本發(fā)明屬于生物工程基因領(lǐng)域，涉及一種重組Taq DNA聚合酶及其編碼基因，以及其表達(dá)、純化、反應(yīng)緩沖液配方及在各種核酸擴(kuò)增中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

DNA聚合酶是完成聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)過程的關(guān)鍵性因子，目前已有100多個DNA聚合酶的相關(guān)基因被克隆和測序。1969年BROCK從Thermus aquaticus YT-1分離出了Taq DNA聚合酶，Thermas aquaticus是一種水生嗜熱菌，從該菌中分離出的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)具有催化以DNA為模板合成DNA的功能。1988年Saiki從另外一個Thermus aquaticus YT-1菌株分離出一種新的Taq DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)使得PCR能被廣泛的使用，雖然Taq DNA聚合酶已經(jīng)商品化生產(chǎn)多年，且該酶的晶體結(jié)構(gòu)及作用機(jī)理也比較清楚，但為了提高該蛋白在大腸桿菌中的可溶表達(dá)量，簡化純化工藝的嘗試一直沒有停止。

Lawyer等利用Lac啟動子表達(dá)了該蛋白，但表達(dá)量很低。Engelke等從T.aquaticus中克隆了Taq DNA聚合酶基因，重組到pTTQ18質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中表達(dá)，但產(chǎn)量較低，且純化步驟要通過熱變性雜蛋白、聚乙烯亞胺(PEI)沉淀，再經(jīng)Bio Rex 70離子交換層析獲得重組Taq DNA聚合酶純品。在實(shí)際應(yīng)用過程中，Taq DNA聚合酶熱穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性不佳，對引物和樣品的結(jié)構(gòu)、純度和濃度要求比較高，反應(yīng)靈敏度較低，擴(kuò)增效率較低，限制了Taq DNA聚合酶的使用和推廣。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種DNA聚合酶的編碼基因，其編碼出的DNA聚合酶具有超強(qiáng)的熱穩(wěn)定性和凍融穩(wěn)定性，該Taq DNA聚合酶編碼基因在大腸桿菌中能高效可溶表達(dá)，通過簡單的純化工藝即可獲得較高純度的TaqDNA聚合酶，同時提供一種反應(yīng)緩沖液，能夠使得該TaqDNA聚合酶反應(yīng)靈敏度，擴(kuò)增效率和保真性都得到提高。

本發(fā)明提供了一種重組Taq DNA聚合酶(以下簡稱為“ZHB Taq DNA聚合酶”)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本發(fā)明提供了編碼上述所述ZHB Taq DNA聚合酶的基因，其堿基序列如SEQ ID NO：2所示。該序列是專為大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行密碼子優(yōu)化得到的序列，能夠顯著提高異源基因在宿主菌中的表達(dá)效率。

本發(fā)明還提供了包含了上述所述編碼ZHB Taq DNA聚合酶的基因的載體，所述的載體優(yōu)選為原核表達(dá)載體pET21b或pDEST14，特別優(yōu)選為pET21b作為ZHB Taq DNA聚合酶高效可溶表達(dá)的載體。

本發(fā)明還提供了包含有上述所述載體的大腸桿菌宿主菌株，優(yōu)選地，所述宿主菌株選自大腸桿菌BL21(DE3)或BL21(AI)菌株，特別優(yōu)選為BL21(DE3)作為ZHB Taq DNA聚合酶高效可溶表達(dá)的宿主菌株。

本發(fā)明還提供了ZHB Taq DNA聚合酶在大腸桿菌中高效可溶表達(dá)方法，包括如下步驟：

1.挑取一個含有上述所述的重組大腸桿菌單菌落，接入LB培養(yǎng)液，于37℃培養(yǎng)過夜；

2.取5mL過夜培養(yǎng)物接入TB或LB培養(yǎng)液中，于37℃震蕩培養(yǎng)至對數(shù)中期(A₆₀₀＝1.0)；

3.在培養(yǎng)物中加入IPTG至1mmol/L，于25℃過夜誘導(dǎo)表達(dá)，4℃以6000rpm離心15min收集含有ZHB Taq DNA聚合酶的大腸桿菌菌體沉淀。

