本發(fā)明涉及一種動物產(chǎn)地來源的鑒定方法、鑒定模型的建立方法及其應用，具體涉及一種通過動物腸道微生物鑒定產(chǎn)地來源的方法及通過動物腸道微生物建立鑒定模型的方法及其應用。
背景技術：
：產(chǎn)地來源的鑒定涉及動物品種及具有產(chǎn)地品牌價值的商品鑒定，利用腸道微生物的方法和鑒定模型的建立方法可高效的鑒定動物的產(chǎn)地來源。以大閘蟹為例：大閘蟹是人們鐘愛的美食，由于陽澄湖大閘蟹的品牌競爭力，不少其它品牌的大閘蟹打著陽澄湖大閘蟹的旗號進行商業(yè)活動。據(jù)統(tǒng)計，陽澄湖的水域面積有限，真正的陽澄湖大閘蟹每年的產(chǎn)量只有2300噸左右，而市場上卻有300多個城市在售賣該品牌的大閘蟹，僅北京每年的陽澄湖大閘蟹消費量就有700噸，市場消費總量遠遠超出了其實際產(chǎn)量。僅從外表很難分辨出陽澄湖大閘蟹、塘蟹和外地蟹的區(qū)別。同時，還存在洗澡蟹、塘蟹冒充湖蟹等現(xiàn)象。由此可見，大閘蟹市場假冒偽劣現(xiàn)象極為嚴重。假冒偽劣的商品嚴重損害了商家的品牌形象，同樣也損害了廣大消費者的利益。陽澄湖大閘蟹在進化上屬于中華絨螯蟹，由長江水域自然生長或從國家原種場及陽澄湖親本基地選育而成。中華絨螯蟹主要分布于甌江以北的大片水域，與分布于北緯26°以南的南方各水系的合浦絨螯蟹，是我國大陸各水系的2個主要的河蟹亞種。目前，已有方法從基因的角度對大閘蟹的品種進行鑒定。中華絨螯蟹包含一個特有的Opp17基因，這對這個基因設計特異的擴增引物，根據(jù)擴增結果即可判斷大閘蟹是否為中華絨螯蟹。已有研究表明，中華絨螯蟹在16SrDNA中的ITS2區(qū)域存在一定的復雜性，不同水系來源的中華絨螯蟹的基因型不同。通過基因分型技術，即可判斷大閘蟹的水性來源。但是由于多年以來各水系中華絨螯蟹培育苗種的盲目放流，加上人工養(yǎng)殖群體向自然水體的逃逸，打破了各水系中華絨螯蟹的天然分布格局，各水系中華絨螯蟹群體間的基因交流非常頻繁，由此產(chǎn)生了中華絨螯蟹的種質(zhì)混雜問題。目前，長江水系中華絨螯蟹種質(zhì)混雜現(xiàn)象在生產(chǎn)中已有所體現(xiàn)，主要表現(xiàn)為性早熟比例增加、肉質(zhì)較差、成蟹規(guī)格小、抗病能力低下等特征。因此，從通過基因檢測只能鑒定到大閘蟹是否為中華絨螯蟹，而其水系來源鑒定則存在很大的困難。因此，一種能夠鑒定大閘蟹產(chǎn)地來源的方法需要被開發(fā)出來。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的一是提供一種鑒定動物產(chǎn)地來源的方法和動物產(chǎn)地來源鑒定模型的建立方法。本發(fā)明的目的二是提供一種鑒定螃蟹產(chǎn)地來源的方法和螃蟹產(chǎn)地來源鑒定模型的建立方法。本發(fā)明的目的三是提供一種鑒定大閘蟹產(chǎn)地來源的方法和大閘蟹產(chǎn)地來源鑒定模型的建立方法。本發(fā)明目的四是公開了上述產(chǎn)地來源鑒定模型的建立方法在動物產(chǎn)地來源鑒定中的應用。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術方案：本發(fā)明公開了一種動物產(chǎn)地來源的鑒定方法，包括如下步驟：1)獲取動物腸道微生物的豐度信息；2)將豐度信息進行關聯(lián)分析，根據(jù)分析結果判斷動物的產(chǎn)地來源。在本發(fā)明的實施例中，所述的動物為螃蟹；具體地，所述的動物為大閘蟹；更為具體地，所述的動物為陽澄湖大閘蟹、太湖大閘蟹。需要說明的是獲取動物腸道微生物的豐度信息的方法有多種，本發(fā)明的實施例中公開的方法為利用微生物分子鐘序列信息對微生物進行分類，并統(tǒng)計各種微生物的豐度信息。所謂的分子鐘區(qū)域指的是能反映物種進化關系的序列，可作為生物分類的分子依據(jù)。凡是能作為分子鐘區(qū)域都可作為目標序列進行分析，并以此對微生物進行分類，例如16SV5-V4，V6區(qū)域。本發(fā)明的實施方案中公開了腸道微生物分子鐘區(qū)域為16S區(qū)域；優(yōu)選地，腸道微生物分子鐘區(qū)域為16SV5-V4區(qū)域；更為優(yōu)選地，腸道微生物分子鐘區(qū)域為16SDNAV5-V4區(qū)域。