本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種伏馬(Fumonisin)的LAMP檢測引物組合及其LAMP檢測試劑盒和LAMP方法。

背景技術(shù)：

玉米穗腐病在世界各地均有分布，其病原一般通過氣流傳播，經(jīng)花絲侵入籽粒，引起籽粒腐爛。玉米穗腐病病原菌種類眾多，但分布最廣、對生產(chǎn)影響最大的是鐮刀菌其中輪枝鐮刀菌Fusarium verticillioides與層出鐮刀菌Fusarium proliferatum為優(yōu)勢菌。病菌也可經(jīng)種子帶菌經(jīng)過系統(tǒng)侵染進(jìn)入玉米植株和果穗(Murillo et al.，2008；Wilke et al.，2007)；也可經(jīng)害蟲造成的傷口進(jìn)入果穗或由蟲體直接帶至害蟲蛀食的籽粒傷口并造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失，轉(zhuǎn)抗蟲基因玉米可有效減少穗腐病的發(fā)生(宋立秋等，2009；Munkvold et al.，1997，1999)，在玉米籽粒收獲儲藏階段，已潛伏侵染的病菌也會引發(fā)籽粒霉變(馬秉元等，1995)。

除產(chǎn)量損失外，鐮刀菌還產(chǎn)生多種真菌毒素，其中伏馬毒素是其中最重要的一種。伏馬毒素是一類由不同的多氫醇和丙三羧酸組成的結(jié)構(gòu)類似的雙酯化合物。1988年，Gelderblom等首次從串珠鐮刀菌培養(yǎng)液中分離出伏馬毒素。隨后，Laurent等又從伏馬毒素中分離出伏馬毒素B1(FB1)和伏馬毒素B2(FB2)。到目前為止，發(fā)現(xiàn)的伏馬毒素有FA1、FA2、FB1、FB2、FB3、FB4、FC1、FC2、FC3、FC4和FP1共11種，其中60％以上是FB1，其毒性也最強(qiáng)。引起穗腐病的主要病原輪枝鐮刀菌Fusarium verticillioides與層出鐮刀菌Fusarium proliferatum菌產(chǎn)生大量的伏馬毒素。伏馬毒素在人畜體內(nèi)的作用比較復(fù)雜，它與神經(jīng)鞘氨醇(Sphinngosine，SO)和二氫神經(jīng)鞘氨醇(Shpinganine，SA)的結(jié)構(gòu)極為相似，而后兩者均為神經(jīng)鞘脂類的長鏈骨架。伏馬毒素通過抑制N-脂酰基神經(jīng)鞘氨醇合成酶，阻斷SO合成，破壞鞘脂類的代謝或影響鞘脂類的功能，這一抑制可引起SA升高，從而導(dǎo)致組織、血、尿中SA/SO比值升高。研究發(fā)現(xiàn)高濃度的FB1可導(dǎo)致各種家畜和試驗動物出現(xiàn)種屬特異性的急毒癥狀，如馬腦白質(zhì)軟化綜合征、豬肺水腫和羊肝腎病變等，現(xiàn)在還發(fā)現(xiàn)FB1可能與人的食管癌和肝癌發(fā)生有關(guān)。

目前，真菌毒素的測定方法主要有生物測定法、化學(xué)測定法和免疫學(xué)測定法。生物測定法是缺乏統(tǒng)一的規(guī)范化標(biāo)準(zhǔn)，并且容易受到環(huán)境因素的影響，通常僅能用于定性分析?；瘜W(xué)測定法是主要的測定方法，具有準(zhǔn)確、重復(fù)性好的特點，但是要依賴于昂貴的科研儀器，并且前期的提取純化步驟繁瑣，技術(shù)要求高，耗時長，難以滿足快速現(xiàn)場檢測的要求。免疫學(xué) 測定法與化學(xué)測定法相比，操作簡單，快速，但依賴于特異性抗體，僅能檢測少數(shù)毒素，并且容易受到一些衍生物干擾，假陽性率高，測定結(jié)果不夠準(zhǔn)確。

