本發(fā)明屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及酶促合成煙酰胺尿嘧啶二核苷酸(nicotinamideuracildinucleotide，NUD)的方法及其應(yīng)用，在微生物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體的編碼基因，工程菌利用內(nèi)源代謝物合成NUD，并且胞內(nèi)NUD可作為輔酶，選擇性介導(dǎo)氧化還原反應(yīng)，提高目標(biāo)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量。
背景技術(shù)：
：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)及其還原態(tài)(NADH)在細(xì)胞的繁殖，生長，分化，凋亡等生命活動中都起著非常重要的作用(W.Ying，etal.AntioxidantsRedoxSignaling.2008，10，179)。除此之外，NAD還是許多重要氧化還原酶的輔酶，起傳遞氫和電子的作用。其結(jié)構(gòu)式如下：由于生物體內(nèi)NAD(H)同時參與多種反應(yīng)，因此在大部分目標(biāo)產(chǎn)物的生物代謝網(wǎng)絡(luò)中，都會存在一步或多步利用NAD(H)的反應(yīng)?，F(xiàn)階段通常采用輔因子工程對目標(biāo)代謝網(wǎng)絡(luò)進行調(diào)控。常見的策略有，1)改變胞內(nèi)輔酶合成，降解，回補代謝和不同輔酶分子相互轉(zhuǎn)化的能力，2)改變氧化還原酶的輔酶偏好性，3)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)可再生輔酶的酶，如葡萄糖脫氫酶等，并在培養(yǎng)環(huán)境中額外添加相應(yīng)酶的底物。但是，由于NAD(H)是一種通用的輔酶，胞內(nèi)NAD(H)水平及不同氧化態(tài)的擾動往往會對細(xì)胞生理及代謝等產(chǎn)生難以預(yù)測的全局性影響。因此，為了實現(xiàn)特異性調(diào)控目標(biāo)代謝網(wǎng)絡(luò)，亟需一種方法使目標(biāo)代謝網(wǎng)絡(luò)從復(fù)雜代謝網(wǎng)絡(luò)中獨立出來，即需要重新設(shè)計出一個生物正交系統(tǒng)(K.Shokat，etal.DrugDiscoveryToday.2002，7，872)。在依賴于NAD類似物的生物正交系統(tǒng)中，NAD(H)類似物可以在該正交代謝途徑中傳遞，而不影響其他利用NAD(H)的代謝途徑，同樣，其他代謝途徑中的NAD(H)也不會影響到生物正交代謝途徑。因此，僅靠調(diào)控NAD(H)類似物的含量就可以對生物正交系統(tǒng)進行特異性的代謝調(diào)控，從而達(dá)到提高目標(biāo)途徑產(chǎn)量的目的。由于依賴于NAD(H)的氧化還原酶與其輔酶的主要結(jié)合作用發(fā)生在腺嘌呤結(jié)合域，吡啶環(huán)部分主要起傳遞電子的作用，因此，為了保證NAD類似物的氧化還原性能，只能對NAD的腺嘌呤環(huán)部分進行改造。目前，大多數(shù)NAD類似物均采用化學(xué)法合成。但是，化學(xué)法合成NAD類似物 通常面臨步驟繁瑣，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，分離，純化較困難，且成本較高，不能直接應(yīng)用于生物體等問題。因此，有人采用酶促方法合成NAD類似物(H.迪費爾，D.海因德爾，C.邁爾，R.施姆克，CARBA-NAD的酶促合成，申請?zhí)枺?01080033434.1)。其借助野生型煙酰胺核糖激酶(RNK)和煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶(NMNAT)進行NAD類似物的酶促反應(yīng)合成。其中，煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶(nicotinamide/nicotinicacidmononucleotideadenylyltransferase，NMNAT)根據(jù)物種來源不同，分別可由基因nadD，nadM，nadR表達(dá)，將煙酰胺單核苷酸(nicotinamidemononucleotide，NMN)或煙酸單核苷酸(nicotinicacidmononucleotide，NaMN)和腺苷三磷酸(ATP)進行縮合反應(yīng)合成NAD或NaAD，是NAD生物合成途徑中的關(guān)鍵酶。雖然在體外反應(yīng)條件下，野生NMNAT也可表現(xiàn)出很低的合成少數(shù)NAD類似物的活性(M.Emanuelli，etal.ProteinExpressionandPurification.2003，27，357)，但不足以用于制備或進行胞內(nèi)直接合成NAD類似物。煙酰胺尿嘧啶二核苷酸(nicotinamideuracildinucleotide，NUD)是一種NAD類似物，可作為輔酶介導(dǎo)氧化還原反應(yīng)。通過構(gòu)建依賴NUD的氧化還原酶，可以建立生物正交的氧化還原體系，用于控制細(xì)胞內(nèi)代謝過程(D.Ji，etal.JournaloftheAmericanChemicalSociety.2011，133，20857)。雖然通過化學(xué)方法可以合成NUD，但NUD和NAD一樣，不能自由透過細(xì)胞膜，成為胞內(nèi)應(yīng)用NUD的瓶頸。因此，需要建立一種酶促合成NUD的方法，以利用細(xì)胞內(nèi)源代謝物直接在胞內(nèi)合成NUD。