本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種A型單端孢霉烯族毒素(Type A trichothecenes)的LAMP檢測引物組合及其LAMP檢測試劑盒和LAMP方法。

背景技術(shù)：

由鐮刀菌引起的麥類赤霉病是一種毀滅性的病害，在亞洲、歐洲、加拿大和美國北部等地頻繁爆發(fā)。病菌能在收獲前僅僅幾周的時間內(nèi)在小麥穗部迅速擴(kuò)展，阻礙種子形成并使麥粒萎縮，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近年來，隨著全球氣候變化和耕作制度改變，發(fā)生區(qū)域不斷擴(kuò)大。赤霉病不僅可造成作物產(chǎn)量嚴(yán)重?fù)p失，而且其病原物鐮刀菌代謝產(chǎn)生單端孢霉烯族毒素污染食物和飼料可造成人類和動物嚴(yán)重疾病和免疫力下降(Pestka and Smolinski 2005)，阻止真核生物蛋白質(zhì)合成(Ueno et al.，1973)。因此，造成食品安全上的重大隱患。

單端孢霉烯族毒素(Trichothecenes)是一大結(jié)構(gòu)相似的倍半萜烯類化合物，迄今已發(fā)現(xiàn)有70多種，是鐮刀菌產(chǎn)生的最重要的真菌毒素。根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)主要可分為A型和B型兩大類：A型包括二乙酰氧基草鐮刀菌烯醇(Diacetoxyscirpenol，DAS)、T-2毒素和HT2毒素等；B型包括脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)、3-乙?；撗跹└牭毒┐?3-acetyldeoxynivalenol，3ADON)、15-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(15-acetyldeoxynivalenol，15ADON)和雪腐鐮刀菌烯醇(Nivalenol，NIV)等。

目前，真菌毒素的測定方法主要有生物測定法、化學(xué)測定法和免疫學(xué)測定法。生物測定法是缺乏統(tǒng)一的規(guī)范化標(biāo)準(zhǔn)，并且容易受到環(huán)境因素的影響，通常僅能用于定性分析。化學(xué)測定法是主要的測定方法，具有準(zhǔn)確、重復(fù)性好的特點(diǎn)，但是要依賴于昂貴的科研儀器，并且前期的提取純化步驟繁瑣，技術(shù)要求高，耗時長，難以滿足快速現(xiàn)場檢測的要求。免疫學(xué)測定法與化學(xué)測定法相比，操作簡單，快速，但依賴于特異性抗體，僅能檢測少數(shù)毒素，并且容易受到一些衍生物干擾，假陽性率高，測定結(jié)果不夠準(zhǔn)確。

近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，特別是鐮刀菌全基因組序列的公布，國內(nèi)外科學(xué)家在單端孢霉烯族毒素的合成與調(diào)控方面取得了重要進(jìn)展，解析了毒素合成基因簇中各基因以及多個相關(guān)調(diào)控基因的功能?；诙舅睾铣杉罢{(diào)控基因的序列信息，開發(fā)快速且成本低廉的檢測方法逐漸成為科學(xué)家研究的熱點(diǎn)。如：Kim等(2003)利用Tri5、Tri7和Tri13基因序列信息開發(fā)了檢測NIV和DON毒素的PCR檢測方法，Li等(2005)通過分析Tri5～Tri6基因間序列信息，設(shè)計了區(qū)分NIV和DON的檢測引物，該方法穩(wěn)定性好，適用于大規(guī)模檢測。Zhang 等(2010)根據(jù)Trill基因開發(fā)了特異性引物組合，能夠在一個反應(yīng)內(nèi)同時區(qū)分DON及其兩種衍生物3ADON、15ADON，取得了很好的效果。但是，這些方法都僅限于檢測部分B型單端孢霉烯族毒素，而無法檢測樣品是否含有T2、HT2等A型單族毒素。A型毒素在全球范圍內(nèi)廣泛出現(xiàn)，如：捷克50％的大麥檢出T2毒素(Malachova et al，2010)，Pettersson等(2011)對歐洲5個國家11個燕麥加工廠進(jìn)行抽檢，發(fā)現(xiàn)T2和HT2毒素檢出率為72％。在我國，Wang等(2013)對山東省420份飼料樣品檢測發(fā)現(xiàn)，T2毒素檢出率為79.5％。T-2毒素的毒性較強(qiáng)，人畜誤食被污染的谷物或飼料會引發(fā)多種急慢性中毒。急性中毒癥狀表現(xiàn)為嘔吐、出血性素質(zhì)和心血管功能障礙等。目前尚沒有通過PCR檢測檢測A型單端孢霉烯族毒素的報道。除此之外，以上檢測均需要進(jìn)行在PCR儀上完成聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，對儀器要求較高，并且常規(guī)PCR反應(yīng)及時間長，靈敏度也相對較低。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種新的等溫擴(kuò)增技術(shù)，因其操作簡單快速、特異性、靈敏度高、成本低等特點(diǎn)，逐漸成為可以替代傳統(tǒng)PCR的新的核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)。它是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4條特異引物，利用Bst DNA聚合酶的鏈置換活性在同一反應(yīng)體系中恒溫高效擴(kuò)增，大量合成目的DNA的同時，產(chǎn)生副產(chǎn)物-白色焦磷酸鎂沉淀。由于擴(kuò)增反應(yīng)依賴于靶DNA的6個獨(dú)立的區(qū)域，因此特異性非常高，反應(yīng)在等溫條件下進(jìn)行，則不需要PCR儀等昂貴設(shè)備，僅用水浴鍋等能夠維持穩(wěn)定恒溫的設(shè)備即可完成，檢測成本大大降低，應(yīng)用范圍顯著擴(kuò)大，可以在田間進(jìn)行實時監(jiān)測。由于LAMP技術(shù)多方面的優(yōu)點(diǎn)，近年來在病原物檢測等方面應(yīng)用廣泛，但在A型單端孢霉烯族毒素檢測方面尚無相關(guān)報到。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：針對以上存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一組檢測A型單端孢霉烯族毒素的LAMP引物組合，能夠檢測A型單端孢霉烯族毒素。本發(fā)明的另一目的是提供上述A型單端孢霉烯族毒素的LAMP檢測試劑盒。本發(fā)明的另一目的是提供上述A型單端孢霉烯族毒素的LAMP檢測方法。

