)測(cè)值409.0425.C₂₀H₁₉BrO₃Na⁺計(jì)算值409.0415。

中間體10a在水/丙酮體系中進(jìn)行單晶培養(yǎng)，得到了丙酮與鄰二醇基團(tuán)縮合物的單晶(CCDC-1417940和CCDC-1417941)，雖然得到的單晶均為中間體10a中(2R，3R)(圖1)和(2S，3S)(圖2)這兩種構(gòu)型的外消旋體，但是確認(rèn)了我們化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

由于中間體10a含有鄰二醇羥基結(jié)構(gòu)，因此我們測(cè)定了Mo₂(OAc)₄試劑誘導(dǎo)下的圓二色譜，帶IV(310nm附近)呈明顯的負(fù)cotton效應(yīng)，帶II不明顯，而判斷主要依據(jù)帶IV，總體判斷誘導(dǎo)cotton效應(yīng)為負(fù)。負(fù)cotton效應(yīng)就表明(OH)-C-C-(OH)的二面扭角為負(fù)，再考慮到立體位阻因素，結(jié)構(gòu)中二芳基大基團(tuán) 與Mo₂(OAc)₄試劑基團(tuán)離得越遠(yuǎn)越有利，因此得到了2位碳原子為2R的構(gòu)型。又由于PhMgBr在對(duì)環(huán)氧結(jié)構(gòu)開環(huán)的時(shí)候，會(huì)導(dǎo)致生成的羥基與苯環(huán)位于相離的兩側(cè)，因此可以知道3位碳為3R構(gòu)型，從而中間體10a為(2R，3R)。

第10步：

將中間體10a(4g，10.3mmol)溶于100mL二氯甲烷中，加入NaIO₄(33g，20％質(zhì)量分?jǐn)?shù)分散于硅膠中)，室溫?cái)嚢?h，反應(yīng)完全后，過濾除去硅膠，母液無水硫酸鎂干燥后，過濾旋干直接投下一步。

第11步：

N₂保護(hù)，溶劑重蒸除水。0℃，將上步中生成的中間體11a溶于22mL無水THF中，滴加新制的萘基溴化鎂(22mL，2M于THF)，攪拌2h。反應(yīng)完全后，加入飽和氯化銨溶液50mL淬滅反應(yīng)。過濾，分層，乙酸乙酯萃取水層三次，合并有機(jī)層用飽和食鹽水洗滌一次后，無水硫酸鎂干燥，過濾減壓旋蒸柱色譜(PE∶EA＝10∶1)得中間體12a白色固體(3.1g，兩步收率62％)。

第12步：

將中間體12a(6.65g，13.8mmol)溶于100mL二氯甲烷中，緩慢加入DMP(9g，21mmol)，室溫?cái)嚢?h，反應(yīng)完全后，加入30mL飽和Na₂S₂O₃溶液與30mL飽和NaHCO₃溶液淬滅，攪拌1小時(shí)后，溶液變澄清，水層用二氯甲烷萃取三遍，合并有機(jī)層用飽和食鹽水洗一遍后，無水硫酸鎂干燥，過濾加壓旋蒸后得中間體13a白色粗品(6.3g，95％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ＝3.80(s，3H)，6.33(s，1H)，7.10(s，1H)，7.19(s，1H)，7.33-7.60(m，10H)，7.78(d，J＝1.7Hz，1H)，7.84(d，J＝8.1Hz，1H)，7.94(d，J＝8.1Hz，1H)，8.05(d，J＝7.3Hz，1H)，8.58(d，J＝8.4Hz，1H).HRMS(ESI)：[M+Na]⁺，實(shí)測(cè)值505.0616.C₂₉H₂₁BrO₂Na⁺計(jì)算值505.0602。

第13步：

將中間體13a(2g，4.15mmol)溶于盡可能少的無水THF(不多于5ml)中，然后將其倒入到現(xiàn)制的烯丙基鋅溴(83mmol)中，塞緊塞子，搖晃5min后，反應(yīng)完全。加入10ml飽和氯化銨溶液淬滅反應(yīng)，過濾，母液分層，乙酸乙酯萃取水層3次，合并有機(jī)層，飽和食鹽水洗一次后，無水硫酸鎂干燥，過濾減壓旋蒸柱色譜(PE∶EA＝20∶1)得中間體14a白色固體(1.3g，60％)。

第14步：

將中間體14a(3.5g，6.7mmol)，溶于THF∶H2O∶丙酮＝1∶1∶1(共60mL)的混合溶劑中，再加入NMO(3.9g，33.5mmol)，在冰浴下加入4％的OsO₄水溶液(0.68mL，0.1mmol)，室溫下攪拌8h，反應(yīng)完全。加入10mL飽和Na₂S₂O₃溶液淬滅反應(yīng)，分層，乙酸乙酯萃取水層3次，合并有機(jī)層，飽和食鹽水洗一次后，無水硫酸鎂干燥，過濾減壓旋蒸后直接投入下一步。

