本發(fā)明涉及植物基因工程領域，更具體的說，涉及一種與玉米籽粒發(fā)育相關的蛋白ZmNF-YA7、編碼基因及應用。

背景技術：

玉米是我國第一大種植面積的糧飼經(jīng)作物，與人類的生活、生產(chǎn)息息相關。社會的發(fā)展和人民生活水平的提高，使玉米產(chǎn)量成為剛需。因而提高種子的產(chǎn)量和質(zhì)量尤為重要。而種子的發(fā)育受到許多基因及其互作的調(diào)控，因而尋找與高產(chǎn)相關的調(diào)控因子對玉米高產(chǎn)育種具有重要的理論意義和應用價值。

種子籽粒的發(fā)育受到眾多基因的調(diào)控，形成一個復雜的調(diào)控網(wǎng)絡，其中轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮重要的功能。玉米種子主要由胚和胚乳構(gòu)成，分別占干重的10％和90％，因此胚和胚乳的正常發(fā)育是決定玉米產(chǎn)量和品質(zhì)的關鍵因素。籽粒大小直接影響產(chǎn)量，因此對調(diào)控籽粒大小相關基因進行研究，在作物遺傳改良方面將為高產(chǎn)育種提供理論依據(jù)和新的基因資源。種子大小是一個復雜的農(nóng)藝性狀，通常由一系列基因或QTLs位點調(diào)控，這些功能基因參與調(diào)節(jié)胚、胚乳、種皮的發(fā)育過程，種子的大小和產(chǎn)量。因此近年來對控制作物種子大小的研究成為科學研究的熱點。經(jīng)過多年研究，對控制作物種子大小的研究已經(jīng)獲得了許多重要的結(jié)果，但目前已發(fā)現(xiàn)的調(diào)控種子大小發(fā)育的基因數(shù)量仍相對較少。

NF-Y是一種真核生物中廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子，能夠特異性的結(jié)合CCAAT-box，而CCAAT-box作為一種順式元件存在于大約1/4的真核生物基因啟動子中。NF-Y是一個三聚體，它包括NF-YA(CBF-B或HAP2)，NF-YB(CBF-A或HAP3)，NF-YC(CBF-C或HAP5)。NF-Y作為保守的轉(zhuǎn)錄因子 在植物的生長發(fā)育和對逆境脅迫響應中扮演著重要的角色。有研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)擬南芥中的NF-YA參與逆境下開花的誘導(Xu et al.,2013)。NF-YA作為三聚體最為重要的組成因子，在結(jié)構(gòu)上它有富含谷氨酰胺和色氨酸或蘇氨酸的氮末端，包括一個NF-YB/NF-YC結(jié)合域以及一個DNA結(jié)合域，而這兩個結(jié)合域是NF-YA的保守域。研究表明NF-YA可以響應各種非生物脅迫而上調(diào)表達，NF-YA過表達株系會變得矮小，但這種植株對ABA逆境脅迫信號變得極為敏感，從而使耐受非生物脅迫的能力提高(Li et al.,2008)。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明從玉米中分離了一個NF-YA類轉(zhuǎn)錄因子ZmNF-YA7，并對其功能進行了研究，表明該基因受干旱、高鹽等逆境的下調(diào)表達，并參與了玉米籽粒大小的發(fā)育調(diào)控，影響籽粒的千粒重，在提高籽粒產(chǎn)量中具有重要作用。

本發(fā)明所提供的蛋白，名稱為ZmNF-YA7，來源于玉米B73，屬NF-YA類轉(zhuǎn)錄因子。

本發(fā)明采用cDNA文庫PCR擴增的方法，獲得了ZmNF-YA7基因的編碼(coding sequence，CDS)序列。ZmNF-YA7基因的全長cDNA序列包含1639bp，CDS序列903bp(序列1)，編碼300個氨基酸(終止子未計入，序列2)。

本發(fā)明所克隆的ZmNF-YA7基因產(chǎn)物在細胞核中表達(圖1)。

本發(fā)明所克隆的ZmNF-YA7基因在逆境條件下受誘導上調(diào)表達，如高鹽、干旱、ABA等逆境條件均可誘導其表達(圖2)。

本發(fā)明把ZmNF-YA7基因構(gòu)建到植物表達載體上，啟動子為Ubiqutin，得到過表達質(zhì)粒pUBI:NF-YA7(圖3)，將其轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105中，用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米并獲得了轉(zhuǎn)基因植株。把轉(zhuǎn)基因純系植株與未轉(zhuǎn)基因的野生型植株在正常生長條件下進行比較，轉(zhuǎn)基因結(jié)果表明ZmNF-YA7直接調(diào)控玉米籽粒的大小(圖4)，說明ZmNF-YA7參與了玉米籽粒發(fā)育的調(diào)控。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例中的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。附圖中：