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對化學(xué)法合成NUD步驟繁瑣，分離純化困難，NUD難以進入細(xì)胞等缺點，并且目前尚未發(fā)現(xiàn)可高效催化合成NUD的酶，本發(fā)明的目的是提供一種酶促合成NUD的方法，以煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶的突變體為催化劑，以煙酰胺單核苷酸和尿嘧啶核苷三磷酸為底物，催化合成NUD，并且通過在胞內(nèi)表達(dá)煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶的突變體，實現(xiàn)直接在胞內(nèi)合成NUD，應(yīng)用于選擇性調(diào)控代謝過程和提高目標(biāo)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量。一方面，本發(fā)明提供了一種酶促合成煙酰胺尿嘧啶二核苷酸(NUD)的方法，以煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶的突變體為催化劑，以煙酰胺單核苷酸(NMN)和尿嘧啶核苷三磷酸(UTP)為底物，合成煙酰胺尿嘧啶二核苷酸。在一些實施方式中，煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列為SEQIDNO：1，SEQIDNO：2或SEQIDNO：3中的一種或二種以上，其中，SEQIDNO：1是來源于大腸桿菌的NadD的氨基酸序列，SEQIDNO：2是來源于大腸桿菌的NadR的氨基酸序列，SEQIDNO：3是來源于土拉熱弗朗西絲氏菌的NadM的氨基酸序列。煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶的突變體為上述氨基酸序列中的1個以上氨基酸進行突變獲得的突變體，突變位點為下述序列中氨基酸位點中的一種或二種以上：一種在SEQIDNO：1的氨基酸序列中的突變位點為：22位突變?yōu)镾，L，A或G中的 一種，23位突變?yōu)門，G或L中的一種，45位突變?yōu)閃，Y或L中的一種，82位突變?yōu)镵，E，L或T中的一種，84位突變?yōu)镵，W，E，A，L，V，M，T或P中的一種，86位突變?yōu)镽，F(xiàn)，D，K，S或W中的一種，107位突變?yōu)镕，V，R，L，S，A，W或P中的一種，109位突變?yōu)镚，A或S中的一種，118位突變?yōu)镈，H，T，P，G，N，A或R中的一種，132位突變?yōu)镮，A，V，P，F(xiàn)，G，L，R或Q中的一種，174位突變?yōu)镮，A，R，P，L，G，V，K，D或M中的一種，175位突變?yōu)門，K，S，N，M，W，E或G中的一種，176位突變?yōu)镸，G，S，A，P，T，R或K中的一種，177位突變?yōu)锳，E，L，P，R或S中的一種，或178位突變?yōu)镻，I，V，S，R，G，T或L中的一種，174，175，176位缺失突變?yōu)閮蓚€氨基酸d，e，其中d為A，S，T或P中的一種，e為S，P，G或A中的一種，或174，175位插入突變?yōu)槿齻€氨基酸d，e，f，其中d為K，L，P，T，V或D中的一種，e為G，P，M，L，V，T，R，D或I中的一種，f為P，R，T，E，Q，K，V或S中的一種，產(chǎn)生的一種或兩種以上突變的新蛋白質(zhì)；或，一種在SEQIDNO：2的氨基酸序列中的突變位點為：82位突變?yōu)镾，L，A或G中的一種，83位突變?yōu)镽，I或K中的一種，88位突變?yōu)镕，V，M或L中的一種，148位突變?yōu)镹，Q，H或S中的一種，154位突變?yōu)镠，Y或F中的一種，176位突變?yōu)镚，A或S中的一種，205位突變?yōu)镻，Q，V，R，G，K，N或L中的一種，176，177位插入突變?yōu)槿齻€氨基酸a，b，c，其中a為P，G或I中的一種，b為V，S或A中的一種，c為S，C，I，H或W中的一種，或203，204，205位缺失突變?yōu)閮蓚€氨基酸d，e，其中d為E，L，M，F(xiàn)，L或V中的一種，e為A，E，D，N，G，V或I中的一種，產(chǎn)生的一種或兩種以上突變的新蛋白質(zhì)；或，一種在SEQIDNO：3的氨基酸序列中的突變位點為：21位突變?yōu)镸，S，K，T，L，F(xiàn)，G，W，Q或R中的一種，23位突變?yōu)镽，T，L或Q中的一種，24位突變?yōu)镹，W，K，S，F(xiàn)，R，G，V，T，D，P，E或A中的一種，110位突變?yōu)镾，R，L，N或Q中的一種，130位突變?yōu)镻，G，A或S中的一種，131位突變?yōu)锳，G，R，F(xiàn)，S，L，E，V，C，W，I或P中的一種，132位突變?yōu)镽，W，V，A，S或G中的一種，133位突變?yōu)閂，T，Q，L或E中的一種，134位突變?yōu)镻，E，A或G中的一種，135位突變?yōu)門，G，S，K或R中的一種，136位突變?yōu)镮，L或V中的一種，或137位突變?yōu)镾，H或D中的一種，產(chǎn)生的一種或兩種以上突變的新蛋白質(zhì)。本發(fā)明獲得可以合成NUD的煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體的操作步驟如下：1.選擇來源于已知物種的NMNAT為模板進行定向進化。提取該物種全基因組DNA，PCR擴增得到該物種表達(dá)NMNAT的基因序列，或全基因合成該基因序列。2.構(gòu)建表達(dá)NMNAT的工程菌。將表達(dá)NMNAT的基因克隆至原核蛋白表達(dá)載體中，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)或DH10b，將獲得的陽性克隆進行測序，測序結(jié)果正確的克隆即為野生型NMNAT表達(dá)工程菌。3.數(shù)據(jù)庫下載或模擬該物種的NMNAT的晶體結(jié)構(gòu)。若該NMNAT晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)解析，且晶體結(jié)構(gòu)中包含ATP或NAD，則直接在PDB數(shù)據(jù)庫(http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do)進行下載并分析；若該NMNAT的晶體結(jié)構(gòu)未解析或已經(jīng)解析但晶體結(jié)構(gòu)中不含ATP或NAD，則在NCBI網(wǎng)站上進行blast(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/)，尋找已解析的含有ATP或NAD且同源性在30％以上的晶體結(jié)構(gòu)為模板，采用Swiss-model(http：//swissmodel.expasy.org/)進行模擬。