本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種穩(wěn)定表達(dá)核心α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的脊椎動(dòng)物細(xì)胞系及其制備方法。

背景技術(shù)：

現(xiàn)行研究顯示，包括哺乳動(dòng)物在內(nèi)的脊椎動(dòng)物沒(méi)有核心α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性。因此，具有核心α(1,3)巖藻糖化的脊椎動(dòng)物和哺乳動(dòng)物蛋白可具有新的理化特性和生物學(xué)特性，具有廣闊的應(yīng)用前景。例如，對(duì)復(fù)雜生物過(guò)程的理解依賴于對(duì)特定分子在包括蛋白質(zhì)分子間動(dòng)態(tài)相互作用在內(nèi)的的定位和示蹤。雖然通過(guò)對(duì)越來(lái)越多種生物的DNA測(cè)序鑒別了蛋白的開(kāi)放閱讀框(ORF)，但是在體內(nèi)和體外對(duì)相應(yīng)蛋白質(zhì)性質(zhì)的鑒定的方法仍是有限的?，F(xiàn)有技術(shù)中，絕大多數(shù)致力于實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的策略基于構(gòu)建一個(gè)融合蛋白，這個(gè)融合蛋白帶有的融合多肽標(biāo)記不僅可以用作蛋白純化以在體外應(yīng)用，也可以進(jìn)一步在體內(nèi)應(yīng)用。研究實(shí)踐中應(yīng)用的標(biāo)簽實(shí)例包括FLAG標(biāo)簽、6X His標(biāo)簽、S－谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、麥芽糖結(jié)合蛋白、綠色熒光蛋白(GFP)融合蛋白和抗原決定簇標(biāo)簽等，但是這些標(biāo)記都或多或少的改變了原有蛋白的氨基酸序列，而基于N型糖蛋白上的核心α(1,3)巖藻糖化標(biāo)記則無(wú)需改變現(xiàn)有N型糖蛋白的氨基酸序列，且在后續(xù)對(duì)標(biāo)記過(guò)的N型糖蛋白的體內(nèi)外檢測(cè)，示蹤和/或操縱也無(wú)需制備特異的抗體，使用通用的抗核心α(1,3)巖藻糖的抗體便可以實(shí)現(xiàn)，使用方便。

經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索，專利文獻(xiàn)201010607689.6(公開(kāi)日2011年9月7日)披露了一種檢測(cè)IgG巖藻糖化的方法及其應(yīng)用。該方法利用凝集素檢測(cè)位于IgG上的核心α(1,6)巖藻糖化度和位于糖鏈末端的α(1,3)巖藻糖化度，用于乙肝患者中慢性肝炎患者和肝硬化患者的鑒別診斷。該文獻(xiàn)披露的技術(shù)方案 不涉及蛋白核心α(1,3)巖藻糖化，不涉及核心α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，也不涉及核心α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。

如前所述，天然脊椎和哺乳動(dòng)物細(xì)胞雖然具有蛋白核心α(1,6)巖藻糖化以及末端α(1,3)巖藻糖化的能力，但沒(méi)有核心α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性。迄今尚未見(jiàn)有穩(wěn)定表達(dá)核心α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系報(bào)道。雖然部分植物和昆蟲(chóng)具有核心α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，由于以下眾多的不確定因素：限制了核心α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶在哺乳動(dòng)物中的表達(dá)和應(yīng)用：

1.不同種屬的細(xì)胞糖鏈具有種屬特性，糖鏈的特異性可限制核心α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性；2。蛋白序列也有種屬特性蛋白序列的特異性可限制核心α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性；3。不同種屬的細(xì)胞有結(jié)構(gòu)特異性，細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)可限制核心α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性；4。細(xì)胞內(nèi)環(huán)境pH和鹽濃度，可能限制核心α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性；5。不同的細(xì)胞可能使用完全不同的底物系統(tǒng)；6。酶的細(xì)胞內(nèi)分布可能限制核心α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性。

