本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，特別是可用于宮頸癌的早期篩查和臨床輔助診斷的多肽、包含該多肽的檢測器件的檢測試劑盒。

背景技術(shù)：

抗原－抗體檢測是免疫檢測的常用檢測方法。大量研究表明，血清或血漿中的腫瘤相關(guān)抗原能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生自身抗體，在眾多患者血清中既存在腫瘤抗原，也存在針對該腫瘤抗原的白身抗體。因此，既可以利用抗體檢測腫瘤抗原，也可以利用抗原檢測腫瘤抗原的自身抗體，但利用腫瘤自身抗體檢測腫瘤的特異性和敏感性均比利用腫瘤抗原檢測腫瘤要高得多。很多腫瘤相關(guān)抗原不僅在腫瘤患者體內(nèi)存在，在正常人體內(nèi)也存在，因此檢測腫瘤相關(guān)抗原作為診斷依據(jù)可信性差。而腫瘤白身抗體在正常人體內(nèi)含量很低檢測不到或根本不存在，若體內(nèi)腫瘤白身抗體水平明顯增高，則表明體內(nèi)存在異常免疫情況，表明體內(nèi)相關(guān)抗原水平發(fā)生波動，預(yù)示疾病的存在或原有疾病加重。

近年來的研究表明，在惡性腫瘤體積發(fā)展到可用現(xiàn)代影像學(xué)技術(shù)檢出之前3-5年，患者血中可出現(xiàn)高濃度的腫瘤相關(guān)抗原自身抗體。因此，檢測血中腫瘤相關(guān)抗原自身抗體具有預(yù)測腫瘤發(fā)病風(fēng)險和早期診斷腫瘤的重要價值。是腫瘤臨床診斷領(lǐng)域的重點(diǎn)發(fā)展方向之一。在國外已有診斷肺癌和乳腺癌的早期診斷試劑盒市售。然而，目前所報道的自身抗體檢測方法敏感度低，特異性差，假陰性比率可高達(dá)50％以上。其主要原因是由于每一種腫瘤相關(guān)抗原自身抗體在癌癥患者中的陽性檢測率平均在10％左右。如何提高診斷試劑敏感度是當(dāng)前需要函待解決的關(guān)鍵問題。比較行之有效的方法是尋找新的可充當(dāng)腫瘤標(biāo)志物的自身抗原，然后與現(xiàn)有己知的腫瘤相關(guān)抗原自身抗體組合成具有敏感度高和特異性強(qiáng)的診斷試劑盒。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種多肽、包含該多肽的檢測器件、以及包含該檢測器件的檢測試劑盒，它們對宮頸癌的早期篩查和臨床輔助診斷有用的。本發(fā)明目的在于提供該多肽在制備可用于宮頸癌臨床輔助診斷的檢測試劑盒中的用途。

即，本發(fā)明包含下述技術(shù)方案：

1.一種多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，即PRSEPDTGNPCHT TKLLHRD。

2.一種檢測器件，其包括：

固體載體，以及

連接于該固體載體上的權(quán)利要求1所述的多肽。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測器件，其中，所述固體載體是iPDMS薄膜。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測器件，其用于宮頸癌的早期篩查和臨床輔助診斷。

5.一種檢測試劑盒，其包括權(quán)利要求2-4中任一項所述的檢測器件。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測試劑盒，其用于宮頸癌的早期篩查和臨床輔助診斷。

7.權(quán)利要求1所述的多肽在制備檢測試劑盒中的用途。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其中，所述檢測試劑盒用于宮頸癌的早期篩查和臨床輔助診斷。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其中，所述檢測試劑盒包括權(quán)利要求2-4中任一項所述的檢測器件。

將本發(fā)明應(yīng)用于宮頸癌的早期篩查和臨床輔助診斷，能夠取得令人滿意的效果。

附圖說明

圖1 iPDMS薄膜的制作過程進(jìn)行說明的示意圖。

圖2說明多肽微陣列點(diǎn)樣模式的示意圖。

圖3是顯示對健康正常人或非宮頸癌病人血清進(jìn)行檢測的結(jié)果的照片。

圖4是顯示對宮頸癌病人血清進(jìn)行檢測的結(jié)果的照片。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的多肽