4.設(shè)計突變策略。經(jīng)過晶體結(jié)構(gòu)分析，選取權(quán)利要求2，3，4所述的氨基酸，用簡并堿基NNK(其中N＝腺嘌呤，鳥嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶；K＝鳥嘌呤或胸腺嘧啶)替換目標(biāo)突變位點的密碼子，設(shè)計突變引物，構(gòu)建飽和突變載體。5.構(gòu)建突變文庫。采用RF克隆的方法，參見文獻(xiàn)(F.vandenEnt，etal.JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods.2006，67，67)。第一步RFIPCR過程中，模板為野生型NMNAT表達(dá)載體，引物為含有簡并堿基NNK的突變引物，得到的PCR產(chǎn)物為第二步RF克隆的大引物；第二步RFIIPCR過程中，模板仍為野生型NMNAT表達(dá)載體，PCR得到的產(chǎn)物用DpnI限制酶進行消化，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，得到的轉(zhuǎn)化子即為NMNAT的飽和突變文庫。6.構(gòu)建突變文庫篩選方法。利用已有的能夠識別目標(biāo)NAD類似物的氧化還原酶進行突變文庫篩選，采用酶偶聯(lián)顯色法。篩選顯色原理見附圖1。酶偶聯(lián)顯色過程中，NMNAT的突變文庫將底物UTP和NMN進行縮合反應(yīng)，合成NAD類似物NUD。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員可以采用文獻(xiàn)(D.Ji，etal.JournalofTheAmericanChemicalSociety.2011，133，20857)類似的方法，獲得能夠使NUD還原為NUDH的氧化還原酶作為指示酶，生成NUDH；吩嗪硫酸甲酯(PMS)和氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)的在NUDH的作用下被還原為肉眼可見的黑紫色不溶物。7.篩選突變文庫。挑取突變體文庫單菌落接種于96深孔板LB液體培養(yǎng)基中，進行菌株培養(yǎng)及突變蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)；收集菌體細(xì)胞進行破碎，離心，上清即為含有可溶的突變蛋白粗酶液。酶偶聯(lián)顯色篩選的反應(yīng)體系的pH為5.0～11.0，反應(yīng)液中含有NMN，UTP，金屬離子，指示氧化還原酶及其共底物，PMS，NBT和粗酶液上清。反應(yīng)液顯藍(lán)色的孔對應(yīng)的突變菌即為疑似目標(biāo)突變菌，將疑似目標(biāo)突變菌進行第二次復(fù)篩驗證，驗證正確的菌即為目標(biāo)突變菌。目標(biāo)突變菌提質(zhì)粒送測序，鑒定氨基酸突變位點。8.純酶活性驗證。將目標(biāo)突變菌進行放大培養(yǎng)并誘導(dǎo)表達(dá)，得到的培養(yǎng)液離心收集菌體并裂解，離心收集裂解液上清，根據(jù)目標(biāo)突變體的特點進行分離純化，收集得到的純酶液驗證活性。驗證純酶活性的反應(yīng)條件如下：緩沖溶液pH5.0～11.0，NMN0.05～10mM，0.02～10mMUTP，0.05～10mM的金屬離子，0.01～1mg/mL的純酶液，25～40℃反應(yīng)2～4h，終止反應(yīng)除去蛋白，選擇合適的方法分離純化得到NAD類似物。純化得到的類似物進行NMR檢測，譜圖正確后即可認(rèn)為對應(yīng)的突變體為可以合成NUD的煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體。在一些實施方式中，煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶的突變體，由相應(yīng)的脫氧核糖核酸(DNA)序列編碼。在另一些實施方式中，煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶的突變體，其相應(yīng)的編碼DNA序列，克隆在一種蛋白質(zhì)表達(dá)載體中，用于可控表達(dá)。另一方面，本發(fā)明提供一種酶促合成NUD方法的應(yīng)用。在一些實施方式中，煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶的突變體，由攜帶相應(yīng)突變體的表達(dá)載體的微生物細(xì)胞產(chǎn)生，純化相應(yīng)突變體，并用于體外酶促反應(yīng)合成NUD，反應(yīng)條件為：pH5.0-9.0，溫度25℃-55℃，時間0.2-30h；煙酰胺單核苷酸，尿嘧啶核苷三磷酸，煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體三者的用量摩爾比例為1∶0.02-50∶0.00002-0.1。在一些實施方式中，在微生物細(xì)胞中表達(dá)所述的突變體蛋白，同時表達(dá)以NUD為輔酶的一種或兩種以上蛋白，構(gòu)建可被選擇性調(diào)控的代謝體系，用于提高目標(biāo)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量。在一些實施方式中，在大腸桿菌工程菌中表達(dá)所述的突變體蛋白，同時表達(dá)以煙酰胺尿嘧啶二核苷酸為輔酶的來源于大腸桿菌K12的第310位亮氨酸突變?yōu)橘嚢彼崽O果酸酶突變體ME*和來源于施氏假單胞菌WM88的第151位異亮氨酸突變?yōu)榫彼醽喠姿崦摎涿竿蛔凅wPDH*，并在亞磷酸存在下培養(yǎng)工程菌細(xì)胞，提高琥珀酸產(chǎn)量。