基于現(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)狀，本申請(qǐng)的發(fā)明人擬建立一種穩(wěn)定表達(dá)核心α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系及其制備方法。與融合蛋白標(biāo)記技術(shù)相比，由核心α(1,3)巖藻糖基化標(biāo)記的蛋白，不帶有可引起宿主免疫反應(yīng)的融合多肽，蛋白序列不發(fā)生變化；與在昆蟲(chóng)和植物細(xì)胞中表達(dá)的蛋白相比，并可排除由昆蟲(chóng)或植物細(xì)胞糖鏈以及蛋白酶帶來(lái)的異質(zhì)性。進(jìn)一步的本發(fā)明的上述方法可用于其它的脊椎動(dòng)物細(xì)胞。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，利用蛋白糖修飾的種屬差異，提供一種穩(wěn)定表達(dá)核心α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系及其制備方法。本發(fā)明涉及的細(xì)胞系能夠穩(wěn)定表達(dá)核心α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，并進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生核心α(1,3)巖藻糖基化的N型糖蛋白，核心α(1,3)巖藻糖基化標(biāo)記為通用標(biāo)記，可用于不同蛋白在復(fù)雜生物系統(tǒng)理解和蛋白質(zhì)分子間潛在的相互作用的示蹤和體內(nèi)體外的研究，具有廣闊的基礎(chǔ)和應(yīng)用價(jià)值。

本發(fā)明是通過(guò)以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，

第一方面，本發(fā)明提供一種穩(wěn)定表達(dá)核心α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。

優(yōu)選地，所述細(xì)胞系可通過(guò)包括如下步驟的方法制備：取源于非哺乳動(dòng)物的核心α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因，導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞系即得；所述細(xì)胞系為中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO-K1，或中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO-S，或人胚腎細(xì)胞系HEK293。

第二方面，本發(fā)明提供一種穩(wěn)定表達(dá)核心α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞系，所述細(xì)胞系為中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO-K1/CAF13 CCTCC C2015182。

第三方面，本發(fā)明涉及一種前述中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO-K1/CAF13 CCTCC C2015182的制備方法，包括如下步驟：

步驟一、培養(yǎng)CHO-K1細(xì)胞；

步驟二，取pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染細(xì)胞；

步驟三，取步驟二得到的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，傳代培養(yǎng)，通過(guò)抗生素篩選獲得細(xì)胞克隆；

步驟四，挑取細(xì)胞克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)并鑒定，獲得強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞克隆，篩選，即得所述細(xì)胞系，即中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO-K1/CAF13 CCTCC C2015182。

優(yōu)選地，所述步驟一包括如下步驟：取100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，加入10mL新鮮F12K完全培養(yǎng)基，所述F12K完全培養(yǎng)基含10％胎牛血清及青鏈霉素，在培養(yǎng)皿中加入CHO-K1細(xì)胞，孵育。

優(yōu)選地，所述在培養(yǎng)皿中加入CHO-K1細(xì)胞具體為：按每個(gè)培養(yǎng)皿1.25 x 10⁶個(gè)CHO-K1細(xì)胞濃度加入細(xì)胞，之后放入CO₂培養(yǎng)箱中37℃孵育過(guò)夜。

優(yōu)選地，所述步驟二包括如下步驟：取pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA質(zhì)粒，濃度為453ng/μL；按照每2mL Opti-Mem中含有24μg質(zhì)粒和40μL Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物，搖勻后室溫放置5分鐘；取鋪有CHO-K1細(xì)胞的100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿加入2mL上述配制的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，搖勻后放入37℃CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育6小時(shí)；6小時(shí)后將培養(yǎng)皿取出，吸掉全部培養(yǎng)基，緩慢加入新鮮的F12K完全培養(yǎng)基，然后放入37℃CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，獲得轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA質(zhì)粒的CHO-K1細(xì)胞。

優(yōu)選地，所述步驟三包括如下步驟：取轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA質(zhì)粒24小時(shí)后的CHO-K1細(xì)胞，使用預(yù)先加入G418的F12K完全培養(yǎng)基，37℃CO₂培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

