本發(fā)明涉及甾族化合物，具體涉及五環(huán)三萜類化合物以及該化合物在制備治療炎癥性血管疾病藥物中的應用。

背景技術(shù)：

毛冬青為冬青科(Aquifoliaceae)冬青屬植物Ilex pubescensHook.etArn.，別名烏尾丁、六月霜、細葉冬青、毛披樹、水火藥、火烙木等，主產(chǎn)于廣東、江西、福建、廣西等地，是我國南方常用中藥。其藥用部位為根，具有活血通絡、消腫止痛、清熱解毒之功效，臨床上廣泛用于治療冠心病、心絞痛、血栓閉塞性脈管炎等。

有文獻報道過毛冬青部位的抗炎作用(Wang JR,Zhou H,Jiang ZH,Wong YF,Liu L.In vivo anti-inflammatory and analgesic activities of a purified saponon fraction derived from the root of Ilex pubescens.Biol.Pharm.Bull.2008,21,643-650.)，同時有文獻報道從中分離得到的烏蘇烷型三萜皂苷類化合物具有抗腫瘤(ZhouY,Chai XY,Zeng K,Zhang JY,Li N,Jiang Y,Tu PF,llexpublesnins C-M,eleven new triterpene saponins from the roots of Ilex pubescens.Planta.Med.2013,79,70-77.)、抗血栓(熊天琴,陳元元,李紅俠.毛冬青皂苷B3的抗血栓作用研究,中草藥.2012,43,1758-1788)和抑制黃嘌呤氧化酶(Zhou Z L,Feng Z C,Yin W Q,Zhang H L.A new triterpene saponin from the leaves of Ilex pubescens and its XOD inhibitory activity.Chem.Nat.Compd.2013,49(4):682-684.)作用。

烏蘇烷型三萜皂苷類化合物在植物界分布較廣，據(jù)文獻報道從1996年至2012年期間，共從自然界發(fā)現(xiàn)烏蘇烷型三萜類化合物約250余個，(Dinda B,Debnath S,Mohanta BC,Harigaya Y.Naturally Occurring Triterpenoid Saponins.Chemistry Biodiversity.2010,2327-2580.Hill RA,Connolly JD.Triterpenoids.Nat.Prod.Rep.2015,32:273-327)。關(guān)于該類化合物抗炎活性的報道并不是很多，2011年從雷公根(Centellaasiatica)的葉子中分離得到1個烏蘇烷型三萜皂苷asiaticoside G(Nhiem NX,Tai BH,Kim YH.A new ursane-type triterpenoid glycoside from Centellaasiatica leaves modulates the production of nitric oxide and secretion of TNF-αin activated RAW264.7 cells.Bioorg Med Chem Lett.2011,21:1777-1781)，并發(fā)現(xiàn)其在100μM濃度條件下，在LPS誘導的RAW264.7細胞模型中，對NO和TNF-α的抑制率分別為77.3％和69.0％。2014年從牡荊(Vitexnegundo var.cannabifolia)的葉子中發(fā)現(xiàn)三個烏蘇烷型三萜皂苷化合物(Li MM,Su XQ,Tu PF.Anti-inflammatory Ursane-and Oleanane-Type Triterpenoids from Vitexnegundo var.cannabifolia.J Nat Prod,2014,77:2248-2254.)，分別是cannabifolin C、 2α,3α-dihydroxyurs-12,20(30)-dien-28-oic acid和tormentic acid，并且發(fā)現(xiàn)它們能抑制LPS誘導RAW26437細胞中NO的表達，其IC₅₀值分別為34.0，24.9和26.1μM，但是所得三個三萜皂苷化合物的抗炎活性仍不理想。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題提供一種環(huán)外雙鍵烏蘇烷型三萜皂苷類化合物，該化合物治療炎癥性血管疾病的效果顯著。