在另一個方面中，本發(fā)明提供對宮頸癌的早期篩查和臨床輔助診斷有用的多肽，由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列構(gòu)成，即：PRSEPDTGNPCH TTKLLHRD。如實(shí)施例所示，本發(fā)明的多肽對宮頸癌病人的血清呈陽性反應(yīng)，而對健康正常人或非宮頸癌病人血清呈陰性反應(yīng)。因此，本發(fā)明的多肽作為宮頸癌的早期篩查和臨床輔助診斷工具是有用的。本發(fā)明的多肽可以用于制造可用于宮頸癌的早期篩查和臨床輔助診斷的檢測器件(例如下述的本發(fā)明的檢測器件)或檢測試劑盒(例如下述的本發(fā)明的檢測試劑盒)。

本發(fā)明的多肽可以適宜采用(1)化學(xué)合成方法、或(2)酶反應(yīng)合成方法等公知方法來獲得，但不限于此，其中化學(xué)合成更為簡便。在化學(xué)合成本發(fā)明的多肽情況下，通過使用肽合成儀合成或者半合成該多肽來進(jìn)行。作為化學(xué)合成方法，可以列舉出例如肽固相合成法等。這樣合成的肽可以采用常規(guī)手段例如離子交換色譜、反相高效液體色譜、親和色譜等進(jìn)行純化。這樣的肽固相合成方法以及其后的肽純化都是本技術(shù)領(lǐng)域公知的。

此外，在通過酶反應(yīng)生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的情況下，可以采用例如國際公開小冊子WO2004/011653號所述的方法。即，可以這樣來生產(chǎn)：將一方的氨基酸或二肽的羧基末端被酯化或酰胺化而得到的氨基酸或二肽、與氨基酸處于游離狀態(tài)的氨基酸(例如羧基保護(hù)的氨基酸)在肽合成酶的存在下進(jìn)行反應(yīng)，生成的二肽或三肽。作為肽合成酶，可以列舉出：具有生成肽的能力的微生物的培養(yǎng)物、由該培養(yǎng)物分離的微生物菌體、或該微生物的菌體處理物、或該微生物來源的肽合成酶。

而且，除了上述的酶方法、化學(xué)合成方法以外，還可以采用例如基因工程方法來生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。

本發(fā)明的多肽的氨基酸序列可以采用常規(guī)的方法進(jìn)行分析和確認(rèn)，例如可以利用質(zhì)譜、色譜等方法來進(jìn)行分析和確認(rèn)。

本發(fā)明的檢測器件

在另一方面中，本發(fā)明還提供一種檢測器件(本發(fā)明的檢測器件)，其包 括固體載體、以及連接于該固體載體上的本發(fā)明的蛋白質(zhì)或本發(fā)明的多肽。所述檢測器件對于宮頸癌的早期篩查和臨床輔助診斷是有用的。

在本發(fā)明中，對固體載體沒有特殊限制，只要是作為固體或不溶性材料(例如是可以通過過濾、沉淀、磁性分離等從反應(yīng)混合物中分離的材料)的載體即可。

構(gòu)成固體載體的材料包括但不限于：硅膠(聚二甲基硅氧烷，PDMS)、纖維素、特氟隆TM、硝基纖維素、瓊脂糖、葡聚糖、殼聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚丙烯、尼龍、聚偏二氟乙烯、膠乳、二氧化硅、玻璃、玻璃纖維、金、鉑、銀、銅、鐵、不銹鋼、鐵氧體、硅晶片、聚乙烯、聚乙烯亞胺、聚乳酸、樹脂、多糖類、蛋白(白蛋白等)、碳或它們的組合等。