近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，特別是鐮刀菌全基因組序列的公布，國內(nèi)外科學(xué)家在伏馬毒素的合成與調(diào)控方面取得了重要進(jìn)展，解析了毒素合成基因簇中各基因以及多個相關(guān)調(diào)控基因的功能?；诙舅睾铣杉罢{(diào)控基因的序列信息，開發(fā)快速且成本低廉的檢測方法逐漸成為科學(xué)家研究的熱點。如：Baird等(2008)利用Fum1基因序列信息開發(fā)了檢測伏馬毒素的PCR檢測方法，取得了很好的效果。但其檢測需要進(jìn)行在PCR儀上完成聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，對儀器要求較高，并且常規(guī)PCR反應(yīng)及時間長，靈敏度也相對較低。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種新的等溫擴(kuò)增技術(shù)，因其操作簡單快速、特異性、靈敏度高、成本低等特點，逐漸成為可以替代傳統(tǒng)PCR的新的核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)。它是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4條特異引物，利用Bst DNA聚合酶的鏈置換活性在同一反應(yīng)體系中恒溫高效擴(kuò)增，大量合成目的DNA的同時，產(chǎn)生副產(chǎn)物-白色焦磷酸鎂沉淀。由于擴(kuò)增反應(yīng)依賴于靶DNA的6個獨(dú)立的區(qū)域，因此特異性非常高，反應(yīng)在等溫條件下進(jìn)行，則不需要PCR儀等昂貴設(shè)備，僅用水浴鍋等能夠維持穩(wěn)定恒溫的設(shè)備即可完成，檢測成本大大降低，應(yīng)用范圍顯著擴(kuò)大，可以在田間進(jìn)行實時監(jiān)測。由于LAMP技術(shù)多方面的優(yōu)點，近年來在病原物檢測等方面應(yīng)用廣泛，但在伏馬毒素檢測方面尚無相關(guān)報到。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：針對以上存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一組檢測伏馬素的LAMP引物組合，能夠檢測伏馬毒素。本發(fā)明的另一目的是提供上述伏馬毒素的LAMP檢測試劑盒。本發(fā)明的另一目的是提供上述伏馬毒素的LAMP檢測方法。

技術(shù)方案：為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種用于伏馬毒素的LAMP引物組合，由正向外引物F3，反向外引物B3，正向內(nèi)引物FIP，反向內(nèi)引物BIP，正向環(huán)引物L(fēng)F和反向環(huán)引物L(fēng)B組成，各引物序列如下：

FIP：5’-AGTCTGTCCGCGACTCGACATAGAGAGCTTGAGGGCATCG-3’；

BIP：5’-ATCGACTTCTTCGCCACTGCTGGGTGCCAGCACCAATCTC-3’；

F3：5’-GTTGACCACTGCGAGGAAAT-3’；

B3：5’-GGATAACTTGAGCTCCGCC-3’；

LF：5’-CCATCTTCTGCCTGAAGAAGTT-3’；

LB：5’-GGCCCACGCTTCGTGTT-3’；

所述引物組合在檢測伏馬中的應(yīng)用。

一種檢測伏馬毒素的LAMP試劑盒，包含以下成分：

(1)包含上述引物組合的引物混合液，濃度分別為：正向外引物F3 1μM、反向外引物B3 1μM、正向內(nèi)引物FIP 8μM、反向內(nèi)引物FIP 8μM、正向環(huán)引物2μM、反向環(huán)引物2μM；

(2)反應(yīng)液，包含：7mM dNTPs、100mM Tris-HCl，50mM KCl，50mM(NH₄)₂SO₄，40mM MgSO₄、0.5％Triton X-100、5M Betain、40U Bst DNA聚合酶、25mM羥基萘酚藍(lán)；

(3)陽性對照為輪枝鐮刀菌CBS218.76的基因組DNA，陰性對照為不含目的基因的反應(yīng)混合液。

所述的檢測伏馬毒素的LAMP試劑盒在檢測伏馬毒素中的應(yīng)用

一種檢測伏馬毒素的方法，包括提取待測材料的總DNA，以提取的DNA為模板，利用LAMP引物組或LAMP試劑盒進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，觀察反應(yīng)溶液的顏色變化，顯示紫色表示檢測為陰性，不存在伏馬毒素，而顯示天藍(lán)色的為陽性，樣品中存在伏馬毒素。

所述的檢測伏馬毒素的方法，提取待測樣品的總DNA，取1μLDNA溶液，加入5μL反應(yīng)液、5μL引物液、14μL滅菌超純水進(jìn)行LAMP反應(yīng)，反應(yīng)程序為60～65℃，時間為30～50min，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行顏色變化的觀察。

