本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種植物表型相關(guān)蛋白NRL2及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：水稻(OryzasativaL.)是世界上最重要的糧食作物之一，全球約一半以上的人口以稻米為主食，因此，培育具有高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的水稻品種對(duì)于水稻生產(chǎn)至關(guān)重要。株型的改良對(duì)于提高水稻產(chǎn)量及適應(yīng)性具有非常重要的作用。水稻株型由株高、分蘗數(shù)量、分蘗角度、葉片大小、葉片夾角、穗型等多個(gè)因素組成。水稻葉片是進(jìn)行光合作用的重要場(chǎng)所，而葉片的形態(tài)也是影響群體光能利用效率的關(guān)鍵因素之一，目前已經(jīng)分離了多個(gè)控制水稻葉型的基因。選育株型優(yōu)良的水稻品種的目的是使群體內(nèi)單位面積獲得最大的光合效率，降低病蟲(chóng)害的影響，最終達(dá)到提高水稻產(chǎn)量的效果。粒型和育性也是影響水稻產(chǎn)量的重要因素，目前已經(jīng)分離了多個(gè)控制水稻粒型和育性的基因，第一個(gè)被克隆的控制水稻粒寬基因是編碼一個(gè)具有泛素連接酶活性的未知功能蛋白，位于第2染色體的GW2基因，而第一個(gè)被克隆的控制水稻粒長(zhǎng)的QTL是一個(gè)位于第3染色體，編碼一個(gè)由232個(gè)氨基酸組成的跨膜蛋白的GS3基因，控制水稻育性的主要是由雌蕊和雄蕊控制，因此花藥的發(fā)育是控制對(duì)水稻育性的關(guān)鍵因素之一，目前已克隆多個(gè)控制花藥發(fā)育的基因。分離控制水稻葉片形態(tài)、花粉育性和籽型的相關(guān)基因，有助于通過(guò)分子育種手段培育新的高產(chǎn)、廣適的水稻新品種。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何增加水稻產(chǎn)量。為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明首先提供了一種植物表型相關(guān)的蛋白。本發(fā)明所提供的植物表型相關(guān)的蛋白，名稱為NRL2，來(lái)源于秈稻品系YIL18，為如下a1)或a2)或a3)：a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)；a2)在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的N端或/和C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；a3)將a1)或a2)所示的蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的與植物表型相關(guān)的蛋白質(zhì)；所述表型為葉型和/或粒型和/或育性。其中，序列表中序列2由987個(gè)氨基酸殘基組成。為了使a1)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的氨基 末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1、標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個(gè))RRRRRPoly-His2-10(通常為6個(gè))HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述a3)中的蛋白質(zhì)NRL2，所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過(guò)10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述a3)中的蛋白質(zhì)NRL2可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述a3)中的蛋白質(zhì)NRL2的編碼基因可通過(guò)將序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。編碼所述NRL2的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述編碼NRL2的核酸分子可為如下(b1)或(b2)或(b3)所示的DNA分子：(b1)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；(b2)與(b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼所述NRL2的DNA分子；(b3)在嚴(yán)格條件下與(b1)或(b2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述NRL2的DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。其中，序列表中序列1由2964個(gè)核苷酸組成，序列表中序列1的核苷酸編碼序列表中序列2所示的氨基酸序列。