技術(shù)方案：為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種用于A型檢測單端孢霉烯族毒素的LAMP引物組合，由正向外引物F3，反向外引物B3，正向內(nèi)引物FIP，反向內(nèi)引物BIP和反向環(huán)引物L(fēng)B組成，各引物序列如下：

FIP：5’-AATGCCACAGCAGACCCTGAGATCGTTTCGATAACGCTGGAG-3’；

BIP：5’-AAGAGGCTCATCGGGATCGGGACCCGTCAGCAAGACCAA-3’；

F3：5’-ATGCAGCGATGTTTTGTTCG-3’；

B3：5’-ACTGATCTATGGGCCTCGT-3’；

LB：5’-TCTTCGGCTGCTGCACCT-3’；

所述引物組合在檢測A型單端孢霉烯族毒素中的應(yīng)用。

一種檢測A型單端孢霉烯族毒素的LAMP試劑盒，包含以下成分：

(1)包含上述引物組合的引物混合液，濃度分別為：正向外引物F3 1μM、反向外引物B3 1μM、正向內(nèi)引物FIP 8μM、反向內(nèi)引物FIP 8μM、反向環(huán)引物2μM；

(2)反應(yīng)液，包含：7mM dNTPs、100mM Tris-HCl，50mM KCl，50mM(NH₄)₂SO₄，40mM MgSO₄、0.5％Triton X-100、5M Betain、40U Bst DNA聚合酶、25mM羥基萘酚藍(lán)；

(3)陽性對照為擬枝孢鐮刀菌ITEM3593的基因組DNA，陰性對照為不含目的基因的反應(yīng)混合液。

所述的檢測A型單端孢霉烯族毒素的LAMP試劑盒在檢測A型單端孢霉烯族毒素中的應(yīng)用

一種檢測A型單端孢霉烯族毒素的方法，包括提取待測材料的總DNA，以提取的DNA為模板，利用LAMP引物組或LAMP試劑盒進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，觀察反應(yīng)溶液的顏色變化，顯示紫色表示檢測為陰性，不存在A型單端孢霉烯族毒素，而顯示天藍(lán)色的為陽性，樣品中存在A型單端孢霉烯族毒素。

所述的檢測A型單端孢霉烯族毒素的方法，提取待測樣品的總DNA，取1μL DNA溶液，加入5μL反應(yīng)液、5μL引物液、14μL滅菌超純水進(jìn)行LAMP反應(yīng)，反應(yīng)程序為60～65℃，時間為30～50min，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行顏色變化的觀察。