獲取16SDNAV5-V4區(qū)域信息，可采用PCR方法，亦可采取序列捕獲、高通量測序等方法，用PCR方法時，根據(jù)目的區(qū)域信息設計引物序列，進行擴增獲取目標片段，根據(jù)不同的平臺采取不同的后續(xù)操作步驟進行測序。上面所述的鑒定方法步驟2)中關聯(lián)分析所用的方法為主成分分析或者聚類分析方法，在利用主成分分析方法進行分析時，分析結果包括PC1、PC2，可根據(jù)PC1、PC2整體分布區(qū)域進行判斷，也可僅利用PC1數(shù)值進行判斷；利用聚類分析時，根據(jù)聚類情況判斷是否屬于同一聚類，從而判斷產(chǎn)地來源是否相同。動物腸道微生物種類及微生物的豐度分布因動物種類及產(chǎn)地不同而不同，所謂的動物種類指不同的動物類別或同一類別動物的不同品種，所謂的動物品種指的生物學意義上的分類。不同產(chǎn)地來源的大閘蟹在生物意義分類上屬于同一品種。具體大閘蟹而言，基于上面所述的鑒定方法，步驟i)中所述的微生物包括擬桿菌門和變形菌門；優(yōu)先地，步驟1)所述的腸道微生物包括擬桿菌門、變形菌門、放線菌門、藍細菌門、厚壁菌門、浮霉菌門、軟壁菌門、疣微菌門；步驟2)根據(jù)PC1的數(shù)值判斷大閘蟹的產(chǎn)地來源，具體為：當PC1<12，判斷大閘蟹產(chǎn)地來源為陽澄湖；本發(fā)明還公開了一種動物產(chǎn)地來源鑒定模型的建立方法，包括如下步驟：i.采集各產(chǎn)地來源動物的建模數(shù)據(jù)庫，所謂的建模數(shù)據(jù)庫為每個動物腸道微生物的豐度信息；ii.將豐度信息用于關聯(lián)分析，分析結果圖譜特征作為動物產(chǎn)地來源鑒定模型。步驟i)所述的采集建模數(shù)據(jù)庫，通過采集一定數(shù)量的同一產(chǎn)地的同一種動物的腸道微生物的豐度信息，構建數(shù)據(jù)庫，如采集一定數(shù)量的螃蟹腸道微生物的豐度信息作為建模數(shù)據(jù)庫，具體的可采集陽澄湖大閘蟹腸道微生物的豐度信息作為建模數(shù)據(jù)庫。上面所述的建立方法步驟ii)所述的關聯(lián)分析所用的方法為主成分分析或者聚類分析方法，分析結果圖譜特征包括：利用主成分分析方法進行分析時，分析結果圖譜特征包括PC1、PC2整體分布區(qū)域或者PC1數(shù)值分布；利用聚類分析時，析結果圖譜特征為是否歸屬同一聚類。需要說明的是步驟i)獲取動物腸道微生物的豐度信息的方法有多種，如涂平板等方法，本發(fā)明的實施例中公開的方法為利用微生物分子鐘序列信息對微生物進行分類，并統(tǒng)計各種微生物的豐度信息。所謂的分子鐘區(qū)域指的是能反映物種進化關系的序列，可作為生物分類的分子依據(jù)。凡是能作為分子鐘區(qū)域都可作為目標序列進行分析，并以此對微生物進行分類，例如16SV5-V4，V6區(qū)域。本發(fā)明的實施方案中公開了腸道微生物分子鐘區(qū)域為16S區(qū)域；優(yōu)選的，腸道微生物分子鐘區(qū)域為16SV5-V4區(qū)域；更為優(yōu)選的，腸道微生物分子鐘區(qū)域為16SDNAV5-V4區(qū)域。動物腸道微生物種類及微生物的豐度分布因動物種類及產(chǎn)地不同而不同，所謂的動物種類指不同動物類別或同一類別動物的不同品種，所謂的動物品種指的生物學意義上的分類。不同產(chǎn)地來源的大閘蟹在生物意義分類上屬于同一品種。具體大閘蟹而言，基于上面所述的建立方法，步驟i)中所述的微生物包括擬桿菌門和變形菌門；優(yōu)先地，步驟1)所述的腸道微生物包括擬桿菌門、變形菌門、放線菌門、藍細菌門、厚壁菌門、浮霉菌門、軟壁菌門、疣微菌門；步驟2)根據(jù)PC1的數(shù)值范圍判斷大閘蟹的產(chǎn)地來源，具體為：當PC1<12，判斷大閘蟹產(chǎn)地來源為陽澄湖；本發(fā)明還公開了上述鑒定模型的建立方法在動物產(chǎn)地來源鑒定中的應用。本
技術領域：