所述TB或LB培養(yǎng)液中均含有氨芐青霉素50-100μg/mL。

本發(fā)明還提供了ZHB Taq DNA聚合酶的純化方法，包括如下步驟：

1.將收集得到的含有誘導(dǎo)ZHB Taq DNA聚合酶大腸桿菌菌體沉淀，用預(yù)冷的PBS重懸，并于4℃高速離心處理。

2.吸去上清，每克菌體加入結(jié)合緩沖液BufferA 3-10ml，攪動，使菌體懸起。

3.每克菌體加入3-10μL濃度為100mmol/L的PMSF，3-100μL濃度為100mg/mL的溶菌酶，于冰上攪動。

4.破碎菌體，于冰浴中超聲，并于4℃以12000rpm高速離心5min收集上清。

5.離心上清液在75℃水浴保溫1h,12000rpm離心20min去除沉淀。將上清細(xì)菌裂解液于0.22um濾膜過濾。

6.IMAC親和層析，合并各收集峰中樣品并以0.22μm濾膜過濾備用。

7.進(jìn)一步以凝膠過濾層析，得到所需目的產(chǎn)物。

優(yōu)選的，所述IMAC親和層析，選用的結(jié)合緩沖液BufferA：20mM NaH₂PO₄，20mM咪唑，300mM NaCl，pH＝7.5，洗脫緩沖液BufferB：20mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，500mM咪唑，pH＝7.5；所述凝膠過濾層析，選用的結(jié)合以及洗脫緩沖液為BufferC:20mM NaH₂PO₄，150mM NaCl，pH＝7.5，0.22μm濾膜過濾備用。

本發(fā)明還提供了能夠應(yīng)用于PCR擴(kuò)增目的基因的10×反應(yīng)緩沖液BufferD配方：100mM Tris-HCl(pH 8.8at 25℃)，500mM KCl，15mM MgCl₂，0.8％(v/v)Nonidet P40。

本發(fā)明還提供了經(jīng)配比優(yōu)化后制得ZHB 2×Taq DNA聚合酶試劑盒的2×反應(yīng)緩沖液BufferE配方：20mM Tris-HCl(pH 8.8at 25℃)，100mM KCl，3mM MgCl₂，0.2％(v/v)Nonidet P40，0.05％(v/v)溴酚藍(lán)，5～10％(v/v)的甘油，400μM dNTPs，2.5U/μL所述的ZHB Taq DNA聚合酶。該Taq DNA聚合酶試劑盒專為PCR鑒定所優(yōu)化，擴(kuò)增效率好：擴(kuò)增長度可達(dá)8kb，能對4kb及其以下長度的片段進(jìn)行高效擴(kuò)增；檢測靈敏度高：能從0.05ng人基因組DNA模板中擴(kuò)增出特定基因片段；使用便捷，只需在加入模板和引物并稀釋到1倍濃度即可進(jìn)行PCR反應(yīng)，大大地簡化了操作過程，降低了PCR操作過程中的誤差。同時在PCR反應(yīng)完成后可直接電泳，節(jié)省時間。

附圖說明

圖1表示Taq DNA聚合酶密碼子優(yōu)化前后核苷酸序列比較

其中，奇數(shù)行(即“優(yōu)化前序列”對應(yīng)的行)為Taq DNA聚合酶天然基因核苷酸序列，即密碼子優(yōu)化前的序列；偶數(shù)行(即“優(yōu)化后序列”對應(yīng)的行)為本發(fā)明的ZHB Taq DNA聚合酶的基因核苷酸序列，即密碼子優(yōu)化后的序列。

圖2-a、圖2-b為Taq DNA聚合酶密碼子優(yōu)化前后在大腸桿菌表達(dá)宿主中CAI指數(shù)。

其中，圖2-a表示Taq DNA聚合酶天然基因核苷酸序列在大腸桿菌表達(dá)宿主中CAI指數(shù)經(jīng)過程序計算為0.57；圖2-b表示優(yōu)化后的本發(fā)明的ZHB Taq DNA聚合酶密碼子在大腸桿菌表達(dá)宿主中CAI指數(shù)經(jīng)過程序計算為0.91。

圖3-a、圖3-b為Taq DNA聚合酶密碼子優(yōu)化前后在大腸桿菌表達(dá)宿主中最優(yōu)密碼子頻率分布區(qū)域圖。

其中，圖3-a表示Taq DNA聚合酶天然基因核苷酸序列在大腸桿菌表達(dá)宿主中最優(yōu)密碼子頻率分布區(qū)域圖，從圖中可以看出：Taq DNA聚合酶天然基因核苷酸序列的低利用率密碼子出現(xiàn)百分比為18％；圖3-b表示優(yōu)化后的本發(fā)明的ZHB Taq DNA聚合酶密碼子在大腸桿菌表達(dá)宿主中最優(yōu)密碼子頻率分布區(qū)域圖，優(yōu)化后的本發(fā)明的ZHB Taq DNA聚合酶密碼子序列的低利用率密碼子出現(xiàn)百分比為0。

圖4-a、圖4-b為Taq DNA聚合酶密碼子優(yōu)化前后在大腸桿菌表達(dá)宿主中平均GC堿基含量分布區(qū)域圖。

其中，圖4-a表示Taq DNA聚合酶天然基因核苷酸序列在大腸桿菌表達(dá)宿主中平均GC堿基含量為：67.95％；圖4-b表示優(yōu)化后的本發(fā)明的ZHB Taq DNA聚合酶密碼子在大腸桿菌表達(dá)宿主中平均GC堿基含量為：57.29％。