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點(diǎn)突變的方法，對(duì)本發(fā)明的編碼NRL2的核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過(guò)人工修飾的，具有與本發(fā)明分離得到的NRL2的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要編碼NRL2且與植物表型相關(guān)，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。這里使用的術(shù)語(yǔ)“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性?！巴恍浴卑ㄅc本發(fā)明的編碼序列表的序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有75％或 更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來(lái)評(píng)價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。含有所述編碼所述NRL2的核酸分子的表達(dá)盒、重組載體、重組微生物或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述表達(dá)盒包括啟動(dòng)子、編碼所述NRL2的核酸分子和終止子。所述啟動(dòng)子具體可為CaMV35S啟動(dòng)子；所述終止子具體可為NOS終止子。所述重組載體可為將所述NRL2的編碼基因(即序列表中序列1所示的DNA分子)通過(guò)含有所述NRL2的編碼基因的表達(dá)盒插入出發(fā)質(zhì)粒得到的重組質(zhì)粒。所述重組載體具體可為用序列表中序列1所示的DNA分子替換pCAMBIA3301的SmaI和KpnI識(shí)別序列間的片段(pCAMBIA3301被限制性核酸內(nèi)切酶SmaI和KpnI切成一個(gè)大片段和一個(gè)小片段，該DNA為該小片段)，得到的重組載體pCAMBIA1301-NRL2，pCAMBIA1301-NRL2表達(dá)序列表中序列2所示的NRL2。所述pCAMBIA3301與pCAMBIA1301-NRL2的差別僅在于將pCAMBIA3301的SmaI和KpnI識(shí)別序列間的DNA片段(pCAMBIA3301被限制性核酸內(nèi)切酶SmaI和KpnI切成一個(gè)大片段和一個(gè)小片段，該DNA為該小片段)替換為序列表中序列1所示的DNA分子。所述重組微生物可通過(guò)將所述重組載體導(dǎo)入出發(fā)微生物得到。所述出發(fā)微生物可為酵母、細(xì)菌、藻類(lèi)或真菌。所述細(xì)菌可為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌或革蘭氏陰性細(xì)菌。所述革蘭氏陰性細(xì)菌可為根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)。所述根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)可為根癌農(nóng)桿菌EHA105。所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系均不包括繁殖材料。所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所述NRL2基因轉(zhuǎn)化受體植物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述轉(zhuǎn)基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細(xì)胞。所述NRL2，或，所述編碼所述NRL2的核酸分子，或，含有所述編碼所述NRL2的核酸分子的表達(dá)盒、重組載體、重組微生物或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，在調(diào)控植物表型中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述NRL2，或，所述編碼所述NRL2的核酸分子，或，含有所述編碼所述NRL2的核酸分子的表達(dá)盒、重組載體、重組微生物或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，在培育表型改變的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述應(yīng)用中，所述植物可為c1)-c5)中的任一種：c1)單子葉植物；c2)雙子 葉植物；c3)水稻；c4)秈稻；c5)秈稻品系YIL18。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，具體可為方法一，包括向受體植物甲中導(dǎo)入編碼所述NRL2的核酸分子，得到轉(zhuǎn)基因植物甲的步驟；與所述受體植物甲相比，所述轉(zhuǎn)基因植物甲具有如下表型：葉片寬度增加和/或葉片卷曲度降低和/或籽粒長(zhǎng)度減少和/或籽粒寬度增加和/或花粉活性增強(qiáng)。