本發(fā)明屬于熒光染料領域，具體涉及一種紅色熒光和大斯托克斯位移的新型PRODAN類熒光染料及其合成方法。

背景技術：

熒光檢測具有高靈敏度和高選擇性的特點，近20年來在化學、環(huán)境科學和生物醫(yī)藥領域都得到迅猛發(fā)展，已成為生物和醫(yī)學研究中微環(huán)境檢測的首選工具。與放射性物質(zhì)示蹤方法相比，熒光探針對生物體和環(huán)境更加友好。熒光染料的開發(fā)與應用在生物技術、細胞成像、藥物代謝、DNA測序和基因分析等領域都發(fā)揮重要作用。

PRODAN類熒光染料是以萘為母體的熒光染料，最大吸收在350nm左右，最大發(fā)射在450-490nm左右，具有光穩(wěn)定性好，摩爾消光系數(shù)高，光量子產(chǎn)率高，生物相容性好，樣品背景干擾相對較少，具有較好的雙光子吸收性能等優(yōu)點，已成為生物和醫(yī)藥成像領域應用廣泛的熒光團之一。但PRODAN類熒光染料的發(fā)射波長較短，商品化的PRODAN染料發(fā)射波長多小于500nm，斯托克斯位移也大多在100nm左右。提高染料的斯托克斯位移能夠最大限度地降低自淬滅作用的干擾，從而提高生物成像應用中的信噪比，并且與常見的短斯托克斯位移的熒光團協(xié)同作用可以對生物體內(nèi)不同靶標進行高靈敏度多色分析。因此開發(fā)具有實際應用價值的新型PRODAN熒光染料成為當前的迫切需要。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種紅色熒光和大斯托克斯位移的新型PRODAN類熒光染料及其合成方法，該類熒光染料的熒光發(fā)射光譜位于近紅外區(qū)域，并且具有很大的斯托克斯位移；其合成方法具有原料廉價易得，合成步驟簡單，反應物易純化，反應收率高等優(yōu)點。

本發(fā)明提供了一種紅色熒光和大斯托克斯位移的新型PRODAN類熒光染料，該熒光染料具有如下結構：

其中，R₁為C_1-20烷基、取代烷基、環(huán)烷基、取代環(huán)烷基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、羥基、氰基或烷氧基中的一種；R₂、R₃、R₄、R₅分別為H、C_1-20烷基、取代烷基、環(huán)烷基、取代環(huán)烷基、芳基、取代芳基、(CH₂)_nOH、(CH₂)_nCOOM、(CH₂)_nSO₃M、雜芳基或取代雜芳基中的一種或二種以上；上述n為0-12的整數(shù)；M為H、K、Na、Li、NH₄、NH₃R₆、NH₂(R₆)₂、NH(R₆)₃或 N(R₆)₄中的一種或二種以上；R₆為H、C_1-20烷基中的一種或二種以上。

本發(fā)明提供了上述熒光染料的合成方法，該染料的合成路線如下：

具體步驟如下：

(1)2-?；?6-羥基萘的合成

2-?；?6-甲氧基萘溶解于冰乙酸中，向其中加入無機酸，120-140℃回流10-14h。反應結束后，向其中滴加1M至飽和的無機堿水溶液中和溶劑中的酸至PH為6-8，然后用乙酸乙酯萃取3-5次，合并有機相，硅膠柱分離，洗脫劑為純CH₂Cl₂，得到產(chǎn)物2-?；?6-羥基萘的合成。

(2)2-酰基-6-氨基萘的合成

2-?；?6-羥基萘溶于DMA中，加入NaOH，室溫攪拌0.5-3小時，加入2-溴異丁酰胺，室溫攪拌6-14小時，第二次加入NaOH，30-70℃攪拌3-6小時。反應降至室溫，用稀釋，CH₂Cl₂萃取3-5次，合并有機相，旋干后溶于乙醇，加入濃HCl，80-120℃回流8-14小時。反應結束后，低壓除去乙醇，用1M至飽和的無機堿水溶液中和HCl至溶液PH為6-8，用乙酸乙酯萃取3-5次，合并有機相，旋干，硅膠柱分離，洗脫劑為石油醚：乙酸乙酯＝100:10-100:60，得到產(chǎn)物2-酰基-6-氨基萘。

(3)2-?；?6-乙酰胺基-5-硝基萘的合成

將2-乙?；?6-氨基萘溶于乙酸酐中，攪拌5-10分鐘后，向其中加入冰乙酸，冰浴條件下緩慢加入濃硝酸，室溫反應3-5小時。反應結束后，用CH₂Cl₂萃取3-5次，合并有機相，旋干后過硅膠柱分離，洗脫劑為氯仿：乙酸乙酯＝20:1-5:1。得到產(chǎn)物2-酰基-6-乙酰胺基-5-硝基萘。