本發(fā)明檢測A型單端孢霉烯族毒素的方法，包括待測樣品DNA的提取，以DNA為模板，利用所述引物組合進(jìn)行LAMP反應(yīng)。羥基萘酚藍(lán)(Hydroxynaphthol blue，HNB)屬于金屬離子指示劑的一種，是Mg²⁺的滴定及劑，其顏色隨溶液PH改變而變化，因此可以通過監(jiān)測Mg²⁺濃度及PH的變化起到顏色指示劑的作用。反應(yīng)前將HNB加到反應(yīng)液中，溶液呈紫色，反應(yīng)過程中大量形成副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀，使Mg²⁺濃度下降，PH發(fā)生改變，溶液顏色由紫色轉(zhuǎn)變?yōu)樘焖{(lán)色。因此，反應(yīng)結(jié)束后通過反應(yīng)體系的顏色變化判斷A型單端孢霉烯族毒素的有無。顯示紫色表示檢測為陰性，不存在A型單端孢霉烯族毒素，而顯示天藍(lán)色的為陽性，樣品中存在A型單端孢霉烯族毒素。

本發(fā)明的關(guān)鍵技術(shù)之一是A型單端孢霉烯族毒素的高效特異擴(kuò)增引物序列及其擴(kuò)增方法。為了驗證引物序列的特異性，本發(fā)明以3株產(chǎn)生A型單端孢霉烯族毒素毒素的不同種鐮刀菌和23株產(chǎn)生其他類型毒素或不產(chǎn)毒素的不同種鐮刀菌為供試材料(表1)，采用快速DNA提取法提取鐮刀菌基因組DNA。具體方法如下：用已滅菌的牙簽或槍頭在樣品表面上挑取少量菌絲，放入PCR管，加入50μL BufferA溶液(100mM NaOH，2％Tween20)，95℃溫育 10min。再加入50μL BufferB溶液(100mM Tris-HCl，2mM EDTA)，振蕩混勻，12000rpm離心15s，取1μL上清液做LAMP擴(kuò)增的模板。

當(dāng)發(fā)生LAMP反應(yīng)時，產(chǎn)生大量的焦磷酸鎂沉淀導(dǎo)致濁度上升。通過HNB顯色反應(yīng)結(jié)果所示，產(chǎn)生A型單端孢霉烯族毒素的鐮刀菌樣品反應(yīng)管里均為天藍(lán)色，其為陽性結(jié)果，而產(chǎn)生其他種毒素和不產(chǎn)毒素鐮刀菌樣品管均呈紫色，為陰性結(jié)果。證明設(shè)計的LAMP引物組合具有特異性。說明該引物組合可被用于田間和收獲谷物中A型單端孢霉烯族毒素快速可靠的檢測鑒定。當(dāng)用于收獲谷物中單端孢霉烯族毒素檢測時，采用快速裂解法提取總DNA，具體過程如下：將待測谷物樣品加入2mL離心管，并同時加入直徑4mm鋼珠，液氮速凍后與Biospec研磨儀高速研磨1min，加入200μL BufferA溶液(100mM NaOH，2％Tween20)，95℃溫育10min。再加入200μLBufferB溶液(100mM Tris-HCl，2mM EDTA)，振蕩混勻，12000rpm離心30s，取上清液做LAMP擴(kuò)增的模板。

有益效果：現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有點(diǎn)和積極效果表現(xiàn)在：

1)特異性強(qiáng)。本發(fā)明針對鐮刀菌A型單端孢霉烯族毒素合成關(guān)鍵基因Tri16序列的6個區(qū)域設(shè)計了5條特異引物，對產(chǎn)毒鐮刀菌進(jìn)行特異性識別，其特異性強(qiáng)、靈敏度高，使本發(fā)明能夠快速準(zhǔn)確完成A型單端孢霉烯族毒素的檢測。

2)操作簡便快捷。本發(fā)明提供的檢測A型單端孢霉烯族毒素的方LAMP法，克服了現(xiàn)有生物與化學(xué)檢測方法樣品處理繁瑣，檢測周期長、費(fèi)時費(fèi)力及需要PCR熱循環(huán)儀等問題。該方法無需PCR反應(yīng)中的退火、復(fù)性等溫度的變化，30～50min內(nèi)即可完成檢測，大大提高了檢測的效率。

3)成本低。本方法無需昂貴、精密的試驗儀器設(shè)備，僅需要恒溫水浴鍋即可完成檢測，且所用DNA快速提取和PCR過程均為常規(guī)試劑，價格低廉。

因此本方法實用性強(qiáng)，可滿足田間及收獲谷物中A型單端孢霉烯族毒素快速檢測，為食品安全提供了保障。

表1 用于檢測引物特異性的產(chǎn)不同種毒素的鐮刀菌菌株

*菌株產(chǎn)生毒素經(jīng)LC-MS確認(rèn)

