本發(fā)明涉及一種高純度蝦夷扇貝的DNA提取方法。

背景技術(shù)：

蝦夷扇貝屬濾食性雙殼貝類，貝殼扇形，右殼較突出，黃白色，左殼稍平，較右殼稍小，呈紫褐色。原產(chǎn)于日本、俄羅斯千島群島南部水域、日本北海道及本州北部，為大型冷水性貝類。是近些年來(lái)貝類水產(chǎn)品的重要品種，其閉殼肌蛋白質(zhì)構(gòu)成特殊，據(jù)分析每百克含有63.7克蛋白質(zhì)、3克脂肪、醣類15克、鈣47毫克、磷886毫克、鐵2.9毫克。蝦夷扇貝含有豐富的不飽和脂肪酸EPA和DHA。

分子生物學(xué)是生物學(xué)研究的一項(xiàng)重要分支，而DNA的提取則是分子生物學(xué)研究的重要基礎(chǔ)，DNA純度的純度及質(zhì)量對(duì)后續(xù)的研究工作具有極為重要的影響。每一物種由于其自身各成分的含量不同（比如有的物種蛋白含量高、有的物種糖分含量高），會(huì)對(duì)DNA的純度和質(zhì)量產(chǎn)生較大影響。因此，需要針對(duì)不同的物種開(kāi)發(fā)出適宜的有針對(duì)性的提取方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明旨在提供一種適于蝦夷扇貝的高質(zhì)量、高純度的DNA提取方法。

一種高純度蝦夷扇貝的DNA提取方法，步驟如下：

（1）取扇貝肌肉組織3-8克，用液氮研磨后，將粉末平均加入到10-15管裝有500μL STE（100mM NaCl；10mM Tris-Cl，pH8.0；1mM EDTA，pH8.0）及50μL 10% SDS裂解緩沖液的1.5mL離心管中，隨即每管加入5μL 濃度為20mg/mL的蛋白酶K，55-57℃水浴10-60 min，至溶液澄清；

（2）每管加入250μL飽和酚、250μL氯仿/異戊醇（24:1），輕柔晃動(dòng)5-15min，室溫10000-12000 rpm離心8-15min；

（3）離心后有機(jī)相位于下層，中間層為蛋白層，上層為溶有DNA的水相，吸取上清液至新離心管中，重復(fù)步驟（2），至水相和有機(jī)相之間無(wú)蛋白層殘留；

（4）吸取上清液至新離心管中，加入500μL氯仿/異戊醇，輕柔晃動(dòng)5-15min，室溫10000-12000 rpm離心8-15min；

（5）吸取上清液，加入50μL 3M NaAc，緩慢輕柔搖勻，添加1mL在-20℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇，放置于-20℃冰箱 20-50min，10000-15000rpm 離心8-15min，得到DNA沉淀；

（6）用預(yù)冷的 70%乙醇洗滌沉淀1-3次；

（7）沉淀干燥，根據(jù)沉淀量多少加入不同量的無(wú)菌超純水及終濃度為0.05mg/mL的RNase A，37℃水浴15-40min，直至RNA全部溶解；

（8）用分光光度計(jì)測(cè)定DNA的濃度，同時(shí)進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)。

本發(fā)明的方法針對(duì)性強(qiáng)，特別適于蝦夷扇貝DNA的提取，提取的DNA濃度、純度非常高，非常適于文庫(kù)構(gòu)建、PCR等后續(xù)研究。

附圖說(shuō)明

圖1 本發(fā)明方法提取的蝦夷扇貝DNA的電泳圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

從市場(chǎng)購(gòu)買的蝦夷扇貝在實(shí)驗(yàn)室用無(wú)菌海水暫養(yǎng)3-5天后，開(kāi)始DNA的提取工作，步驟如下：

（1）取扇貝肌肉組織3-8克，用液氮研磨后，將粉末平均加入到10-15管裝有500μL STE（100mM NaCl；10mM Tris-Cl，pH8.0；1mM EDTA，pH8.0）及50μL 10% SDS裂解緩沖液的1.5mL離心管中，隨即每管加入5μL 濃度為20mg/mL的蛋白酶K，55-57℃水浴10-60 min，至溶液澄清；

（2）每管加入250μL飽和酚、250μL氯仿/異戊醇（24:1），輕柔晃動(dòng)5-15min，室溫10000-12000 rpm離心8-15min；

（3）離心后有機(jī)相位于下層，中間層為蛋白層，上層為溶有DNA的水相，吸取上清液至新離心管中，重復(fù)步驟（2），至水相和有機(jī)相之間無(wú)蛋白層殘留；

（4）吸取上清液至新離心管中，加入500μL氯仿/異戊醇，輕柔晃動(dòng)5-15min，室溫10000-12000 rpm離心8-15min；

（5）吸取上清液，加入50μL 3M NaAc，緩慢輕柔搖勻，添加1mL在-20℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇，放置于-20℃冰箱 20-50min，10000-15000rpm 離心8-15min，得到DNA沉淀；

（6）用預(yù)冷的 70%乙醇洗滌沉淀1-3次；

（7）沉淀干燥，根據(jù)沉淀量多少加入不同量的無(wú)菌超純水及終濃度為0.05mg/mL的RNase A，37℃水浴15-40min，直至RNA全部溶解；

（8）用分光光度計(jì)測(cè)定DNA的濃度，同時(shí)進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)。

經(jīng)檢測(cè)，DNA的濃度為927 ng/uL，A260/A280=1.82。電泳結(jié)果如圖1所示，可見(jiàn)DNA的濃度及純度都非常高。