關(guān)于表示方法的說明ME*表示：來源于大腸桿菌K12的第310位亮氨酸突變?yōu)橘嚢彼崽O果酸酶突變體(D.Ji，etal.JournaloftheAmericanChemicalSociety.2011，133，20857)。PDH*表示：來源于施氏假單胞菌WM88的第151位異亮氨酸突變?yōu)榫彼醽喠姿崦摎涿竿蛔凅w(王磊.基于煙酰胺胞嘧啶二核苷酸的代謝電路研究[博士學(xué)位論文].北京：中國科學(xué)院大學(xué)，2014)。在提高琥珀酸產(chǎn)量的實施方式中，選擇的宿主為E.coliKJ134(K.Jantama，etal.BiotechnologyBioengineering.2008，5，881)。在宿主中同時過表達(dá)能夠合成NUD的煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體，依賴NUD(H)為輔酶的來源于施氏假單胞菌WM88的第151位異亮氨酸突變?yōu)榫彼岬膩喠姿崦摎涿竿蛔凅wPDH*(將亞磷酸氧化為磷酸的同時將NUD還原為NUDH)和來源于大腸桿菌K12的第310位亮氨酸突變?yōu)橘嚢彼岬奶O果酸酶突變體ME*(以NUDH為還原力催化丙酮酸生成蘋果酸)，構(gòu)建NUD的胞內(nèi)合成，還原與再生正交系統(tǒng)。將亞磷酸氧化為磷酸的同時將NUD還原為NUDH，在不干擾胞內(nèi)其他以NAD(H)為輔因子的生 命過程的情況下，以NUDH為還原力催化丙酮酸生成蘋果酸，實現(xiàn)還原力的特異性分配和蘋果酸下游產(chǎn)物琥珀酸的積累。在一些優(yōu)選實施方式中，突變體蛋白的具體氨基酸序列為SEQIDNO：4，SEQIDNO：5，SEQIDNO：6中的一種或二種以上。其中，SEQIDNO：4是來源于大腸桿菌的NadD的突變體的氨基酸序列，與野生型NadD相比，其118位酪氨酸突變?yōu)榻M氨酸，175位脯氨酸突變?yōu)橘嚢彼幔?76位色氨酸突變?yōu)榫彼?；SEQIDNO：5是來源大腸桿菌的NadR的突變體的氨基酸序列，與野生型NadR相比，其第198，199，200位的天冬氨酸、脯氨酸、賴氨酸缺失突變?yōu)楸彼岷屠野彼?；SEQIDNO：6是來源于土拉熱弗朗西絲氏菌的NadM的突變體的氨基酸序列，與野生型NadM相比，其第131位天冬氨酸突變?yōu)楦彼帷８綀D說明圖1NMNAT突變文庫的篩選原理。其中，UTP是ATP的類似物，NUD是目標(biāo)NAD類似物，NMNAT*是煙酰胺核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體，氧化還原酶作為指示酶在共底物存在的條件下將NAD類似物NUD還原成具有還原性質(zhì)的NUDH，吩嗪硫酸甲酯(PMS)和氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)的在NUDH的作用下被還原為肉眼可見的黑紫色不溶物。圖2胞內(nèi)原位合成NUD并用于提高琥珀酸產(chǎn)量的代謝通路。宿主細(xì)胞為WXYO2，該菌株敲除了ldhA，adhE，focA，pflB，mgsA，poxB，tdcDE，citF，aspC，sfcA，pta-ackA，maeB等丙酮酸，草酰乙酸消耗途徑；又過表達(dá)了可以合成NUD的NadD3G10，特異性依賴NUDH為還原力的蘋果酸酶突變體ME*，可以使NUDH再生的亞磷酸脫氫酶突變體PDH*。其中，NadD3G10是來源于大腸桿菌的NadD的突變體，與野生型NadD相比，其118位酪氨酸突變?yōu)榻M氨酸，175位脯氨酸突變?yōu)橘嚢彼幔?76位色氨酸突變?yōu)榫彼?；ME*是來源于大腸桿菌K12的第310位亮氨酸突變?yōu)橘嚢彼崽O果酸酶突變體；PDH*是來源于施氏假單胞菌WM88的第151位異亮氨酸突變?yōu)榫彼醽喠姿崦摎涿竿蛔凅w。具體實施方式以下實施例可以進一步闡明本發(fā)明，通過參考以下的實施例將更容易理解本發(fā)明。這些實施例僅用于示例性說明，而不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明中，獲得能夠合成NAD類似物NUD的突變體的操作步驟見
發(fā)明內(nèi)容。表達(dá)載體構(gòu)建均采用RF克隆方法。第一步PCR擴增得到含有與目標(biāo)載體同源臂片段的目標(biāo)基因，第二步PCR以其為大引物，將其克隆至目標(biāo)載體上。得到的產(chǎn)物用DpnI限制酶進行消化，并轉(zhuǎn)入宿主感受態(tài)細(xì)胞中，得到的轉(zhuǎn)化子即為可表達(dá)NMNAT突變體的突變文庫。文庫中各突變體表達(dá)菌分別以xxx進行編號，其中，xxx為數(shù)字和字母的組合，命名方式：菌株名稱加載體名稱；突變體表達(dá)載體命名方式：在野生型表達(dá)載體名稱后加“-xxx”；突變體蛋白命名方式：野生型蛋白名稱加右上標(biāo)xxx命名。如：來源于大腸桿菌的煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶NadD的表達(dá)載體pET-NadD轉(zhuǎn)入宿主BL21(DE3)中，得到的表達(dá)菌命名為BL21(DE3)(pET-NadD)； NadD的突變體表達(dá)菌中有一個編號為3G10，其表達(dá)菌命名為BL21(DE3)(pET-NadD-3G10)，突變體表達(dá)載體命名為pET-NadD-3G10，突變體蛋白命名為NadD3G10。文庫中各突變體表達(dá)菌分別以xxx進行編號，其中，xxx為數(shù)字和字母的組合，每個突變菌株對應(yīng)一個編號。突變體表達(dá)載體的命名方式為在野生型表達(dá)載體后加“-xxx”，突變體表達(dá)菌以菌株名稱和載體名稱命名，其蛋白產(chǎn)物以野生型蛋白名稱加右上標(biāo)xxx命名。突變體蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)條件為：挑目標(biāo)單菌落在37℃200rpm過夜活化，轉(zhuǎn)接于新的培養(yǎng)基中，加入IPTG0.01～1mM，在15℃～37℃200rpm誘導(dǎo)表達(dá)目標(biāo)蛋白。