第15步：

將上一步得到的中間體15a溶于50mL二氯甲烷中，加入NaIO₄(25g，20％質(zhì)量分?jǐn)?shù)分散于硅膠中)，室溫?cái)嚢?h，反應(yīng)完全后，過濾除去硅膠，母液無水硫酸鎂干燥后，過濾旋干直接投下一步。

第16步：

將上一步的中間體16a溶于30mL甲醇中，冰浴下緩慢加入NaBH₄(0.3g，8mmol)，室溫下攪拌3h。反應(yīng)完全后，直接過濾，無水硫酸鎂干燥，過濾減壓 旋蒸后柱色譜(PE∶EA＝10∶1)得中間體17a白色固體(1.8g，三步產(chǎn)率50％)。ESI-MS m/z：526(M⁺)。

第17步：

將中間體17a(2g，3.8mmol)溶于76mL吡啶中，加入DMAP(0.93g，7.6mmol)，在冰浴下緩慢加入TsCl(6.5g，38mmol)，室溫?cái)嚢?6h。反應(yīng)完全后，加入10mL水淬滅反應(yīng)，旋蒸除去大部分吡啶后，用乙酸乙酯與水萃取，水層萃取3次，合并有機(jī)層，飽和食鹽水洗一次后，無水硫酸鎂干燥，過濾減壓旋蒸后柱色譜(PE∶EA＝10∶1)得中間體18a白色固體(1.5g，58％)。ESI-MS m/z：698(M+NH₄⁺)。

第18步：

將中間體18a(1g，1.5mmol)溶于120mL二甲胺的THF溶液中，與高壓反應(yīng)釜內(nèi)，45℃攪拌10h。反應(yīng)完全后，直接減壓旋蒸后柱色譜(純CH₂Cl₂為洗脫劑)，分別得到白色固體(1R，2S)-1-苯基-2-(1-萘基)-1-[2-(7-溴-3-甲氧基)萘基]-4-(N，N-二甲氨基)-2-丁醇(TM-05-a，Rf＝0.3，CH2Cl2/MeOH＝50∶1，87％e.e.)與(1R，2R)-1-苯基-2-(1-萘基)-1-[2-(7-溴-3-甲氧基)萘基]-4-(N，N-二甲氨基)-2-丁醇(TM-05-b，Rf＝0.25，CH2Cl2/MeOH＝50∶1，87％e.e.)。

實(shí)施例2：(1S，2R)-1-苯基-2-(1-萘基)-1-[2-(7-溴-3-甲氧基)萘基]-4-(N，N-二甲氨基)-2-丁醇與(1S，2S)-1-苯基-2-(1-萘基)-1-[2-(7-溴-3-甲氧基)萘基]-4-(N，N-二甲氨基)-2-丁醇的制備

采用與實(shí)施例1相同的操作步驟，只是在第8步中，將所采用的手性配體由(+)-DIPT改為(-)-DIPT，經(jīng)過相同的操作后，第8步的產(chǎn)物為中間體9b白色固體，97％e.e.，測(cè)定ee值的分析條件：HPLC[Chiralpak IC(250×4.6mm，5μ)，IPA/hexane＝30％∶70％，flow＝1.0mL，T＝20℃，λ＝225nm]。

之后，經(jīng)過相同的操作步驟，在第18步反應(yīng)完成后，通過柱色譜分離(展開劑為純CH₂Cl₂)，分別得到白色固體(1S，2R)-1-苯基-2-(1-萘基)-1-[2-(7-溴-3-甲氧基)萘基]-4-(N，N-二甲氨基)-2-丁醇(TM-05-c，Rf＝0.3，CH2Cl2/MeOH＝50∶1，97％e.e.)與(1S，2S)-1-苯基-2-(1-萘基)-1-[2-(7-溴-3-甲氧基)萘基]-4-(N，N-二甲氨基)-2-丁醇(TM-05-d，Rf＝0.25，CH2Cl2/MeOH＝50∶1，97％e.e.)。TM-05-a與TM-05-c為對(duì)映異構(gòu)體，其手性柱分析條件為：I 2000 RSP(250×4.6mm，5μ)，MeOH∶(50μM CH₃COONH₄aqueous solution)＝80％∶20％，flow＝0.8mL，T＝20℃，λ＝225nm，t_R＝6.3min(TM-05-a)，8.3min(TM-05-c)。

我們通過比較理論計(jì)算和實(shí)際測(cè)得的電子圓二色譜(ECD)的方法，確定了TM-05-a至TM-05-d四種異構(gòu)體各自的絕對(duì)構(gòu)型。在MMFF94力場(chǎng)中對(duì)終產(chǎn)物的(1R，2S)和(1R，2R)構(gòu)型進(jìn)行構(gòu)象搜索。在5-kJ/mol的范圍內(nèi)，對(duì)于(1R，2S)構(gòu)型，得到了8種優(yōu)勢(shì)構(gòu)象，對(duì)于(1R，2R)構(gòu)型，得到了6種優(yōu)勢(shì)構(gòu)象。采用在甲醇中B3LYP/6-31g(d)基組水平的構(gòu)象，計(jì)算在B3LYP/6-31g(d)基組水平的 60個(gè)激發(fā)態(tài)，峰展寬為0.45eV，得到各個(gè)構(gòu)象的ECD圖譜。經(jīng)Boltzmann分布權(quán)重加合主要構(gòu)象的圖譜，得到(1R，2S)與(1R，2R)的ECD圖譜。而(1S，2R)與(1S，2S)的ECD圖譜會(huì)與他們的對(duì)映體對(duì)稱，因此可以通過圖形的對(duì)稱操作得到。

