本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種抗體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

在正常生理?xiàng)l件下，血管的生成是一個(gè)受多個(gè)環(huán)節(jié)嚴(yán)密調(diào)節(jié)的過(guò)程，對(duì)修復(fù)和維持機(jī)體的正常功能具有重要的作用。然而，如果腫瘤內(nèi)部血管快速生長(zhǎng)，則是臨床常見(jiàn)的現(xiàn)象之一。大量的動(dòng)物模型和人體臨床試驗(yàn)表明，阻斷腫瘤內(nèi)新生血管的形成可以有效地阻止腫瘤的生長(zhǎng)和引發(fā)腫瘤細(xì)胞的死亡，從而達(dá)到對(duì)腫瘤的治療作用。因此，抑制血管新生是目前抗腫瘤新藥研究的重要方向之一，另外，對(duì)于老年性視網(wǎng)膜血管病變(Age-related macular degeneration，簡(jiǎn)稱(chēng)為AMD)、糖尿病視網(wǎng)膜病變、關(guān)節(jié)炎等多種與血管新生相關(guān)的疾病，抑制血管新生的治療新藥也有廣泛和重要的作用。血管新生是一個(gè)由多種活性生物因子進(jìn)行調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程，其中一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)是內(nèi)皮細(xì)胞表面受體與多種生長(zhǎng)因子相結(jié)合從而被激活，然后經(jīng)細(xì)胞內(nèi)酪氨酸磷酸化的信號(hào)傳遞系統(tǒng)控制內(nèi)皮細(xì)胞活動(dòng)，從而促使血管新生。在多種生長(zhǎng)因子中，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial cell growth factor，簡(jiǎn)稱(chēng)為VEGF)是控制血管新生最重要的因子，是誘導(dǎo)和促進(jìn)血管形成作用最強(qiáng)、最專(zhuān)一的血管生長(zhǎng)因子，在幾乎所有的人體腫瘤中都過(guò)量表達(dá)，是抗癌研究的一個(gè)重要分子靶標(biāo)。VEGF在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面上有多種受體，其中包括VEGFR-1(又稱(chēng)為Flt-1)和VEGFR-2(又稱(chēng)為KDR或Flk-1)，它們的細(xì)胞外部分均由七個(gè)可與VEGF相結(jié)合的免疫球蛋白樣區(qū)域(D1-D7)組成，細(xì)胞內(nèi)部分均包括酪氨酸激酶基團(tuán)。當(dāng)受體被VEGF激活后，細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸激酶基團(tuán)發(fā)生磷酸化，并導(dǎo)致一系列的信號(hào)傳遞，最終引發(fā)血管新生。由于VEGF信號(hào)傳遞對(duì)血管新生的重要性，阻斷VEGF或VEGF受體從而達(dá)到抑制血管新生具有重要的抗癌作用，同時(shí)也對(duì)其他包括視網(wǎng)膜血管病變等與血管新生相關(guān)的疾病有著重要的治療作用。

在藥物的研制過(guò)程以及后期臨床應(yīng)用過(guò)程中，藥代動(dòng)力學(xué)研究數(shù)據(jù)是必不可少的，因?yàn)樗苯雨P(guān)系到藥物的安全性和有效性。為了檢測(cè)血清中抑制VEGF生長(zhǎng)的藥物的濃度變化，更好的分析抑制VEGF生長(zhǎng)的藥物的藥代動(dòng)力學(xué)特征，有效檢測(cè)出血清中活性藥物的含量變得越來(lái)越重要，尤其是檢測(cè)下限越低，檢測(cè)靈敏度越高，更能有效反映藥物在血清中的藥代動(dòng)力學(xué)特征。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種抗體，該抗體可以用在利用ELISA檢測(cè)血清中蛋白藥物濃度等方面。

本發(fā)明涉及兩種細(xì)胞分別為亞克隆細(xì)胞A(名稱(chēng)：雜交瘤細(xì)胞1D7C11，2015年5月20日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：湖北省武漢市武漢大學(xué)校內(nèi)，保藏編號(hào)：CCTCC C201544)、亞克隆細(xì)胞B(名稱(chēng)：雜交瘤細(xì)胞11F11E4，2015年5月20日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：湖北省武漢市武漢大學(xué)校內(nèi)，保藏編號(hào)：CCTCC C201545)。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明一方面提供了一種抗體，所述抗體通過(guò)亞克隆細(xì)胞A或B分泌生產(chǎn)。所述抗體優(yōu)選由亞克隆細(xì)胞A或B分泌生產(chǎn)后使用親和層析柱純化獲得。