參考文獻(xiàn)(J.Wang，etal.ProteinExpressionandPurification.2007，53，97-103)方法，進行蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)，表達(dá)，純化。蛋白質(zhì)的濃度測定采用伯樂公司蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒用Bradford法進行測定?；蚯贸捎肦edβ重組系統(tǒng)(T.Baba，etal.MolecularSystemsBiology.2006，2，1-11)和FLP重組酶系統(tǒng)進行無標(biāo)記敲除。胞內(nèi)輔因子濃度測定采用輔因子循環(huán)策略(S.Kern，etal.MethodsinMolecularBiology.2014，1149，311)。測定NMNAT及其突變酶利用ATP合成NAD的活性時采用文獻(xiàn)(E.Balducci，etal.AnalyticalBiochemistry.1995，228，64)中的酶偶聯(lián)方法。測定NMNAT及其突變酶利用UTP合成NUD的活性時，反應(yīng)體系中加入：20～1000mM的緩沖溶液pH5.0～11.0，0.05～10mM的NMN，0.02～10mM的UTP，0.05～10mM的金屬離子，0.01～1mg/mL的突變純酶液，5～10mM的L-蘋果酸，50U/mL的蘋果酸酶突變體ME*純酶液，在25℃恒溫條件下用分光光度計測340nm處吸光度變化。其中，ME*是來源于大腸桿菌K12，第310位亮氨酸突變?yōu)橘嚢彼岬奶O果酸酶突變體。工程菌BL21(DE3)(pET24b-ME*)誘導(dǎo)表達(dá)及ME*純化方法同文獻(xiàn)(D.Ji，etal.JournaloftheAmericanChemicalSociety.2011，133，20857)。PDH*是來源于施氏假單胞菌WM88的第151位異亮氨酸突變?yōu)榫彼醽喠姿崦摎涿竿蛔凅w(王磊.基于煙酰胺胞嘧啶二核苷酸的代謝電路研究[博士學(xué)位論文].北京：中國科學(xué)院大學(xué)，2014)。酶活力單位定義：在測定條件下每分鐘催化產(chǎn)生1nmol產(chǎn)物所需的酶量，即1U＝1nmol/min。NADH和NUDH的摩爾消光系數(shù)按6220M-1cm-1計。比酶活用公式1進行計算。其中，Vt為反應(yīng)液總體積，Vs為加入酶體積，C為酶濃度。公式1其中，Vt為反應(yīng)液總體積，Vs為加入酶體積，C為酶濃度。酶反應(yīng)合成產(chǎn)物的分離純化采用文獻(xiàn)(D.Ji，etal.JournalofThe AmericanChemicalSociety.2011，133，20857-20862)的方法。粗酶液反應(yīng)結(jié)束后產(chǎn)物NUD的定性與定量采用文獻(xiàn)(L.Sorci，etal.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica.2009，106，3083)中HPLC的方法。發(fā)酵培養(yǎng)基中的最小礦物鹽培養(yǎng)基采用文獻(xiàn)(T.Causey，etal.ProceedingoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatedofAmerica.2003.100，825)中配方。對比實施例1野生NadD催化合成NUD參考文獻(xiàn)(R.Mehl，etal.JournalofBacteriology.2000，182，4372)構(gòu)建來源于大腸桿菌的野生型煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶NadD的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，獲得工程菌BL21(DE3)(pET-NadD)。參考文獻(xiàn)(R.Mehl，etal.JournalofBacteriology.2000，182，4372)誘導(dǎo)表達(dá)并純化NadD，即SEQIDNO：1對應(yīng)的蛋白。采用上述與蘋果酸酶突變體ME*偶聯(lián)的方法測定其利用UTP合成NUD的反應(yīng)活性。反應(yīng)條件：150μL反應(yīng)體系中含HEPES50mM，UTP100μM，NMN4mM，MgCl210mM，MnCl25mM，NadD6mg，L-蘋果酸10mM，蘋果酸酶突變體ME*純酶7.5U，pH7.5，在25℃恒溫條件下用分光光度計測340nm處吸光度變化。測得野生NadD合成NUD的活性為0.02U/mg。實施例1NadD3G10催化合成NUD1.構(gòu)建突變文庫采用RF克隆(F.vandenEnt，etal.JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods.2006，67，67)的方法構(gòu)建突變文庫。第一步，模板為野生型NadD表達(dá)載體(見對比實施例1)，引物將待突變氨基酸位點堿基替換為簡并堿基NNK，回收PCR產(chǎn)物；第二步，模板同第一步，引物為第一步中回收的PCR產(chǎn)物，得到的產(chǎn)物用DpnI限制酶進行消化，并轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，得到的轉(zhuǎn)化子即為可表達(dá)NadD突變體的突變文庫，各突變體表達(dá)菌分別命名為BL21(DE3)(pET-NadD-xxx)，表達(dá)蛋白產(chǎn)物命名為NadDxxx。其中，xxx為數(shù)字和字母的組合，每個突變菌株對應(yīng)一個編號，下同。2.突變文庫篩選挑取突變文庫單菌落接種于96深孔板LB液體培養(yǎng)基中，在30℃，200rpm培養(yǎng)72h，誘導(dǎo)表達(dá)突變體。