圖5為ZHB Taq DNA聚合酶基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。

其中，泳道1為500bp DNA Ladder；泳道2為兩端含有NdeI和XhoI酶切位點(diǎn)的重組Taq DNA聚合酶基因PCR產(chǎn)物。

圖6-a，圖6-b為ZHB Taq DNA聚合酶表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建過程圖。

其中，圖6-a為ZHB Taq DNA聚合酶構(gòu)建到表達(dá)質(zhì)粒pET21b過程圖；圖6-b為ZHB Taq DNA聚合酶構(gòu)建到表達(dá)質(zhì)粒pDEST14過程圖。

圖7-a，圖7-b為ZHB Taq DNA聚合酶誘導(dǎo)前后SDS-PAGE凝膠電泳鑒定圖。

其中，圖7-a泳道1為(10-230kDa)寬范圍的預(yù)染的蛋白上樣Marker；泳道2為未加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的ZHB Taq DNA聚合酶重組大腸桿菌BL21(DE3)裂解液；泳道3為加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的ZHB Taq DNA聚合酶重組大腸桿菌BL21(DE3)裂解液。

其中，圖7-b泳道1為(10-230kDa)寬范圍的預(yù)染的蛋白上樣Marker；泳道2為未加入阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)的ZHB Taq DNA聚合酶大腸桿菌BL21(AI)裂解液；泳道3為加入阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)的ZHB Taq DNA聚合酶大腸桿菌BL21(AI)裂解液。

圖8 IMAC親和純化不同的重組菌株誘導(dǎo)表達(dá)ZHB Taq DNA聚合酶的SDS-PAGE凝膠電泳圖。

其中，圖8-a為IMAC親和純化重組BL21(DE3)菌株誘導(dǎo)表達(dá)ZHB Taq DNA聚合酶的SDS-PAGE凝膠電泳圖。泳道1為(10-230kDa)寬范圍的預(yù)染的蛋白上樣Marker；泳道2-12為緩沖液BufferB洗脫時收集的不同收集管樣品。

其中，圖8-b為IMAC親和純化重組BL21(AI)菌株誘導(dǎo)表達(dá)ZHB Taq DNA聚合酶的SDS-PAGE凝膠電泳圖。泳道1為(10-230kDa)寬范圍的預(yù)染的蛋白上樣Marker；泳道2-12為緩沖液BufferB洗脫時收集的不同收集管樣品。

圖9 Superdex75凝膠過濾純化重組菌株BL21(DE3)誘導(dǎo)表達(dá)ZHB Taq DNA聚合酶的SDS-PAGE凝膠電泳圖。

其中，泳道1為(10-230kDa)寬范圍的預(yù)染的蛋白上樣Marker；泳道2-8為緩沖液BufferC洗脫時收集的不同收集管樣品。

圖10為重組Taq DNA聚合酶擴(kuò)增不同片段的人基因組中DNA序列瓊脂糖凝膠電泳圖。

其中，泳道1為500bp DNA Ladder；泳道2-7為ZHB Taq DNA聚合酶擴(kuò)增1.0-1.5kb人基因組中DNA片段。

圖11-a和圖11-b為高溫孵育不同時間的ZHB Taq DNA聚合酶擴(kuò)增人基因組中DNA序列瓊脂糖凝膠電泳圖。

其中，圖11-a泳道1為500bp DNA Ladder；泳道2為沒有經(jīng)過高溫孵育的ZHB Taq DNA聚合酶擴(kuò)增人基因組1.5kb DNA片段；泳道3為高溫孵育1小時ZHB Taq DNA聚合酶擴(kuò)增人基因組1.5kb DNA片段；泳道4為高溫孵育2小時ZHB Taq DNA聚合酶擴(kuò)增人基因組1.5kb DNA片段；泳道5為高溫孵育3小時ZHB Taq DNA聚合酶擴(kuò)增人基因組1.5kb DNA片段；泳道6為高溫孵育 4小時ZHB Taq DNA聚合酶擴(kuò)增人基因組1.5kb DNA片段；泳道7為高溫孵育5小時ZHB Taq DNA聚合酶擴(kuò)增人基因組1.5kb DNA片段；泳道8為高溫孵育6小時ZHB Taq DNA聚合酶擴(kuò)增人基因組1.5kb DNA片段。