本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，具體可為方法二，包括向受體植物乙中導(dǎo)入抑制編碼所述NRL2的核酸分子的表達(dá)的物質(zhì)，得到轉(zhuǎn)基因植物乙的步驟；與所述受體植物乙相比，所述轉(zhuǎn)基因植物乙具有如下表型：葉片寬度減少和/或葉片卷曲度增高和/或籽粒長(zhǎng)度增加和/或籽粒寬度減少和/或花粉活性減弱。上述方法中，所述編碼NRL2的核酸分子可為如下(b1)或(b2)或(b3)所示的DNA分子：(b1)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；(b2)與(b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼所述NRL2的DNA分子；(b3)在嚴(yán)格條件下與(b1)或(b2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述NRL2的DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。其中，序列表中序列1由2964個(gè)核苷酸組成，序列表中序列1的核苷酸編碼序列表中序列2所示的氨基酸序列。上述方法中，所述受體植物甲為d1)-d5)中的任一種：d1)單子葉植物；d2)雙子葉植物；d3)水稻；d4)秈稻；d5)nrl2突變體。上述方法中，所述受體植物乙為e1)-e5)中的任一種：e1)單子葉植物；e2)雙子葉植物；e3)水稻；e4)秈稻；e5)秈稻品系YIL18。上述方法中，所述受體植物甲具體可為轉(zhuǎn)基因植物乙。所述抑制編碼所述NRL2的核酸分子的表達(dá)的物質(zhì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述任一所述抑制編碼所述NRL2的核酸分子的表達(dá)的物質(zhì)具體可為特異DNA分子、含有所述特異DNA分子的表達(dá)盒或含有所述特異DNA分子重組質(zhì)粒。所述特異DNA分子包括正義片段、反義片段以及位于它們之間的間隔片段。所述正義片段為序列表的序列1自5′末端起第814位至第1175位所示的DNA分子的反向互補(bǔ)序列，所述反義片段為序列表的序列1自5′末端起第837位至第1205位所示的DNA分子。所述含有所述特異DNA分子重組質(zhì)粒具體可為重組質(zhì)粒pTCK303/JL1460-NRL2。所述重組質(zhì)粒pTCK303/JL1460-NRL2具體可為將質(zhì)粒pTCK303/JL1460的BamHI識(shí)別序列和KpnI識(shí)別序列間的DNA小片段替換為核苷酸序列是序列表的序列1自5′末端起第814位至第1175位所示的DNA分子的反向互補(bǔ)序列，SpeI識(shí)別序列和SacI識(shí)別序列間的DNA小片段替換為核苷酸序列是序列表的序列1自5′末端起第837位至第1205位所示的DNA分子。上述任一所述表型可為葉型和/或粒型和/或育性。所述葉型可為葉片寬度和/或葉片卷曲度。所述粒型可為籽粒長(zhǎng)度和/或籽粒寬度。所述育性可為花粉活性。上述任一所述葉片可為旗葉。實(shí)驗(yàn)證明，利用本發(fā)明提供的植物表型相關(guān)的蛋白NRL2及其編碼基因能調(diào)控植物表型：沉默株(RNAi-NRL2-1、RNAi-NRL2-2或RNAi-NRL2-3)與突變體nrl2的表型基本一致，均表現(xiàn)為葉片窄而卷，籽粒窄而長(zhǎng)，花粉活性較弱；T1代NRL2基因回補(bǔ)株與秈稻品系YIL18的表型基本一致，均表現(xiàn)為葉片寬且平展，籽粒寬而短，花粉活性較強(qiáng)。結(jié)果表明，植物表型相關(guān)的蛋白NRL2及其編碼基因能調(diào)控植物表型。附圖說(shuō)明圖1為突變體nrl2和秈稻品系YIL18的表型比較。圖2為NRL2基因的圖位克隆。圖3為轉(zhuǎn)基因植株的表型鑒定。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。秈稻品系YIL18(YIL18)記載于如下文獻(xiàn)中：TanLB，LiXR，LiuFX，SunXY，LiCG，ZhuZF，F(xiàn)uYC，CaiHW，WangXK，XieDXandSunCQ.Controlofakeytransitionfromprostratetoerectgrowthinricedomestication.NatureGenetics，2008，40(11):1360-1364。公眾可以從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得，以重復(fù)本實(shí)驗(yàn)。ZH17記載于如下文獻(xiàn)中：TanLB，LiXR，LiuFX，SunXY，LiCG，ZhuZF，F(xiàn)uYC，CaiHW，WangXK，XieDXandSunCQ.Controlofakeytransitionfromprostratetoerectgrowthinricedomestication.NatureGenetics，2008， 40(11)：1360-1364。