我們也測(cè)定了TM-05-a至TM-05-d四種異構(gòu)體在甲醇溶液中的200-400nm范圍的實(shí)際圓二色譜圖、1H NMR(圖5)、1D NOESY(圖6、圖7)、2D(NOESY/ROESY)(圖8、圖9)和HLPC(圖10、圖11)。通過比較理論計(jì)算和實(shí)際測(cè)得的電子圓二色譜(圖3、圖4)及其他譜圖數(shù)據(jù)，我們可以很容易的看出TM-05-a為(1R，2S)，TM-05-b為(1R，2R)，TM-05-c為(1S，2R)，TM-05-d為(1S，2S)。光學(xué)異構(gòu)體的ee值數(shù)據(jù)見圖10、圖11。

實(shí)施例3：光學(xué)異構(gòu)體1-苯基-2-(1-萘基)-1-[2-(3-甲氧基)萘基]-4-(N，N-二甲氨基)-2-丁醇的制備

采用與實(shí)施例1相同的操作步驟，得到白色固體1和2。

實(shí)施例4：光學(xué)異構(gòu)體1-(4-氯苯基)-2-(1-萘基)-1-[2-(7-溴-3-甲氧基)萘基]-4-(N，N-二甲氨基)-2-丁醇的制備

采用與實(shí)施例1相同的操作步驟，得到白色固體3和4。

實(shí)施例5：光學(xué)異構(gòu)體1-(4-氯苯基)-2-(1-萘基)-1-[2-(3-甲氧基)萘基]-4-(N，N-二甲氨基)-2-丁醇5、6的制備。

采用與實(shí)施例1相同的操作步驟，得到白色固體5和6。

實(shí)施例6光學(xué)異構(gòu)體1-(4-氯苯基)-2-(3-溴苯基)-1-[2-(7-溴-3-甲氧基)萘基]-4-(N，N-二甲氨基)-2-丁醇7、8的制備

采用與實(shí)施例1相同的操作步驟，得到白色固體7和8。

實(shí)施例7：光學(xué)異構(gòu)體1-苯基-2-(1-萘)-1-[2-(7-溴-3-甲氧基)萘]-4-(N，N-二甲氨基)-2-丁醇9、10的制備

采用與實(shí)施例1相同的操作步驟，得到白色固體9和10。

實(shí)施例8：光學(xué)異構(gòu)體1-(4-氯苯基)-2-(1-萘)-1-[2-(3-甲氧基)萘]-4-(N，N-二甲氨基)-2-丁醇鹽酸鹽11的制備

采用與實(shí)施例1相同的操作步驟，得到白色固體11。

實(shí)施例9：應(yīng)用Microplate Alamar Blue Assay(MABA)法測(cè)定化合物對(duì)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的最低抑菌濃度(MIC)。

方法：無菌96孔板(Falcon3072；Becton Dickinson，Lincoln Park，N.J.)，實(shí)驗(yàn)化合物以二甲基亞砜溶解，制成濃度為5mg/ml的初溶液，最高濃度孔加入199μl 7H9培養(yǎng)基，1μl化合物初溶液，混合均勻后，向其余各孔依次2 倍稀釋，化合物終濃度為：12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.2、0.1、0.05、0.025、、0.0125μg/ml。選取結(jié)核分枝桿菌H37RV培養(yǎng)2～3周的培養(yǎng)物制成菌懸液，接種到含0.05％吐溫80、10％ADC的7H9培養(yǎng)基中，37℃靜止培養(yǎng)1～2周，生長(zhǎng)至濁度為McFarland 1(相當(dāng)于107CFU/ml)時(shí)，1∶20稀釋后，加入各孔100μl，菌液的終濃度為106CFU/ml。每板上均設(shè)2個(gè)不含抗菌藥的生長(zhǎng)對(duì)照孔，96孔板于37℃孵育。7天后加入生長(zhǎng)對(duì)照孔20μl 10×Alamar Blue(Setotec公司產(chǎn)品)和5％Tween8050μl的混合液，37孵育24小時(shí)，如果顏色從藍(lán)色變?yōu)榉凵?，則在各實(shí)驗(yàn)藥物的孔內(nèi)加入上述量的Alamar Blue和Tween80混合液，37℃孵育24小時(shí)記錄各孔的顏色，MIC定義為阻止顏色變化(從藍(lán)色變?yōu)榉奂t色)的最低藥物濃度。