本發(fā)明要解決上述問題的技術(shù)方案是：

一種環(huán)外雙鍵烏蘇烷型三萜皂苷類化合物，其分子結(jié)構(gòu)如式Ⅰ所示：

本發(fā)明所述的環(huán)外雙鍵烏蘇烷型三萜皂苷類化合物的分子式C₄₇H₇₄O₁₇，HR-ESI-MS m/z[M+Na]⁺:910.4930，化學名稱為3-O-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃木糖基]-3β-羥基烏蘇烷-12,19(29)-二烯-28-酸-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

本發(fā)明所述的環(huán)外雙鍵烏蘇烷型三萜皂苷類化合物可以通過化學合成的方法。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以通過本領(lǐng)域的知識確定合成步驟和工藝條件。本發(fā)明所述的環(huán)外雙鍵烏蘇烷型三萜皂苷類化合物還可以從毛冬青(Ilex pubescens Hook et Arn.)中分離得到，具體分離方法由下步驟組成：

(1)取毛冬青根，依次用12、10和8倍的濃度為70％的乙醇回流提取2h，合并乙醇提取液，回收乙醇并減壓濃縮至無醇味，得總浸膏；

(2)將總浸膏溶解在水中，過D-101型大孔樹脂柱，依次用濃度為30％的乙醇、濃度為60％的乙醇和濃度為95％的乙醇洗脫；收集濃度為60％的乙醇洗脫液過200～300目的硅膠柱，以氯仿-甲醇為溶劑按氯仿︰甲醇為100︰1～0︰1的梯度進行洗脫；收集氯仿︰甲醇為85︰15的洗脫液過Sephadex LH-20柱，以甲醇為洗脫劑洗脫，收集洗脫液濃縮后過ODS柱，收集甲醇：水為7：3的洗脫液，濃縮后得到白色粉末狀結(jié)晶即可。

上述分離方法中所述的乙醇的濃度均為體積濃度。

上述分離方法中所述的毛冬青是冬青科(Aquifoliaceae)冬青屬(Ilex)植物毛冬青的干燥根。

本發(fā)明所述的環(huán)外雙鍵烏蘇烷型三萜皂苷類化合物，具有抗炎作用，可用于制備預防和治療治療炎癥性血管疾病的藥物。所述的藥物是由(Ⅰ)式所示環(huán)外雙鍵烏蘇烷型三萜皂苷類化合物和藥學上可以接受的輔料組成的常用的劑型，如，注射劑、片劑或膠囊劑等。所述制劑中(Ⅰ)式所示的化合物的重量百分含量為10％～50％。

下面通過實驗來證明(Ⅰ)式所示環(huán)外雙鍵烏蘇烷型三萜皂苷類化合物所具有的技術(shù)效果。采用脂多糖(LPS)誘導的RAW264.7細胞模型，研究化合物對細胞中一氧化氮合成酶(iNOS)和環(huán)氧酶-2(COX-2)蛋白表達量的影響，考察本發(fā)明所述化合物的抗炎作用，具體實驗方法如下所述。

1、樣品1來源于具體實施例1所示制備方法。對照品tormentic acid(委陵菜酸)為文獻(Li MM,Su XQ,Tu PF.Anti-inflammatory Ursane-and Oleanane-Type Triterpenoids from Vitexnegundo var.cannabifolia.J Nat Prod,2014,77:2248-2254.)所報道化合物，具體結(jié)構(gòu)式如下式(Ⅱ)所示。陽性對照藥DEX為地塞米松。

2、鼠源巨噬細胞RAW264.7購自美國標準菌庫，保存在含有10％FBS、100units/ml盤尼西林G、100mg/ml鏈霉素及2mM L-左旋谷酰胺培養(yǎng)液中，在飽和濕度、37℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)。

3、化合物溶解在DMSO中，母液濃度配成30mM，工作濃度為30μM。

4、RAW264.7細胞以8×10⁴個/孔接種于24孔板中培養(yǎng)24h，細胞經(jīng)過測試樣品和陽性對照藥地塞米松(0.5μM)預處理1h，然后用100ng/ml的LPS刺激18h，設空白組合正常組。

