本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)組學(xué)研究方向復(fù)雜生物樣品預(yù)處理方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：，具體涉及酰肼化學(xué)法用于選擇性富集N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：：“鳥槍法”是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主流技術(shù)，在這種技術(shù)中，復(fù)雜蛋白質(zhì)組樣品首先用酶(主要是胰蛋白酶)酶解成肽的混合物，然后用一維或者多維分離技術(shù)對(duì)該酶解物進(jìn)行分離，并用二級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行檢測；利用所獲得的串聯(lián)質(zhì)譜譜圖，通過數(shù)據(jù)庫檢索來鑒定蛋白(文獻(xiàn)1.Yates,J.R.,TheRevolutionandEvolutionofShotgunProteomicsforLarge-ScaleProteomeAnalysis.JAmChemSoc,2013,135(5)，1629-1640.)。但是這種技術(shù)也存在一些問題，一個(gè)蛋白經(jīng)過酶解以后平均可以產(chǎn)生幾十種肽段，因此一個(gè)復(fù)雜的蛋白質(zhì)組樣品經(jīng)過酶解后所產(chǎn)生的肽的混合物是及其復(fù)雜的，可能含有幾十萬種不同的肽(文獻(xiàn)2.Zhang,H.；Li,X.J.；Martin,D.B.；Aebersold,R.,IdentificationandquantificationofN-linkedglycoproteinsusinghydrazidechemistry,stableisotopelabelingandmassspectrometry.Naturebiotechnology,2003,21(6),660-666.)。這樣來自高豐度蛋白的大量冗余肽段就會(huì)干擾低豐度蛋白的檢測和鑒定。為了解決這個(gè)問題，一個(gè)比較好的策略是通過對(duì)蛋白質(zhì)的特征肽段進(jìn)行富集來對(duì)蛋白質(zhì)的酶解液進(jìn)行簡化，去掉冗余的肽段，從而降低分離分析的強(qiáng)度。在國際上，目前已經(jīng)發(fā)展了多種樣品預(yù)處理方法來簡化蛋白質(zhì)組樣品酶解液的復(fù)雜度，其中把含有特定稀有氨基酸殘基如半胱氨酸(文獻(xiàn)3.Giron,P.；Dayon,L.；David,F.；Sanchez,J.C.；Rose,K.,EnrichmentofN-terminalcysteinyl-peptidesbycovalentcapture.JProteomics,2009,71(6),647-61.)，組氨酸(文獻(xiàn)4.Mesmin,C.；Domon,B.,ImprovementofthePerformanceofTargetedLC-MSAssaysthroughEnrichmentofHistidine-ContainingPeptides.JProteomeRes,2014,13(12),6160-6168.)，色氨酸(文獻(xiàn)5.Yu,Y.；Liu,M.；Yan,G.；He,Y.；Xu,C.；Shen,H.；Yang,P.,Hydrazide-functionalizedmagneticmicrospheresfortheselectiveenrichmentofdigestedtryptophan-containingpeptidesinserum.Talanta,2011,85(2),1001-1006.)等的肽段富集出來是比較常用的方法。并且這些特定的氨基酸殘基的存在還能提高蛋白鑒定的可靠性。除了上述的氨基酸殘基，N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段也比較特殊，其N-端的絲氨酸或者蘇氨酸的1,2-氨基醇結(jié)構(gòu)與糖肽中的順式二醇結(jié)構(gòu)類似，也可以被高碘酸鈉氧化為醛基，從而被酰肼材料捕獲。因此用于富集糖肽的酰肼化學(xué)法(文獻(xiàn)6.Nilsson,J.；Ruetschi,U.；Halim,A.；Hesse,C.；Carlsohn,E.；Brinkmalm,G.；Larson,G.,Enrichmentofglycopeptidesforglycanstructureandattachmentsiteidentification.Naturemethods,2009,6(11),809-U26.)也可以用于N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段的富集。