公眾可以從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得，以重復(fù)本實(shí)驗(yàn)。C418記載于如下文獻(xiàn)中：ZhuZF，TanLB，F(xiàn)uYC，LiuFX，CaiHW，XieDX，WuF，WuJZ，MatsumotoT&SunCQ.Geneticcontrolofinflorescencearchitectureduringricedomestication.NATURECOMMUNICATIONS，2013，4:2200DOI:10.1038/ncomms3200.公眾可以從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得，以重復(fù)本實(shí)驗(yàn)。載體pCAMBIA1301記載于如下文獻(xiàn)中：YuBS，LinZW，LinHX，LiXJ，LiJY，WangYH，ZhangWX，ZhuZF，ZhaiWX，WangXK，XieDX，SunCQ.TAC1，amajorquantitativetraitlocuscontrollingtillerangleinrice.PlantJ，2007，52:891-898.公眾可以從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得，以重復(fù)本實(shí)驗(yàn)。載體pTCK303/JL1460記載于如下文獻(xiàn)中：WangZ，ChenCG，XuYY，JiangRX，HanY，XuZHandChongK.APracticalVectorforEfficientKnockdownofGeneExpressioninRice(OryzasativaL.).PlantMolecularBiologyReporter，2004，22:409–417.公眾可以從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得，以重復(fù)本實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例1、NRL2基因的發(fā)現(xiàn)秈稻品系YIL18經(jīng)甲基磺酸乙脂(EthylMethylSulfone，EMS)處理并經(jīng)過(guò)多代自交和性狀觀察后，形成基因型純和的突變體系。通過(guò)突變體系的篩選發(fā)現(xiàn)了一個(gè)葉片發(fā)育異常的突變體，將該突變體命名為nrl2。與YIL18葉片相比，nrl2的葉片寬度變窄(YIL18的葉片寬度為13.37±1.28mm，nrl2的葉片寬度為7.43±0.67mm)并極度變卷(卷曲度達(dá)到了41.3％)，nrl2和YIL18的葉片表型比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1中a、b和c。nrl2和YIL18的籽粒形態(tài)見(jiàn)圖1中d。與YIL18相比，nrl2的花粉活性弱(圖1中e)、葉片寬度小(圖1中f)、卷曲度高(圖1中g(shù))、結(jié)實(shí)率低(圖1中h)、籽粒寬度窄(圖1中i)，籽粒長(zhǎng)度長(zhǎng)(圖1中j)。nrl2分別與野生型常規(guī)品種(YIL18、ZH17或C418)進(jìn)行雜交，雜交F1代的葉片表型與相應(yīng)的野生型常規(guī)品種的葉片特征無(wú)顯著差異，因此推測(cè)出控制該突變性狀的基因是隱性的。雜交F1經(jīng)過(guò)自交后產(chǎn)生F2后代中，表現(xiàn)為野生型常規(guī)品種的葉片表型的株數(shù)與表現(xiàn)為nrl2的葉片表型的株數(shù)比例接近3：1(χ2＝0.26<χ20.05,1＝3.84)。所以，nrl2的水稻葉片窄卷由一個(gè)隱性單基因控制，將該基因被命名為NRL2基因。圖位克隆結(jié)果見(jiàn)圖2。首先利用nrl2與ZH17雜交獲得的分離群體將NRL2基因(序列表中序列1所示)初略定位在第三染色體的SSR標(biāo)記RM251附近，進(jìn)一步通過(guò)分離群體中的隱性個(gè)體將NRL2基因最終定位在兩個(gè)標(biāo)記MarkM4和M6之間約59KB的區(qū)域內(nèi)，最后通過(guò)對(duì)候選基因進(jìn)行DNA擴(kuò)增和序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)與YIL18相比，nrl2中一個(gè)堿基G的缺失，從而導(dǎo)致編碼序列發(fā)生移碼，蛋白提前終止。NRL2基因的序列如序列表中序列1所示，編碼的蛋白命名為NRL2，其氨基酸序列如序列表中序列2所示，由987個(gè)氨基酸殘基組成。實(shí)施例2、沉默株的獲得和鑒定一、重組質(zhì)粒pTCK303/JL1460-NRL2的構(gòu)建重組質(zhì)粒pTCK303/JL1460-NRL2的構(gòu)建步驟如下：(1)合成引物根據(jù)序列表中序列1所示的NRL2基因的序列，設(shè)計(jì)并合成引物GR7-1F、GR7-1R、GR7-2F和GR7-2R。