固體載體的形狀包括但不要限于：珠子、磁珠、薄膜、微細(xì)管、濾膜、板、微量板、碳納米管、傳感器芯片等。正如本技術(shù)領(lǐng)域公知的那樣，薄膜或板等平坦的固體載體上可以設(shè)置凹坑、溝槽、濾膜底部等。

在本發(fā)明中，磁珠可以具有約25nm-約1mm范圍的球體直徑。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，磁珠具有約50nm-約10μm范圍的直徑。磁珠的尺寸可以根據(jù)特定的用途來進(jìn)行選擇。

在本發(fā)明中，由Sepharose等高交聯(lián)球形瓊脂糖制成的珠子具有約24μm-約165μm范圍的直徑。優(yōu)選地，高交聯(lián)球形瓊脂糖珠具有約24μm-約44μm范圍的直徑。高交聯(lián)球形瓊脂糖珠的尺寸可以根據(jù)特定的用途來進(jìn)行選擇。

具有疏水性表面的固體載體的例子包括可從Polysciences，Warrington，PA或Spherotech，Liberville，IL購買的制品等聚苯乙烯膠乳珠。

二氧化硅(SiO₂)-處理或二氧化硅(SiO₂)基的固體載體的例子包括可從Polysciences，Warrington，PA購買的超常磁性二氧化硅珠等，其可以用于捕捉核酸(例如DNA)?；蛘?，還可以使用可從Dynal Biotech購買的M-280等。

具有親水性表面的磁珠可用于捕捉增殖期的細(xì)菌細(xì)胞、核酸以及其它成分。作為該磁珠的例子，可以列舉出Polysciences，Warrington，PA銷售 的珠子(名稱：Biomag(注冊商標(biāo))羧基)、或者Bangs Laboratory，Inc.，F(xiàn)ishers，IN的名稱為MC0₂N/2928的珠子?；蛘撸梢允褂肈ynal Biotech銷售的M-270等。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方式中，所述固體載體是SJ改性硅膠，其是蘇州偲聚生物材料有限公司開發(fā)的一種硅橡膠材質(zhì)的微陣列固體支撐材料(iPDMS薄膜，參見中國專利公開CN101265329A)。這種材料是以生物學(xué)研究常用的PDMS為基礎(chǔ)，在其中加入特定的引發(fā)劑成分(使該材料可通過表面引發(fā)聚合反應(yīng)(SIP)實(shí)現(xiàn)表面功能化修飾)，再經(jīng)過聚乙二醇甲基丙烯酸酯(poly(oligo(ethylene glycol)methacrylate)，POEGMA)表面修飾獲得的。SJ改性硅膠具有優(yōu)秀的抗蛋白質(zhì)非特異性吸附(Nonspecific protein adsorption，NPA)能力，可以將復(fù)雜蛋白免疫檢測中的非特異性蛋白質(zhì)吸附控制到接近“絕對0”水平(接近或低于儀器的檢測極限)，不僅可以免除封閉和多次清洗的麻煩，還可以通過使用更強(qiáng)的信號擴(kuò)增手段來提高蛋白質(zhì)微陣列的靈敏性。而且其硅橡膠的本質(zhì)賦予了該材料較強(qiáng)的機(jī)械性能和良好的可操作性。蘇州偲聚已經(jīng)成功地將SJ改性硅膠應(yīng)用于11個腫瘤標(biāo)志物組成的多指標(biāo)聯(lián)檢微陣列ELISA試劑盒，實(shí)現(xiàn)了高通量和高靈敏的檢測，證明了這種材料是一種優(yōu)秀的蛋白質(zhì)微陣列固體支撐材料。同時，這種材料還具有表面性質(zhì)可調(diào)的特性，可以通過控制修飾反應(yīng)時間在一定范圍內(nèi)調(diào)整其表面形貌。