圖1為ZmNF-YA7蛋白的亞細胞定位圖；圖1(A)為細胞核染料染色與綠色熒光蛋白的對比結(jié)果，圖1(B)為空白對照組與混合顯示的對比結(jié)果；

圖2為ZmNF-YA7蛋白在逆境條件下的表達結(jié)果圖；圖2(A)、2(B)、2(C)分別為高鹽、ABA處理、干旱條件的表達結(jié)果圖；

圖3為pUBI:NF-YA7表達載體圖譜；

圖4為轉(zhuǎn)基因玉米的表型結(jié)果圖；圖4(A)為對照組、4(B)為實驗組。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。

實施例1 玉米ZmNF-YA7基因cDNA的克隆

以玉米B73的cDNA文庫為模板進行RT-PCR擴增，PCR引物如下：

ZmNF-YA7F：5′-ATGCCTGTGATTTTACGGGAAATG-3′；

ZmNF-YA7R：5′-TTACCTTATGGTGGAAACACGCTG-3′。

擴增條件如下：

擴增出的DNA片段從瓊脂糖膠中回收，克隆至pEASY-T1載體。酶切并測序鑒定，命名為pTNFYA7，測序結(jié)果表明：得到CDS為序列1所示的基因，將該基因命名為ZmNF-YA7，全長903bp，具體序列如下：

ATGCCTGTGATTTTACGGGAAATGGAGGATCATTCTGTCCATCCCATGTCTAAGTCTA ACCACGGCTCCTTGTCAGGAAATGGTTACGAGATGAAACATTCAGGCCATAAAGTTTGCGATAGGCATTCATCATCGGAGTCTGATCGGTCTCACCAAGAAGCATCAGCAGCAAGTGAAAGCAGTCCAAATGAACACACATCAACTCAATCAGACAATGATGAAGATCATGGGAAAGATAATCAGGACACAATGAAGCCAGTATTGTCCTTGGGGAAGGAAGGCTCTGCCTTTTTGGCCCCAAAATTACATTACAGCCCATCTTTTGCTTGTATTCCTTATACTGTTGATGCTTATTATAGTGGGGTTGGGGTCTTGACAGGATATGCTCCACATGCCATTGTCCATCCCCAGCAAAATGATACAACGAACACTCCGGGTATGTTACCTGTGGAACCTGCAGAAGAACCAATATATGTTAATGCAAAACAATACCATGCAATCCTTAGGAGGAGGCAAACACGTGCTAAATTGGAGGCCCAGAACAAGATGGTGAAAAATCGGAAGCCATATCTTCATGAGTCCCGACATCGTCATGCCATGAAACGGGCTCGTGGATCAGGAGGACGGTTCCTCAACACAAAGCAGCTCCAGGAGCAGAACCAGCAGTATCAGGCATCGAGTGGTTCATTGTGCTCAAAGATCATTGGCAACAGCATAATCTCCCAAAGTGGCCCCACCTGCACGCCCTCTTCTGGCACTGCAGGTGCTTCAACAGCCTGCCAGGACCGCAGCTGCTTGCCCTCAGTTGGCTTCCGCCCCACAACGAACTTCAGTGACCAAGGTCGAGGAGGCTTGAAGCTGGCCGTGATCGGCATGCAGCAGCGTGTTTCCACCATAAGGTAA

其編碼的蛋白的氨基酸序列如序列2所示，編碼300個氨基酸(末端終止子未計入，即序列中***號未計入)，其編碼的蛋白的氨基酸序列如下：

實施例2 玉米ZmNF-YA7亞細胞定位分析

轉(zhuǎn)錄因子的特征之一是定位于細胞核中，并在細胞核中執(zhí)行其轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。為此，利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法在玉米原生質(zhì)體中對玉米ZmNF-YA7蛋白的亞細胞定位進行了研究。

2.1載體構(gòu)建：

利用引物pRTL2-NFYA7-F:

5′-CTCGAGGGATCCCC ATGCCTGTGATTTTACGGGAAATG-3′；

pAS2-NFYA7-R:

5′-TGCAGGTCGACGGATCCCC CCTTATGGTGGAAACACGCTG-3′；

擴增出ZmNF-YA7編碼區(qū)片段，通過GBclonart無縫克隆技術將帶有同源臂的ZmNF-YA7重組到pRTL2載體中，與GFP形成融合蛋白，由35S啟動子驅(qū)動表達。

2.2玉米葉片原生質(zhì)體的制備：

待玉米長到3片葉子時，選完整無傷害的第二片葉子，剪取中部生長良好的葉片用刀片切成0.5mm寬的葉條。將切好的葉條放入預先配置好的酶解液(1.5％CellμLase R10,0.4％macerozyme R10,0.4M mannitol,20mM KCl,20mM MES,pH 5.7,10mM CaCl₂,and 0.1％BSA)中(每5-10ml酶解液大約需10-20片葉子)。并用鑷子幫助使葉子完全浸入酶解液，50轉(zhuǎn)/分鐘，震蕩條件下酶解5～7h。

2.3原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化：

1)100g離心10分鐘使原生質(zhì)體沉淀在管底，然后用適量MMG溶液(0.4M mannitol,15mM MgCl₂,and 4mM MES,pH 5.7)重懸原生質(zhì)體，使之最終濃度在2×10⁵個/ml。

2)每100μl原生質(zhì)體加入10μl DNA(10微克約5-10kb的質(zhì)粒DNA)至2ml離心管中，輕柔混合。

3)加入等體積110μl PEG溶液(40％PEG[v/v],0.2M mannitol,and 0.1M CaCl₂)，輕柔拍打離心管完全混合。誘導轉(zhuǎn)化混合物10分鐘。

4)100g離心2分鐘去除上清后，用1ml WI溶液(0.5M mannitol,20mM KCl，4mM MES,pH5.7)輕柔重懸原生質(zhì)體。

5)室溫下(20-25℃)誘導原生質(zhì)體14小時以上。在誘導12小時的時候取一部分原生質(zhì)體用5mg/ml核染料Hoechst33342(CalBiochem)染色0.5～2h。以上所有操作均在室溫下進行。

2.4 GFP表達情況觀察：

在激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP表達，結(jié)果表明，ZmNF-YA7定位于細胞核中，表明該基因為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。圖1示出了ZmNF-YA7蛋白的亞細胞定位情況；圖1(A)為細胞核染料染色與綠色熒光蛋白的對比結(jié)果，圖1(B)為空白對照組與混合顯示的對比結(jié)果，如圖1(A)所示，ZmNF-YA7-GFP(綠色熒光蛋白，上部)的顯示位置與細胞核染料Hochest的染色結(jié)果(藍色，下部)重疊，相互印證。

實施例3 ZmNF-YA7在非生物逆境條件下的表達分析

3.1玉米材料的處理：

取玉米種子，經(jīng)10％H₂O₂表面消毒，無菌水清洗3遍之后，吸脹6h，然后置于兩層濾紙上，28℃黑暗中萌發(fā)兩天之后，將出芽一致的小苗種植于花盆蛭石中，白天28℃，夜間24℃，14h/10h光周期培養(yǎng)至出兩片完整葉子，再轉(zhuǎn)移置1/2Hoagland培養(yǎng)液中，一天后轉(zhuǎn)移至全營養(yǎng)Hoagland繼續(xù)培養(yǎng)，待長出三葉一芯，進行不同條件的處理。

1)PEG模擬旱處理：將玉米苗置于含16％PEG的培養(yǎng)液中，白天28℃，夜間24℃，14h/10h光周期培養(yǎng)，分別在0h，4h，12h，24h，48h和15天時，取根，用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2)ABA處理：將玉米苗置于50μM的ABA溶液中，與上面相同條件培養(yǎng)，分別在0h，4h，12h，24h，48h和15天時，取根，用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3)鹽處理：分別將玉米苗置于125mM的NaCl溶液中，與上面相同條件培養(yǎng)，分別在0h，4h，12h，24h，48h和15天時，取根，用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4)對照的處理：直接取未經(jīng)任何處理的苗-80℃凍存，作為對照。

