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一種落葉松胚性細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化方法與流程

文檔序號(hào):12712611閱讀:來(lái)源:國(guó)知局

技術(shù)特征:

1.一種落葉松胚性細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化方法,依次包括如下步驟:

(a1)取落葉松胚性細(xì)胞,懸浮于重組農(nóng)桿菌侵染液進(jìn)行侵染;

(a2)完成步驟(a1)后,收集落葉松胚性細(xì)胞,進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng);

(a3)完成步驟(a2)后,取落葉松胚性細(xì)胞,采用抽濾脫菌裝置進(jìn)行脫菌;

所述抽濾脫菌裝置包括分離裝置(1)、液體收集裝置(2)和抽氣裝置(3);

所述分離裝置的上部為頂端開(kāi)口內(nèi)部中空的加樣部(1-1),下部為底端開(kāi)口內(nèi)部中空的漏斗部(1-2),加樣部和漏斗部外部相接、內(nèi)部連通,加樣部和漏斗部的內(nèi)部連接處設(shè)有孔徑為200-500目的不銹鋼網(wǎng)(1-3);

所述液體收集裝置為密閉的中空容器,具有上開(kāi)口和側(cè)開(kāi)口;

所述分離裝置的漏斗部的底端開(kāi)口與所述液體收集裝置的上開(kāi)口氣密連通;

所述液體收集裝置的側(cè)開(kāi)口與抽氣裝置氣密連通。

2.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于:所述步驟(a3)中,所述脫菌的過(guò)程為:先用蒸餾水洗滌3-5次、每次2-5min,再用300-500mg/L抗生素溶液洗滌3-5次、每次5-10min。

3.如權(quán)利要求2所述的方法,其特征在于:

所述步驟(a1)中,所述重組農(nóng)桿菌侵染液為用侵染液懸浮重組農(nóng)桿菌得到的液相;所述重組農(nóng)桿菌為含有目的DNA的農(nóng)桿菌;

所述侵染液為:乙酰丁香酮2-40mg/L,余量為水;pH5.75-5.85;

所述步驟(a1)中,所述侵染的條件為:室溫靜置5-20分鐘。

4.如權(quán)利要求1至3中任一所述的方法,其特征在于:

所述步驟(a2)中,所述恢復(fù)培養(yǎng)在S1培養(yǎng)基上進(jìn)行;

所述S1培養(yǎng)基如下:KNO31836-2836mg/L、NH4NO3243-360mg/L、KH2PO470-130mg/L、CaCl2·2H2O300-450mg/L、MgSO4·7H2O130-250mg/L、H3BO32-11mg/L、ZnSO4·7H2O3-7mg/L、MnSO4·H2O6.5-10.5mg/L、Na2MoO4·2H2O0.11-0.21mg/L、KI0.28-0.63mg/L、CuSO4·5H2O0.01-0.035mg/L、CoCl20.01-0.035mg/L、FeSO4·7H2O13-21mg/L、Na2·EDTA·H2O15-27mg/L、肌醇50-1500mg/L、維生素B10.4-0.6mg/L、谷氨酰胺400-700mg/L、蔗糖20000-55000mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.3-2.7mg/L、酸水解酪蛋白350-1050mg/L、6-芐氨基嘌呤0.05-3.1mg/L、瓊脂2500-7000mg/L、乙酰丁香酮2-40mg/L,余量為水;pH5.75-5.85;

所述步驟(a2)中,所述恢復(fù)培養(yǎng)的條件為:20-25℃、黑暗條件下靜置46-50小時(shí)。

5.如權(quán)利要求1至4中任一所述的方法,其特征在于:所述方法還包括如下步驟 (a4):完成步驟(a3)后,取落葉松胚性細(xì)胞,轉(zhuǎn)移至S2培養(yǎng)基上,20-25℃、黑暗條件下靜置培養(yǎng)7-10天;

所述S2培養(yǎng)基如下:KNO31836-2836mg/L、NH4NO3243-360mg/L、KH2PO470-130mg/L、CaCl2·2H2O300-450mg/L、MgSO4·7H2O130-250mg/L、H3BO32-11mg/L、ZnSO4·7H2O3-7mg/L、MnSO4·H2O6.5-10.5mg/L、Na2MoO4·2H2O0.11-0.21mg/L、KI0.28-0.63mg/L、CuSO4·5H2O0.01-0.035mg/L、CoCl20.01-0.035mg/L、FeSO4·7H2O13-21mg/L、Na2·EDTA·H2O15-27mg/L、肌醇50-1500mg/L、維生素B10.4-0.6mg/L、谷氨酰胺400-700mg/L、蔗糖20000-55000mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.3-2.7mg/L、酸水解酪蛋白350-1050mg/L、6-芐氨基嘌呤0.05-3.1mg/L、瓊脂2500-7000mg/L、頭孢霉素200-700mg/L,余量為水;pH5.75-5.85。