本發(fā)明還進(jìn)一步提供了所述亞克隆細(xì)胞A或B的篩選方法，其具體如下：

1)使用抗VEGF的重組蛋白作為免疫原免疫小鼠，收集免疫前血清和免疫后血清進(jìn)行初步ELISA抗體篩選，免疫后6個(gè)月按時(shí)收集血清進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)保留所有血清樣品供檢測(cè)；

2)獲得陽(yáng)性血清后，將選定的動(dòng)物進(jìn)行細(xì)胞融合；融合后的細(xì)胞放入96孔板進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞上清再進(jìn)行一次正向篩選和反向篩選；將篩選到的陽(yáng)性克隆放入24孔板進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)上清重新進(jìn)行一次正向篩選和反向篩選，再對(duì)確定的陽(yáng)性克隆進(jìn)行一次亞克隆篩選，并對(duì)產(chǎn)生的抗體進(jìn)行類(lèi)型鑒別，挑選出IgG1或IgG2類(lèi)型的陽(yáng)性克??；隨后進(jìn)行抗體表位分析并確定不同抗體間的配對(duì)情況，并評(píng)估所有陽(yáng)性克隆與抗原間的相對(duì)親和力，挑選親和力及配對(duì)情況最好的一對(duì)抗體進(jìn)行亞克??；

3)對(duì)挑選好的亞克隆母細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的不超過(guò)3代的亞克隆，并對(duì)每一個(gè)亞克隆培養(yǎng)細(xì)胞上清進(jìn)行正向篩選和反向篩選；對(duì)于每個(gè)母細(xì)胞，培養(yǎng)出亞克隆細(xì)胞。

上述抗VEGF的重組蛋白優(yōu)選為康柏西普或阿柏西普

本發(fā)明另一方面提供了上述抗體在利用ELISA法檢測(cè)血清中蛋白藥物濃度中的應(yīng)用；其中所述蛋白藥物為康柏西普或阿柏西普；所述ELISA法為夾心ELISA法。

本發(fā)明更進(jìn)一步提供了所述抗體在夾心ELISA法中檢測(cè)血清中游離性康柏西普或游離性阿柏西普。

本發(fā)明更進(jìn)一步提供了所述抗體在夾心ELISA法中檢測(cè)血清中結(jié)合型康柏西普或結(jié)合型阿柏西普。

本發(fā)明所述抗體在檢測(cè)蛋白藥物時(shí)靈敏度高，且蛋白藥物(如康柏西普或阿柏西普)最低線性濃度低，更適合用于檢測(cè)血清中蛋白藥物濃度，更適于用于評(píng)價(jià)藥物的藥代動(dòng)力學(xué)特征。

本發(fā)明中所述術(shù)語(yǔ)：

游離型康柏西普(游離型阿柏西普)：是指未與靶蛋白(VEGF)結(jié)合的藥物分子形式， 該形式的藥物分子具有能結(jié)合靶蛋白(VEGF)的能力。

結(jié)合型康柏西普(結(jié)合型阿柏西普)：是指與靶蛋白(VEGF)結(jié)合后的藥物分子形式。

陽(yáng)性亞克隆細(xì)胞A對(duì)應(yīng)抗體為抗體A

陽(yáng)性亞克隆細(xì)胞B對(duì)應(yīng)抗體為抗體B

附圖說(shuō)明

圖1為康柏西普(抗體A)線性范圍篩選及結(jié)合比

圖2為康柏西普(抗體B)線性范圍篩選及結(jié)合比

圖3為阿柏西普(抗體A)線性范圍篩選及結(jié)合比

圖4為阿柏西普(抗體B)線性范圍篩選及結(jié)合比

圖5為VEGF對(duì)康柏西普/阿柏西普信號(hào)抑制率(抗體A)

圖6為VEGF對(duì)康柏西普/阿柏西普信號(hào)抑制率(抗體B)