本發(fā)明的多肽與固體載體的連接可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多肽與固體載體的連接方法來進(jìn)行。例如，對于蛋白質(zhì)/多肽與改性硅膠表面的連接而言，可以通過1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺[1-ethyl-3-(3-dimethyl ami-nopropyl)carbodiimide，EDC]和N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)的反應(yīng)將改性硅膠表面高分子鏈上的羧基(-COOH)基團(tuán)改為活化基團(tuán)，該活化基團(tuán)可與蛋白/多肽上所帶的氨基(-NH2)反應(yīng)從而實(shí)現(xiàn)將蛋白/多肽固定于固體載體表面(參見例如Hongwei Ma，Yuanzi Wu,Xiaoli Yang,Xing Liu,Jian’an He,Long Fu,Jie Wang,Hongke Xu,Yi Shi and Renqian Zhong,Integrated poly(dimethysiloxane)with an intrinsic nonfouling property approaching“Absolute”zero background in immunoassays,Anal.Chem.,82,6338–6342,2010)。

對于點(diǎn)樣時使用的點(diǎn)樣液中本發(fā)明的多肽的濃度沒有特殊限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以依常規(guī)選擇，優(yōu)選為1μg-1000μg/mL，更優(yōu)選10μg-500μg/mL。此外，對于本發(fā)明的多肽在固體載體上分布的密度沒有特殊限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以依常規(guī)選擇，優(yōu)選為1-100點(diǎn)/10mm²，更優(yōu)選5-50點(diǎn)/10mm²。

本發(fā)明的檢測器件對于宮頸癌的早期篩查和臨床輔助診斷是有用的，或者其可以用于制造可用于宮頸癌的早期篩查和臨床輔助診斷的檢測試劑盒。

本發(fā)明的檢測試劑盒

在另一個方面中，本發(fā)明還提供一種檢測試劑盒(本發(fā)明的檢測試劑盒)，其包括本發(fā)明的檢測器件。該檢測試劑盒可用于宮頸癌的早期篩查和臨床輔助診斷。

本發(fā)明的檢測試劑盒必須包含本發(fā)明的檢測器件。本發(fā)明的檢測試劑盒還可以包括：

1.配好的血清樣本稀釋液或血清樣本稀釋液組分溶液：樣本稀釋液，例如有北京賽馳生物科技有限公司的樣本稀釋液(產(chǎn)品編號070021-S2)、鄭州博威嘉生物科技有限公司的加樣變色樣本稀釋液(產(chǎn)品編號bwj010103)等。該類樣本稀釋液為含BSA、蔗糖等成分的PBS溶液，含防腐劑，澄清液體，可直接使用。該樣本稀釋液用來稀釋血清，試劑盒檢測的血清要稀釋適當(dāng)倍數(shù)，例如2-200倍，優(yōu)選10-100倍。

本發(fā)明的檢測試劑盒還可以包括：

2.濃縮洗液及洗液：固體載體表面孵育血清及酶標(biāo)二抗后，需用洗液清洗掉固體載體表面未結(jié)合的抗體和酶標(biāo)二抗。濃縮洗液例如是1％的吐溫20水溶液，使用時需稀釋2-40倍、優(yōu)選5-20倍?？梢酝ㄟ^將濃縮洗液(10×)用純化水或蒸餾水按1:9稀釋，來配置洗液。例如，450mL純化水或蒸餾水中加入50mL濃縮洗液(10×)，充分混勻。未使用完的洗液放在2-8℃保存,可保存3個月。

本發(fā)明的檢測試劑盒還可以包括：

3.酶標(biāo)二抗溶液：人宮頸癌者血清中的IgM可與固體載體(例如SJ改性硅膠)上的本發(fā)明的多肽結(jié)合，酶標(biāo)二抗可與抗體結(jié)合，而酶標(biāo)二抗上的標(biāo) 記物可與發(fā)光底物混合溶液反應(yīng)，從而發(fā)出可檢測的光。酶標(biāo)二抗可以是例如辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgM。對酶標(biāo)二抗在酶標(biāo)二抗溶液中的濃度沒有特殊限制，可以是例如1ng-1000ng/mL。