圖11-b泳道1為500bp DNA Ladder；泳道2為沒有經(jīng)過高溫孵育的ZHB Taq DNA聚合酶擴(kuò)增人基因組1.0kb DNA片段；泳道3為高溫孵育1小時ZHB Taq DNA聚合酶擴(kuò)增人基因組1.0kb DNA片段；泳道4為高溫孵育2小時ZHB Taq DNA聚合酶擴(kuò)增人基因組1.0kb DNA片段；泳道5為高溫孵育3小時ZHB Taq DNA聚合酶擴(kuò)增人基因組1.0kb DNA片段；泳道6為高溫孵育4小時ZHB Taq DNA聚合酶擴(kuò)增人基因組1.0kb DNA片段；泳道7為高溫孵育5小時ZHB Taq DNA聚合酶擴(kuò)增人基因組1.0kb DNA片段；泳道8為高溫孵育6小時ZHB Taq DNA聚合酶擴(kuò)增人基因組1.0kb DNA片段。

圖12為交替凍融處理不同次數(shù)的ZHB Taq DNA聚合酶擴(kuò)增含有重組人基因組中0.5kb DNA序列大腸桿菌菌株瓊脂糖凝膠電泳圖。

泳道1為500bp DNA Ladder；泳道2為沒有經(jīng)過凍融交替處理的ZHB Taq DNA聚合酶擴(kuò)增含有重組人基因組中0.5kbDNA序列；泳道3-22為經(jīng)過凍融交替處理1-20次的ZHB Taq TaqDNA聚合酶擴(kuò)增含有重組人基因組中0.5kb DNA序列。

圖13不同Taq DNA聚合酶在ABI7500實(shí)時熒光定量PCR儀擴(kuò)增人基因組中EGFR不同突變體基因的擴(kuò)增曲線圖

圖14為ZHB Taq DNA聚合酶經(jīng)配比優(yōu)化后制得的ZHB 2×Taq DNA聚合酶試劑盒擴(kuò)增人基因組中DNA序列瓊脂糖凝膠電泳圖。

其中，泳道1為500bp DNA Ladder；泳道2為ZHB 2×Taq DNA聚合酶試劑盒反應(yīng)緩沖液中含有10％的甘油擴(kuò)增人基因組中1.5kb DNA片段；泳道3為ZHB 2×Taq DNA聚合酶試劑盒反應(yīng)緩沖液中含有5％的甘油擴(kuò)增人基因組中1.5kb DNA片段；泳道4為ZHB 2×Taq DNA聚合酶試劑盒反應(yīng)緩沖液中含有10％的甘油擴(kuò)增人基因組中1.0kb DNA片段；泳道5為ZHB 2×Taq DNA聚合酶試劑盒中含有5％的甘油擴(kuò)增人基因組中1.0kb DNA片段。

圖15為交替凍融處理不同次數(shù)的ZHB 2×Taq DNA聚合酶試劑盒擴(kuò)增含有人基因組中0.5kb DNA序列重組大腸桿菌菌株瓊脂糖凝膠電泳圖。

泳道1為500bp DNA Ladder；泳道2為沒有經(jīng)過凍融交替處理的ZHB 2×Taq DNA聚合酶試劑盒擴(kuò)增含有人基因組中0.5kb DNA序列重組大腸桿菌菌株；泳道3-22為經(jīng)過凍融交替處理1-20次的ZHB 2×Taq DNA聚合酶試劑盒擴(kuò)增含有人基因組中0.5kb DNA序列重組大腸桿菌菌株。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解，引用實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1 Taq DNA聚合酶基因優(yōu)化設(shè)計

發(fā)明人根據(jù)GenBank已公開的Taq DNA聚合酶的cDNA序列(GenBank登錄號：BAA06775.1)，對該基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化后得到本發(fā)明的ZHB Taq DNA聚合酶基因，如SEQ ID No：2所示。

下面是對Taq DNA聚合酶進(jìn)行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化前后各參數(shù)對比如下：

1.密碼子適應(yīng)指數(shù)(Codon Adaptation Index，CAI)

由圖2-a可知，密碼子沒有優(yōu)化前，Taq DNA聚合酶天然基因在大腸桿菌中密碼子適應(yīng)指數(shù)(CAI)為0.57。由圖2-b可知，通過密碼子優(yōu)化后，使得本發(fā)明的ZHB Taq DNA聚合酶基因在大腸桿菌中CAI指數(shù)為0.91。通常CAI＝1時被認(rèn)為該基因在該表達(dá)系統(tǒng)中是最理想的高效表達(dá)狀態(tài)，CAI指數(shù)越低表明該基因在該宿主中表達(dá)水平越差，因此可以看出經(jīng)過了密碼子優(yōu)化后得到的基因序列可以提高Taq DNA聚合酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)水平。

2.最優(yōu)密碼子使用頻率(Frequency of Optimal Codons，F(xiàn)OP)