具體實(shí)施方式

現(xiàn)通過(guò)以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡釋。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而非對(duì)本發(fā)明有任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員在本說(shuō)明書(shū)的啟示下對(duì)本發(fā)明實(shí)施中所作的任何變動(dòng)都將落在權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。

實(shí)施例1：抗體的制備

1、動(dòng)物免疫

使用抗VEGF的重組蛋白(如康柏西普或阿柏西普)作為免疫原免疫5只小鼠，收集免疫前血清和免疫后血清進(jìn)行初步ELISA抗體篩選，免疫后6個(gè)月按時(shí)收集血清進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)保留所有血清樣品供檢測(cè)。其中，ELISA篩選采用正向篩選(使用免疫原)和反向篩選(使用人IgG-Fc)進(jìn)行，以確?？贵w為免疫原指定結(jié)構(gòu)域抗體。

2、細(xì)胞融合

獲得陽(yáng)性血清后，將選定的動(dòng)物進(jìn)行細(xì)胞融合。融合后的細(xì)胞放入96孔板進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞上清再進(jìn)行一次正向篩選(使用免疫原)和反向篩選(使用人IgG-Fc)。將篩選到的陽(yáng)性克隆放入24孔板進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)上清重新進(jìn)行一次正向篩選(使用免疫原)和反向篩選(使用人IgG-Fc)，再對(duì)確定的陽(yáng)性克隆進(jìn)行一次亞克隆篩選，并對(duì)產(chǎn)生的抗體進(jìn)行類(lèi)型鑒別，挑選出IgG1或IgG2類(lèi)型的陽(yáng)性克隆。隨后進(jìn)行抗體表位分析并確定不同抗體間的配對(duì)情況，并評(píng)估所有陽(yáng)性克隆與抗原間的相對(duì)親和力，挑選親和力及配對(duì)情況最好的一對(duì)抗體進(jìn)行亞克隆。

3、亞克隆、擴(kuò)增以及保存

對(duì)挑選好的亞克隆母細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的亞克隆(不超過(guò)3代)，并對(duì)每一個(gè)亞克隆培養(yǎng)細(xì) 胞上清進(jìn)行正向篩選(使用免疫原)和反向篩選(使用人IgG-Fc)。對(duì)于每個(gè)母細(xì)胞，培養(yǎng)出陽(yáng)性亞克隆細(xì)胞A或B進(jìn)行保存。

4、抗體生產(chǎn)、純化及偶聯(lián)

使用搖瓶培養(yǎng)之前得到的亞克隆細(xì)胞，并通過(guò)親和層析柱純化出篩選的抗體，并對(duì)抗體進(jìn)行純度(SDS-PAGE)、濃度(UV-280nm)以及與抗原結(jié)合性(ELISA)的檢測(cè)。隨后對(duì)抗體進(jìn)行Biotin偶聯(lián)操作，獲得。

實(shí)施例2抗體檢測(cè)游離型康柏西普/阿柏西普含量檢測(cè)方法研究

原理：采用夾心ELISA法，使用VEGF捕獲樣品中的康柏西普分子或阿柏西普分子，再使用抗體作為檢測(cè)抗體。

利用棋盤(pán)法確定檢測(cè)用抗體的使用量以及初步確認(rèn)康柏西普的線性范圍。使用濃度依次為50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL、1.563ng/mL、0.781ng/mL、0.391ng/mL、0.195ng/mL、0.098ng/mL、0.049ng/mL、0ng/mL的康柏西普(阿柏西普)標(biāo)準(zhǔn)品按列添加到酶標(biāo)板的1-11行，12行為Control。再按照試驗(yàn)方法將抗體儲(chǔ)備液按照1:1250、1:2500、1:5000、1:10000、1:20000、1:40000、1:80000倍稀釋?zhuān)糠N稀釋倍數(shù)按行添加到酶標(biāo)板的A-G行，H行為Control。

1、線性范圍研究

將康柏西普和阿柏西普從50ng/mL倍比向下稀釋11個(gè)濃度，分別采用抗體抗體A和抗體B作為檢測(cè)抗體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)下表及附圖1、附圖2、附圖3及附圖4。

