本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及一種穩(wěn)定低表達(dá)Midkine蛋白的LM3穩(wěn)定細(xì)胞系及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

Midkine蛋白是一種重要的細(xì)胞因子，分子量大小為13kDa，可以與肝素結(jié)合，是肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子家族成員之一。近些年研究發(fā)現(xiàn)，Midkine蛋白在正常人組織中不表達(dá)或低表達(dá)，而在多種惡性腫瘤中過(guò)度表達(dá)，包括肝癌、胰腺癌、乳腺癌、腸癌等。研究發(fā)現(xiàn)，Midkine蛋白具有多種生物學(xué)功能，如促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂、細(xì)胞增殖、血管生成、誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、抗凋亡等活性，從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，成為腫瘤生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。此外，Midkine蛋白還具有分泌性，在惡性腫瘤患者血清中發(fā)現(xiàn)Midkine蛋白表達(dá)量顯著提高，而在正常人血清中幾乎檢測(cè)不到。因此，血清Midkine有望成為一種新的腫瘤標(biāo)志物，用于腫瘤臨床早期診斷、預(yù)后判斷等輔助性治療，成為腫瘤生物標(biāo)志物研究的目標(biāo)。

肝癌在我國(guó)的發(fā)病率和死亡率很高，嚴(yán)重危害國(guó)民身體健康。對(duì)肝癌發(fā)病機(jī)制的研究是腫瘤生物學(xué)研究的重要課題。目前關(guān)于Midkine功能研究主要發(fā)生在腫瘤增殖、遷移和表皮細(xì)胞間質(zhì)化(Epithelial-to-Mesenchymal Transition,EMT)等方面，而Midkine蛋白對(duì)肝癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)調(diào)控機(jī)制報(bào)道很少，尤其是Midkine與肝癌能量代謝的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本發(fā)明通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染體系構(gòu)建Midkine低表達(dá)穩(wěn)定肝癌細(xì)胞株，為研究Midkine對(duì)肝癌的致病機(jī)制以及生物學(xué)功能提供有力工具。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種低表達(dá)Midkine蛋白的LM3穩(wěn)定細(xì)胞系及其構(gòu)建方法，該細(xì)胞系可作為細(xì)胞模型，用于研究Midkine對(duì)腫瘤尤其是肝癌發(fā)生發(fā)展的調(diào)控機(jī)制以及對(duì)細(xì)胞代謝通路的影響等生物學(xué)功能。

本發(fā)明提供的一種低表達(dá)Midkine蛋白的LM3穩(wěn)定細(xì)胞系，是以肝癌細(xì)胞 系LM3作為宿主細(xì)胞，感染帶有Midkine shRNA基因的病毒培養(yǎng)液，經(jīng)過(guò)Puromycin抗性篩選、細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后獲得低表達(dá)Midkine蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞系。由于Midkine基因與tGFP報(bào)告基因融合表達(dá)，可以在熒光顯微鏡下直接觀測(cè)到Midkine重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率。

本發(fā)明提供的一種低表達(dá)Midkine蛋白的LM3穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

(1)從Open Biosystems公司購(gòu)買(mǎi)攜帶Midkine shRNA序列的pSM2載體。設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)Midkine shRNA的PCR引物(如下)，采用PCR方法擴(kuò)增Midkine shRNA基因；

Forward primer：5′-AAGCCCTTTGTACACCCTAAGCCT-3′

Reverse primer：5′-ACTGGTGAAACTCACCCAGGGATT-3′

(2)采用PCR產(chǎn)物清潔試劑盒將上述PCR產(chǎn)物清潔后，測(cè)定OD值。

(3)采用Mlu I和Xho I酶對(duì)慢病毒表達(dá)載體pLenti進(jìn)行雙酶切，切膠回收線性載體。

(4)利用T4DNA連接酶將步驟(2)中PCR片斷與步驟(3)中線性載體pLenti于16℃過(guò)夜連接，構(gòu)建pLenti-MDKshRNA重組質(zhì)粒。

(5)將上述連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化E.coli.DH5a感受態(tài)細(xì)胞，放入37℃過(guò)夜培養(yǎng)16小時(shí)以上；次日收集菌體，從細(xì)菌培養(yǎng)液中提取重組質(zhì)粒pLenti-MDKshRNA，進(jìn)行Mlu I和Xho I雙酶切鑒定。

(6)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前一天，在100mm培養(yǎng)皿中接種0.5×10⁶～1×10⁶cells個(gè)HEK293T細(xì)胞，次日細(xì)胞匯合度達(dá)到50～70％。