(4)2-?；?6-氨基-5-硝基萘的合成

2-?；?6-乙酰胺基-5-硝基萘溶于甲醇中，向其中加入濃硫酸，80-120℃回流反應6-10小時。反應結束后，用冰水淬滅反應，過濾得到2-?；?6-氨基-5-硝基萘固體。

(5)2-?；?5,6-二氨基萘的合成

2-?；?6-氨基-5-硝基萘溶解于甲醇中，然后向其中加入催化劑，冰浴攪拌 1-3小時，向其中緩慢分批次加入硼氫化鈉，冰浴反應0.5-2小時。反應結束后，旋干，所得固體用CH₂Cl₂溶解，過濾，濾液旋干得2-?；?5,6-二氨基萘固體。

(6)2-?；?5-取代氨基-6-取代氨基萘的合成

以乙腈為溶劑，加入催化劑4-二甲氨基吡啶、2-?；?5,6-二氨基萘、鹵代物進行縮合，反應溫度為50-80℃，反應時間為6-12h，反應結束后旋干溶劑，硅膠柱分離，洗脫劑為石油醚：乙酸乙酯＝100:1-10:1，得到熒光染料。

所述步驟(1)中，各試劑用量比為1g 2-?；?6-甲氧基萘溶于10-40mL冰乙酸，加入5-40mL HCl或HBr；所述硅膠柱分離，洗脫劑為石油醚：乙酸乙酯＝100:4-100:40。

所述步驟(2)中，各試劑用量比為1g 2-?；?6-羥基萘溶于5-30mL DMA中，第一次加入0.5-1g NaOH；2-溴異丁酰胺3-4g，第二次加入NaOH2.5-3g，用250mL水稀釋旋干后溶于10-40mL乙醇，加入濃HCl5-20mL；所述硅膠柱分離，洗脫劑為石油醚：乙酸乙酯＝100:10-100:60。

所述步驟(3)中，各試劑用量比為1g 2-?；?6-氨基萘溶于20-30mL乙酸酐，加入15-30mL冰乙酸，2-3mL濃硝酸；所述硅膠柱分離，洗脫劑為氯仿：乙酸乙酯＝20:1-5:1。

所述步驟(4)中，各試劑用量比為1g 2-?；?6-乙酰胺基-5-硝基萘溶于15-30mL甲醇加入3-5mL濃硫酸，。

所述步驟(5)中，各試劑用量比為1g 2-?；?6-氨基-5-硝基萘200-300mL甲醇400-900mg催化劑，向其中緩慢分批次加入硼氫化鈉450-600mg，所得固體用CH₂Cl₂溶解。

所述步驟(6)中，各試劑用量比為50-200mL乙腈2-6mol催化劑4-二甲氨基吡啶1mol2-?；?5,6-二氨基萘1-6mol鹵代物。步驟(6)中所述的鹵代物通式為R₇-Cl，R₇為C_1-20烷基、取代烷基、環(huán)烷基、取代環(huán)烷基、芳基、取代芳基、(CH₂)_nOH、(CH₂)_nCOOM、(CH₂)_nSO₃M、雜芳基、取代雜芳基中的一種或二種以上；n為0-12的整數(shù)；M為H、K、Na、Li、NH₄、NH₃R₆、NH₂(R₆)₂、NH(R₆)₃、N(R₆)₄中的一種或二種以上；R₆為H、C_1-20烷基中的一種或二種以上。

所述步驟1和步驟2中使用的無機堿為Na₂CO₃、NaHCO₃、NaOH、K₂CO₃、KHCO₃、KOH中的至少一種。步驟1中使用的無機酸為HCl、HBr中的至少一種。步驟5中使用的催化劑為Pt/C、雷尼鎳、鐵粉、氯化亞錫中的至少一種。上述的紅色熒光和大斯托克斯位移的PRODAN類熒光染料在制備發(fā)光材料、制

備生物熒光探針或生物熒光成像中可以應用。

本發(fā)明提供的新型紅色熒光和大斯托克斯位移的新型PRODAN類熒光染料應用于發(fā)光材料、生物熒光探針、生物熒光成像等領域。

本發(fā)明提供的新型紅色熒光和大斯托克斯位移的新型PRODAN類熒光染料的熒光發(fā)射波譜在582nm，同時具有很大的斯托克斯位移(約200nm)其合成方法具有原料廉價易得，合成步驟簡單，反應物易純化，反應收率高.