表1 康柏西普及阿柏西普線性范圍結(jié)合比篩選

以結(jié)合比大于1.5作為最低線性范圍濃度，從表1中可以看出，采用抗體A作為檢測(cè)抗體，康柏西普和阿柏西普的最低線性濃度均為0.195ng/mL，采用抗體B作為檢測(cè)抗體，康柏西普和阿柏西普的最低線性濃度均為0.098ng/mL。

2、最小稀釋倍數(shù)及檢測(cè)靈敏度研究

由于健康人血清中存在一定量的VEGF(一般為200pg/mL左右)，故有可能干擾添加在其中的康柏西普分子/阿柏西普分析的含量信號(hào)，特別是在低濃度康柏西普/阿柏西普標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)樣品中，故為了驗(yàn)證VEGF分子對(duì)康柏西普/阿柏西普信號(hào)的影響，測(cè)定了不同分子比的康柏西普/阿柏西普和VEGF樣品的信號(hào)值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2、附圖5及表3、附圖6。

表2 康柏西普和VEGF分子比及相應(yīng)抑制率

從上表可以看出，對(duì)于康柏西普，采用抗體A作為檢測(cè)抗體，信號(hào)抑制率低于15％時(shí)，分子比為0.5；采用抗體B作為檢測(cè)抗體，信號(hào)抑制率低于15％時(shí)，分子比為0.4。

以血清中VEGF含量為200pg/mL計(jì)，對(duì)于采用抗體A作為檢測(cè)抗體，康柏西普最低定量濃度為0.195ng/mL,即1.35pM,故血清中VEGF含量應(yīng)低于0.675pM(27pg/mL),所以血清稀釋倍數(shù)應(yīng)至少不低于7.5倍，為了檢測(cè)方法在應(yīng)用中更為穩(wěn)定，確定10倍為最低血清稀釋倍 數(shù)。對(duì)于采用抗體B作為檢測(cè)抗體，康柏西普最低定量濃度為0.098ng/mL,即0.675pM,故血清中VEGF含量應(yīng)低于0.27pM(10.8pg/mL),所以血清稀釋倍數(shù)應(yīng)至少不低于18.5倍，為了檢測(cè)方法在應(yīng)用中更為穩(wěn)定，確定20倍為最低血清稀釋倍數(shù)。

表3 阿柏西普和VEGF分子比及相應(yīng)抑制率

從上表可以看出，對(duì)于阿柏西普，采用抗體A作為檢測(cè)抗體，信號(hào)抑制率低于15％時(shí)，分子比為0.2；采用抗體B作為檢測(cè)抗體，信號(hào)抑制率低于15％時(shí)，分子比為0.075。

以血清中VEGF含量為200pg/mL計(jì)，對(duì)于采用抗體A作為檢測(cè)抗體，阿柏西普最低定量濃度為0.195ng/mL,即1.69pM,故血清中VEGF含量應(yīng)低于0.338pM(13.52pg/mL),所以血清稀釋倍數(shù)應(yīng)至少不低于14.8倍，為了檢測(cè)方法在應(yīng)用中更為穩(wěn)定，確定15倍為最低血清稀釋倍數(shù)。對(duì)于采用抗體B作為檢測(cè)抗體，康柏西普最低定量濃度為0.098ng/mL,即0.85pM,故血清中VEGF含量應(yīng)低于0.064pM(2.55pg/mL),所以血清稀釋倍數(shù)應(yīng)至少不低于78倍，為了檢測(cè)方法在應(yīng)用中更為穩(wěn)定，確定80倍為最低血清稀釋倍數(shù)。

綜上，采用抗體抗體A和抗體B和VEGF作為抗體對(duì)來(lái)檢測(cè)康柏西普和阿柏西普的檢測(cè)靈敏度見(jiàn)表3-1。

表3-1 抗體檢測(cè)康柏西普和阿柏西普的靈敏度

實(shí)施例2抗體檢測(cè)結(jié)合型康柏西普/阿柏西普含量檢測(cè)方法研究

原理：采用夾心ELISA法，使用Anti-VEGF捕獲樣品中的結(jié)合型康柏西普分子或結(jié)合型阿柏西普分子，再使用抗體作為檢測(cè)抗體。

利用棋盤(pán)法確定檢測(cè)用抗體的使用量以及初步確認(rèn)康柏西普的線性范圍。使用濃度依次為5nM、2.5nM、1.25nM、0.625nM、0.313nM、0.156nM、0.078nM、0.039nM、0.020nM、0.010nM、0.005nM、0nM的結(jié)合型康柏西普(結(jié)合型阿柏西普)按列添加到酶標(biāo)板的1-11行，12行為Control。將抗體儲(chǔ)備液按照1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000倍稀釋?zhuān)糠N稀釋倍數(shù)按行添加到酶標(biāo)板的A-G行，H行為Control。