由圖3-a可知，基于大腸桿菌表達(dá)載體，密碼子沒有優(yōu)化前，Taq DNA聚合酶天然基因序列的低利用率密碼子出現(xiàn)百分比為18％。這條未進(jìn)行優(yōu)化的基因含有串聯(lián)稀有密碼子，這些密碼子可能降低翻譯效率，甚至能夠解散翻譯裝配物。由圖3-b可知，通過密碼子優(yōu)化后，本發(fā)明的ZHB Taq DNA聚合酶基因在大腸桿菌系統(tǒng)中出現(xiàn)低利用率密碼子的頻率為0。

3.GC堿基含量(GC curve)

GC含量理想分布區(qū)域?yàn)?0％-70％，在這個區(qū)域外的出現(xiàn)任何峰都會不同程度地影響轉(zhuǎn)錄和翻譯效率。由圖4-a、圖4-b的Taq DNA聚合酶基因的GC堿基平均含量分布區(qū)域圖對比可知，由圖4-a中顯示Taq DNA聚合酶天然基因中在優(yōu)化前GC堿基平均含量為67.95％，由圖4-b中顯示出優(yōu)化后的序列消除了GC含量在30％-70％區(qū)域外所有堿基，最終得到優(yōu)化后ZHB Taq DNA聚合酶的GC堿基平均含量為57.29％。

實(shí)施例2 ZHB Taq DNA聚合酶基因的表達(dá)載體構(gòu)建

將優(yōu)化后的ZHB Taq DNA聚合酶全基因在5’端引入NdeI酶切位點(diǎn)序列，在3’端引入組氨酸標(biāo)簽和XhoI酶切位點(diǎn)序列(如SEQ ID No：2所示)，并進(jìn)行全基因合成，將合成的基因片段，構(gòu)建到pUC57質(zhì)粒(由南京金斯瑞科技有限公司提供)中，得到一種長期保存質(zhì)粒，記為 pUC57-ZHB Taq DNA質(zhì)粒。以pUC57-ZHB Taq DNA質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用引物序列如下：

上游引物：

M13F:CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC

下游引物：

M13R:AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA

反應(yīng)總體積50μL，其中濃度為10μmol/L引物各加2.5μL，濃度為10mmol/L的dNTP加1μL，所用DNA聚合酶為Q5(購自New England Biolabs公司)，2U/μL，加0.5μL。反應(yīng)條件為98℃5秒、55℃45秒、72℃30秒，25個循環(huán)后，產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示產(chǎn)物大小與預(yù)期大小(2500bp)一致(結(jié)果如圖5所示)。

方案1.ZHB Taq DNA聚合酶基因在pET21b中的表達(dá)載體構(gòu)建

將得到的基因產(chǎn)物用DNA凝膠回收試劑盒(購自北京天根生化科技有限公司)純化。純化后，用NdeI和XhoI(購自New England Biolabs公司)雙酶切，用T4連接酶(購自New England Biolabs公司)連接到pET21b質(zhì)粒(購自Merck公司)載體中，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞(購自北京天根生化科技有限公司)中，在含有100μg/mL的氨芐青霉素(購自Amresco公司)的LB平板中37℃培養(yǎng)過夜。第二天篩選陽性克隆菌測序，比對，與預(yù)期序列完全一致，即得到ZHB Taq DNA聚合酶一種形式的表達(dá)載體，記為pET21b-ZHB Taq DNA(質(zhì)粒構(gòu)建流程如圖6-a所示)。

方案2.ZHB Taq DNA聚合酶基因在pDEST14中的表達(dá)載體構(gòu)建

將得到的基因產(chǎn)物用DNA凝膠回收試劑盒(購自北京天根生化科技有限公司)純化。純化后，用NdeI和XhoI(購自New England Biolabs公司)雙酶切，用T4連接酶(購自New England Biolabs公司)連接到分別在attR1位點(diǎn)后引入NdeI酶切位點(diǎn)，attR2位點(diǎn)后引入XhoI酶切位點(diǎn)的pDEST14質(zhì)粒(購自Invitrogen公司)中，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞(購自北京天根生化科技有限公司)中，在含有100μg/mL的氨芐青霉素(購自Amresco公司)的LB平板中37℃培養(yǎng)過夜。第二天篩選陽性克隆菌測序，比對，與預(yù)期序列完全一致，即得到重組ZHB Taq DNA聚合酶一種形式的表達(dá)載體，記為pDEST14-ZHB Taq DNA(質(zhì)粒構(gòu)建流程如圖6-b所示)。

實(shí)施例3 ZHB Taq DNA聚合酶在重組大腸桿菌中的表達(dá)和鑒定

方案1.ZHB Taq DNA聚合酶在BL21(DE3)中的誘導(dǎo)表達(dá)鑒定

具體步驟如下：

1).將實(shí)施例2步驟1中測序比對正確的pET21b-ZHB Taq DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中(購自北京天根生化科技有限公司)中，37℃氨芐青霉素平板中過夜培養(yǎng)。