5、Western Blot方法：LPS刺激之后，用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液將細胞總蛋白提取出來，通過Bio-Rad蛋白質(zhì)定量法測得濃度，凝膠電泳之后轉(zhuǎn)膜，5％脫脂牛奶進行封閉， 然后用iNOS、COX-2一抗和鼠特異性抗體在4℃條件下孵育過夜，室溫二抗孵育，蛋白表達含量用Odyssey v3.0軟件進行分析。

6、統(tǒng)計分析：上述檢測結(jié)果用X±S表示，樣品組合空白對照組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計數(shù)據(jù)學分析，P＜0.05表示具有顯著性差異。

表1 iNOS和COX-2蛋白表達抑制率

以上實驗結(jié)果表明化合物1能夠顯著性抑制LPS誘導的RAW264.7細胞中iNOS和COX-2蛋白的表達。表明該化合物均具有較好的節(jié)抗炎作用。同時與已報道化合物tormentic acid相比，雖然兩個化合物對iNOS抑制率相差不大，但是化合物1對COX-2的抑制率明顯要大于tormentic acid。

附圖說明

圖1本發(fā)明所述化合物的¹H-NMR圖(500MHz)。

圖2本發(fā)明所述化合物的¹³C-NMR圖(150MHz)。

圖3本發(fā)明所述化合物的DEPT圖。

圖4本發(fā)明所述化合物的COSY NMR圖。

圖5本發(fā)明所述化合物的HSQC NMR圖。

圖6本發(fā)明所述化合物的HMBC NMR圖。

圖7本發(fā)明所述化合物的NOESY NMR圖。

具體實施方式

下述實驗用毛冬青(Ilex pubescens Hook et Arn.)根采自廣東省從化市。

例1：

一、化合物的制備

(1)取毛冬青根，依次用12、10和8倍的濃度為70％的乙醇回流提取2h，合并乙醇提取液，過濾后回收乙醇并減壓濃縮至無醇味，得總浸膏2.2kg；

(2)將總浸膏溶解在水中，過D-101型大孔樹脂柱，依次用濃度為30％的乙醇、濃度為60％的乙醇和濃度為95％的乙醇洗脫；收集濃度為60％的乙醇洗脫液減壓回收溶劑，得稠浸膏566g，該稠浸膏過200～300目的硅膠柱，以氯仿-甲醇為溶劑按氯仿︰甲醇為100︰1～0︰1的梯度進行洗脫；收集氯仿︰甲醇為85︰15的洗脫液濃縮后過Sephadex LH-20 柱，以甲醇為洗脫劑洗脫，收集洗脫液濃縮后過ODS柱，收集甲醇：水為7：3的洗脫液，濃縮后得到白色粉末狀結(jié)晶116mg。