(四)附圖說明

圖1：LAMP引物組合的特異性驗證結(jié)果

圖中菌株編號與表1相同，圖中顯示1～3反應(yīng)應(yīng)管為產(chǎn)生A族單端孢霉烯族毒素鐮刀菌，檢測結(jié)果呈陽性，其他為產(chǎn)生其他毒素或不產(chǎn)毒鐮刀菌，結(jié)果顯示陰性。

圖2：LAMP引物組合的靈敏度試驗結(jié)果

1.100ng；2.10ng；3.1ng；4.100Pg；5.10Pg；6.1pg。圖中顯示25μL反應(yīng)體系內(nèi)含有10pg-100ng DNA均顯示陽性，而含有1pg DNA呈陰性，說明反應(yīng)靈敏度為10pg。

圖3：小麥中A型單端孢霉烯族毒素檢測結(jié)果

1.陽性對照(ITEM3593)；2～5.接種小麥；6～7.未接種小麥；8.陰性對照(water)。圖中顯示接種鐮刀菌的小麥含有A型單端孢霉烯族毒素，而其余樣品呈陰性。

(五)具體實施方式

下面以具體實施例做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不受以下實施例的限制。

實施實例1：A型單端孢霉烯族毒素LAMP反應(yīng)的特異性實驗

為了驗證LAMP方法的特異性，以26個種的鐮刀菌為參試對象，其中3個種產(chǎn)生A型單端孢霉烯族毒素、其余18個種產(chǎn)生B型單端孢霉烯族毒素、伏馬毒素等其他毒素，5個種不產(chǎn)毒素(表1)。

模板DNA提?。河靡褱缇难篮灮驑岊^在樣品表面上挑取少量菌絲，放入PCR管，加入50μL BufferA溶液(100mM NaOH，2％Tween20)，95℃溫育10min。再加入50μL BufferB溶液(100mM Tris-HCl，2mM EDTA)，振蕩混勻，12000rpm離心15s，取1μL上清液做LAMP擴(kuò)增的模板。

LAMP反應(yīng)：取1μLDNA溶液，加入5μL反應(yīng)液、5μL引物組混合液、14μL滅菌超純水進(jìn)行LAMP反應(yīng)，反應(yīng)程序為65℃，時間為45min，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行顏色變化的觀察。

LAMP檢測結(jié)果如圖1所示，3株產(chǎn)生A型單端孢霉烯族毒素菌株反應(yīng)管均顯示天藍(lán)色的陽性反應(yīng)，而其他23株菌株均呈紫色的陰性反應(yīng)。

實施實例2：A型單端孢霉烯族毒素LAMP反應(yīng)的靈敏度實驗

為了驗證LAMP方法的靈敏度，提取單端孢霉烯族毒素陽性的鐮刀菌菌株ITEM3593，并采用分光光度計測定DNA濃度(100ng/μL)，用超純水進(jìn)行10倍梯度稀釋，-20℃保存做模板。分別取各濃度的DNA溶液1μL做模板，加入5μL反應(yīng)液、5μL引物組混合液、14μL滅菌超純水進(jìn)行LAMP反應(yīng)，反應(yīng)程序為65℃，時間為45min，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行顏色變化的觀察。結(jié)果表明(圖2)，加入100ng、10ng、1ng、100pg、10pg DNA的反應(yīng)管呈明顯天藍(lán)色，而加入1pg DNA的反應(yīng)管呈紫色，表明LAMP反應(yīng)的靈敏度達(dá)到10pg基因組DNA。

實施實例3：小麥中檢測A型單端孢霉烯族毒素

模板DNA提?。捍郎y樣品中國農(nóng)科院植保所廊坊實驗基地樣品，2～5號樣品為接種擬枝孢鐮刀菌小麥，6、7號樣品為未接種小麥。將待測小麥樣品加入2mL離心管，并同時加入直徑4mm鋼珠，液氮速凍后與Biospec研磨儀高速研磨1min，加入200μL Buffer A溶液(100mM NaOH，2％Tween20)，95℃溫育10min。再加入200μL BufferB溶液(100mM Tris-HCl， 2mM EDTA)，振蕩混勻，12000rpm離心30s，取上清液做LAMP擴(kuò)增的模板。

LAMP反應(yīng)：取1μL DNA溶液，加入5μL反應(yīng)液、5μL引物組混合液、14μL滅菌超純水進(jìn)行LAMP反應(yīng)，反應(yīng)程序為65℃，時間為45min，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行顏色變化的觀察。

LAMP檢測結(jié)果如圖3所示，接種擬枝孢鐮刀菌的小麥樣品呈陽性，表明含有A型單端孢霉烯族毒素，而未接種小麥樣品為陰性，不含有A型單端孢霉烯族毒素。

序列表：