優(yōu)選地，所述步驟三包括如下步驟：將轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA質(zhì)粒24小時(shí)后的CHO-K1細(xì)胞取出，吸掉全部培養(yǎng)液上清，用10mL PBS洗一遍，加入2mL胰酶消化液；室溫放置并消化5-7分鐘作用，吸掉胰酶消化液，再放置2-4分鐘；等待期間取3個(gè)新100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，每個(gè)預(yù)先加入10mL含有800μg/mL G418的F12K完全培養(yǎng)基，待用；倒置顯微鏡下觀察，待所有細(xì)胞脫壁后立刻加入10mL新鮮F12K完全培養(yǎng)基，緩慢吹打幾遍；將細(xì)胞懸液取1/30的體積分別加入到剛才準(zhǔn)備的3個(gè)100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，輕輕搖勻后放入37℃CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)數(shù)天后；再次按照上述方法傳代細(xì)胞一次，繼續(xù)培養(yǎng)若干天，待細(xì)胞群落生長(zhǎng)出來(lái)后，挑取細(xì)胞克隆待用。

優(yōu)選地，步驟四中，所述篩選包括如下步驟：通過(guò)極限稀釋法，將獲得的陽(yáng)性克隆細(xì)胞的單個(gè)細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)挑取生長(zhǎng)健康的單克隆細(xì)胞株，并經(jīng)過(guò)若干天擴(kuò)大培養(yǎng)并制備細(xì)胞裂解液，隨后進(jìn)行針對(duì)核心α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶及其產(chǎn)物核心α(1,3)巖藻糖表位的蛋白免疫印跡，以此篩選出強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)的單克隆細(xì)胞株。

第四方面，本發(fā)明還提供一種制備核心α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的方法，包括如下步驟：發(fā)酵培養(yǎng)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO-K1/CAF13 CCTCC C2015182，即得核心α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。

第五方面，本發(fā)明還提供一種中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO-K1/CAF13 CCTCC C2015182在制備核心α(1,3)巖藻糖基化糖蛋白中的應(yīng)用。

本發(fā)明涉及的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO-K1/CAF13 CCTCC C2015182已經(jīng)于2015年11月4日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)；郵編：430072；保藏編號(hào)為CCTCC C2015182。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：

本發(fā)明成功獲得了能夠穩(wěn)定表達(dá)核心α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，首次在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生α(1,3)核心巖藻糖基化的N型糖蛋白，且表 達(dá)穩(wěn)定，解決了現(xiàn)有技術(shù)中長(zhǎng)期未能解決的穩(wěn)定表達(dá)核心α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的技術(shù)問(wèn)題，為研究復(fù)雜生物系統(tǒng)和和蛋白質(zhì)分子間潛在的相互作用提供了新的方法和手段，具有顯著地意想不到的效果。

附圖說(shuō)明

通過(guò)閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯：

圖1為通過(guò)對(duì)核心α(1,3)巖藻糖進(jìn)行相對(duì)定量免疫組織化學(xué)染色，鑒定出核心α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶陽(yáng)性CHO-K1細(xì)胞克隆結(jié)果圖；

圖2為免疫組織化學(xué)染色法揭示核心α(1,3)巖藻糖在CHO-K1細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)果圖；

圖3為蛋白免疫印跡法篩選出表達(dá)核心α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的CHO-K1細(xì)胞株結(jié)果圖；

圖4為蛋白免疫印跡法篩選出表達(dá)核心α(1,3)巖藻糖的CHO-K1細(xì)胞株結(jié)果圖；

圖5為蛋白免疫印跡揭示核心α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)物，即核心α(1,3)巖藻糖在CAF13細(xì)胞中表達(dá)持續(xù)且穩(wěn)定結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

本發(fā)明涉及的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO-K1/CAF13 CCTCC C2015182已經(jīng)于2015年11月4日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)；郵編：430072；保藏編號(hào)為CCTCC C2015182。