(7)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。采用慢病毒轉(zhuǎn)染方法，將步驟(5)獲得的重組質(zhì)粒pLenti-MDKshRNA與病毒包裝質(zhì)粒psPAX2、pVSVG按照10：9：1質(zhì)量比例混合(總質(zhì)量6μg)，添加到580μl Opti-MEM基本培養(yǎng)基中，然后加入12μl轉(zhuǎn)染試劑，混勻、室溫靜置20min；取出HEK293T細(xì)胞，除去培養(yǎng)基，添加5ml PBS清洗1次；除去PBS溶液，添加3ml DMEM基本培養(yǎng)基室溫培養(yǎng)20min；然后將上述轉(zhuǎn)染試劑混合液逐滴添加到預(yù)先接種HEK293細(xì)胞的100mm培養(yǎng)皿中，輕輕搖勻，放入37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱里培養(yǎng)；6個(gè)小時(shí)后取出培養(yǎng)皿，補(bǔ)加7ml DMEM完全培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

(8)培養(yǎng)48小時(shí)后，收集含有上述含有病毒的細(xì)胞培養(yǎng)液，使用0.45μm 低吸附無(wú)菌濾膜過(guò)濾并保留濾液。該病毒培養(yǎng)液可以直接使用或濃縮后使用，也可放置-80℃長(zhǎng)期保存。

(9)病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前一天，在6孔板中接種LM3細(xì)胞，每孔接種2×10⁵cells，次日細(xì)胞匯合度可達(dá)50～70％。

(10)病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)LM3細(xì)胞的6孔板，除去細(xì)胞培養(yǎng)液，將步驟(8)中獲得的含有病毒的細(xì)胞培養(yǎng)液添加到上述LM3細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每孔添加2.5ml，然后放入37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。

(11)次日從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出上述6孔板，除去含有病毒的培養(yǎng)液，添加含有體積濃度10％胎牛血清和終濃度1×P/S的DMEM新鮮培養(yǎng)液，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72小時(shí)。

(12)培養(yǎng)48～72小時(shí)以后，在熒光顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞發(fā)出綠色熒光。在培養(yǎng)液中添加終濃度為2μg/ml的Puromycin進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞系篩選。每三天更換一次含有2μg/ml Puromycin的DMEM新鮮培養(yǎng)液。連續(xù)篩選七周以上，直到熒光顯微鏡下可見(jiàn)所有細(xì)胞都發(fā)出綠色熒光，說(shuō)明獲得了穩(wěn)定生長(zhǎng)的陽(yáng)性細(xì)胞系。

(13)陽(yáng)性細(xì)胞系鑒定。取出部分篩選后的LM3細(xì)胞，分別采用細(xì)胞倒置熒光顯微鏡、RT-qPCR和Western Blot鑒定Midkine基因和蛋白的表達(dá)。采用該轉(zhuǎn)染方法，Midkine基因沉默效率可達(dá)80％以上，并且持續(xù)低表達(dá)，證明Midkine低表達(dá)LM3細(xì)胞系構(gòu)建成功。

(14)與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過(guò)調(diào)整慢病毒轉(zhuǎn)染時(shí)間、轉(zhuǎn)染體系等條件，獲得了穩(wěn)定低表達(dá)Midkine細(xì)胞系，該方法具有轉(zhuǎn)染效率高，能特異、持續(xù)、穩(wěn)定的低表達(dá)Midkine優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明為研究Midkine蛋白在肝癌中的作用機(jī)制與腫瘤能量代謝提供有力工具。

附圖說(shuō)明

圖1：pLenti-MDKshRNA重組質(zhì)粒的酶切圖；其中M表示λ-HindⅢdigest，泳道1表示重組質(zhì)粒，泳道2表示重組質(zhì)粒酶切圖。

圖2：低表達(dá)人Midkine基因的LM3穩(wěn)定細(xì)胞系在倒置熒光顯微鏡(100倍)的細(xì)胞熒光鑒定圖。

圖3：低表達(dá)人Midkine基因的LM3穩(wěn)定細(xì)胞系RT-qPCR鑒定圖。

圖4：低表達(dá)人Midkine基因的LM3穩(wěn)定細(xì)胞系Western Blot鑒定圖。泳道1為對(duì)照，泳道2為穩(wěn)定細(xì)胞系，抗體為Rabbit Anti-Midkine Antibody。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1、重組表達(dá)載體pLenti-MDKshRNA構(gòu)建