引物序列如下：GR7-1F：5′-GGATCCCTGCACAAGTCACCTGCTAC-3′(下劃線為限制性內(nèi)切酶BamHI的識(shí)別位點(diǎn))；GR7-1R：5′-GGTACCGAGCGTGAATCTCCAGAAGT-3′(下劃線為限制性內(nèi)切酶KpnI識(shí)別位點(diǎn))；GR7-2F：5′-ACTAGTGGCACACATTTGTGTTCAGA-3′(下劃線為限制性內(nèi)切酶SpeI識(shí)別位點(diǎn))；GR7-2R：5′-GAGCTCTCCATGGCCTCTAGTGTTTT-3′(下劃線為限制性內(nèi)切酶SacI識(shí)別位點(diǎn))。(2)以人工合成的序列表的序列1所示的雙鏈DNA分子為模板，以GR7-1F和GR7-1R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到DNA片段A。(3)以人工合成的序列表的序列1所示的雙鏈DNA分子為模板，以GR7-2F和GR7-2R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到DNA片段B。(4)用限制性內(nèi)切酶BamHI和KpnI酶切DNA片段A，回收酶切產(chǎn)物1。(5)用限制性內(nèi)切酶BamHI和KpnI酶切載體pTCK303/JL1460，回收約14616kb的載體骨架1。(6)將酶切產(chǎn)物1與載體骨架1連接，得到重組質(zhì)粒甲。(7)用限制性內(nèi)切酶SpeI和SacI酶切DNA片段B，回收酶切產(chǎn)物2。(8)用限制性內(nèi)切酶SpeI和SacI酶切重組質(zhì)粒甲，回收約14972kb的載體骨架2。(9)將酶切產(chǎn)物2與載體骨架2連接，得到重組質(zhì)粒pTCK303/JL1460-NRL2。對(duì)重組質(zhì)粒pTCK303/JL1460-NRL2進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將質(zhì)粒pTCK303/JL1460的BamHI識(shí)別序列和KpnI識(shí)別序列間的DNA小片段替換為核苷酸序列是序列表的序列1自5′末端起第814位至第1175位所示的DNA分子的反向互補(bǔ)序列，SpeI識(shí)別序列和SacI識(shí)別序列間的DNA小片段替換為核苷酸序列是序列表的序列1自5′末端起第837位至第1205位所示的DNA分子。二、沉默株的獲得和鑒定1、采用基因槍法將步驟一構(gòu)建的重組質(zhì)粒pTCK303/JL1460-NRL2轉(zhuǎn)化秈稻品系 YIL18，獲得T0代沉默株。將T0代沉默株自交產(chǎn)生的種子命名為T(mén)1代沉默種子，由T1代沉默種子長(zhǎng)成的水稻植株命名為T(mén)1代沉默株，隨機(jī)選擇三個(gè)沉默株系，將其命名為RNAi-NRL2-1、RNAi-NRL2-2和RNAi-NRL2-3。分別以RNAi-NRL2-1、RNAi-NRL2-2、RNAi-NRL2-3和秈稻品系YIL18的基因組DNA為模板，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)NRL2基因的相對(duì)表達(dá)量(以u(píng)biquitin基因?yàn)閮?nèi)參基因)。鑒定NRL2基因的引物為5′-TCCCTTTCTTTTGATGAGGA-3′和5′-GCTACATGTAACGCCGATTC-3′。鑒定ubiquitin基因的引物為5′-CTGTCAACTGCCGCAAGAAG-3′和5′-GGCGAGTGACGCTCTAGTTC-3′。將秈稻品系YIL18中NRL2基因的相對(duì)表達(dá)量作為1，T1代沉默株的3個(gè)株系中NRL2基因的相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)圖3中k(其中WT為秈稻品系YIL18)。結(jié)果表明，T1代沉默株的3個(gè)株系中的NRL2基因的表達(dá)量均有不同程度的降低，分別為YIL18中NRL2基因的表達(dá)量的0.38倍、0.27倍和0.25倍。實(shí)施例3、沉默株的NRL2基因回補(bǔ)一、重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-NRL2的構(gòu)建重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-NRL2的構(gòu)建步驟如下：(1)合成引物以序列表中序列1所示的NRL2基因的序列，設(shè)計(jì)并合成引物NQC6F和NQC6R。引物序列如下：NQC6F：5′-TCCCCCGGGGGAATGGGTTTCATGTCAGCGAAGC-3′(下劃線為限制性內(nèi)切酶SmaI的識(shí)別位點(diǎn)及保護(hù)堿基)；NQC6R：5′-CGGGGTACCCCGCTACTAGGCACGATATGCAGCC-3′(下劃線為限制性內(nèi)切酶KpnI識(shí)別位點(diǎn)及保護(hù)堿基)。(2)以人工合成的序列表的序列1所示的雙鏈DNA分子為模板，以NQC6F和NQC6R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。(3)用限制性內(nèi)切酶SmaI和KpnI酶切步驟(2)獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物3。