1、線性范圍研究

將結(jié)合型康柏西普和結(jié)合型阿柏西普從5nM倍比向下稀釋11個(gè)濃度，分別采用抗體抗體A和抗體B作為檢測(cè)抗體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 結(jié)合型康柏西普及結(jié)合型阿柏西普線性范圍結(jié)合比篩選

以結(jié)合比大于1.5作為最低線性范圍濃度，從表4中可以看出，采用抗體A作為檢測(cè)抗 體，結(jié)合型康柏西普和結(jié)合型阿柏西普的最低線性濃度分別為0.020nM和0.010nM，采用抗體B作為檢測(cè)抗體，結(jié)合型康柏西普和結(jié)合型阿柏西普的最低線性濃度分別為0.010nM和0.010nM。

2、最小稀釋倍數(shù)及檢測(cè)靈敏度研究

將健康均質(zhì)人血清使用1％BSA-PBS稀釋液稀釋2X，4X，8X，16X，觀察不同稀釋倍數(shù)血清對(duì)檢測(cè)的干擾。

表5 最小稀釋倍數(shù)研究試驗(yàn)結(jié)果

從表5所示結(jié)果可以看出，2X，4X，8X，16X稀釋的人血清檢測(cè)結(jié)果與表4中的空白OD值類(lèi)似，且相互之間基本無(wú)差異，表明人血清基質(zhì)稀釋2倍不干擾檢測(cè)的準(zhǔn)確度。

綜上，采用抗體抗體A和抗體B和VEGF作為抗體對(duì)來(lái)檢測(cè)結(jié)合型康柏西普和結(jié)合型阿柏西普的檢測(cè)靈敏度分別為：

表6 抗體檢測(cè)康柏西普和阿柏西普的靈敏度

實(shí)施例3、抗體檢測(cè)游離型康柏西普含量檢測(cè)方法研究

利用棋盤(pán)法確定檢測(cè)用抗體的使用量以及初步確認(rèn)康柏西普的線性范圍。使用濃度依次為400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL、1.563ng/mL、0.781ng/mL、0.391ng/mL的康柏西普按列添加到酶標(biāo)板的1-11行，12行為Control。將抗體儲(chǔ)備液按照1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200倍稀釋?zhuān)糠N稀釋倍數(shù)按行添加到酶標(biāo)板的A-G行，H行為Control。

抗VEGFR1多抗(Cell Signaling Technology,2893S)：將包被VEGF按A-G行從高到低的濃度進(jìn)行包被(H為對(duì)照行)，康柏西普按1-11列從高到低的濃度進(jìn)行加樣(12為對(duì)照列)，再采用一種抗VEGFR1多抗作為檢測(cè)抗體，如下面的棋盤(pán)法試驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)表7)所示，作為對(duì)照組的12列其OD值均超過(guò)0.4，說(shuō)明該檢測(cè)抗體的非特異性吸附較為嚴(yán)重，且結(jié)合效 價(jià)比較低，會(huì)嚴(yán)重影響檢測(cè)方法靈敏度，故該檢測(cè)抗體無(wú)法使用。

表7 棋盤(pán)法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

抗VEGFR1單抗(Creative Biomart，CABT-18117MH):利用VEGF進(jìn)行包被，康柏西普按1-11列從高到低的濃度進(jìn)行加樣(12為對(duì)照列)，一種抗VEGFR1單抗按A-G行從高到低的濃度進(jìn)行檢測(cè)(H為對(duì)照行)，如下面的棋盤(pán)法試驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)表8)所示，作為對(duì)照組的12列其OD值按照檢測(cè)抗體VEGFR1的濃度變化情況進(jìn)行從大到小的變化，說(shuō)明該檢測(cè)抗體同樣有較為嚴(yán)重的非特異性吸附，即使在不含有被檢測(cè)物的情況下仍然會(huì)出現(xiàn)較高信號(hào)，這種情況下該檢測(cè)抗體是無(wú)法使用的。