本發(fā)明正是利用酰肼化學(xué)法開發(fā)了一種基于固相捕獲-釋放的富集蛋白質(zhì)組樣品酶解液中N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段的方法。通過高碘酸鈉氧化，酰肼材料捕獲，鹽酸羥胺釋放(文獻(xiàn)7.Dirksen,A.；Yegneswaran,S.；Dawson,P.E.,Bisarylhydrazonesasexchangeablebiocompatiblelinkers.AngewandteChemie,2010,49(11),2023-7.)，最終只有N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段進(jìn)行LC-MS/MS分析。這樣去除了大量的冗余肽段，從而大大降低了樣品的復(fù)雜度以利于低豐度蛋白的鑒定和分析。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種可以簡便、高效、高特異性的富集復(fù)雜蛋白樣品蛋白酶解液中N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段的方法。本發(fā)明提供的方法是利用酰肼材料可以與高碘酸鈉氧化后的N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段上的醛基發(fā)生反應(yīng)，從而將N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段從復(fù)雜樣品蛋白酶解液中富集分離出來，然后通過質(zhì)譜分析得到樣品的肽段和蛋白鑒定結(jié)果。本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：取生物樣品，使用胰蛋白酶Trypsin酶解，并用PNGaseF酶去除糖鏈，然后用高碘酸鈉將蛋白酶解液中的N-端為絲氨酸/蘇氨酸的肽段選擇性氧化為N-端為醛基結(jié)構(gòu)的肽段，之后利用酰肼材料富集氧化后的肽段并使用鹽酸羥胺處理，最后對(duì)釋放的肽段進(jìn)行LC-MS/MS分析來獲得肽段和蛋白的鑒定結(jié)果。所述的肽段選擇性富集方法具體步驟如下：(1)取生物樣品，溶解在含6-8MUrea和50-100mMTEAB的緩沖溶液中，加入終濃度為10-20mMDTT，37-60℃水浴中1-3h，然后加入終濃度為20-40mMIAA，20-25℃避光反應(yīng)40-60min，生物樣品在緩沖溶液的濃度為1-10mg/mL；(2)步驟(1)結(jié)束后得到的樣品，用含50-100mMTEAB的水溶液按將Urea濃度稀釋至0.5-1M的比例稀釋，然后加入與蛋白質(zhì)量比為1/50-1/25的胰蛋白酶Trypsin，37℃水浴中酶解12-16h，得到肽段溶液；(3)步驟(2)結(jié)束后得到的樣品，用截留分子量為3-30K的超濾管在離心力為2000-20000g下進(jìn)行超濾離心，得到濾出液；(4)向步驟(3)得到的溶液中加入與肽段質(zhì)量比為500Unites/mg-1000Unites/mg的PNGaseF，然后置于37℃水浴中酶切1-10h；(5)向步驟(4)得到的肽段溶液中加入三氟乙酸調(diào)pH至2-3，然后用C18固相萃取柱除去溶液中的小分子，將得到的肽段洗脫液冷凍干燥；(6)將100-1000μg步驟(5)得到的蛋白質(zhì)組樣品酶解肽段復(fù)溶于100-1000μL的氧化緩沖溶液中；(7)向上述步驟(6)的溶液中加入高碘酸鈉，使其終濃度為0.2-20mM，在4-37℃溫度下避光反應(yīng)10-100min；(8)向上述步驟(7)的溶液中加入硫代硫酸鈉，使其終濃度為0.4-40mM，在4-37℃溫度下反應(yīng)10-30min；(9)將上述步驟(8)的溶液加入10-200μL酰肼材料中，在振蕩器上渦旋震蕩12-36h后通過離心分離的方法去除上清液，上清液為非N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段的混合溶液；(10)將洗滌溶液加入上述步驟(9)得到的酰肼材料中，在振蕩器上渦旋震蕩1-10min后通過離心分離的方法去除上清液，上清液為酰肼材料上非特異性吸附的肽段的混合溶液；(11)向上述步驟(10)得到的酰肼材料中加入100-1000μL鹽酸羥胺溶液中，在25-40℃水浴中孵育12-36h，然后通過離心分離，收集上層清液，加入三氟乙酸調(diào)pH至2-3，然后用C18固相萃取柱除去溶液中的小分子，將得到的肽段洗脫液冷凍干燥即得到富集后的N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段。步驟(6)氧化緩沖溶液組成為10-200mM乙酸鈉和10-200mM氯化鈉，其余為水，pH值為3.0-6.5。步驟(9)中渦旋振蕩時(shí)溫度控制在10-40℃；步驟(9)、步驟(10)和步驟(11)中離心機(jī)的離心力為500g-3000g。步驟(10)中的洗滌溶液依次為10-300mM氯化鈉水溶液，50％-100％乙腈水溶液以及0.1％-3％氯化鈉水溶液，每種洗滌溶液分別連續(xù)洗滌1-6次。