2).第二天挑1-4個含有pET21b-ZHB Taq DNA質(zhì)粒的重組單菌落，接入含有100μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)過夜。

3).取25mL過夜培養(yǎng)物接入500mL含100μg/mL氨芐青霉素的TB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)。

4).接種后每隔1小時測菌液OD₆₀₀值，待OD₆₀₀≈1.0時，用1mmol/L的IPTG(購自Amresco公司)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。同時以未加入IPTG的大腸桿菌培養(yǎng)液做陰性對照。

5).4小時后收集菌液，12000rpm高速離心3min，用預(yù)冷的PBS清洗沉淀，加入5×SDS凝膠上樣緩沖液，100℃加熱5min，12000rpm高速離心1min，取上清。未加入IPTG的大腸桿菌培養(yǎng)液也按此步驟處理。

6).各取5μL未加入IPTG和加入IPTG誘導(dǎo)的培養(yǎng)物懸液，10％SDS-PAGE凝膠電泳分析。

7).8-15V/cm電泳，至溴酚藍(lán)遷移到分離膠底部。

8).考馬斯亮藍(lán)染色，觀察表達(dá)產(chǎn)物條帶，見圖7-a。

方案2.ZHB Taq DNA聚合酶在BL21(AI)中的誘導(dǎo)表達(dá)鑒定

具體步驟如下：

1).將實(shí)施例2步驟2中測序比對正確的pDEST14-ZHB Taq DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(AI)感受態(tài)菌株(購自Invitrogen公司)中，37℃氨芐青霉素平板中過夜培養(yǎng)。

2).第二天挑1-4個含有pDEST14-ZHB Taq DNA質(zhì)粒的重組單菌落，接入含有100μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)過夜。

3).取25mL過夜培養(yǎng)物接入500mL含100μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)。

4).接種后每隔1小時測菌液OD₆₀₀值，待OD₆₀₀≈1.0時，用0.2％(V/V)的阿拉伯糖(購自Amresco公司)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。同時以未加入阿拉伯糖的大腸桿菌培養(yǎng)液做陰性對照。

5). 4小時后收集菌液，12000rpm高速離心3min，用預(yù)冷的PBS清洗沉淀，加入5×SDS凝膠上樣緩沖液，100℃加熱5min，12000rpm高速離心1min，取上清。未加入阿拉伯糖誘導(dǎo)的大腸桿菌培養(yǎng)液也按此步驟處理。

6).各取5μL未加入阿拉伯糖和加入阿拉伯糖誘導(dǎo)的培養(yǎng)物懸液，10％SDS-PAGE凝膠電泳分析。

7). 8-15V/cm電泳，至溴酚藍(lán)遷移到分離膠底部。

8).考馬斯亮藍(lán)染色，觀察表達(dá)產(chǎn)物條帶，見圖7-b。

實(shí)施例4 ZHB Taq DNA聚合酶純化

步驟1.重組菌體破碎

1).將實(shí)施例3方案1中重組BL21(DE3)菌體或方案2步驟5中重組BL21(AI)菌體，分別經(jīng)預(yù)冷的PBS清洗得到的含有誘導(dǎo)ZHB Taq DNA聚合酶的大腸桿菌沉淀，用預(yù)冷的PBS重懸，于4℃以12000rpm離心15min；重復(fù)一次。

2).吸去上清，稱菌體沉淀重量，每克菌體加入5mL結(jié)合緩沖液BufferA，用磨光玻璃棒攪動，使菌體懸起。

3).每克菌體加入5μL 100mmol/L PMSF，5μL 100mg/mL溶菌酶，冰上攪動20min。

4).用探針型超聲波儀破碎菌體，樣品置于冰上，超聲120次，每次5秒間隔5秒，循環(huán)三次，每次循環(huán)間隔等待5min。12000rpm，4℃高速離心15min。

5).將離心獲得的上清液分別于75℃水浴中孵育1h,12000rpm離心20min去除沉淀。過0.22μm濾膜過濾備用。

步驟2.IMAC親和純化細(xì)菌裂解液

1).IMAC親和層析選用的層析柱是HisTrap crude FF 5mL(購自GE healthcare)，結(jié)合緩沖液BufferA：20mM NaH₂PO₄，20mM咪唑，300mM NaCl，pH＝7.5，洗脫緩沖液BufferB：20mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，500mM咪唑，pH＝7.5，0.22μm濾膜過濾備用。

2).將HisTrap FF crude 5mL接入AKTA avant150純化儀柱位閥中，依次用雙蒸水清洗機(jī)器和柱子后，再用結(jié)合緩沖液BufferA平衡柱子。并用樣品泵對步驟1中處理的重組BL21(DE3)和BL21(AI)細(xì)菌裂解液進(jìn)行上樣。上完樣品后，先用結(jié)合緩沖液BufferA清洗柱子，再用洗脫緩沖液BufferB進(jìn)行洗脫并收集洗脫峰。