在3500rpm條件下離心15min收集菌體，加入細(xì)胞裂解劑(50mMHPEPS，1％Triton，1mg/mL溶菌酶，pH7.5)，在37℃，200rpm破碎1h，3500rpm離心獲得粗酶液上清。采用酶偶聯(lián)顯色方法進行合成NUD的活性篩選。60μL反應(yīng)條件為：HEPES50mM，UTP2mM，NMN4mM，MgCl210mM，MnCl25mM，L-蘋果酸10mM，蘋果酸酶突變體ME*純酶7.5U，PES0.4mM，NBT1mM，pH7.5，加入粗酶液10μL，30℃反應(yīng)1.5h，觀察顏色變化，顯藍(lán)色的孔所對應(yīng)的菌株即為疑似可以合成NUD的突變菌株。復(fù)篩采用放大培養(yǎng)，在5mLLB液體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)突變體，篩選方法同上，能重復(fù)顯藍(lán)色的突變菌株即為目標(biāo)突變菌株。選其中顯色較快的突變菌命名為BL21(DE3)(pET-NadD-3G10)并進行測序，其表達(dá)蛋白產(chǎn)物NadD3G10的氨基酸序列為SEQIDNO：4，與野生型NadD相比，其118位酪氨酸突變?yōu)榻M氨酸，175位脯氨酸突變?yōu)橘嚢彼幔?76位色氨酸突變?yōu)榫彼帷?.NadD3G10催化合成NUD突變菌BL21(DE3)(pET-NadD-3G10)的培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)及NadD3G10的純化過程同對比實施例1。從9g濕菌體中純化得到純酶NadD3G1027mg/mL，共10mL。測定其利用UTP合成NUD的比酶活方法同對比實施例1。測得其合成NUD的活性為9.22U/mg，比野生型NadD提高了460倍。可見，本發(fā)明得到的突變體純酶NadD3G10催化合成NUD的活性顯著高于相應(yīng)野生型蛋白的活性，為制備NUD和在細(xì)胞內(nèi)合成NUD提供了新的生物催化劑。實施例2NadD3G10純酶制備NUD10mL純酶NadD3G10反應(yīng)合成NUD的體系含有Tris50mM，UTP2mM，NMN4mM，MgCl210mM，MnCl25mM，純酶NadD3G1010mg，pH8.0，在37℃，200rpm反應(yīng)1h，然后用超濾離心管在5000g，4℃條件下離心15min除去蛋白，參考文獻(xiàn)方法(D.Ji，etal.JournaloftheAmericanChemicalSociety.2011，133，20857)，分離純化得NUD5.8mg，產(chǎn)率45％。產(chǎn)物核磁共振數(shù)據(jù)：1HNMR(D2O，400MHz)：δ9.36(s，1H)，9.20(d，J＝6.2Hz，1H)，8.88(d，J＝8.1Hz，1H)，8.22(pseudot，J＝6.6Hz，1H)，7.79(d，J＝8.2Hz，1H)，6.10(d，J＝5.4Hz，1H)，5.82-5.80(m，2H)，4.52(brs，1H)，4.48-4.46(m，1H)，4.39-4.37(m，1H)，4.34-4.32(m，1H)，4.25-4.21(m，2H)，4.18-4.15(m，3H)，4.07-4.04(m，1H).13CNMR(D2O，100MHz)：δ166.1，165.6，151.7，146.1，142.6，141.7，139.9，133.9，128.7，102.5，99.9，88.5，87.0，82.9，77.6，73.7，70.7，69.5，64.9，64.7.31PNMR(D2O，162MHz)：δ-11.1，-11.3.實施例3NadD3G10粗酶液制備NUD將NadD3G10的表達(dá)工程菌BL21(DE3)(pET-NadD-3G10)劃線培養(yǎng)，挑取單菌落接種于5mLLB(含卡那霉素50ng/μL)液體培養(yǎng)基中，在37℃，200rpm過夜活化，將其全部接種于50mL新鮮LB(含卡那霉素50ng/μL和IPTG1mM)中，在30℃，200rpm培養(yǎng)24h。離心收集菌體，加入5mL細(xì)胞裂解液(50mMHPEPSpH7.5，1％TritonX-100，1mg/mL溶菌酶)，在37℃，200rpm下裂解1h。離心(12000g)處理10min，收集上清，得到NadD3G10粗酶液。300μL粗酶液反應(yīng)體系中含有：Tris50mM，UTP100μM，NMN4mM，MgCl210mM，MnCl25mM，NadD3G10粗酶液50μL，pH8.0，在37℃，200rpm反應(yīng)2h。加入150μL冰預(yù)冷的1.2M的HClO4，混勻后冰浴10min中止反應(yīng)；在4℃，離心力為12000g下處理1min，取300μL上清加入80μL冰預(yù)冷的0.8M的K2CO3溶液，混勻后冰浴10min進行中和；在4℃，離心力為12000g下處理1min，取上清300μL用0.22μm濾膜過濾后進行HPLC分析。 定量分析顯示反應(yīng)結(jié)束時，反應(yīng)液中含NUD1.83mM。實施例4NadD3G10胞內(nèi)合成NUD同NadD3G10粗酶液合成NUD時工程菌的培養(yǎng)方法，經(jīng)過劃線復(fù)蘇，過夜活化及誘導(dǎo)表達(dá)之后，取菌液稀釋至OD600為1.0，取1mL菌液離心(12000g)處理2min，收集菌體；加入500μL50mMpH7.2的磷酸鹽緩沖液進行重懸，離心(12000g)處理2min，收集菌體；NUD提取時加入150μL0.2M的HCl，55℃加熱10min，于0℃中降溫5min；加入150μL0.1M的NaOH溶液中和，離心(12000g)處理5min，上清即為胞內(nèi)NUD提取液。胞內(nèi)NUD含量的測量采用酶循環(huán)法。100μL的反應(yīng)體系中含有：50mMHEPES，10mMMgCl2，5mMMnCl2，50U/mL的蘋果酸酶突變體ME*純酶液，10mML-蘋果酸，0.4mMPES，1mMMTT和15μLNUD提取液，pH7.5。測得工程菌BL21(DE3)(pET-NadD-3G10)胞內(nèi)NUD含量為23.1μM。