表8 棋盤(pán)法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

抗VEGFR1多抗(Thermo Scientific Pierce Antibodies,PA5-32408)：利用VEGF進(jìn)行包被，康柏西普按1-11列從高到低的濃度進(jìn)行加樣(12為對(duì)照列)，一種抗VEGFR1單抗按A-G行從高到低的濃度進(jìn)行檢測(cè)(H為對(duì)照行)，如下面的棋盤(pán)法試驗(yàn)結(jié)果(表9)所示，即使在康柏西普濃度最高的1列，其OD值也不高于1，說(shuō)明該檢測(cè)抗體與被檢測(cè)物的結(jié)合效價(jià)降低，這種情況無(wú)法滿(mǎn)足對(duì)檢測(cè)靈敏度的要求。

表9 棋盤(pán)法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

抗VEGFR1單抗(Abbiotec，251808)：利用VEGF進(jìn)行包被，康柏西普按1-11列從高到低的濃度進(jìn)行加樣(12為對(duì)照列)，一種抗VEGFR1單抗按A-G行從高到低的濃度進(jìn)行檢測(cè)(H為對(duì)照行)，如下面的棋盤(pán)法試驗(yàn)結(jié)果(表10)所示，該結(jié)果表明該檢測(cè)抗體不與被檢測(cè)物結(jié)合，無(wú)法滿(mǎn)足檢測(cè)需求。

表10 棋盤(pán)法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

抗VEGFR1多抗(Sino Biological,10136-RP02)：利用VEGF進(jìn)行包被，康柏西普按1-11列從高到低的濃度進(jìn)行加樣(12為對(duì)照列)，一種抗VEGFR1單抗按A-G行從高到低的濃度進(jìn)行檢測(cè)(H為對(duì)照行)，如下面的棋盤(pán)法試驗(yàn)結(jié)果(表11)所示，該結(jié)果表明該檢測(cè)抗體基本不與被檢測(cè)物結(jié)合，無(wú)法滿(mǎn)足檢測(cè)需求。

表11 棋盤(pán)法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

抗VEGFR1單抗(Sino Biological,10136-MM03)：利用VEGF進(jìn)行包被，康柏西普按1-11列從高到低的濃度進(jìn)行加樣(12為對(duì)照列)，一種抗VEGFR1單抗按A-G行從高到低的濃度進(jìn)行檢測(cè)(H為對(duì)照行)，如下面的棋盤(pán)法試驗(yàn)結(jié)果(表12)所示，該結(jié)果表明該檢測(cè)抗體與被檢測(cè)物結(jié)合效價(jià)非常低，無(wú)法滿(mǎn)足檢測(cè)需求。

表12 棋盤(pán)法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

抗VEGFR1多抗(Biorbyt,orb11556)：用VEGF進(jìn)行包被，康柏西普按1-11列從高到低的濃度進(jìn)行加樣(12為對(duì)照列)，一種抗VEGFR1多抗按A-G行從高到低的濃度進(jìn)行檢測(cè)(H為對(duì)照行)，如下面的棋盤(pán)法試驗(yàn)結(jié)果(表13)所示，該結(jié)果表明該檢測(cè)抗體與被檢測(cè)物結(jié)合效價(jià)比較低，導(dǎo)致線性區(qū)間范圍較窄，無(wú)法滿(mǎn)足檢測(cè)需求。

表13 棋盤(pán)法試驗(yàn)結(jié)果

抗VEGFR1多抗(LifeSpan BioSciences,LS-C160522-400)：用VEGF進(jìn)行包被，康柏西普按1-11列從高到低的濃度進(jìn)行加樣(12為對(duì)照列)，一種抗VEGFR1多抗按A-G行從高到低的濃度進(jìn)行檢測(cè)(H為對(duì)照行)，如下面的棋盤(pán)法試驗(yàn)結(jié)果(表14)所示，即使在康柏西普濃度最高的1列，其OD值也不高于1，說(shuō)明該檢測(cè)抗體與被檢測(cè)物的結(jié)合效價(jià)降低，這種情況無(wú)法滿(mǎn)足對(duì)檢測(cè)靈敏度的要求。

表14 棋盤(pán)法試驗(yàn)結(jié)果