本發(fā)明屬于生物制品、藥物分析技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種凝血因子Ⅹ激活劑的效價(jià)測(cè)定方法。

背景技術(shù)：

蛇毒中含有多種能夠影響哺乳動(dòng)物凝血系統(tǒng)的酶類，這些酶類與凝血機(jī)制級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)中的各個(gè)凝血因子之間有比較嚴(yán)格的專一性作用，其中凝血因子Ⅹ激活劑是一種能夠直接作用于凝血因子Ⅹ的具有蛋白水解酶特性的酶類，在蝰亞科、蝮亞科、眼鏡蛇科等蛇毒中分布廣泛。

人體正常的血液系統(tǒng)處于促凝-抗凝之間的動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)機(jī)體受到外源傷害或疾病干擾時(shí)，機(jī)體的凝血平衡被打破，啟動(dòng)凝血瀑布級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)以抵抗外來(lái)因素的影響。然而無(wú)論是外源凝血途徑還是內(nèi)源凝血途徑，最終均是凝血因子Ⅹ（Coagulation Factor Ⅹ，F(xiàn)Ⅹ）被激活為活化狀態(tài)，即活化的凝血因子Ⅹ（Coagulation Factor Ⅹ Activated，F(xiàn)Ⅹa），F(xiàn)Ⅹa激活凝血酶原生成凝血酶，發(fā)揮凝血作用。我公司自巴西矛頭蝮蛇蛇毒中分離得到凝血因子Ⅹ激活劑（Coagulation Factor Ⅹ Activator，F(xiàn)ⅩA），其為分子量為79000Da的單一組分的糖蛋白，含有一條重鏈和兩條輕鏈，具有鈣離子依賴性。體外研究表明，在Ca²⁺存在的條件下FⅩA可以特異性的水解FⅩ生成FⅩa，近而使人-枸櫞酸血漿凝固。體內(nèi)試驗(yàn)研究表明FⅩA可明顯縮短正常小鼠的斷尾出血時(shí)間，具有較好的止血作用，鑒于FⅩA高度特異性作用特點(diǎn)，初步判斷對(duì)A型血友病小鼠也會(huì)有較好的止血效果，可緩解目前臨床僅靠補(bǔ)充凝血因子Ⅷ治療A型血友病的局面，可以降低患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，具有較好的藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)價(jià)值。

目前，根據(jù)作用底物的不同可將FⅩA的活性測(cè)定方法分為兩大類:第一大類為天然底物法，即以人血漿為底物，以FⅩA的加入血漿發(fā)生凝固的時(shí)間來(lái)進(jìn)行FⅩA的活性測(cè)定，如公告號(hào)為CN101104847B的中國(guó)專利申請(qǐng)。該法在20世紀(jì)80年代初得到普遍應(yīng)用，方法常規(guī)，但需目測(cè)判斷血漿凝固時(shí)間，受檢測(cè)者主觀干擾，并且不同廠家的人質(zhì)控血漿和普通人枸櫞酸血漿FⅩ含量差異較大，血漿中FⅩ含量對(duì)FⅩA活性測(cè)定至關(guān)重要，因此導(dǎo)致FⅩA效價(jià)測(cè)試結(jié)果不一致。第二大類為生色底物法，即通過(guò)FⅩa水解生色底物產(chǎn)生有特征吸收的生色產(chǎn)物進(jìn)行的活性測(cè)定，又可分為二步法和FⅩA外標(biāo)法。二步法即在FⅩA作用于FⅩ一段時(shí)間后加入終止劑，同時(shí)加入生色底物，根據(jù)特定時(shí)間內(nèi)FⅩa的生成量計(jì)算FⅩA的活性。此方法需要引入FⅩa標(biāo)準(zhǔn)品，不能排除在活化的早期階段時(shí)間和FⅩa生成量之間可能存在的非線性關(guān)系（李晶，梁成罡，楊化新等，生色底物連續(xù)速率測(cè)定圓斑蝰蛇凝血因子Ⅹ激活劑的活性[J].中國(guó)新藥雜志，2007,16（18）：1419），因而不能精確地反映FⅩA的活性作用特點(diǎn)。FⅩA外標(biāo)法（如公開(kāi)號(hào)為CN102798598的中國(guó)專利申請(qǐng)）通過(guò)檢測(cè)FⅩA標(biāo)準(zhǔn)品不同濃度在405nm處ρNA的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品效價(jià)。此方法需提供FⅩA標(biāo)準(zhǔn)品，而FⅩA標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定又以血漿為底物目測(cè)方法標(biāo)定，同樣會(huì)出現(xiàn)上述提到的第一類方法的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種凝血因子Ⅹ激活劑的效價(jià)測(cè)定方法，該方法是以凝血因子Ⅹ（FⅩ）為反應(yīng)底物，F(xiàn)ⅩA激活FⅩ生成活化的凝血因子Ⅹ（FⅩa），F(xiàn)Ⅹa水解生色底物生成顯黃色的對(duì)硝基苯胺（ρNA），在405nm波長(zhǎng)有最大吸收，在FⅩ和生色底物足量的條件下，ρNA濃度與FⅩA的活性相關(guān)且在一定的范圍內(nèi)具有線性相關(guān)性，依據(jù)單位時(shí)間內(nèi)生成ρNA的物質(zhì)的量計(jì)算FⅩA的活性。本發(fā)明的效價(jià)測(cè)定方法可以準(zhǔn)確的測(cè)定FⅩA效價(jià)，不用FⅩA和FⅩa標(biāo)準(zhǔn)品間接計(jì)算待測(cè)品效價(jià)，減少測(cè)試過(guò)程中誤差，準(zhǔn)確、方便、快捷。該方法具有較好的重復(fù)性、精密度、耐用性和線性，能夠穩(wěn)定的測(cè)定FⅩA的效價(jià)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種凝血因子Ⅹ激活劑的效價(jià)測(cè)定方法，所述方法包括：