實施例5NadD3G10調(diào)控琥珀酸發(fā)酵產(chǎn)量琥珀酸發(fā)酵工程菌的宿主為E.coliKJ134(K.Jantama，etal.BiotechnologyBioengineering.2008，5，881)。用Redβ重組系統(tǒng)和FLP重組酶系統(tǒng)敲除maeB基因，防止蘋果酸被消耗菌株，獲得的工程菌株命名為E.coliWXY01(KJ134，ΔmaeB)。構(gòu)建琥珀酸發(fā)酵工程菌需要將能夠合成NUD的NadD3G10，依賴NUD(H)為輔酶的來源于施氏假單胞菌WM88的第151位異亮氨酸突變?yōu)榫彼岬膩喠姿崦摎涿竿蛔兠窹DH*(將亞磷酸氧化為磷酸的同時將NUD還原為NUDH)和來源于大腸桿菌K12的第310位亮氨酸突變?yōu)橘嚢彼岬奶O果酸酶突變酶ME*(以NUDH為還原力催化丙酮酸生成蘋果酸)，共表達(dá)于宿主E.coliWXYO1中。三酶共表達(dá)載體以pK載體(王磊.基于煙酰胺胞嘧啶二核苷酸的代謝電路研究[博士學(xué)位論文].北京：中國科學(xué)院大學(xué)，2014)為模板。采用三步RF克隆的方法。所用到的引物和模板如下表1和表2所示。得到的RF克隆產(chǎn)物經(jīng)過轉(zhuǎn)化并菌落PCR鑒定正確后提質(zhì)粒送測序，測序正確的即為目標(biāo)載體，命名為pK-ME*-NadD3G10-PDH*。表1構(gòu)建共表達(dá)載體所用的引物表引物名稱引物序列ME-FGGATAACAATTTCACACAGGAAACACATATGGAACCAAAAACAAAAAAACAGCME-RGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAATCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGPK-ME-FCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCPK-ME-RGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCATCCCGGAGACGGTCACAGCPK-NadD-FGCTGTGACCGTCTCCGGGATGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCPK-NadD-RGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCATCCCGGAGACGGTCACAGC表2兩步RF克隆所用引物，模板簡表將pK-ME*-NadD3G10-PDH*電轉(zhuǎn)入WXY01感受態(tài)細(xì)胞中，得到的陽性克隆經(jīng)驗證正確后，即為本實施例的工程菌，命名為WXY02，其琥珀酸積累途徑如附圖2所示。WXY02發(fā)酵產(chǎn)生琥珀酸的種子培養(yǎng)基為LB液體培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基為最小礦物鹽培養(yǎng)基添加10％葡萄糖，100mMKHCO3，0.15％乙酸鈉，100mM亞磷酸和0.4mMIPTG。過夜活化的種子培養(yǎng)液以1∶50的接種率接種于1.5L發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30℃，200rpm培養(yǎng)96h。琥珀酸的含量采用文獻(xiàn)方法(K.Jantama，etal.BiotechnologyBioengineering.2008，5，881)利用HPLC分析，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液琥珀酸含量為97g/L，而相同條件下培養(yǎng)KJ134，發(fā)酵液琥珀酸含量為72g/L。表明以葡萄糖為碳源時，工程菌WXY02的琥珀酸產(chǎn)量提高了35％。本實施例的結(jié)果說明，工程菌WXY02通過在胞內(nèi)合成NUD，并且在PDH*作用下還原為NUDH，進而被ME*利用，推動ME*途徑克服熱力學(xué)屏障催化蘋果酸合成，進一步提高了琥珀酸產(chǎn)量。因此，胞內(nèi)合成NUD及其介導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)體系，為代謝工程提供了新技術(shù)。對比實施例2參考文獻(xiàn)(N.Raffaelli，etal.JournalofBacteriology.1999，181，5509)將來源于大腸桿菌BL21(DE3)的煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶NadR的基因nadR亞克隆至pK載體上，得到野生型NadR的表達(dá)載體pK-NadR，將其電轉(zhuǎn)入DH10b感受態(tài)細(xì)胞中，得到可表達(dá)NadR的工程菌，命名為DH10b(pK-NadR)。參考文獻(xiàn)(N.Raffaelli，etal.JournalofBacteriology.1999，181，5509)對工程菌進行誘導(dǎo)表達(dá)并純化，得到純酶NadR，即SEQIDNO：2對應(yīng)的蛋白。采用對比實施例1中相同的方法進行NUD合成酶活測定。測得野生NadR合成NUD的活性為0.01U/mg。實施例6NadR7G11催化合成NUDNadR突變文庫的構(gòu)建方法基本同實施例1，不同之處在于，將RF克隆得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)DpnI消化后電轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH10b感受態(tài)細(xì)胞中，得到的轉(zhuǎn)化子即為可表達(dá)NadR突變體的突變文庫，各突變體表達(dá)菌分別命名為DH10b(pK-NadR-xxx)，表達(dá)蛋白產(chǎn)物命名為NadRxxx。