(1)從Open Biosystems公司購(gòu)買(mǎi)商品化帶有Midkine shRNA序列的pSM2載體。采用PCR方法擴(kuò)增Midkine shRNA基因，引物序列如下：

MDKshRNA Forward Primer:5′-AAGCCCTTTGTACACCCTAAGCCT-3′

MDKshRNA Reverse primer:5′-ACCTGGTGAAACTCACCCAGGGATT-3′

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：

PCR反應(yīng)條件：

(2)采用寶生物公司TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit將上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行清潔回收，并溶于110μl無(wú)菌水。操作步驟參照說(shuō)明書(shū)。

(3)將回收的PCR產(chǎn)物進(jìn)行Mlu I和Xho I雙酶切，酶切反應(yīng)體系如下：50μl酶切體系，分別添加5μl PCR產(chǎn)物、10U Mlu I、10U Xho I、5μl 10×H buffer，其余用dH2O補(bǔ)足，混勻后，放入37℃水浴孵育1小時(shí)。

(4)將酶切產(chǎn)物在1.2％～1.5％(g/ml)瓊脂糖凝膠上電泳，并進(jìn)行切膠回收。采用寶生物公司凝膠回收試劑盒TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit，參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作。Midkine shRNA片斷長(zhǎng)度為345bp，最終溶于50μl無(wú)菌水。

(5)采用NanoDrop1000測(cè)定Midkine shRNA片斷濃度。

(6)準(zhǔn)備慢病毒載體plenti。采用Mlu I和Xho I限制酶對(duì)重組質(zhì)粒pLenti進(jìn)行雙酶切，在37℃水浴孵育1小時(shí)；然后在0.8％瓊脂糖凝膠電泳，并切 膠回收線性載體。

(7)利用T4DNA連接酶將plenti線性載體和Midkine shRNA片斷，于16℃過(guò)夜連接。

(8)采用熱轉(zhuǎn)化方法，將上述連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化E.coli.DH5a感受態(tài)細(xì)胞后，在含有100μg/ml Ampicillin的LB培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)，次日提取pLenti-MDKshRNA重組質(zhì)粒。質(zhì)粒提取試劑盒采用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit，具體操作步驟參照說(shuō)明書(shū)。

(9)對(duì)提取的pLenti-MDKshRNA重組質(zhì)粒進(jìn)行Mlu I和Xho I雙酶切鑒定(見(jiàn)圖1)。酶切反應(yīng)體系如下：50μl酶切體系，含有1μg的pLenti-MDKshRNA重組質(zhì)粒、10U Mlu I、10U Xho I、5μl 10×H buffer，其余用dH2O補(bǔ)足，混勻后，放入37℃水浴孵育1小時(shí)；然后在1％(g/ml)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

實(shí)施例2、低表達(dá)Midkine穩(wěn)定細(xì)胞系的建立，具體實(shí)施步驟如下：

(1)將pLenti-MDKshRNA重組質(zhì)粒大量提取后，測(cè)定OD值。

(2)在100mm培養(yǎng)皿中接種1×106個(gè)HEK293T細(xì)胞，添加10ml含有10％胎牛血清、1×P/S的DMEM培養(yǎng)基，放入37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，次日細(xì)胞匯合度約50～70％。

(3)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。將重組質(zhì)粒pLenti-MDKshRNA和病毒包裝質(zhì)粒psPAX2、pVSVG按照10：9：1質(zhì)量比例混合到Opti-MEM基本培養(yǎng)液中，具體操作如下：分別將3μg pLenti-MDKshRNA重組質(zhì)粒、2.7μg psPAX2和0.3μg pVSVG包裝質(zhì)粒添加到580μl Opti-MEM基本培養(yǎng)液中，混合均勻，然后添加12μl Transfect Reagent(ThermoFisher)轉(zhuǎn)染試劑，混勻、室溫靜置20分鐘；取出HEK293T細(xì)胞，除去培養(yǎng)液，添加5ml PBS清洗一次；除去PBS溶液、添加3ml DMEM基本培養(yǎng)液室溫放置20min；然后將上述含有轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)液逐滴添加到HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)皿中，輕輕搖勻，放入37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱里培養(yǎng)；培養(yǎng)6小時(shí)以后，補(bǔ)加含有10％胎牛血清和終濃度1×P/S的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。

(4)培養(yǎng)48小時(shí)后，收集含有病毒的細(xì)胞培養(yǎng)液，采用0.45μm濾膜過(guò)濾含有病毒的細(xì)胞培養(yǎng)液，保留含有病毒的濾出液。該病毒培養(yǎng)液可以直接使用或濃縮后使用，也可以放置在-80℃長(zhǎng)期保存?zhèn)溆谩?/p>