1）將凝血因子Ⅹ用緩沖溶液A稀釋，得到凝血因子X(jué)的濃度為1.0U/ml～2.0U/ml的溶液1；

2）將凝血因子Ⅹ激活劑用緩沖溶液B稀釋，制成溶液2；

3）將生色底物用去離子水溶解，得到濃度為1.5mg/ml～3.0mg/ml的溶液3；

4）將溶液1、溶液2、緩沖溶液C混勻，置37℃水浴中保溫8~12分鐘，加入緩沖溶液D和溶液3，混勻，405nm波長(zhǎng)下測(cè)定第0、1、2、3分鐘光吸收值，以緩沖溶液B代替溶液2，同法操作，作為空白對(duì)照；所述溶液1、溶液2、溶液3、緩沖溶液C和緩沖溶液D的體積比為1∶1∶1∶1∶1；

5）按計(jì)算公式計(jì)算對(duì)硝基苯胺濃度，得到凝血因子Ⅹ激活劑效價(jià)；

其中，所述緩沖溶液A是以Na⁺離子含量計(jì)濃度為0.02mol/L的磷酸氫二鈉緩-磷酸二氫鈉沖液、以三羥甲基氨基甲烷含量計(jì)濃度為0.02mol/L的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液或以Na⁺離子含量計(jì)濃度為0.02mol/L的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液，均含有0.1mol/L氯化鈉和0.001mol/L鹽酸苯甲脒，pH為7.4；

所述緩沖溶液B是以Na⁺離子含量計(jì)濃度為0.01mol/L的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液、以三羥甲基氨基甲烷含量計(jì)濃度為0.01mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液或以Na⁺離子含量計(jì)濃度為0.01mol/L 檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液，pH為8.0；

所述緩沖溶液C是以Na⁺離子含量計(jì)濃度為0.1mol/L的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液、以三羥甲基氨基甲烷含量計(jì)濃度為0.1mol/L的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液或以Na⁺離子含量計(jì)濃度為0.1mol/L的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液，均含有0.3mol/L氯化鈉、0.002mol/L鹽酸苯甲脒和0.01mol/L氯化鈣，pH為7.5；

所述緩沖溶液D是以Na⁺離子含量計(jì)濃度為1mol/L的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液、以三羥甲基氨基甲烷含量計(jì)濃度為1mol/L的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液或以Na⁺離子含量計(jì)濃度為1mol/L的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液，均含有0.75mol/L氯化鈉、0.05mol/L EDTA-Na₂，pH為8.3；