人員可理解上述方法和鑒定模型的建立方法適用的動物不局限于大閘蟹，還包括其它動物，如其它種類的螃蟹、蝦、各種家畜及野生動物等產(chǎn)地來源的鑒定，對于大閘蟹產(chǎn)地來源的鑒定不局限于陽澄湖、太湖來源，同樣適用洪澤湖、固城湖等湖泊，以及長江、閩江、甌江，以及海洋等水系來源的大閘蟹的鑒定。發(fā)明的有益效果：通過對動物腸道微生物的關聯(lián)分析可鑒定動物的產(chǎn)地來源；通過對大閘蟹腸道微生物采用關聯(lián)分析，可鑒定大閘蟹的產(chǎn)地來源。此方法和鑒定模型的建立方法可用于對動物產(chǎn)地來源進行鑒定，優(yōu)選地，可用于對大閘蟹產(chǎn)地來源進行鑒定。當PC1<12，判斷大閘蟹來源于陽澄湖；屬于同一產(chǎn)地來源的相同動物腸道微生物主成分分析結果PC1、PC2分布在相同區(qū)域，聚類分析結果中歸為同一類。附圖說明本發(fā)明結合下面附圖，實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中：圖1是：陽澄湖大閘蟹和太湖大閘蟹腸道微生物的主成分分析圖。其中1A，2A，3A，4A，5A，6A為陽澄湖大閘蟹；7A，8A，9A，10A為太湖大閘蟹。圖2是：陽澄湖大閘蟹和太湖大閘蟹腸道微生物的聚類分析。其中1A，2A，3A，4A，5A，6A為陽澄湖大閘蟹；7A，8A，9A，10A為太湖大閘蟹。具體實施方式為了使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結合附圖對本發(fā)明作進一步的詳細闡述。通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實施例中未注明具體技術或條件的，按照本領域內(nèi)的文獻所描述的技術或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實施例、測定大閘蟹的腸道微生物大閘蟹腸道微生物的測定按照如下步驟進行：1.腸道微生物DNA的提取采集6只陽澄湖大閘蟹和4只太湖大閘蟹做好標記，并分別采集這10只大閘蟹的腸道微生物樣品置于2mlEP管中。樣品信息如表1所示：表1：樣品樣品來源樣品名稱陽澄湖大閘蟹1A，2A，3A，4A，5A，6A太湖大閘蟹7A，8A，9A，10A按照《腸道微生物DAN提取方法》中的指導，進行DNA提取。1)在裝有待提取樣品的EP管中加入細胞裂解液。同時加入500ul直徑為0.1mm的玻璃珠，2)將該樣品管置于高通量組織破碎儀中，破碎處理10min。(振蕩程序：25次/s，10min)，3)置于70℃水浴鍋中處理1h，4)4℃，14000rpm，離心5min，5)取上清液至新的2mL離心管B中，6)利用苯酚氯仿萃取法，進行DNA的提取。苯酚萃取兩次，氯仿萃取兩次7)萃取完后，得到的上清液中加入1/10體積的3M醋酸鈉溶液，加入二倍體積的無水乙醇，充分混勻，-20℃靜置過夜，8)4℃，14000rpm，離心15min，9)去上清，加入500μL預冷的70％乙醇，懸浮沉淀，充分洗滌。4℃，14000rpm，離心10min。重復一次10)最后得到的DNA利用100μLTE溶液溶解。DNA溶解后置于-20℃冰箱備。2.16S中V5-V4區(qū)域擴增構建測序文庫將上述步驟1中準備的DNA樣品作為模板，利用16S中V5-V4區(qū)域的引物進行PCR擴增，所用引物序列如下：正向引物515F：5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’反向引物907R：5’-CCGTCAATTCMTTTRAGT-3’注：M代表A/C，R代表A/GPCR反應體系，如表2所示：表2：PCR反應體系組成體積TakaraExTaq(5U/μL)0.25μL10xExTaqbuffer(Mg2+Plus)5μLdNTPMixture(2.5mMeach)4μL反向引物907R(20pmol/μL)1μL正向引物515F(20pmol/μL)1μL分子級水37.75μL模板DNA(20ng)1μL總體積50ulPCR反應條件如下PCR產(chǎn)物經(jīng)磁珠純化后，用于PGM平臺測序，純化步驟如下：將PCR反應產(chǎn)物轉移至1個1.5mL離心管中，用AMPureXPDNAPurificationkit(SPRIbeads，BioCanal)純化擴增后的樣品。