本發(fā)明檢測伏馬毒素的方法，包括待測樣品DNA的提取，以DNA為模板，利用所述引物組合進(jìn)行LAMP反應(yīng)。羥基萘酚藍(lán)(Hydroxynaphthol blue，HNB)屬于金屬離子指示劑的一種，是Mg²⁺的滴定及劑，其顏色隨溶液PH改變而變化，因此可以通過監(jiān)測Mg²⁺濃度及PH的變化起到顏色指示劑的作用。反應(yīng)前將HNB加到反應(yīng)液中，溶液呈紫色，反應(yīng)過程中大量形成副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀，使Mg²⁺濃度下降，PH發(fā)生改變，溶液顏色由紫色轉(zhuǎn)變?yōu)樘焖{(lán)色。因此，反應(yīng)結(jié)束后通過反應(yīng)體系的顏色變化判斷伏馬毒素的有無。顯示紫色表示檢測為陰性，不存在伏馬毒素，而顯示天藍(lán)色的為陽性，樣品中存在伏馬毒素。

本發(fā)明的關(guān)鍵技術(shù)之一是伏馬毒素的高效特異擴(kuò)增引物序列及其擴(kuò)增方法。為了驗證引物序列的特異性，本發(fā)明以3株產(chǎn)生伏馬毒素毒素的不同種鐮刀菌和21株產(chǎn)生其他類型毒素或不產(chǎn)毒素的不同種鐮刀菌為供試材料(表1)，采用快速DNA提取法提取鐮刀菌基因組DNA。具體方法如下：用已滅菌的牙簽或槍頭在樣品表面上挑取少量菌絲，放入PCR管，加入50μL BufferA溶液(100mM NaOH，2％Tween20)，95℃溫育10min。再加入50μL BufferB溶液(100mM Tris-HCl，2mM EDTA)，振蕩混勻，12000rpm離心15s，取1μL上清液做LAMP擴(kuò)增的模板。

當(dāng)發(fā)生LAMP反應(yīng)時，產(chǎn)生大量的焦磷酸鎂沉淀導(dǎo)致濁度上升。通過HNB顯色反應(yīng)結(jié)果所示，產(chǎn)生伏馬毒素的鐮刀菌樣品反應(yīng)管里均為天藍(lán)色，其為陽性結(jié)果，而產(chǎn)生其他種毒素和不產(chǎn)毒素鐮刀菌樣品管均呈紫色，為陰性結(jié)果。證明設(shè)計的LAMP引物組合具有特異性。 說明該引物組合可被用于田間和收獲谷物中伏馬毒素快速可靠的檢測鑒定。當(dāng)用于收獲谷物中單端孢霉烯族毒素檢測時，采用快速裂解法提取總DNA，具體過程如下：將待測谷物樣品加入2mL離心管，并同時加入直徑4mm鋼珠，液氮速凍后與Biospec研磨儀高速研磨1min，加入200μL Buffer A溶液(100mM NaOH，2％Tween20)，95℃溫育10min。再加入200μL BufferB溶液(100mM Tris-HCl，2mM EDTA)，振蕩混勻，12000rpm離心30s，取上清液做LAMP擴(kuò)增的模板。

有益效果：現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有點和積極效果表現(xiàn)在：

1)特異性強(qiáng)。本發(fā)明針對鐮刀菌伏馬毒素合成關(guān)鍵基因Fum1序列的6個區(qū)域設(shè)計了5條特異引物，對產(chǎn)毒鐮刀菌進(jìn)行特異性識別，其特異性強(qiáng)、靈敏度高，使本發(fā)明能夠快速準(zhǔn)確完成伏馬毒素的檢測。

2)操作簡便快捷。本發(fā)明提供的檢測伏馬毒素的方LAMP法，克服了現(xiàn)有生物與化學(xué)檢測方法樣品處理繁瑣，檢測周期長、費(fèi)時費(fèi)力及需要PCR熱循環(huán)儀等問題。該方法無需PCR反應(yīng)中的退火、復(fù)性等溫度的變化，30～50min內(nèi)即可完成檢測，大大提高了檢測的效率。

3)成本低。本方法無需昂貴、精密的試驗儀器設(shè)備，僅需要恒溫水浴鍋即可完成檢測，且所用DNA快速提取和PCR過程均為常規(guī)試劑，價格低廉。

因此本方法實用性強(qiáng)，可滿足田間及收獲谷物中伏馬毒素快速檢測，為食品安全提供了保障。

表1 用于檢測引物特異性的產(chǎn)不同種毒素的鐮刀菌菌株

*菌株產(chǎn)生毒素經(jīng)LC-MS確認(rèn)