所述溶液2濃度控制在能使生成的ρNA濃度為0.05μmol·ml^-1·min^-1～0.25μmol·ml^-1·min^-1；

所述的計(jì)算公式為

△A_樣表示樣品的第t分鐘與第0分鐘的吸收值的差值；△A_空表示空白對(duì)照品的第t分鐘與第0分鐘的吸收值的差值；t代表以min計(jì)的樣品和空白對(duì)照的測(cè)定時(shí)間，t﹥0，優(yōu)選地，t=1、2或3；V_t表示以ml計(jì)的反應(yīng)總體積；10.4表示以ml·μmol^-1·cm^-1計(jì)的ρNA的摩爾吸光系數(shù)；1表示以cm計(jì)的光程；V_s為以ml計(jì)的FⅩA供試品體積。

在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述溶液1的濃度為1.0U/ml～1.5U/ml；優(yōu)選為1.25U/ml。

在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述溶液3的濃度為1.5mg/ml～3.0mg/ml；優(yōu)選為1.5mg/ml。

在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子Ⅹ為人源或牛源凝血因子。

在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述生色底物為含有對(duì)硝基苯胺基團(tuán)（ρNA）的短肽或其鹽酸鹽。

在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子Ⅹ激活劑來(lái)自蛇毒。

在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛇毒選自矛頭蝮蛇蛇毒、茂基蝮蛇蛇毒和圓斑蝰蛇蛇毒中的一種或多種。

本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，在凝血因子Ⅹ和生色底物足量的條件下，對(duì)硝基苯胺的生成量?jī)H與凝血因子Ⅹ激活劑的量有關(guān)，且具有較好的線性相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)R≥0.99。該方法的重復(fù)性較好，RSD為2.1%。中間精密度及耐用性較好，包括不同試驗(yàn)測(cè)試者試驗(yàn)RSD為2.8%、不同廠家生色底物測(cè)試RSD為2.2%、不同廠家凝血因子Ⅹ測(cè)試RSD為6.8%、不同廠家紫外分光光度計(jì)測(cè)試RSD為2.6%。該方法的回收率為100.2%。由此可見(jiàn)該方法能夠準(zhǔn)確、穩(wěn)定測(cè)試出凝血因子Ⅹ激活劑的效價(jià)，明顯優(yōu)于血漿底物法和FⅩa、FⅩA標(biāo)準(zhǔn)品的外標(biāo)法，能夠提供準(zhǔn)確的臨床使用劑量，提高臨床用藥的安全性和有效性。

附圖說(shuō)明

圖1為FⅩA供試濃度確定中FⅩA稀釋倍數(shù)倒數(shù)與ρNA濃度的線性關(guān)系曲線。

圖2為計(jì)算回收率的線性關(guān)系曲線。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體的實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但是，應(yīng)當(dāng)理解為，這些實(shí)施例僅作為更詳細(xì)具體地說(shuō)明之用，而不應(yīng)理解為用于以任何形式限制本發(fā)明。

實(shí)施例1 凝血因子Ⅹ（FⅩ）和生色底物優(yōu)選濃度確定

FⅩ選擇人源、生色底物選擇S-2765。將FⅩ用pH7.4 0.02mol/L Tris-HCl緩沖液（含0.1mol/L NaCl、0.01mol/L鹽酸苯甲脒）分別配制成0.75U/ml、1.0U/ml、1.25U/ml、1.5U/ml、2.0U/ml的溶液，作為溶液1。取FⅩA供試品用pH8.0 0.01mol/L Tris-HCl緩沖液適度稀釋，作為溶液2。取生色底物S-2765，用去離子水溶解并分別稀釋成濃度為1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml、2.5 mg/ml、3.0mg/ml的溶液，作為溶液3。配制pH7.5 0.1mol/L Tris-HCl緩沖液（含NaCl 0.3mol/L、鹽酸苯甲脒0.002mol/L、CaCl₂ 0.01mol/L）作為緩沖溶液C；配制pH8.3 1mol/L Tris-HCl緩沖液（含NaCl 0.75mol/L、EDTA-Na₂ 0.05mol/L）作為緩沖溶液D；pH8.0 0.01mol/L Tris-HCl緩沖液代替FⅩA供試品作為空白對(duì)照。打開(kāi)紫外分光光度計(jì)，待溫度達(dá)到37℃,分別取溶液1、2、緩沖液C各0.2ml加入比色皿，混勻，于紫外分光光度計(jì)37±0.5℃在線保溫10min，加入0.2ml緩沖溶液D和0.2ml溶液3，混勻，繼續(xù)保溫，檢測(cè)405nm波長(zhǎng)下第0、1、2、3分鐘的吸收值。將數(shù)據(jù)代入公式，計(jì)算ρNA的濃度。FⅩ和S-2765優(yōu)選濃度結(jié)果如下表1。