3).對IMAC親和層析收集的各收集管的樣品進(jìn)行SDS-PAGE蛋白凝膠電泳檢測，由圖8-a和8-b所示，重組菌株BL21(DE3)誘導(dǎo)可溶表達(dá)的ZHB Taq DNA聚合酶的量遠(yuǎn)高于重組BL21(AI)菌株。

步驟3.Superdex 75凝膠過濾層析

1).凝膠過濾層析選用的層析柱是HiLoad 16/60superdex75pg(購自GE healthcare)，緩沖液BufferC為20mM NaH₂PO₄，150mM NaCl，pH＝7.5，0.22μm濾膜過濾備用。

2).將Superdex75凝膠過濾層析柱接入AKTA avant150純化儀柱位閥中，依次用雙蒸水清洗機(jī)器和柱子后，再用緩沖液BufferC平衡柱子，每次上樣總體積不超過柱體積的5％。上完樣品后，用BufferC洗脫，并收集洗脫峰。

3).對Superdex75凝膠過濾層析收集的各收集管樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳檢測(結(jié)果如 圖9所示)。

實(shí)施例5 ZHB Taq DNA聚合酶在核酸擴(kuò)增中的應(yīng)用

將實(shí)施例4制備得到的ZHB Taq DNA聚合酶應(yīng)用于核酸擴(kuò)增。首先，測試該ZHB Taq DNA聚合酶在核酸擴(kuò)增中的反應(yīng)條件，以人基因組中1.0kb和1.5kb基因片段作為模板，在PCR儀(Applied Biosystems，96-Well Thermal Cycler)擴(kuò)增確定其反應(yīng)的最適pH值及K⁺、Mg²⁺離子濃度。配制10×PCR初始反應(yīng)緩沖液:100mmol/L Tris-HCl，pH值為7.4～8.8，15mmol/L MgCl₂，分別添加不同濃度KCl、Nonidet P40、Triton X-100，反應(yīng)體系為50μL，其中含不同條件的10×PCR反應(yīng)緩沖液5μL，10mmol/L的dNTPs1μL，10μmol/L的上下游引物各1μl，ZHB Taq DNA聚合酶1μL(2.5U/μL)，50ng/μL的模板0.5μL，按94℃1min，(94℃15s，55℃45s，72℃1min)25cycles，最后72℃延伸5min，電泳檢測確定其最適反應(yīng)緩沖液。根據(jù)結(jié)果，確定ZHB Taq DNA PCR最適反應(yīng)緩沖液BufferD(10×ZHB Taq DNA PCR buffer)為：100mM Tris-HCl(pH 8.8at 25℃)，500mM KCl，15mM MgCl₂，0.8％(v/v)Nonidet P40。

以上所述的BufferD和實(shí)施例4制備得的ZHB Taq DNA聚合酶分別擴(kuò)增人基因組不同片段的DNA序列，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖10所示，均能很好地擴(kuò)增得到目的片段。將上述PCR產(chǎn)物送至南京金斯瑞科技有限公司進(jìn)行DNA序列測序，序列比對結(jié)果顯示，只有一個核苷酸突變，保真性達(dá)到了99.3％。

實(shí)施例6 ZHB Taq DNA聚合酶熱穩(wěn)定性

將實(shí)施例4制備得到的ZHB Taq DNA聚合酶于90℃高溫孵育0、1、2、3、4、5、6h；并將孵育后獲得的不同時間的ZHB Taq DNA聚合酶以實(shí)施例5中BufferD在PCR儀中測其人在基因組1.0-1.5kb DNA片段中擴(kuò)增活性，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測其擴(kuò)增效果。結(jié)果如圖11-a和圖11-b所示，泳道2-8為ZHB Taq DNA聚合酶于90℃高溫孵育0、1、2、3、4、5、6h后，分別以此聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增目的DNA片段，ZHB Taq DNA聚合酶在90℃高溫中孵育5h后，仍擴(kuò)增出目的基因，說明ZHB Taq DNA聚合酶具有較高的熱穩(wěn)定性，其90℃半衰期為5h。

實(shí)施例7 ZHB Taq DNA聚合酶凍融穩(wěn)定性

將實(shí)施例4制備得到的ZHB Taq DNA聚合酶試劑盒用干冰凍結(jié)、37℃水浴溶解進(jìn)行交替處理20次，并將交替處理得到的不同次數(shù)的ZHB Taq DNA聚合酶以實(shí)施例5中的BufferD在PCR儀中測其在擴(kuò)增人基因組0.5kb DNA片段中擴(kuò)增活性，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測其擴(kuò)增效果。結(jié)果如圖12所示ZHB Taq DNA聚合酶經(jīng)過干冰凍結(jié)、37℃水浴溶解交替處理20次后均能很好 地擴(kuò)增得到目的片段，說明ZHB Taq DNA聚合酶經(jīng)過反復(fù)凍融20次以上，仍具有較高的穩(wěn)定性。