本發(fā)明的檢測試劑盒還可以包括：

4.發(fā)光底物混合溶液：發(fā)光底物混合溶液可與酶標(biāo)二抗上標(biāo)記的辣根過氧化物酶反應(yīng)，使得反應(yīng)發(fā)出儀器可檢測到的化學(xué)光，發(fā)光底物混合溶液包括發(fā)光底物液A—過氧化氫溶液，及發(fā)光底物液B—發(fā)光氨(魯米諾)溶液。使用時預(yù)先采用兩種發(fā)光底物液體以等體積混合而成，得到發(fā)光底物混合溶液(45分鐘內(nèi)使用)。發(fā)光氨只有用氧化劑處理過才會發(fā)光。通常使用雙氧水和一種氫氧化物堿的混合水溶液作為激發(fā)劑。在辣根過氧化物酶催化下，雙氧水分解為氧氣和水：

2H₂O₂→O₂+2H₂O

魯米諾與氫氧化物反應(yīng)時生成了一個雙負(fù)離子，它可被過氧化氫分解出的氧氣氧化，產(chǎn)物為一個有機(jī)過氧化物。該過氧化物很不穩(wěn)定，立即分解出氮?dú)猓杉ぐl(fā)態(tài)的3-氨基鄰苯二甲酸。激發(fā)態(tài)至基態(tài)轉(zhuǎn)化中，釋放的能量以光子的形式存在，波長位于可見光的藍(lán)光部分。發(fā)光底物混合溶液的例子例如Thermo Seientific公司的ELISA Femto Maximum Sensitivi-ty Substrate，貨號37074。

本發(fā)明的檢測試劑盒還可以包括：

5.一個或兩個以上的反應(yīng)腔體，根據(jù)需求可以采用例如雙面的生物孵育反應(yīng)器，中國專利ZL 201120177686.3或者ZL201110142518.5；或者單面的生物孵育反應(yīng)器ZL201220430886.x。

本發(fā)明的檢測試劑盒還可以包括：

6.其他用于檢測宮頸癌的檢測分子(例如多肽、蛋白質(zhì)、核酸等)。

本發(fā)明的檢測試劑盒還可以包括：

7.使用說明書，其中記載了該檢測試劑盒可以用于宮頸癌的早期篩查和臨床輔助診斷。

反應(yīng)器件和反應(yīng)試劑盒可以例如采用凝膠成像儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光成像。作為凝膠成像儀，可以采用例如GE LAS4000mini型或天能5500型微陣 列成像儀。

實(shí)施例

以下，通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更具體的說明，但并不是對本發(fā)明技術(shù)范圍的限定。通過本說明書的記載，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易的對本發(fā)明進(jìn)行修飾/改變，這些包含在本發(fā)明的技術(shù)范圍內(nèi)。本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求書確定。

1.多肽制備與確認(rèn)

實(shí)施例中使用的多肽具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，由成都凱捷生物醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司合成，該多肽的表征可通過氫譜和質(zhì)譜確認(rèn)合成了所述多肽。液相色譜法檢測純度:95.36％(面積歸一法)：質(zhì)譜法檢測(ESI-MS):計算分子量：2274.5，測試值2274.0。

2.檢測器件的制備

檢測芯片是以SJ改性硅膠(iPDMS薄膜)為固體支撐材料，在其上通過點(diǎn)樣固定多肽溶液制備而成。改性硅膠是在傳統(tǒng)的聚二甲基硅氧烷材料中加入帶烯烴末端的、表面引發(fā)聚合反應(yīng)的引發(fā)劑，并通過熱交聯(lián)(硅氫鍵鍵合)固定到聚二甲基硅氧烷的三維結(jié)構(gòu)中，得到SJ改性硅膠，其制作過程如圖1所示。