(5)病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前一天，在6孔板中接種LM3細(xì)胞，每孔接入2×105cells，添加含有10％胎牛血清、1×P/S的DMEM培養(yǎng)基，放入37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，次日細(xì)胞匯合度約50～70％。

(6)病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，取出預(yù)先接種LM3細(xì)胞的6孔板，除去細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔添加2ml PBS清洗一次，除去PBS溶液，然后將步驟(3)獲得的病毒培養(yǎng)液，按照250μl/孔添加到6孔板中，輕輕混勻，放入CO₂培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24小時(shí)。

(7)次日取出6孔板，除去病毒培養(yǎng)液，每孔添加2.5ml含有10％胎牛血清、1×P/S的DMEM新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48～72小時(shí)。期間在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞是否發(fā)出綠色熒光。

(8)陽(yáng)性細(xì)胞系篩選。培養(yǎng)48～72小時(shí)以后，在熒光顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，然后在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加終濃度為2μg/ml Puromycin篩選陽(yáng)性細(xì)胞；每三天更換一次含有2μg/ml Puromycin的DMEM完全培養(yǎng)基，連續(xù)篩選七周以上，直到觀測(cè)到幾乎所有細(xì)胞都發(fā)出綠色熒光為止(見(jiàn)圖2)；當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80～90％時(shí)，按照1/5比例傳代，同時(shí)添加含有2μg/ml Puromycin的DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行篩選；也可以在熒光顯微鏡下挑取陽(yáng)性細(xì)胞簇，使用培養(yǎng)基稀釋到1cell/孔，利用96孔板篩選陽(yáng)性單克隆細(xì)胞系。

(9)低表達(dá)Midkine基因檢測(cè)。根據(jù)人Midkine基因的外顯子序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物(如下)。提取陽(yáng)性細(xì)胞系總RNA，進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，電泳檢測(cè)(結(jié)果如圖3)。核酸提取試劑和qPCR檢測(cè)試劑分別采用寶生物公司RNAiso Plus和One Step SYBR PrimeScrip RT-PCR Kit，操作步驟參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。引物序列如下：

MDK Forward Primer：5’-TGCCCTGCAACTGGAAGAA-3’

MDK Reverse Primer：5’-CTTGGTGACGCGGATGGT-3’

(10)轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)。提取穩(wěn)定細(xì)胞株總蛋白，采用BCA方法進(jìn)行蛋白定量，然后進(jìn)行Western Blot檢測(cè)Midkine蛋白表達(dá)量(見(jiàn)圖4)。具體操作方法如下：將Midkine低表達(dá)的LM3細(xì)胞傳代至100mm培養(yǎng)皿中，添加8ml預(yù)冷的PBS清洗1次，棄上清，加入350μl預(yù)冷的RIPA細(xì)胞裂解液(ThermoFisher)到上述培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿置于冰上裂解細(xì)胞30min，期間輕輕混勻幾次；然后使用預(yù)冷的細(xì)胞刮鏟將細(xì)胞快速刮下，并轉(zhuǎn)移到1.5ml離 心管中；然后12000rpm，4℃離心30min，小心吸取上清液，轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管中。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度(ThermoFisher)，操作方法參考產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。吸取20μg蛋白提取液，加入終體積1/5的4×SDS PAGE Loading Buffer，于100℃變性5min，進(jìn)行10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，恒定電壓80V；然后將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜，恒定電流250mA；轉(zhuǎn)膜后，將PVDF膜用質(zhì)量體積比為5％的脫脂奶粉(用TBST溶液配制)封閉1小時(shí)，然后加入TBST溶液洗膜3次，每次10min，加入rabbit anti-MDK抗體，于4℃過(guò)夜孵育。次日早上，回收一抗，添加TBST洗膜3次，每次10min，再加入鼠二抗，室溫孵育1小時(shí)，TBST洗膜3次，每次10min。加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑后進(jìn)行成像分析。如圖4所示，對(duì)照細(xì)胞可見(jiàn)Midkine蛋白帶，而轉(zhuǎn)染Midkine shRNA重組質(zhì)粒后該蛋白表達(dá)量很低，幾乎看不到條帶，沉默效率超過(guò)80％以上，表明Midkine低表達(dá)LM3細(xì)胞系構(gòu)建成功。

(11)將步驟(8)獲得的低表達(dá)Midkine的LM3穩(wěn)定細(xì)胞系，擴(kuò)大培養(yǎng)后，放置在液氮中長(zhǎng)期保存。