實(shí)施例1、培養(yǎng)細(xì)胞

取100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，加入10mL新鮮F12K完全培養(yǎng)基(含10％胎牛血清及青鏈霉素)，按每個(gè)培養(yǎng)皿1.25 x 10⁶個(gè)CHO-K1細(xì)胞濃度加入細(xì)胞，放入CO₂培養(yǎng)箱中37℃孵育過(guò)夜；本實(shí)施例中的F12K完全培養(yǎng)基和CHO-K1細(xì)胞均可通過(guò)公開(kāi)的市售渠道獲得，為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。

實(shí)施例2、轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA質(zhì)粒

取pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA質(zhì)粒(濃度為濃度為453ng/μL，序列如SEQ ID NO.1所示)，冰上解凍后待用；

取出鋪有CHO-K1細(xì)胞的100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，吸掉全部培養(yǎng)液，分別用10mL PBS洗一遍，后加入無(wú)血清無(wú)青鏈霉素新鮮F12K培養(yǎng)基，再將細(xì)胞放入37℃CO₂培養(yǎng)箱中孵育待用；

按照每2mL Opti-Mem中含有24μg質(zhì)粒和40μL Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物，搖勻后室溫放置5分鐘；

取鋪有CHO-K1細(xì)胞的100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿加入2mL上述配制的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，搖勻后放入37℃ CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育6小時(shí)；

6小時(shí)后將6碟培養(yǎng)皿取出，吸掉全部培養(yǎng)基，緩慢加入新鮮的F12K完全培養(yǎng)基，然后放入37℃CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，獲得轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA質(zhì)粒的CHO-K1細(xì)胞。

實(shí)施例3、傳代培養(yǎng)，通過(guò)抗生素篩選獲得細(xì)胞克隆

本實(shí)施例中，將轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA質(zhì)粒24小時(shí)后的CHO-K1細(xì)胞取出，吸掉全部培養(yǎng)液上清，用10mL PBS洗一遍，加入2mL胰酶消化液；

室溫放置并消化5-7分鐘作用，吸掉胰酶消化液，再放置2-4分鐘；

等待期間取3個(gè)新100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，每個(gè)預(yù)先加入10mL含有800μg/mL G418的F12K完全培養(yǎng)基，待用；

倒置顯微鏡下觀察，待所有細(xì)胞脫壁后立刻加入10mL新鮮F12K完全培養(yǎng)基，緩慢吹打幾遍；

將細(xì)胞懸液取1/30的體積分別加入到剛才準(zhǔn)備的3個(gè)100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，輕輕搖勻后放入37℃CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)數(shù)天后；

再次按照上述方法傳代細(xì)胞一次，繼續(xù)培養(yǎng)若干天，待細(xì)胞群落生長(zhǎng)出來(lái)后，挑取細(xì)胞克隆進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

實(shí)施例4、挑取細(xì)胞克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)并鑒定，獲得強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞克隆

挑取16個(gè)細(xì)胞克隆，提前兩天接種于3個(gè)6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，長(zhǎng)滿后依次吸掉孔內(nèi)培養(yǎng)液上清，用2mL PBS洗一遍，加入0.6mL胰酶消化液；

室溫放置并消化5-7分鐘作用，待消化結(jié)束時(shí)依次用移液器先吸入0.6mL培養(yǎng)基，加入到剛剛正在消化的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，吹打均勻，將全部細(xì)胞懸液依次轉(zhuǎn)入到16個(gè)空的1.5mL離心管中；

對(duì)所有16管細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，將每個(gè)細(xì)胞克隆的5 x 10⁴個(gè)細(xì)胞加入到96孔板中，每個(gè)細(xì)胞克隆3個(gè)復(fù)孔，加入后放入CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)過(guò)夜；