3.2 RNA的提取及DNA的去除：

①取約200mg處理的玉米材料，液氮研磨，用Trizol試劑(Invitrogen)提取RNA。

②將RNA溶于85μl水中，加入10×buffer 10μl和5μlRQ1 RNA Free DNase(1U/μl)，37℃，15min，以去除DNA的污染。

③加入100μl的酚氯仿抽提一次，取上清，用等體積的異丙醇沉淀RNA，70％的乙醇洗一次，溶于50μl的水中。

④定量RNA的濃度為1μg/μl。

3.3 RT-qPCR：

按照Promega公司的GoScript^TM Reverse Transcription System(Promega A5000)進行RT-qPCR，反應程序如下：

1)依次加入以下試劑進行反應：

2)上述反應完成后，在反應體系中繼續(xù)加入以下試劑：

3)再繼續(xù)加入1μl M-MLV(200u/μl)；42℃，50min；70℃，15min 滅活，備用。

將得到的cDNA稀釋3倍作為熒光定量PCR的模板。玉米TubμLin5基因(GRMZM2G099167_T01)作為內(nèi)參。引物設計如下：

ZmTub5FW：5′-CTCACGCATCGACCACAAG-3′；

ZmTub5RV：5′-CTTCCATACCCTCACCGACA-3′。

熒光定量用promega公司的GoqPCR Master Mix在ABI 7500上采用兩步法進行：

①qPCR反應體系如下：

②PCR條件如下：

采用2^-ΔΔCt法計算不同處理條件下ZmNF-YA7的表達量。圖2示出了ZmNF-YA7蛋白在逆境條件下的表達結(jié)果；圖2(A)、2(B)、2(C)分別為高鹽、ABA處理、干旱條件的表達結(jié)果圖，結(jié)果表明ZmNF-YA7基因受高鹽誘導在4h內(nèi)上調(diào)表達，之后開始下降到初始水平(圖2A)；受ABA誘導，到48h時根中表達上升到最高，之后降至初始水平(圖2B)；受干旱誘導，處理植株根中ZmNF-YA7基因表達在4h快速升高，這種上調(diào)表達一直持續(xù)到48h，之后逐漸減弱，至15d，恢復到初始水平(圖2C)。

實施例4 pUBI:NF-YA7表達載體的構(gòu)建

1)設計擴增ZmNF-YA7CDS全長的引物，在引物兩端各加20nt載體同 源序列，

ZmNF-YA7F：

5′-GCGTGGATCCGAGCTCACATGCCTGTGATTTTACGGGAAATG-3′；

ZmNF-YA7R：

5′-GTCACCTGTAATTCACACCCTTATGGTGGAAACACGCTG-3′。

以pTNFYA7質(zhì)粒為模板，進行PCR擴增；

2)擴增產(chǎn)物進行回收，回收后產(chǎn)物和改造過的pCAMBIA3301m進行重組反應，所用試劑為GBclonart Seamless Cloning Kit，反應體系如下：

3)酶切鑒定陽性克隆，陽性克隆即為pUBI:NF-YA7載體。將陽性克隆進行測序驗證，獲得陽性質(zhì)粒如圖3所示，用于后續(xù)實驗。

實施例5 pUBI:NF-YA7轉(zhuǎn)基因玉米的獲得

5.1農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及玉米轉(zhuǎn)化：

將實施例4中獲得的植物表達載體pUBI:NF-YA7其轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105中。玉米轉(zhuǎn)化方法參照Frame et al.,進行。

5.2轉(zhuǎn)基因玉米PCR檢測：

正向引物：ZmNF-YA7FW:5’-ACCAGCAGTATCAGGCATCGAG-3’

反向引物：NOS 70:5’-CCGGCAACAGGATTCAATCTTA-3’

1)反應體系如下：

2)反應條件如下：

篩選出PCR陽性植株。

5.3轉(zhuǎn)基因玉米Basta葉面噴灑檢測及純系的獲得：

待PCR陽性植株長至5-6片葉時，用1000倍稀釋的Basta噴施，每周一次，連續(xù)噴施3周后觀察植株存活情況，存活的陽性苗連續(xù)自交篩選兩代，獲得T2代純系，種植觀察表型。

實施例6 pUBI:NF-YA7轉(zhuǎn)基因玉米表型分析

將轉(zhuǎn)空載體對照及過表達NF-YA7基因的轉(zhuǎn)基因玉米各選取三個純系種植，圖4示出了轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)表型結(jié)果圖，圖4(A)為對照組、4(B)為實驗組，如圖4所示，轉(zhuǎn)基因玉米與對照相比過表達NF-YA7的植株籽粒較對照顯著變小，表明過表達ZmNF-YA7參與玉米籽粒發(fā)育調(diào)控。

顯然，上面描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動的前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。