實(shí)施例8 ZHB Taq DNA聚合酶在熒光定量PCR中的應(yīng)用

將實(shí)施例4制備得到的ZHB Taq DNA聚合酶以實(shí)施例5中的BufferD測其在熒光定量PCR儀(ABI 7500)中擴(kuò)增人基因組中EGFR基因不同的突變體活性，同時并以ABI的AmpliTaq DNA Polymerase試劑盒(N8080241)和Takara的EX Taq的試劑盒(DRR001A)作為對照，并且在進(jìn)行PCR反應(yīng)液配制時，均使用各自配套的反應(yīng)緩沖液，Mg²⁺以及dNTP以保證擴(kuò)增效率。PCR反應(yīng)體系為20μl，各成分分別為：ZHB Taq/ABI/Takara DNA聚合酶，0.5μl，dNTP(10mM)1μl，Mg²⁺(25mM)1μl，10×buffer 2μl，正向引物(1μM)1μl，反向引物(1μM)1μl，熒光探針(1μM)1μl，DNA模板50ng，ddH₂O補(bǔ)足至20μl。按照上述要求將各試劑制備成混合液，分裝至各PCR管中，并蓋好蓋子，稍離心，以95℃10min，(95℃10s，60℃1min)40cycles，60℃時收集熒光的程序進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果如圖13所示，ZHBTaq DNA聚合酶在ABI熒光定量PCR儀中擴(kuò)增人基因組中EGFR不同的突變體，多種反應(yīng)擴(kuò)增曲線CT值均小于其他兩種酶，熒光值高于其他兩種酶；說明ZHB Taq DNA聚合酶有更好的擴(kuò)增效果和更高的活性。

實(shí)施例9 ZHB 2×Taq DNA聚合酶試劑盒的制備

將實(shí)施例4制備得到的ZHB Taq DNA聚合酶應(yīng)用于ZHB 2×Taq DNA聚合酶試劑盒的制備。以人基因組中1.0kb和1.5kb基因片段做為模板，確定ZHB 2×Taq DNA聚合酶試劑盒最佳反應(yīng)緩沖液。首先配制ZHB 2×Taq DNA聚合酶試劑盒初始反應(yīng)緩沖液：20mmol/L Tris-HCl，pH值為7.4～8.8，100mmol/L KCl，然后分別添加不同濃度MgCl₂、Nonidet P40、Triton X-100，甘油等，反應(yīng)體系為50μL，其中含不同條件的2×PCR反應(yīng)緩沖液25μL，10mmol/L的dNTPs1μL，10μmol/L的上下游引物各0.5μL，ZHB Taq DNA聚合酶1μL(2.5U/μL)，按94℃1min，(94℃15s，55℃45s，72℃1min)25cycles，最后72℃延伸5min，瓊脂糖電泳電泳檢測(結(jié)果見圖14)，確定最適反應(yīng)緩沖液。根據(jù)結(jié)果，確定ZHB 2×Taq DNA聚合酶試劑盒最適反應(yīng)緩沖液BufferE為：20mM Tris-HCl(pH 8.8at 25℃)，100mM KCl，3mM MgCl₂，0.2％(v/v)Nonidet P40，0.05％(v/v)溴酚藍(lán)，5～10％(v/v)的甘油，400μM dNTPs，2.5U/μL ZHB Taq DNA聚合酶。

實(shí)施例10 ZHB 2×Taq DNA聚合酶試劑盒凍融穩(wěn)定性

將實(shí)施例9制備得到的ZHB 2×Taq DNA聚合酶試劑盒用干冰凍結(jié)、37℃水浴溶解進(jìn)行交替處理20次，并將交替處理得到的不同次數(shù)的ZHB 2×Taq DNA聚合酶試劑盒在PCR儀中測其在擴(kuò)增人基因組中0.5kb DNA片段中擴(kuò)增活性，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測其擴(kuò)增效果。結(jié)果如圖15所示ZHB 2×Taq DNA聚合酶試劑盒經(jīng)過干冰凍結(jié)、37℃水浴溶解交替處理20次后均能很好地擴(kuò)增得到目的片段，說明ZHB 2×Taq DNA聚合酶試劑盒經(jīng)過反復(fù)凍融20次以上，仍具有較高的穩(wěn)定性。

以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出的是，上述優(yōu)選實(shí)施方式不應(yīng)視為對本發(fā)明的限制，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)當(dāng)以權(quán)利要求所限定的范圍為準(zhǔn)。對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。