第二天將96孔板取出，在水池邊將培養(yǎng)基全部甩出，放在干的吸水紙上將板子翻過(guò)來(lái)輕拍數(shù)次；

緩慢加入300μL/孔的PBS將貼壁的細(xì)胞洗一遍，在水池邊將PBS全部甩出，放在干的吸水紙上將板子翻過(guò)來(lái)輕拍數(shù)次；

立刻加入預(yù)冷的固定液(含4％(w/v)多聚甲醛的PBS溶液)，100μL/孔，室溫固定30分鐘；

固定好后，在水池邊將固定液全部甩出，放在干的吸水紙上將板子翻過(guò)來(lái)輕拍數(shù)次后，緩慢加入300μL/孔的PBS將固定好的細(xì)胞洗一遍，然后在水池邊將PBS全部甩出，放在干的吸水紙上將板子翻過(guò)來(lái)輕拍數(shù)次；

立刻加入PBST溶液(含0.5％(w/v)Triton X-100的PBS溶液)，100μL/孔，室溫放置15分鐘進(jìn)行破膜；

破膜后，在水池邊將PBST溶液全部甩出，放在干的吸水紙上將板子翻過(guò)來(lái)輕拍數(shù)次后，緩慢加入封閉緩沖液(10％FBS+90％PBS)，室溫放置1小時(shí)進(jìn)行封閉處理；封閉后，加入一抗緩沖液(將兔抗核心α(1,3)巖藻糖抗體按1：2000稀釋在上述封閉液中)或者封閉液，50μL/孔，置于4℃孵育過(guò)夜。

第三天，將前一天進(jìn)行一抗孵育過(guò)夜的96孔板取出，在水池邊將一抗緩沖液全部甩出，放在干的吸水紙上將板子翻過(guò)來(lái)輕拍數(shù)次；

緩慢加入300μL/孔的TBST溶液將細(xì)胞洗一遍，在水池邊將TBST溶液全部甩出，放在干的吸水紙上將板子翻過(guò)來(lái)輕拍數(shù)次；重復(fù)上述步驟4遍；

由此步開(kāi)始全部操作避光進(jìn)行，加入二抗緩沖液(將AlexaFluor488標(biāo)記的羊抗兔二抗按1：1000稀釋在上述封閉液中)或者封閉液，50μL/孔，室溫孵育1小時(shí)；

孵育結(jié)束后，在水池邊將二抗緩沖液全部甩出，放在干的吸水紙上將板子翻過(guò)來(lái)輕拍數(shù)次；

緩慢加入300μL/孔的TBST溶液將細(xì)胞洗一遍，在水池邊將TBST溶液全部甩出，放在干的吸水紙上將板子翻過(guò)來(lái)輕拍數(shù)次；

在所有孔中緩慢加入50μL/孔的DAPI溶液(含100ng/mL DAPI的PBS溶液)，室溫孵育5分鐘；

孵育結(jié)束后，在水池邊將DAPI溶液全部甩出，放在干的吸水紙上將板子翻過(guò)來(lái)輕拍數(shù)次；

緩慢加入300μL/孔的TBST溶液將細(xì)胞洗一遍，在水池邊將TBST溶液全部甩出，放在干的吸水紙上將板子翻過(guò)來(lái)輕拍數(shù)次；重復(fù)上述步驟3遍；

將洗好的板子放入多功能酶標(biāo)儀中分別讀取FITC(激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，發(fā)射波長(zhǎng)為535nm)和DAPI(激發(fā)波長(zhǎng)為358nm，發(fā)射波長(zhǎng)為461nm)熒光值，并根據(jù)FITC相對(duì)熒光值與DAPI相對(duì)熒光值的比值(單位細(xì)胞FITC相對(duì)熒光值)作為參考挑取陽(yáng)性細(xì)胞克隆以進(jìn)行后續(xù)單克隆稀釋，如圖1所示，圖1中顯示了核心α(1,3)巖藻糖在16個(gè)細(xì)胞克隆中的相對(duì)含量；并對(duì)強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞克隆拍照，包括11號(hào)與13號(hào)克隆細(xì)胞，如圖2所示，相較于母細(xì)胞，這兩株陽(yáng)性細(xì)胞由于表達(dá)核心α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶從而產(chǎn)生了核心α(1,3)巖藻糖而被標(biāo)記為亮綠色，能夠被明顯被識(shí)別出來(lái)。