(四)附圖說明

圖1：LAMP引物組合的特異性驗證結(jié)果

圖中菌株編號與表1相同，圖中顯示1～3應(yīng)管為產(chǎn)生伏馬毒素鐮刀菌，檢測結(jié)果呈陽性，其他為產(chǎn)生其他毒素或不產(chǎn)毒鐮刀菌，結(jié)果顯示陰性。

圖2：LAMP引物組合的靈敏度試驗結(jié)果

1.1000ng；2.100ng；3.10ng；4.1ng；5.100pg；6.10pg；7.1pg。圖中顯示25μL反應(yīng)體系內(nèi)含有10pg-100ng DNA均顯示陽性，而含有1pg DNA呈陰性，說明反應(yīng)靈敏度為10pg。

圖3：玉米中伏馬毒素檢測結(jié)果

1.陽性對照(CBS218.76)；2～5.接種玉米；6～7.未接種玉米；8.陰性對照(water)。圖中顯示接種鐮刀菌的玉米含有伏馬毒素，而其余樣品呈陰性。

(五)具體實施方式

下面以具體實施例做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不受以下實施例的限制。

實施實例1：伏馬毒素LAMP反應(yīng)的特異性實驗

為了驗證LAMP方法的特異性，以24個種的鐮刀菌為參試對象，其中3個種產(chǎn)生伏馬毒素、其余17個種產(chǎn)生其他毒素，4個種不產(chǎn)毒素(表1)。

模板DNA提?。河靡褱缇难篮灮驑岊^在樣品表面上挑取少量菌絲，放入PCR管，加入50μL BufferA溶液(100mM NaOH，2％Tween20)，95℃溫育10min。再加入50μL BufferB溶液(100mM Tris-HCl，2mM EDTA)，振蕩混勻，12000rpm離心15s，取1μL上清液做LAMP擴(kuò)增的模板。

LAMP反應(yīng)：取1μL DNA溶液，加入5μL反應(yīng)液、5μL引物組混合液、14μL滅菌超純水進(jìn)行LAMP反應(yīng)，反應(yīng)程序為65℃，時間為45min，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行顏色變化的觀察。

LAMP檢測結(jié)果如圖1所示，2株產(chǎn)生伏馬毒素菌株反應(yīng)管均顯示天藍(lán)色的陽性反應(yīng)，而其他23株菌株均呈紫色的陰性反應(yīng)。

實施實例2：伏馬毒素LAMP反應(yīng)的靈敏度實驗

為了驗證LAMP方法的靈敏度，提取伏馬毒素陽性的鐮刀菌菌株CBS218.76，并采用分光光度計測定DNA濃度(1000ng/μL)，用超純水進(jìn)行10倍梯度稀釋，-20℃保存做模板。分別取各濃度的DNA溶液1μL做模板，加入5μL反應(yīng)液、5μL引物組混合液、14μL滅菌超純水進(jìn)行LAMP反應(yīng)，反應(yīng)程序為65℃，時間為45min，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行顏色變化的觀察。結(jié)果表明(圖2)，加入1000ng、100ng、10ng、1ng、100pg、10pg DNA的反應(yīng)管呈明顯天藍(lán)色，而加入1pg DNA的反應(yīng)管呈紫色，表明LAMP反應(yīng)的靈敏度達(dá)到10pg基因組DNA。

實施實例3：玉米中檢測伏馬毒素

模板DNA提?。捍郎y樣品中國農(nóng)科院植保所廊坊實驗基地樣品，2～6號樣品為接種輪枝鐮刀菌玉米，7號樣品為未接種玉米。將待測玉米樣品加入2mL離心管，并同時加入直徑4mm鋼珠，液氮速凍后與Biospec研磨儀高速研磨1min，加入200μL BufferA溶液(100mM NaOH，2％Tween20)，95℃溫育10min。再加入200μL BufferB溶液(100mM Tris-HCl，2mM EDTA)，振蕩混勻，12000rpm離心30s，取上清液做LAMP擴(kuò)增的模板。

LAMP反應(yīng)：取1μL DNA溶液，加入5μL反應(yīng)液、5μL引物組混合液、14μL滅菌超純水進(jìn)行LAMP反應(yīng)，反應(yīng)程序為65℃，時間為45min，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行顏色變化的觀察。

LAMP檢測結(jié)果如圖3所示，接種輪枝鐮刀菌的玉米樣品呈陽性，表明含有伏馬毒素，而未接種玉米樣品為陰性，不含有伏馬毒素。

序列表：