表1 FⅩ和S-2765的優(yōu)選濃度結(jié)果。

結(jié)果顯示，本發(fā)明中FⅩ濃度在1.0U/ml～2.0 U/ml范圍內(nèi)，S-2765濃度在1.5mg/ml～3.0mg/ml范圍內(nèi)，ρNA的濃度測(cè)定結(jié)果較為穩(wěn)定，并且FⅩ和S-2765是足量的。

實(shí)施例2 FⅩA供試濃度的確定

將FⅩ（人源）用pH7.4 0.02mol/L Tris-HCl緩沖液（含0.1mol/L NaCl、0.01mol/L鹽酸苯甲脒）緩沖液配制成1.25 U/ml的溶液，作為溶液1；取FⅩA供試品用pH8.0 0.01mol/L Tris-HCl緩沖液分別稀釋20000倍、12500倍、8333倍、5000倍、4000倍、3030倍，作為溶液2；取生色底物S-2765，用去離子水溶解并稀釋成濃度為1.5mg/ml的溶液，作為溶液3；配制pH7.5 0.2mol/L Tris-HCl緩沖液（含NaCl 0.6mol/L、鹽酸苯甲脒0.004mol/L、CaCl₂0.02mol/L）作為緩沖溶液C；配制pH8.3 1mol/L Tris-HCl緩沖液（含NaCl 0.75mol/L、EDTA-Na₂ 0.05mol/L）作為緩沖溶液D；pH8.0 0.01mol/L Tris-HCl緩沖液代替FⅩA供試品作為空白對(duì)照。打開(kāi)紫外分光光度計(jì)，待溫度達(dá)到37℃，分別取溶液1、2、緩沖溶液C各0.2ml加入比色皿，混勻，于紫外分光光度計(jì)37±0.5℃在線保溫10min，加入0.2ml緩沖溶液D和0.2ml溶液3，混勻，繼續(xù)保溫，檢測(cè)405nm波長(zhǎng)下第0、1、2、3分鐘的吸收值。將數(shù)據(jù)代入公式，計(jì)算ρNA的濃度。FⅩA效價(jià)（U/ml）=ρNA的濃度×稀釋倍數(shù)。

對(duì)硝基苯胺（ρNA）的濃度范圍確定結(jié)果如表2所示，近而限定FⅩA的最佳工作濃度范圍。

表2 FⅩA濃度確定結(jié)果。

以供試品稀釋倍數(shù)的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，ρNA濃度為縱坐標(biāo)，繪制曲線（見(jiàn)圖1），線性方程為Y=856.61X+0.00162，R²=0.99118。由表2數(shù)據(jù)可以得出，本發(fā)明中將FⅩA稀釋適宜濃度使生成的ρNA濃度在0.042～0.274μmol·ml^-1·min^-1范圍內(nèi)，F(xiàn)ⅩA的效價(jià)穩(wěn)定。在本發(fā)明中，適宜稀釋FⅩA供試品，使生成的ρNA濃度在0.05μmol·ml^-1·min^-1～0.25μmol·ml^-1·min^-1的范圍內(nèi)。