之后進(jìn)行獲得純化過(guò)的穩(wěn)定表達(dá)核心α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞系CAF13及效果驗(yàn)證：通過(guò)極限稀釋法，將這兩株陽(yáng)性克隆細(xì)胞的單個(gè)細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，經(jīng)過(guò)若干天培養(yǎng)挑取數(shù)個(gè)生長(zhǎng)健康的單克隆細(xì)胞株，并經(jīng)過(guò)若干天擴(kuò)大培養(yǎng)并制備細(xì)胞裂解液，隨后進(jìn)行針對(duì)核心α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移 酶及其產(chǎn)物核心α(1,3)巖藻糖表位的蛋白免疫印跡，以此篩選出強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)的單克隆細(xì)胞株。如圖3所示，11號(hào)克隆的3號(hào)單克隆細(xì)胞株內(nèi)檢測(cè)到核心α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)；又如圖4所示，在對(duì)應(yīng)的表達(dá)核心α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的單克隆細(xì)胞株中也檢測(cè)出該酶的產(chǎn)物，N型糖蛋白上的核心α(1,3)巖藻糖。綜上，其中11號(hào)克隆的3號(hào)單克隆細(xì)胞株被鑒定為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞株，此結(jié)果表明表達(dá)核心α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的單克隆細(xì)胞系被成功純化得到，并命名為CAF13，即中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO-K1/CAF13 CCTCC C2015182，該細(xì)胞系已經(jīng)于2015年11月4日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)；郵編：430072；保藏編號(hào)為CCTCC C2015182。

通過(guò)對(duì)CAF13細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)及對(duì)該核心α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)物，即N型糖蛋白上核心α(1,3)巖藻糖的連續(xù)檢測(cè)，蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)證明了該細(xì)胞系能夠穩(wěn)定表達(dá)核心α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。如圖5所示，第7代CAF13細(xì)胞與連續(xù)培養(yǎng)至第22代的CAF13細(xì)胞具有一致的蛋白免疫印跡效果，從而表明此細(xì)胞經(jīng)過(guò)連續(xù)數(shù)代培養(yǎng)后，核心α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)持續(xù)且穩(wěn)定。由此可見(jiàn)，本發(fā)明成功獲得了能夠穩(wěn)定表達(dá)α(1,3)核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞系，首次在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生核心α(1,3)巖藻糖基化的N型糖蛋白，且表達(dá)穩(wěn)定，解決了現(xiàn)有技術(shù)中長(zhǎng)期未能解決的穩(wěn)定表達(dá)核心α(1,3)巖藻糖的技術(shù)問(wèn)題，對(duì)復(fù)雜生物系統(tǒng)理解和蛋白質(zhì)分子間潛在的相互作用有著重要的研究?jī)r(jià)值，具有意想不到的技術(shù)效果。

綜上所述，本發(fā)明涉及的細(xì)胞系能夠穩(wěn)定表達(dá)α(1,3)核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，本發(fā)明首次實(shí)現(xiàn)了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生核心α(1,3)巖藻糖基化的N型糖蛋白，對(duì)復(fù)雜生物系統(tǒng)理解和蛋白質(zhì)分子間潛在的相互作用有著重要的研究?jī)r(jià)值。利用本發(fā)明涉及的細(xì)胞系中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO-K1/CAF13 CCTCC C2015182表達(dá)的核心α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，能夠標(biāo)記且無(wú)需改變現(xiàn)有N型糖蛋白的氨基酸序列，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)功能，解決了現(xiàn)有技術(shù)中未能解決的在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)核心α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的技術(shù)問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)了意想不到的技術(shù)效果。

以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了描述。上述方法可用于其它的脊椎動(dòng)物細(xì)胞。

需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容。