6.如權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于:所述方法還包括如下步驟(a5):完成步驟(a4)后,取落葉松胚性細(xì)胞,轉(zhuǎn)移至S3培養(yǎng)基上,20-25℃、黑暗條件下靜置培養(yǎng)15-25天;

所述S3培養(yǎng)基如下:KNO31836-2836mg/L、NH4NO3243-360mg/L、KH2PO470-130mg/L、CaCl2·2H2O300-450mg/L、MgSO4·7H2O130-250mg/L、H3BO32-11mg/L、ZnSO4·7H2O3-7mg/L、MnSO4·H2O6.5-10.5mg/L、Na2MoO4·2H2O0.11-0.21mg/L、KI0.28-0.63mg/L、CuSO4·5H2O0.01-0.035mg/L、CoCl20.01-0.035mg/L、FeSO4·7H2O13-21mg/L、Na2·EDTA·H2O15-27mg/L、肌醇50-1500mg/L、維生素B10.4-0.6mg/L、谷氨酰胺400-700mg/L、蔗糖20000-55000mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.3-2.7mg/L、酸水解酪蛋白350-1050mg/L、6-芐氨基嘌呤0.05-3.1mg/L、瓊脂2500-7000mg/L、頭孢霉素200-700mg/L、潮霉素的濃度為3-20mg/L,余量為水;pH5.75-5.85。

7.如權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于:所述方法還包括如下步驟(a6):完成步驟(a5)后,進(jìn)行兩次以上如下操作:取存活的胚性細(xì)胞團(tuán),轉(zhuǎn)移到所述S3培養(yǎng)基上,20-25℃、黑暗條件下靜置培養(yǎng)15-25天。

8.如權(quán)利要求1至7中任一所述的方法,其特征在于:進(jìn)行所述步驟(a1)以前,落葉松胚性細(xì)胞先進(jìn)行如下操作:

(b1)將落葉松胚性細(xì)胞接種至S0培養(yǎng)基上,20-25℃、黑暗條件下靜置培養(yǎng)15-20天;

所述S0培養(yǎng)基如下:KNO31836-2836mg/L、NH4NO3243-360mg/L、KH2PO470-130mg/L、CaCl2·2H2O300-450mg/L、MgSO4·7H2O130-250mg/L、H3BO32-11mg/L、ZnSO4·7H2O3-7mg/L、MnSO4·H2O6.5-10.5mg/L、Na2MoO4·2H2O0.11-0.21mg/L、KI0.28-0.63mg/L、CuSO4·5H2O0.01-0.035mg/L、CoCl20.01-0.035mg/L、FeSO4·7H2O13-21mg/L、Na2·EDTA·H2O15-27mg/L、肌醇50-1500mg/L、維生素B10.4-0.6mg/L、谷氨酰胺 400-700mg/L、蔗糖20000-55000mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.3-2.7mg/L、酸水解酪蛋白350-1050mg/L、6-芐氨基嘌呤0.05-3.1mg/L、瓊脂2500-7000mg/L,余量為水;pH5.4-6.2;

(b2)完成步驟(b1)后,挑取落葉松胚性細(xì)胞,加入Y0培養(yǎng)基中,20-25℃、黑暗條件下振蕩培養(yǎng),每7-10天繼代一次,繼代培養(yǎng)5-7天時(shí)加入乙酰丁香酮,加入乙酰丁香酮12-24小時(shí)后取落葉松胚性細(xì)胞進(jìn)行所述步驟(a1);

所述Y0培養(yǎng)基如下:KNO31836-2836mg/L、NH4NO3243-360mg/L、KH2PO470-130mg/L、CaCl2·2H2O300-450mg/L、MgSO4·7H2O130-250mg/L、H3BO32-11mg/L、ZnSO4·7H2O3-7mg/L、MnSO4·H2O6.5-10.5mg/L、Na2MoO4·2H2O0.11-0.21mg/L、KI0.28-0.63mg/L、CuSO4·5H2O0.01-0.035mg/L、CoCl20.01-0.035mg/L、FeSO4·7H2O13-21mg/L、Na2·EDTA·H2O15-27mg/L、肌醇50-1500mg/L、維生素B10.4-0.6mg/L、谷氨酰胺400-700mg/L、蔗糖20000-55000mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.3-2.7mg/L、酸水解酪蛋白350-1050mg/L、6-芐氨基嘌呤0.05-3.1mg/L,余量為水;pH5.4-6.2;