實(shí)施例3 3批FⅩA效價(jià)測(cè)定

將FⅩ（人源）用pH7.4 0.02mol/L Tris-HCl緩沖液（含0.1mol/L NaCl、0.01mol/L鹽酸苯甲脒）緩沖液配制成1.25 U/ml的溶液，作為溶液1；取3批FⅩA供試品用pH8.0 0.01mol/L Tris-HCl緩沖液適度稀釋，能夠使ρNA的濃度在0.05μmol/ml～0.25μmol/ml的范圍內(nèi)，作為溶液2；取生色底物S-2765，用去離子水溶解并稀釋成濃度為1.5mg/ml的溶液，作為溶液3；配制pH7.5 0.2mol/L Tris-HCl緩沖液（含NaCl 0.6mol/L、鹽酸苯甲脒0.004mol/L、CaCl₂0.02mol/L）作為緩沖溶液C；配制pH8.3 1mol/L Tris-HCl緩沖液（含NaCl 0.75mol/L、EDTA-Na₂ 0.05mol/L）作為緩沖溶液D ；pH8.0 0.01mol/L Tris-HCl緩沖液代替FⅩA供試品作為空白對(duì)照。打開(kāi)紫外分光光度計(jì)，待溫度達(dá)到37℃。分別取溶液1、2、緩沖溶液C各0.2ml加入比色皿，混勻，于紫外分光光度計(jì)37±0.5℃在線保溫10min，加入0.2ml緩沖溶液D和0.2ml溶液3，混勻，繼續(xù)保溫，檢測(cè)405nm波長(zhǎng)下第0、1、2、3分鐘的吸收值。將數(shù)據(jù)代入公式計(jì)算ρNA的濃度。公式如下：

以批號(hào)為150107FⅩA為例計(jì)算效價(jià)，V_t表示反應(yīng)總體積1ml，V_s表示FⅩA供試品體積0.2ml， t表示樣品和空白對(duì)照品的測(cè)定時(shí)間3min，△A_樣表示樣品第3分鐘與第0分鐘的吸收值的差值1.092，△A_空表示空白對(duì)照品第3分鐘與第0分鐘的吸收值的差值0.000，代入公式計(jì)算得出ρNA的濃度為0.175μmol·ml^-1·min^-1，150107批次FⅩA稀釋倍數(shù)為5000，得出效價(jià)為875U/ml，蛋白含量為0.155mg/ml，比活力為875/0.155=5645U/mg。

本發(fā)明中FⅩA活力單位定義：在37℃，pH 8.0條件下，1min內(nèi)生成1μmol對(duì)硝基苯胺所需要的酶量，定義為1單位。

按實(shí)施例3方法測(cè)定3批次凝血因子Ⅹ激活劑效價(jià)，結(jié)果如表3。

表3 3批FⅩA的效價(jià)測(cè)定結(jié)果。

實(shí)施例4 FⅩA效價(jià)測(cè)定方法重復(fù)性

按實(shí)施例3方法測(cè)定FⅩA效價(jià)，取供試品150107測(cè)試，重復(fù)6次，記錄數(shù)據(jù)，結(jié)果如表4。

表4 FⅩA效價(jià)測(cè)定方法重復(fù)性結(jié)果。

實(shí)施例5 FⅩA效價(jià)測(cè)定方法中間精密度考察

按實(shí)施例3方法測(cè)定FⅩA效價(jià)，取供試品150107，不同人員不同時(shí)間進(jìn)行測(cè)試，記錄測(cè)試數(shù)據(jù)，結(jié)果如表5。

表5 FⅩA效價(jià)測(cè)定方法中間精密度結(jié)果。

實(shí)施例6 FⅩA效價(jià)測(cè)定方法耐用性考察

1）不同廠家生色底物S-2765測(cè)定FⅩA效價(jià)穩(wěn)定性

按實(shí)施例3方法測(cè)定，取供試品150107，用不同廠家生色底物S-2765測(cè)定效價(jià)，記錄測(cè)試數(shù)據(jù)，結(jié)果如表6。

表6 不同廠家S-2765測(cè)定FⅩA效價(jià)結(jié)果。

2）不同廠家反應(yīng)底物FⅩ測(cè)定FⅩA效價(jià)的穩(wěn)定性

按實(shí)施例3方法測(cè)定FⅩA效價(jià)，取供試品150107，用不同廠家反應(yīng)底物FⅩ測(cè)定，記錄測(cè)試數(shù)據(jù)，結(jié)果如表7。