其中，xxx為數(shù)字和字母的組合，每個菌株對應(yīng)一個編號，下同。突變文庫的篩選和復(fù)篩方法同實施例1，不同之處在于酶偶聯(lián)顯色篩選體系中NMN由4mM減少至1mM。選其中顯色較快的突變菌命名為DH10b(pK-NadR7G11)并進行測序，其表達(dá)蛋白產(chǎn)物NadR7G11的氨基酸序列為SEQIDNO：5，與野生型NadR相比，其第198，199，200位的天冬氨酸、脯氨酸、賴氨酸缺失突變?yōu)楸彼岷屠野彼?。突變菌DH10b(pK-NadR-7G11)的培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)及NadR7G11的純化過程同對 比實施例2。從12g濕菌體中純化得到純酶NadR7G11濃度為15mg/mL，共10mL。測定其利用UTP合成NUD的比酶活方法同對比實施例1。測得其合成NUD的活性為2.15U/mg，比野生型NadR提高了210倍?？梢?，本發(fā)明得到的突變體蛋白NadR7G11催化合成NUD的活性顯著高于相應(yīng)野生型蛋白的活性，為制備NUD和在細(xì)胞內(nèi)合成NUD提供了新的生物催化劑。實施例7NadR7G11純酶制備NUD10mLNadR7G11純酶反應(yīng)合成NUD的體系如下：HEPES100mM，UTP4mM，NMN4mM，MgCl210mM，MnCl25mM，NadR7G115mg，pH8.6，在30℃，200rpm反應(yīng)2h，然后用超濾離心管在5000g，4℃條件下離心15min除去蛋白，參考文獻(xiàn)方法(D.Ji，etal.JournaloftheAmericanChemicalSociety.2011，133，20857)，分離純化得NUD7.8mg，產(chǎn)率30％。實施例8NadR7G11胞內(nèi)合成NUD胞內(nèi)合成NUD及NUD的提取方法同實施例4，所不同的是采用工程菌DH10b(pK-NadR-7G11)，誘導(dǎo)條件為0.1mMIPTG，在20℃，200rpm培養(yǎng)60h。胞內(nèi)NUD含量的測量同實施例4。測得工程菌DH10b(pK-NadR-7G11)胞內(nèi)NUD含量為2.5μM。對比實施例3野生NadM催化合成NUD參考文獻(xiàn)(L.Sorci，etal.ProceedingoftheNationalAcademyofSciences.2009，106，3083)構(gòu)建來源于土拉熱弗朗西絲氏菌的煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶NadM的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，獲得工程菌BL21(DE3)(pET-NadM)，并誘導(dǎo)表達(dá)，純化得到野生型NadM，即SEQIDNO：3對應(yīng)的蛋白。采用對比實施例1中相同的方法進行NUD合成酶活測定。測得野生NadM合成NUD的活性為0.07U/mg。實施例9NadM15C12催化合成NUDNadM突變文庫的構(gòu)建方法基本同實施例1，得到的轉(zhuǎn)化子即為可表達(dá)NadM突變體的突變文庫，各突變體表達(dá)菌分別命名為BL21(DE3)(pET-NadM-xxx)，表達(dá)蛋白產(chǎn)物命名為NadMxxx。其中，xxx為數(shù)字和字母的組合，每個菌株對應(yīng)一個編號，下同。突變文庫的篩選和復(fù)篩方法同實施例1，不同之處在于突變文庫的誘導(dǎo)條件為20℃，200rpm，96h，培養(yǎng)基中加入IPTG濃度為0.1mM，酶偶聯(lián)顯色篩選時NMN濃度由4mM減少至100μM。選其中顯色較快的突變菌命名為BL21(DE3)(pET-NadM-15C12)并進行測序，其表達(dá)蛋白產(chǎn)物NadM15C12的氨基酸序列為SEQIDNO：6，與野生型NadM相比，其第131位天冬氨酸突變?yōu)楦彼帷Ｍ蛔兙鶥L21(DE3)(pET-NadM-15C12)的培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)及NadM15C12的純化過程同對比實施例3。從8g濕菌體中純化得到純酶NadM15C12濃度為7.8mg/mL，共5mL。測定其利用UTP合成NUD的比酶活方法同對比實施例1。測得其合成NUD的活性為13.7U/mg，比野生型NadM提高了196倍?？梢?，本發(fā)明得到的突變體蛋白NadM15C12催化合成NUD的活性顯著高于相應(yīng)野生型蛋白的活性，為制備NUD和在細(xì)胞內(nèi)合成NUD提供了新的生物催化劑。實施例10NadM15C12純酶制備NUD10mL純酶反應(yīng)合成NUD的體系如下：HEPES50mM，UTP4mM，NMN4mM，MgCl210mM，MnCl25mM，NadM15C1220mg，pH7.0，在25℃，200rpm反應(yīng)4h，得到產(chǎn)物然后用超濾離心管在5000g4℃條件下離心15min除去蛋白，參考文獻(xiàn)方法(D.Ji，etal.JournaloftheAmericanChemicalSociety.2011，133，20857)，分離純化得NUD13.34mg，產(chǎn)率52％。表3列出了本發(fā)明中其他部分NMNAT突變體的活性。本發(fā)明利用煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體為催化劑，催化煙酰胺單核苷酸和尿嘧啶核苷三磷酸耦合反應(yīng)，制備煙酰胺尿嘧啶二核苷酸。在微生物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體的編碼基因，工程菌利用內(nèi)源代謝物合成煙酰胺尿嘧啶二核苷酸，并且胞內(nèi)煙酰胺尿嘧啶二核苷酸可作為輔酶，選擇性介導(dǎo)氧化還原反應(yīng)，提高目標(biāo)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量。在一個典型實例中，琥珀酸產(chǎn)量提高了35％。當(dāng)前第1頁1 2 3