步驟(11)中的鹽酸羥胺溶液的組成為10-200mM乙酸鈉和50-300mM鹽酸羥胺，其余為水，pH值為2.5-6.5。將上述步驟(11)中得到的N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段復(fù)溶在0.1％體積濃度的甲酸中進(jìn)行RPLC-MS/MS分析。該方法特異性高，能降低酶解液的復(fù)雜度，促進(jìn)低豐度蛋白的鑒定，可用于復(fù)雜生物樣品的蛋白質(zhì)組分析。所述的肽段選擇性富集方法，所用的肽段富集材料為商品化的酰肼修飾的瓊脂糖凝膠(75-300μm)(Hercules,CA,U.S.A.)。所述的肽段選擇性富集方法，蛋白酶解液中只有N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段才可以被選擇性氧化，從而被酰肼材料富集。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：該富集方法簡單，易于操作，特異性高，樣品富集前后鑒定結(jié)果有很高的互補(bǔ)性，是一種序列特異性富集方法。本發(fā)明是首次將酰肼材料用于N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段的富集，結(jié)合高分辨率的RPLC-MS/MS分析，降低了樣品的復(fù)雜度，有利于低豐度蛋白的鑒定和分析。其序列特異性富集的特性在分析蛋白質(zhì)的細(xì)胞成分，蛋白質(zhì)的分子作用等方面有很大的應(yīng)用前景。附圖說明圖1為所述復(fù)雜蛋白質(zhì)組樣品酶解液中N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段富集方法的流程圖。酶解后得到的肽段混合物用高碘酸鈉進(jìn)行氧化，得到的混合物與酰肼材料進(jìn)行渦旋振蕩，在洗去非特異性吸附的冗余肽段后，使用鹽酸羥胺將與微球結(jié)合的肽段釋放下來進(jìn)行LC-MS/MS分析。圖2為所述復(fù)雜蛋白質(zhì)組樣品酶解液中N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段富集方法， 用于鼠肝蛋白質(zhì)組學(xué)分析的肽段鑒定數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)組(富集后的樣品)和對(duì)照組(富集前的樣品)都分別進(jìn)行了三次技術(shù)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。(a)富集前后肽段的鑒定結(jié)果。(b)富集前后鑒定到肽段的Weblogo圖。圖3為所述復(fù)雜蛋白質(zhì)組樣品酶解液中N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段富集方法，用于鼠肝蛋白質(zhì)組學(xué)分析的蛋白質(zhì)鑒定數(shù)據(jù)。(a)富集前三次技術(shù)重復(fù)的蛋白質(zhì)鑒定數(shù)目，(b)富集后三次技術(shù)重復(fù)的蛋白質(zhì)鑒定數(shù)目，(c)富集前后蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果的overlap。圖4為所述復(fù)雜蛋白質(zhì)組樣品酶解液中N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段富集方法，用于人血清蛋白質(zhì)組學(xué)分析的蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果。實(shí)驗(yàn)組(富集后的樣品)和對(duì)照組(富集前的樣品)都分別進(jìn)行了三次技術(shù)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，圖中的結(jié)果為三次技術(shù)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。具體實(shí)施方式下面通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。