表7 不同廠家FⅩ測(cè)定FⅩA效價(jià)結(jié)果。

3）不同型號(hào)紫外分光光度計(jì)測(cè)定FⅩA效價(jià)的穩(wěn)定性

按實(shí)施例3方法測(cè)定FⅩA效價(jià)，取供試品150107，用不同型號(hào)紫外分光光度計(jì)測(cè)定效價(jià)，記錄測(cè)試數(shù)據(jù)，結(jié)果如表8。

表8 不同型號(hào)儀器測(cè)定FⅩA效價(jià)結(jié)果。

實(shí)施例7 FⅩA效價(jià)測(cè)定方法的線性及準(zhǔn)確度（回收率）

按實(shí)施例3方法測(cè)定FⅩA效價(jià)，取供試品150107，分別稀釋8333倍、7143倍、6250倍、5000倍、4000倍，記錄測(cè)試數(shù)據(jù)，結(jié)果如表9。

表9線性及回收率結(jié)果。

以供試品稀釋倍數(shù)的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，ρNA濃度為縱坐標(biāo)，繪制曲線（見(jiàn)圖2），線性方程為y=848.13x+0.00282 R²=0.99356，線性良好。

將稀釋倍數(shù)倒數(shù)帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算理論效價(jià)，實(shí)測(cè)效價(jià)與理論效價(jià)比值為回收率，回收率平均值為100.2%，RSD=2.6%，本發(fā)明方法準(zhǔn)確度良好。

實(shí)施例8 本發(fā)明中FⅩA效價(jià)測(cè)定方法與直接血漿為底物法測(cè)定結(jié)果的比較

1）普通人血漿為直接底物法測(cè)定FⅩA的效價(jià)

取FⅩA供試品，批號(hào)150107，用pH8.0的0.01mol/L Tris-HCl緩沖液稀釋800倍，作為供試品溶液。取普通人血漿（血站來(lái)源），37℃水浴完全融化，備用。用去離子水配制氯化鈣溶液，濃度為0.02mol/L，備用。

取0.2ml普通人血漿至小試管中于37試預(yù)熱2min，加入0.1ml供試品溶液，加入0.1ml 0.02mol/L氯化鈣溶液，搖勻，計(jì)時(shí)，記錄血漿出現(xiàn)白色絮團(tuán)的時(shí)間，測(cè)定結(jié)果如表10所示。

由下表10可以看出，血漿之間測(cè)試結(jié)果差異較大，不能準(zhǔn)確穩(wěn)定測(cè)試出FⅩA效價(jià)。

表10 普通人血漿為直接底物測(cè)定FⅩA效價(jià)結(jié)果。

2）人凝血質(zhì)控血漿為直接底物法測(cè)定FⅩA的效價(jià)

取FⅩA供試品，批號(hào)150107，用pH8.0的0.01mol/L Tris-HCl緩沖液稀釋800倍，作為供試品溶液。取人凝血質(zhì)控血漿（分別購(gòu)于兩個(gè)廠家），每個(gè)廠家取2批，分別用去離子水1ml溶解，備用。用去離子水配制氯化鈣溶液，濃度為0.02mol/L，備用。

取0.2ml人凝血質(zhì)控血漿至小試管中于37至預(yù)熱2min，加入0.1ml供試品溶液，加入0.1ml 0.02mol/L氯化鈣溶液，搖勻，計(jì)時(shí)，記錄血漿出現(xiàn)白色絮團(tuán)的時(shí)間，測(cè)定結(jié)果如表11所示。

由下表11可以看出，同一生產(chǎn)廠家不同批次血漿之間測(cè)試結(jié)果存在差異，不同廠家之間的血漿測(cè)試結(jié)果也存在差異，不能準(zhǔn)確穩(wěn)定測(cè)試出FⅩA效價(jià)。

表11 人凝血質(zhì)控血漿為直接底物測(cè)定FⅩA效價(jià)結(jié)果。

盡管本發(fā)明已進(jìn)行了一定程度的描述，明顯地，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的條件下，可進(jìn)行各個(gè)條件的適當(dāng)變化?？梢岳斫?，本發(fā)明不限于所述實(shí)施方案，而歸于權(quán)利要求的范圍，其包括所述每個(gè)因素的等同替換。