(4)用限制性內(nèi)切酶SmaI和KpnI酶切載體pCAMBIA1301，回收約11832kb的載體骨架3。(5)將酶切產(chǎn)物3與載體骨架3連接，得到重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-NRL2。對(duì)重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-NRL2進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將質(zhì)粒pCAMBIA1301的SmaI識(shí)別序列和KpnI識(shí)別序列間的DNA小片段替換為序列表的序列1所示的DNA分子，得到 重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-NRL2。二、NRL2基因回補(bǔ)株的獲得和鑒定1、采用基因槍法將步驟一構(gòu)建的重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-NRL2轉(zhuǎn)化nrl2，獲得T0代NRL2基因回補(bǔ)株。將T0代NRL2基因回補(bǔ)株自交產(chǎn)生的種子命名為T(mén)1代回補(bǔ)種子，由T1代回補(bǔ)種子長(zhǎng)成的水稻植株命名為T(mén)1代NRL2基因回補(bǔ)株。隨機(jī)選擇三個(gè)株系，將其命名為OE-NRL2-1、OE-NRL2-2和OE-NRL2-3。分別以O(shè)E-NRL2-1、OE-NRL2-2、OE-NRL2-3和nrl2的基因組DNA為模板，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)NRL2基因的相對(duì)表達(dá)量(以u(píng)biquitin基因?yàn)閮?nèi)參基因)。。鑒定NRL2基因的引物為5′-TCCCTTTCTTTTGATGAGGA-3′和5′-GCTACATGTAACGCCGATTC-3′。鑒定ubiquitin基因的引物為5′-CTGTCAACTGCCGCAAGAAG-3′和5′-GGCGAGTGACGCTCTAGTTC-3′。將nrl2中NRL2基因的相對(duì)表達(dá)量作為1，T1代過(guò)表達(dá)NRL2基因的水稻植株的3個(gè)株系中NRL2基因的相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)圖3中i。結(jié)果表明，T1代NRL2基因回補(bǔ)株的3個(gè)株系中的NRL2基因的表達(dá)量均有不同程度的升高，分別為nrl2中NRL2基因的表達(dá)量的172倍、572倍和1376倍。按照上述方法，將nrl2替換為RNAi-NRL2-1，獲得T1代NRL2基因回補(bǔ)株，隨機(jī)選擇三個(gè)株系，將其命名為OE-RNAi-NRL2-1、OE-RNAi-NRL2-2和OE-RNAi-NRL2-3。按照上述方法，將nrl2替換為RNAi-NRL2-2，獲得T1代NRL2基因回補(bǔ)株，隨機(jī)選擇三個(gè)株系，將其命名為OE-RNAi-NRL2-4、OE-RNAi-NRL2-5和OE-RNAi-NRL2-6。按照上述方法，將nrl2替換為RNAi-NRL2-3，獲得T1代NRL2基因回補(bǔ)株，隨機(jī)選擇三個(gè)株系，將其命名為OE-RNAi-NRL2-7、OE-RNAi-NRL2-8和OE-RNAi-NRL2-9。實(shí)施例4、沉默株和T1代NRL2基因回補(bǔ)株的表型檢測(cè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次重復(fù)的步驟如下：將YIL18、nrl2、沉默株(RNAi-NRL2-1、RNAi-NRL2-2或RNAi-NRL2-3)和T1代NRL2基因回補(bǔ)株(OE-NRL2-1、OE-NRL2-2、OE-NRL2-3、OE-RNAi-NRL2-1、OE-RNAi-NRL2-2、OE-RNAi-NRL2-3、OE-RNAi-NRL2-4、OE-RNAi-NRL2-5、OE-RNAi-NRL2-6、OE-RNAi-NRL2-7、OE-RNAi-NRL2-8或OE-RNAi-NRL2-9)的種子分別播種到培養(yǎng)土中，每個(gè)株系隨機(jī)選取20株。在水稻抽穗期，用光學(xué)顯微鏡觀察同一時(shí)期的花粉活性；在水稻成熟期，觀察水稻葉片表型、花粉活性和籽粒形態(tài)，并統(tǒng)計(jì)水稻旗葉寬度、籽粒長(zhǎng)度和籽粒寬度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3(a、b、e和f為葉片表型，c和g為籽粒形態(tài)，d和h為花粉活性，i和k為相對(duì)表達(dá)水平，j和l為旗葉寬度，m為籽粒長(zhǎng)度，n為籽粒寬度，WT為 秈稻品系YIL18)。結(jié)果表明，沉默株與nrl2的表型一致，葉片窄而卷，籽粒窄而長(zhǎng)，花粉活性較弱；T1代NRL2基因回補(bǔ)株與YIL18的表型基本一致，葉片寬且平展，籽粒寬而短，花粉活性較強(qiáng)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3