實(shí)施例1N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段富集方法用于鼠肝蛋白質(zhì)組學(xué)分析：(1)取1mg鼠肝蛋白質(zhì)樣品，溶解在含8MUrea和100mMTEAB(四乙基溴化銨)的緩沖溶液中(pH8.0)，加入終濃度為20mMDTT，60℃水浴中1h，然后加入終濃度為40mMIAA，25℃避光反應(yīng)40min以封閉巰基；(2)用100mMTEAB(pH8.0)稀釋Urea濃度至1M，然后加入25μg胰蛋白酶，37℃水浴中酶解16h；(3)用截留分子量為10K的超濾管在14000g離心力下對(duì)上述得到的溶液進(jìn)行超濾離心，得到濾出液；(4)加入500Unites的PNGaseF酶，然后置于37℃水浴中酶切6h；(5)用三氟乙酸調(diào)pH至2.5，然后C18固相萃取柱除去溶液中的小分子，將得到的肽段洗脫液冷凍干燥；(6)將200μg得到的酶解肽段復(fù)溶于400μL氧化緩沖溶液中,加入終濃度為2mM的高碘酸鈉，25℃溫度下避光反應(yīng)60min；然后加入4mM硫代硫酸鈉，25℃下反應(yīng)15min以猝滅氧化反應(yīng)；(7)將上述溶液加入40μL酰肼材料中，在25℃振蕩器上渦旋震蕩24h，之后在1400g離心力作用下離心去除上清液；(8)用150mMNaCl水溶液、80％(v/v)乙腈、0.9％NaCl水溶液各連續(xù)洗滌上述酰肼材料3次，以洗去非特異性吸附的肽段，并將酰肼材料分散在200μL鹽酸羥胺水溶液中，于37℃水浴中孵育16h；(9)收集上層清液，用三氟乙酸調(diào)pH至2.5，然后用C18固相萃取柱除去溶液中的小分子，將得到的肽段洗脫液冷凍干燥即得到富集的N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段混合物；(10)將上述得到的肽段混合物用0.1％(v/v)甲酸復(fù)溶進(jìn)行RPLC- MS/MS分析。圖2為肽段的鑒定結(jié)果，對(duì)比富集前后總的肽段鑒定數(shù)目以及N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段所占的比例，可以看出富集以后肽段的總數(shù)減少但是N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段的比例卻由富集之前的15.0％增加到93.5％，說明這種固相捕獲-釋放方法將N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段從復(fù)雜蛋白質(zhì)組樣品酶解液中富集出來可以有效降低樣品的復(fù)雜程度，并且具有很高的富集特異性。由Weblogo圖可以更直觀地看出該方法的特異性很高，而且還是一種序列特異性富集方法。圖3為蛋白質(zhì)的鑒定結(jié)果，從圖中可以看出富集前和富集后三次技術(shù)重復(fù)鑒定結(jié)果的overlap都很高，有60％～70％，但是分別合并富集前和富集后三次技術(shù)重復(fù)的結(jié)果，再對(duì)比發(fā)現(xiàn)兩者的overlap只有37％，這么低的overlap說明富集后和富集前的鑒定結(jié)果有很高的互補(bǔ)性。并且，從圖中還可以發(fā)現(xiàn)，有500多個(gè)蛋白是富集之后新鑒定到的，由于這些蛋白的豐度較低，直接分析不容易鑒定的到。而該富集方法選擇性的將N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段富集出來，去掉了高豐度蛋白冗余肽段，從而有利于低豐度蛋白的鑒定。實(shí)施例2N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段富集方法用于人血清蛋白質(zhì)組學(xué)分析：本實(shí)驗(yàn)所用的人血清由大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院(大連，中國)提供。樣品的取得和使用完全合法，并符合該院倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定。人血清蛋白樣品中N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段的富集實(shí)驗(yàn)操作同實(shí)施例1鼠肝蛋白實(shí)驗(yàn)流程。圖4為N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段富集前后鑒定到的蛋白譜圖數(shù)目分布圖，從圖中可以看出富集前后鑒定到蛋白的譜圖數(shù)目發(fā)生了很大的變化，富集后的蛋白集中在低譜圖鑒定數(shù)目區(qū)(小于8)，并且高譜圖鑒定數(shù)目(大于32)的蛋白總數(shù)也大大減少，例如血清中豐度最高的蛋白，血清白蛋白，其譜圖數(shù)目從富集前的1583降低至富集后的244，這就說明通過N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段的富集可以有效降低血清蛋白樣品酶解液的復(fù)雜程度，從而有利于血清中一些低豐度蛋白的鑒定。總之，本發(fā)明為一種基于酰肼化學(xué)法來選擇性富集復(fù)雜蛋白質(zhì)組樣品酶解液中N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段來降低樣品的復(fù)雜度，從而促進(jìn)低豐度蛋白鑒定的方法。該方法原理簡單，容易操作，富集特異性高，能有效降低蛋白質(zhì)組樣品酶解液的復(fù)雜度，促進(jìn)低豐度蛋白的鑒定。當(dāng)前第1頁1 2 3 當(dāng)前第1頁1 2 3