1)取出4℃保存的AmpureXPBeads，室溫放置30min平衡；2)使用前振蕩均勻，按照樣品體積1.0倍體積加入磁珠(50ul)并混勻，靜置5min,瞬時離心3秒。3)將1.5mL離心管轉移放置在磁力架上,靜置3-5min至澄清；4)小心吸去上清，不要觸及磁珠(1.5mL離心管放在磁力架上)；5)加入500μL70％乙醇，輕輕吹打磁珠2-3次，等待30秒，棄上清(加入乙醇時應緩緩加入，盡量不要讓液體往磁珠方向添加，否則會使磁珠脫離管體而損耗。)6)重復步驟5)，盡量去除上清(此步不需要吹打磁珠)。7)置恒溫混勻儀37℃干燥3-5min左右,磁珠表面沒有水分即可。(仔細觀察磁珠情況，避免磁珠干裂之后再持續(xù)加熱，持續(xù)加熱有使磁珠崩離加樣孔的潛在風險，造成損失和樣品間污染，個別未干孔可取離干燥儀靜置風干)。8)往1.5mL離心管中加入30μLnuclease-freewater，充分混勻，靜置5min，然后置于磁力架約5min至澄清。9)將30μL澄清液轉移至事先準備好的新1.5mL離心管中(轉管時需要特別注意將轉移至對應管中,避免出錯)。3.高通量測序及序列分析將所得PCR產(chǎn)物在PGM(PersonalGenomeMachine)平臺進行16SV5-V4區(qū)域的測序。分析結果利用分析軟件mothur軟件(http://www.mothur.org/wiki/Mothur_manual)進行分析。分析內(nèi)容包括OTU(運算的分類單位operationaltaxonomicunit)聚類等分析，從而計算出每個樣品在每一個OUT上的豐度信息，如表3。本發(fā)明中OUT采用的分類單位為“門”。表3：微生物豐度通過對OTU物種注釋的結果，對大閘蟹腸道微生物組成進行分析，可以明顯看出以門為分類單位時，兩種產(chǎn)地大閘蟹腸道微生物有著很大的區(qū)別。如表3所示，兩地區(qū)大閘蟹的腸道微生物組成上有明顯差異，主要表現(xiàn)在擬桿菌門(Bacteroidetes)和變形菌門(Proteobacteria)豐度上的差異。本領域的技術人員可以理解，高通量測序方法不局限于PGM平臺，利用第二代、第三代測序平臺都可達到相同的效果，如Illumina平臺，CG平臺等，利用這些平臺時根據(jù)各平臺的測序特點構建與之相適應的測序文庫。4.主成分分析PCA根據(jù)每個樣品的OTU豐度信息，在此基礎上進行主成分分析(PrincipalComponentAnalysis，PCA):將各個樣品的所有微生物豐度導入SPSS(StatisticalProductandServiceSolutions)軟件中，計算各微生物豐度間的相關性，并通過線性變換，挑選出最具代表性的兩個變量，即PC1和PC2。PC1與PC2的數(shù)值如表4所示，表4：PC1與PC2根據(jù)表4作圖，如圖1，通過圖1我們可以看出，通過第一主成分PC1和第二主成分PC2整體分布區(qū)域或者通過第一主成分PC1的分布范圍可將陽澄湖大閘蟹和太湖大閘蟹分別歸類為不同的組群，兩個組群可以明顯的分開，從而可以看到陽澄湖大閘蟹的腸道微生物和太湖大閘蟹的腸道微生物有很大的差異。進一步地，由圖1可知，PC1<12時，所述的大閘蟹為陽澄湖大閘蟹。據(jù)此標準，可以判斷大閘蟹是否來源于陽澄湖。5.聚類分析利用mothur軟件(http://www.mothur.org/wiki/Mothur_manual)做聚類分析，輸入表3中微生物的豐度信息，選擇非加權距離進行聚類分析，結果如圖2。來自于兩個不同地區(qū)的大閘蟹的腸道微生物樣品聚成兩個大類。聚類分析結果顯示，陽澄湖大閘蟹和太湖大閘蟹分別屬于兩個獨立的類群，區(qū)分效果較好，與主成分分析方法得到的區(qū)分結果一致。最后需要說明的是，以上實施例僅用說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)化的實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了描述，但本領域的普通技術人員應當理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權利要求及其等同物限定。當前第1頁1 2 3