附圖說明

圖1實施例1制備得到的產(chǎn)品的核磁氫譜；

圖2實施例1制備得到的產(chǎn)品在DMSO中的吸收光譜和熒光發(fā)射光譜的歸一化譜圖；

圖3實施例2中不同溶劑中實施例1制備得到的產(chǎn)品的吸收光譜的歸一化譜圖；

圖4實施例2中不同溶劑中實施例1制備得到的產(chǎn)品的熒光發(fā)射光譜的歸一化譜圖；

具體實施方式

下面的實施例將對本發(fā)明予以進一步的說明，但并不因此而限制本發(fā)明。

實施例1：

(1)2-乙?；?6-羥基萘的合成

5g 2-乙酰基-6-甲氧基萘溶解于50mL冰乙酸中，向其中加入15mL HBr，120℃回流12h。反應結束后，用飽和NaHCO₃水溶液中和溶劑中的酸至PH為7，然后用乙酸乙酯萃取3次，合并有機相，常壓室溫過硅膠柱，洗脫劑為純CH₂Cl₂，旋干收集到的洗脫劑，得到產(chǎn)物為白色固體。

(2)2-乙?；?6-氨基萘的合成

3.3g 2-乙酰基-6-羥基萘溶于30mL DMA中，加入2.1g NaOH，室溫攪拌1小時，加入9g 2-溴異丁酰胺，室溫攪拌12小時，在加入6g NaOH，50℃攪拌5小時。反應降至室溫，用250mL水稀釋，CH₂Cl₂萃取3次，合并有機相，旋干后溶于80mL乙醇，加入50mL濃HCl，90℃回流12小時。反應結束后，低壓除去乙醇，飽和NaOH水溶液中和HCl至PH為7，用乙酸乙酯萃取3次，合并有機相，旋干，常壓室溫過硅膠柱，洗脫劑為石油醚：乙酸乙酯＝100:20，旋干收集到含產(chǎn)物組分的洗脫劑，得到產(chǎn)物為淡黃色固體。

(3)2-乙?；?6-乙酰胺基萘的合成

將2.1g 2-乙酰基-6-氨基萘溶于60mL乙酸酐中，攪拌5分鐘后，向其中加入40mL冰乙酸，冰浴條件下緩慢加入6.5mL濃硝酸，室溫反應3小時。反應結束后，用CH₂Cl₂萃取3次，合并有機相，旋干后常壓室溫過硅膠柱，洗脫劑為氯仿：乙酸乙酯＝5:1。旋干收集到含產(chǎn)物組分的洗脫劑，得到產(chǎn)物為淡黃色固體。

(4)2-乙?；?6-乙酰胺基-5-硝基萘的合成

1.5g 2-乙?；?6-乙酰胺基萘溶于50mL甲醇中，向其中加入9mL濃硫酸，80℃回流反應7小時。反應結束后，用20mL冰水淬滅反應，反應過程中析出固體，過濾得到產(chǎn)物為黃色固體。

(5)2-乙?；?5,6-二氨基萘的合成

350mg 2-乙?；?6-乙酰胺基-5-硝基萘用于90mL甲醇中，向其中加入200mg 10％的鈀碳，冰浴攪拌1小時，向其中緩慢分3批次加入180mg硼氫化鈉，每次加入60mg，反應半小時。反應結束后，旋干，用300mL CH₂Cl₂溶解，過濾除去鈀碳，濾液旋干得綠色固體。所合成熒光團的氫譜數(shù)據(jù)如下：¹H NMR(CD₃CN,400MHz)δ8.34(s,1H),7.96(d,1H),7.73(d,1H),7.43(d,1H),7.07(d,1H),3.77(s,4H),2.68(s,3H)。核磁氫譜譜圖如圖1所示。

測試施例1中所制得的產(chǎn)品的濃度為10^-5M的DMSO溶液的吸收光譜和熒光發(fā)射光譜，歸一化后的譜圖如圖2所示該產(chǎn)品在DMSO中的最大吸收位于395nm，熒光發(fā)射位于582nm，斯托克斯位移為187nm。

實施例2：測定不同溶劑中2-乙?；?6-氨基萘衍生物染料的吸收光譜

將實施例1中制得的產(chǎn)品溶解于DMSO中，配置成濃度為0.002M的母液。移取20μL的母液至樣品瓶中，以不同溶劑配置成4mL溶液，測定不同溶劑中染料的吸收光譜，并作歸一化處理，所得譜圖如圖3所示。圖中曲線溶劑從左至右依次為：氯仿、二氯甲烷、甲苯、乙醚、二氧六環(huán)、丙酮、乙腈、THF、乙醇DMF、DMSO。從圖中可以看出，在極性溶劑中，染料的吸收發(fā)生較小的紅移。

實施例3：測定不同溶劑中2-乙酰基-6-氨基萘衍生物染料的熒光發(fā)射光譜

同實施例2中配置成不同溶劑中濃度為10^-5M的染料溶液，分別測試其熒光發(fā)射光譜，所得譜圖做歸一化處理，如圖4所示。圖中曲線從左至右溶劑依次為：二氧六環(huán)、乙酸乙酯、THF、乙醚、異丙醇、氯仿、二氯甲烷、丙酮、乙腈、DMF、DMSO。從圖中可以看出，在極性溶劑中，染料的熒光發(fā)射發(fā)生明顯的紅移。