本發(fā)明屬于放線菌微生物總基因組提取的技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種放線菌微生物的快速破壁及其裂解物中基因組純化的方法。

背景技術(shù)：

放線菌微生物是存在于自然中極其重要的生物，其次級(jí)代謝基因產(chǎn)物對(duì)人類生活和健康非常重要，因此，挖掘相關(guān)基因?yàn)槿祟惙?wù)是很有意義的工作。

為了發(fā)掘放線菌微生物基因就要提取總DNA，一般采用液氮研磨法、溶菌酶破壁法等方法提取放線菌微生物基因組，由于放線菌細(xì)胞壁含肽聚糖，物理法破壁費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，酶法破壁的消化處理過程過長(zhǎng)，兩種方法獲得的總 DNA 質(zhì)量和產(chǎn)量一般都不高，因此，放線菌微生物的某些基因不能獲得有效擴(kuò)增。

微波法即在基因組DNA提取過程中，用微波處理，使細(xì)胞內(nèi)的極性物質(zhì)，尤其是水分子吸收能量而產(chǎn)生大量熱，細(xì)胞質(zhì)受熱甚至水分子汽化膨脹產(chǎn)生較大壓力沖破細(xì)胞壁，釋放胞內(nèi)物質(zhì)便于基因組DNA的提取。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明提供了一種基于微波處理的放線菌微生物快速破壁提取基因組的方法，對(duì)比其它放線菌微生物提取方法，本發(fā)明具有簡(jiǎn)便、高效、快速和價(jià)廉等特點(diǎn)，特別是在大量菌株的快速鑒別和活性物質(zhì)產(chǎn)生菌的快速基因篩選方面可以避免較多的資源浪費(fèi)，大大節(jié)省了人力物力財(cái)力。微波法提取基因組DNA時(shí)僅需微量菌體，可直接采用固體瓊脂平板上的單菌落，避免了菌體大量繁殖所需的時(shí)間。微波法由于只需洗滌、微波處理和酚/氯仿抽提等三步反應(yīng)，可以有效避免物理破壁的費(fèi)時(shí)、費(fèi)力或酶解法破壁的長(zhǎng)時(shí)間消化處理過程。

本發(fā)明提出一種快速提取放線菌基因組的方法, 其特征在于僅需微量菌體，經(jīng)過微波處理，提取放線菌基因組。

所述方法包括以下步驟。

1、放線菌微生物收集。

2、放線菌微生物細(xì)胞的洗滌：挑取0.05g放線菌孢子絲溶于洗滌液，10000rpm離心1-2min后棄上清，加50μL裂解液，振蕩懸浮；所述洗滌液成分包括：50-100mmol/L Tris pH7.0-8.0的Tris緩沖液，25-50mmol/L EDTA，0.1-1% PVP；所述裂解液成分包括：50-100mmol/L pH7.0-8.0的Tris緩沖液，25-50mmol/L EDTA，3-5% (w/v) SDS，1.2-2% (w/v) PVP。

3、將上述前期處理所得的菌體混合液，采用700-1000W微波中火處理。

4、之后將微波處理產(chǎn)物經(jīng)酚/氯仿抽提純化得到放線菌基因組DNA。

本發(fā)明在上述放線菌微生物破壁及基因組提取整個(gè)過程中，平均只需1h，使得基因組提取時(shí)間大大縮短，提高了效率。

綜上所述，本發(fā)明提供了放線菌微生物的快速破壁及其基因組的提取方法，為提取放線菌微生物基因組DNA提供了快捷適用的技術(shù)。本發(fā)明可用于鏈霉菌屬、諾卡氏菌屬以及不產(chǎn)孢子的放線菌微生物的快速破壁及其基因組的提取。

附圖說明

圖1 微波法提取的放線菌基因組DNA電泳圖。

圖2 實(shí)驗(yàn)菌株Z8的四種16S rDNA序列結(jié)果比對(duì)圖

（注：Z8為采用溶菌酶破壁法提取的DNA作為16S rDNA序列的擴(kuò)增模板）。

具體實(shí)施方式

通過以下具體實(shí)施例和附圖，對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說明，本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容不局限于以下實(shí)施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點(diǎn)都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書為保護(hù)范圍。實(shí)施本發(fā)明的過程、條件、試劑、實(shí)驗(yàn)方法等，除本領(lǐng)域的普遍知識(shí)和公知常識(shí)外，本發(fā)明沒有特別限制內(nèi)容。

實(shí)施例1 微波法提取放線菌基因組DNA。

1）向經(jīng)滅菌的EP管中加入300μL洗滌液，挑取放線菌約0.01g至EP管中，振蕩器振蕩懸浮。

2）8000rpm離心1min；棄上清液。

3）加35μL裂解液，振蕩懸浮。

4）700W微波處理，中火，秒表計(jì)時(shí)90s。

5）加400μL 65℃的抽提液，振蕩5s。

6）加等體積酚/氯仿，輕混合，靜置2min，12000rpm離心5min。

7）取上清至新EP管，加等體積異丙醇，輕混，之后，靜置30min，棄上清。

8）加入70%乙醇200μL，12000rpm離心1min。

9）棄上清， 置于37℃烘干。

10）加40μL 1×TE溶解，靜置20min，期間不時(shí)搖動(dòng)使溶解充分。

按上述方法本發(fā)明獲得了大于10kb的基因組DNA條帶，無降解，無蛋白質(zhì)污染，結(jié)果如圖1 所示。

實(shí)施例2 微波法提取的基因組準(zhǔn)確性的檢測(cè)。

用700W微波功率，處理時(shí)間分別為60s、90s和120s，提取放線菌菌株基因組DNA，同時(shí)用溶菌酶破壁法提取同一種菌株的基因組DNA。以這四組DNA作為PCR擴(kuò)增模板，擴(kuò)增菌株的16S rDNA全長(zhǎng)序列，對(duì)得到的16S rDNA全長(zhǎng)序列進(jìn)行比對(duì)分析，來檢測(cè)微波法提取的基因組DNA的準(zhǔn)確性。

1）16S rDNA序列的擴(kuò)增。

16S rDNA體系（50μL）

擴(kuò)增用的引物序列為細(xì)菌16S rDNA通用引物（27F和1492R），擴(kuò)增產(chǎn)物為約1500bp的16S rDNA全長(zhǎng)序列。

PCR反應(yīng)條件: 94℃ 5min，94℃ 1min，54℃ 1min，72℃ 1min 30s，72℃10 min，4℃保存，30個(gè)循環(huán)。將PCR產(chǎn)物送至測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，獲得16S rDNA序列。

2）16S rDNA序列的分析比較。

將上述1）中得到的16S rDNA序列用DNAMAN軟件比較其核酸序列的同源性。得到序列比對(duì)結(jié)果圖2。比對(duì)結(jié)果表明，三種不同處理時(shí)間的微波法所得到的16S rDNA序列同源性為99.71%，差別極微小；三種不同處理時(shí)間的微波法所得到的16S rDNA序列與溶菌酶破壁法所得序列的同源性為99.75%，差別極微小，表明微波法與溶菌酶破壁法所提取的放線菌基因組DNA效果是相同的。

3）結(jié)論

綜上所述，微波法與標(biāo)準(zhǔn)酶法所提取的放線菌基因組DNA效果是相同的；另外，與溶菌酶破壁法相比，微波法節(jié)省了溶菌酶消化的時(shí)間，大大縮短了操作時(shí)間的同時(shí)也節(jié)省了費(fèi)用，可用于大量快速提取放線菌基因組DNA。