二、化合物的鑒定

所得到的白色狀粉末結(jié)晶Liebermann-Burchard反應呈陽性，最終顯示紫紅色，說明其為三萜類化合物。

參見圖1～5，IR顯示有羥基吸收(3429cm^-1)，羰基吸收(1705cm^-1)，雙鍵吸收(1632cm^-1)。高分辨質(zhì)譜給出分子式C₄₇H₇₄O₁₇，[M+Na]⁺:910.4930，根據(jù)分子式計算出該分子的不飽和度為11。該化合物通過酸水解，衍生化后用TLC和HPLC分析并與糖標準品的衍生物對照，證明其糖單元為D-木糖和D-葡萄糖。參見表1，¹³C-NMR譜中共顯示47個碳信號，其中17個歸屬為糖，剩下30個碳信號提示可能為三萜苷元。參見表1，¹H-NMR譜中顯示有6個角甲基信號[δ_H0.87,1.05,1.06,1.08,1.24,1.25(3H,s)]。一組末端雙鍵(δ_C153.5,C-20；δ_H5.05,δ_C113.0,C-29)，一組三取代雙鍵(δ_H5.46,δ_C127.8,C-12；δ_C137.7,C-13)，一個酯羰基(δ_C176.4,COOR-28)，一個木糖的端基質(zhì)子信號(δ_H4.81,δ_C106.0,CH-Xyl-1)和兩個葡萄糖的端基質(zhì)子信號(δ_H5.34,δ_C106.1,CH-Glc-1；δ_H6.28,δ_C96.1,CH-Glc-1)，其耦合常數(shù)為5.6、7.2和8.0提示D-木糖和D-葡萄糖均為β-構(gòu)型。以上信息提示該化合物可能為同時具有羧基和羥基的環(huán)外雙鍵烏蘇烷型三萜皂苷。與已知化合物3β-hydroxyurs-12,19(29)-dien-28-oic acidβ-D-glucopyranosylester比較碳譜數(shù)據(jù)，兩者化學位移很相似，區(qū)別在于該化合物多了個糖側(cè)鏈。

參見圖6，HMBC譜顯示烯氫δ_H5.46(1H,br s,H-12)與δ_C24.1(C-11)、δ_C43.0(C-14)和δ_C47.4(C-18)均有遠程相關(guān)，末端烯氫δ_H5.05(2H,br d,7.6Hz,H-29)與δ_C47.4(C-18)和δ_C37.5(C-20)均有遠程相關(guān)，提示兩個雙鍵分別處于C-12與C-13和C-19與C-29之間。端基氫質(zhì)子δ_H4.81(d,J＝5.6Hz,CH-Xyl-1)與δ_C89.1(C-3)有遠程相關(guān)，而且C-3的化學位移偏向低場提示糖側(cè)鏈連接在C-3位上。糖側(cè)鏈的連接方式可以通過δ_H5.34(d,J＝7.2Hz,CH-Glc-1)與δ_C83.2(Xyl-C-2)的遠程相關(guān)確定，即Glc(1→2)Xyl。

參見圖7，ROESY譜顯示其相關(guān)峰有H-C(3)/H-C(5)、H-C(5)/H-C(9)、H-C(9)/H-C(27)、H-C(20)/H-C(27)提示23-Me和27-Me處于α位，相關(guān)峰H-C(24)/H-C(25)、H-C(25)/H-C(26)提示3位氧取代、24-Me、25-Me、26-Me和30-Me處于β位。綜上確定新化合物的結(jié)構(gòu)為3-O-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃木糖基]-3β-羥基烏蘇烷-12,19(29)-二烯-28-酸-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

表2 化合物Ⅰ的¹H NMR和¹³C NMR數(shù)據(jù)(Pyridine-d₅,J＝Hz)

例2：(注射劑)

取采用上述實施例1所述方法得到的化合物1000mg，加1000ml的注射用水，用碳酸鈉調(diào)pH值至7～7.5，攪拌使溶解，除菌濾過，灌封，經(jīng)100℃15分鐘流通蒸汽滅菌，制成每支2mg/2ml的注射液供注射使用。

例3：(膠囊劑)

取采用上述實施例1所述方法得到的化合物5000mg與4000mg微晶纖維素、500mg羧甲基淀粉鈉、400mg十二烷基硫酸鈉等輔料充分混合，采用輥壓法進行干法制粒，再與適量硬脂酸鎂混勻，填充入3#空心膠囊，制成規(guī)格為100mg/粒的膠囊劑供口服使用。

例4：(片劑)

取采用上述實施例1所述方法得到的化合物5000mg與4000mg淀粉、200mg交聯(lián)PVP、300mg羧甲基淀粉鈉混合均勻，用5％PVP的75％乙醇溶液作為粘合劑，制軟材，以18目篩制粒，60℃干燥后1h，20目整粒后加入適量滑石粉，混勻，壓片，制成規(guī)格為100mg/片的片劑供口服使用。