其中的A和B為聚二甲基硅氧烷的兩個組分，聚二甲基硅氧烷(Poly(dimethylsiloxane)，Sylgard 184)購買自美國道康寧(DowCorning)公司，包含液態(tài)組分A(成分為金屬鉑催化劑與帶乙烯基的二甲硅氧烷高分子前體混合物)和交聯(lián)劑B(成分為帶有乙烯基和Si-H基團(tuán)的二甲基硅氧烷前體)兩種成分。C為末端帶乙烯基的引發(fā)劑，購于杭州東偉公司。最后修飾上的高分子是寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯單體(Oligo(ethylene glycol)methacrylate，以下簡稱OEGMA，分子量Mw＝526)購買于Aldrich。將聚二甲基硅氧烷前體A和交聯(lián)劑B與帶乙烯基末端的引發(fā)劑C以A：B：C＝10：1：0.5比例充分混合。通過固化反應(yīng)制成透明的彈性硅橡膠，然后通過SIP技術(shù)進(jìn)行表面修飾即可得到SJ改性硅膠。實(shí)驗(yàn)表明，SJ改性硅膠的表面有足夠高密度的、通過共價鍵固定的引發(fā)劑，其可以通過表面引發(fā)聚合反應(yīng)(SIP) 實(shí)現(xiàn)表面高分子修飾。使用poly(OEGMA)(聚乙二醇甲基丙烯酸酯)進(jìn)行反應(yīng)獲得聚乙二醇(Polyethylene Glycol，PEG)修飾的表面，實(shí)現(xiàn)較強(qiáng)的抗蛋白非特異性吸附的能力。

制好的SJ改性硅膠薄膜需保存在4℃冰箱中。

采用PersonalArrayerTM 16個人點(diǎn)樣儀在改性硅膠上制備多肽微陣列，過程為：

1)預(yù)處理

將SJ改性硅膠薄片(15×15mm2)浸泡在活化液中，30min后取出用去離子水淋洗3次，用氮?dú)獯蹈桑R上用于點(diǎn)樣。

2)點(diǎn)樣

將點(diǎn)樣液稀釋好并轉(zhuǎn)移到384孔板相應(yīng)的微孔中，將帶樣本的384孔板置于點(diǎn)樣儀基臺上，同時將預(yù)處理的改性硅膠薄片置于點(diǎn)樣儀的基臺上，馬上進(jìn)行點(diǎn)樣。點(diǎn)樣環(huán)境條件為室溫(25℃)，濕度設(shè)定為50％。制成的多肽微陣列上每個點(diǎn)的點(diǎn)樣量約為0.6nL，樣點(diǎn)半徑為200μm。

3)化學(xué)固定

剛制好的多肽微陣列要放在恒溫恒濕箱(26℃，60％濕度)中固定至少6h。化學(xué)固定過程如下:

首先通過點(diǎn)樣儀將包含有捕獲多肽分子的緩沖液點(diǎn)在改性硅膠薄膜上，接著緩沖液開始蒸發(fā)，捕獲多肽分子與SJ改性硅膠表面親密接觸并相互作用，通過化學(xué)結(jié)合，改性硅膠表面的ploy(OEGMA)高分子的末端-COOH與多肽分子的-—NH₂形成穩(wěn)定共價鍵，進(jìn)而將有化學(xué)活性的多肽分子固定在SJ改性硅膠表面。

4)裝配

固定6h的多肽微陣列必須在兩天內(nèi)裝配好。首先通過背膠將SJ改性硅膠薄片貼在專門的反應(yīng)柱上，蓋上反應(yīng)腔體。一個反應(yīng)器由兩個反應(yīng)柱和一個反應(yīng)腔體組成。

5)保存

裝配好的多肽微陣列，需要抽真空密封，保存在4℃的冰箱中，備用。

3.用檢測器件進(jìn)行檢測

檢驗(yàn)步驟

1、開始檢測前，將濃縮洗液按1：10的比例加入純化水或蒸餾水進(jìn)行稀釋，稀釋完成后得洗液，直接使用，使用移液槍將2mL洗液加到芯片表面，浸泡芯片3分鐘，保證芯片表面被完全浸潤。