乙酰丁香酮的加入量為:每92毫升Y0培養(yǎng)基加入0.5-2mg乙酰丁香酮。

9.一種用于落葉松胚性細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化的試劑盒,包括侵染液、S1培養(yǎng)基、S2培養(yǎng)基和S3培養(yǎng)基;

所述侵染液為:乙酰丁香酮2-40mg/L,余量為水;pH5.75-5.85;

所述S1培養(yǎng)基如下:KNO31836-2836mg/L、NH4NO3243-360mg/L、KH2PO470-130mg/L、CaCl2·2H2O300-450mg/L、MgSO4·7H2O130-250mg/L、H3BO32-11mg/L、ZnSO4·7H2O3-7mg/L、MnSO4·H2O6.5-10.5mg/L、Na2MoO4·2H2O0.11-0.21mg/L、KI0.28-0.63mg/L、CuSO4·5H2O0.01-0.035mg/L、CoCl20.01-0.035mg/L、FeSO4·7H2O13-21mg/L、Na2·EDTA·H2O15-27mg/L、肌醇50-1500mg/L、維生素B10.4-0.6mg/L、谷氨酰胺400-700mg/L、蔗糖20000-55000mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.3-2.7mg/L、酸水解酪蛋白350-1050mg/L、6-芐氨基嘌呤0.05-3.1mg/L、瓊脂2500-7000mg/L、乙酰丁香酮2-40mg/L,余量為水;pH5.75-5.85;

所述S2培養(yǎng)基如下:KNO31836-2836mg/L、NH4NO3243-360mg/L、KH2PO470-130mg/L、CaCl2·2H2O300-450mg/L、MgSO4·7H2O130-250mg/L、H3BO32-11mg/L、ZnSO4·7H2O3-7mg/L、MnSO4·H2O6.5-10.5mg/L、Na2MoO4·2H2O0.11-0.21mg/L、KI0.28-0.63mg/L、CuSO4·5H2O0.01-0.035mg/L、CoCl20.01-0.035mg/L、FeSO4·7H2O13-21mg/L、Na2·EDTA·H2O15-27mg/L、肌醇50-1500mg/L、維生素B10.4-0.6mg/L、谷氨酰胺400-700mg/L、蔗糖20000-55000mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.3-2.7mg/L、酸水解酪蛋白350-1050mg/L、6-芐氨基嘌呤0.05-3.1mg/L、瓊脂2500-7000mg/L、頭孢霉素200-700mg/L,余量為水;pH5.75-5.85。

所述S3培養(yǎng)基如下:KNO31836-2836mg/L、NH4NO3243-360mg/L、KH2PO470-130mg/L、CaCl2·2H2O300-450mg/L、MgSO4·7H2O130-250mg/L、H3BO32-11mg/L、ZnSO4·7H2O3-7mg/L、MnSO4·H2O6.5-10.5mg/L、Na2MoO4·2H2O0.11-0.21mg/L、KI0.28-0.63mg/L、CuSO4·5H2O0.01-0.035mg/L、CoCl20.01-0.035mg/L、FeSO4·7H2O13-21mg/L、Na2·EDTA·H2O15-27mg/L、肌醇50-1500mg/L、維生素B10.4-0.6mg/L、谷氨酰胺400-700mg/L、蔗糖20000-55000mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.3-2.7mg/L、酸水解酪蛋白350-1050mg/L、6-芐氨基嘌呤0.05-3.1mg/L、瓊脂2500-7000mg/L、頭孢霉素200-700mg/L、潮霉素的濃度為3-20mg/L,余量為水;pH5.75-5.85。

10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒,其特征在于:所述試劑盒還包括抽濾脫菌裝置;

所述抽濾脫菌裝置包括分離裝置(1)、液體收集裝置(2)和抽氣裝置(3);

所述分離裝置的上部為頂端開(kāi)口內(nèi)部中空的加樣部(1-1),下部為底端開(kāi)口內(nèi)部中空的漏斗部(1-2),加樣部和漏斗部外部相接、內(nèi)部連通,加樣部和漏斗部的內(nèi)部連接處設(shè)有孔徑為200-500目的不銹鋼網(wǎng)(1-3);

所述液體收集裝置為密閉的中空容器,具有上開(kāi)口和側(cè)開(kāi)口;

所述分離裝置的漏斗部的底端開(kāi)口與所述液體收集裝置的上開(kāi)口氣密連通;

所述液體收集裝置的側(cè)開(kāi)口與抽氣裝置氣密連通。

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