2、將待測血清樣本用樣本稀釋液按照1：40稀釋混勻。

3、棄去浸泡芯片的洗液，在芯片表面完全濕潤的狀態(tài)下，每個血清樣本吸取200μL稀釋后的血清加入到芯片反應(yīng)器內(nèi)。

4、將芯片反應(yīng)器放入芯片固定座，放到搖床上，開啟搖床，頻率150轉(zhuǎn)/分鐘，室溫孵育30分鐘。

5、棄去芯片反應(yīng)器內(nèi)的血清樣本，用15mL洗液清洗反應(yīng)腔體和芯片表面3次。

6、清洗完成后，每個芯片反應(yīng)器分別加入200μL酶標(biāo)二抗溶液，將芯片反應(yīng)器放入芯片固定座，放到搖床上，開啟搖床，頻率150轉(zhuǎn)/分鐘，室溫孵育30分鐘。

7、棄去芯片反應(yīng)器內(nèi)的酶標(biāo)二抗溶液，用15mL洗液清洗反應(yīng)腔體和芯片表面3次。

8、可預(yù)先將發(fā)光底物液A和發(fā)光底物液B以等體積混合均勻，得發(fā)光底物混合溶液(45分鐘內(nèi)使用)。待清洗完成后，取下反應(yīng)腔體，每個芯片表面分別加入15μL發(fā)光底物混合溶液，使發(fā)光底物混合溶液能均勻的鋪于芯片表面。

9、將加入了發(fā)光液的芯片置于凝膠成像儀中化學(xué)發(fā)光成像，并判讀結(jié)果。

健康正常人血清、宮頸癌病人血清及其他疾病病人血清樣本由合作醫(yī)院提供，疾病標(biāo)準(zhǔn)均經(jīng)過臨床檢驗(yàn)確證，均獲得了提供者的知情同意書。

陰性對照有PBS緩沖液(即在第3步中不用待測血清孵育，而用PBS溶液孵育，其余步驟相同)的對照，血清稀釋液的對照，及陰性血清(指健康人及非宮頸癌病人的血清)的對照。

多肽微陣列的點(diǎn)樣模式如圖2所示：其中，三角形的4個點(diǎn)的樣本為人IgG，作為定位點(diǎn)；正方形的1個點(diǎn)的樣本為PB點(diǎn)樣液，作為空白對照；圓形點(diǎn)的樣本是其他的宮頸癌自身抗原蛋白多肽，作為檢測指標(biāo)(這些多肽有 響應(yīng)說明被檢測的血清中有宮頸癌自身抗體)；星形點(diǎn)的樣本多肽為本發(fā)明的多肽，它是宮頸癌自身抗原蛋白多肽，會對宮頸癌患者血清產(chǎn)生響應(yīng)。

使用該多肽微陣列按照上述檢測步驟對宮頸癌病人血清及陰性對照進(jìn)行了檢測，響應(yīng)模式如圖3-4所示：其中，圖3顯示了陰性對照的檢測結(jié)果，只有三角形所示的點(diǎn)的樣本有響應(yīng)。圖4顯示了宮頸癌病人血清的檢測結(jié)果，三角形、圓形和星形點(diǎn)的樣本有響應(yīng)。需要說明的是，儀器測得信號值由低到高，相應(yīng)的信號點(diǎn)顏色由黑—紅—白漸變。

以上，通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更具體的說明，但并不是對本發(fā)明技術(shù)范圍的限定。通過本說明書的記載，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易的對本發(fā)明進(jìn)行修飾/改變，這些包含在本發(fā)明的技術(shù)范圍內(nèi)。

序列表

<110> 中國科學(xué)院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所

<120> 用于檢測宮頸癌的多肽、檢測器件和檢測試劑盒

<130> SJ-20151126-6

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(20)

<223> 用于檢測宮頸癌的抗原性多肽

<400> 1

Pro Arg Ser Glu Pro Asp Thr Gly Asn Pro Cys His Thr Thr Lys Leu

1 5 10 15

Leu His Arg Asp

20