本領(lǐng)域涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及經(jīng)密碼子優(yōu)化而適于在畢赤酵母中表達的HPV31人乳頭瘤病毒主要衣殼蛋白L1的基因，以及含有該人乳頭瘤病毒主要衣殼蛋白L1基因的載體，菌株，表達該基因的方法，及其用途。
背景技術(shù)：
：人乳頭狀瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)是乳多空病毒科多瘤病毒亞科的一個無包膜的小型雙鏈環(huán)狀DNA病毒。HPV可通過人體間的密切接觸傳播，引起被感染者的皮膚出現(xiàn)尋常疣和肛門生殖器尖銳濕疣等病變，被列為性傳播疾病。1995年，國際癌癥研究中心公布的研究結(jié)果證實，HPV與宮頸癌有密切的因果關(guān)系。由此可見，HPV感染已成為嚴重危害人類健康的病原體。因此，研制高效、廉價的HPV疫苗，對于預(yù)防女性宮頸癌和HPV感染所引起的性傳播疾病具有十分重要的意義。目前已經(jīng)確定的HPV型超過100種。采用靈敏的檢測方法，可以從幾乎100％的宮頸癌患者病變組織中檢測到高危HPV‐DNA。根據(jù)HPV亞型與女性生殖道惡性腫瘤的關(guān)系，將HPV分為低危型和高危型。HPV6、11、34、40、42等型多見于良性宮頸病變?nèi)鐚m頸濕疣及宮頸上皮輕度不典型性增生病變中，屬HPV低危型；而宮頸上皮重度不典型增生及宮頸癌中以HPV16、18、31、33、35、39、45，52，58型感染更為多見，這些亞型為高危型。不同人群中一系列的研究已證實生殖道的HPV16、18型感染與宮頸癌的發(fā)生高度相關(guān)，較其他危險因素更密切。宮頸癌患者中，約50‐60％是由HPV16感染引起，HPV18約占14％，HPV45占約8％，HPV31占約5％，其余型占23％(WalboomersJM.etal.JPathol1999；189:12‐19)。宮頸癌是僅次于乳腺癌的第二大婦科惡性腫瘤，全球每年有超過50萬的婦女被診斷出患有宮頸癌，27萬婦女死于此病，年齡標準化感染率達10.5％。早在80年代初，HaraldzurHausen就發(fā)現(xiàn)人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)的感染與宮頸癌發(fā)病有關(guān)，后續(xù)的大量研究也已證明HPV與宮頸癌及其癌前病變有密切聯(lián)系。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)了百余種HPV基因型，其中約40種可以感染生殖道粘膜。一個正常婦女一生中宮頸至少感染一種HPV的終生累計概率約為40％。HPV是無包膜二十面體對稱病毒，其病毒基因組DNA為閉合環(huán)狀，長度約7200‐8000bp，由早期編碼區(qū)(earlyregion)、晚期編碼區(qū)(lateregion)和位于兩者之間的長調(diào)控區(qū)(longcontrolregion)組成。其中晚期編碼區(qū)含兩個開放閱讀框(ORF)，編碼病毒衣殼蛋白L1和L2。L1蛋白分子量約55kDa，為主要衣殼蛋白，以72個五聚體的形式支撐整個病毒衣殼結(jié)構(gòu)，在不同型別中氨基酸序列高度保守，能夠刺激機體產(chǎn)生保護性抗體。L2蛋白分子量較小，多位于L1蛋白內(nèi)部。昆蟲表達系統(tǒng)、酵母表達系統(tǒng)、原核表達系統(tǒng)和哺乳動物細胞等多種表達系統(tǒng)都可以通過單獨表達主要衣殼蛋白L1或聯(lián)合表達L1+L2的方式獲得病毒樣顆粒(VLP)。L1單獨表達得到的VLP與天然病毒衣殼結(jié)構(gòu)類似，可用于誘導(dǎo)與保護免受病毒侵襲有關(guān)的高效價病毒中和抗體應(yīng)答。因此，鑒于L1蛋白于不同基因型別內(nèi)部高度保守，并且能夠單獨表達形成VLP，以L1蛋白作為HPV疫苗研發(fā)的目標蛋白具有較高的可行性。不過，以表達重組病毒蛋白得到的VLP作為HPV疫苗的商業(yè)化開發(fā)與生產(chǎn)需要解決許多技術(shù)問題，其中首先需要解決的技術(shù)問題就是如何提高重組病毒蛋白的表達水平。而L1蛋白在大腸桿菌、畢赤酵母、桿狀病毒等表達系統(tǒng)中，往往受到這些生物體內(nèi)氨基酸密碼子使用頻率的限制導(dǎo)致表達水平較低甚至無表達。如Merck公司的美國專利No.7,498,036中記載，野生型VLP蛋白在釀酒酵母中的表達量為 35μg/mg(破菌上清液中的VLP/破菌上清液總蛋白)左右。因此，本領(lǐng)域中需要一種高水平表達基因的方法，所述方法應(yīng)該能夠高水平地、操作簡便和低成本地表達HPV基因。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了解決上述技術(shù)問題，根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種能夠在畢赤酵母中表達的HPV基因，所述基因具有SEQIDNO：2所示的核苷酸序列。利用畢赤酵母作為表達重組蛋白的表達系統(tǒng)，具有表達量高、操作簡便、成本低等特點，并且相較于更高等的昆蟲細胞與哺乳動物細胞而言更利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。由于不同物種間氨基酸密碼子使用頻率不一，在利用畢赤酵母表達重組蛋白的時候，往往根據(jù)目的蛋白的氨基酸序列經(jīng)過密碼子優(yōu)化調(diào)整后得到更利于翻譯的DNA序列。因此，本發(fā)明的經(jīng)過密碼子優(yōu)化后的HPV基因在畢赤酵母中可以獲得較高的表達水平，且所獲得的蛋白在純化后純度極高，更有利于針對HPV的預(yù)防性疫苗的研發(fā)與生產(chǎn)。如本申請實施例所示，本發(fā)明的密碼子優(yōu)化過的HPV31基因在畢赤酵母中表達后蛋白的純度約為95％。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了一種在畢赤酵母中表達HPVL1基因的方法，包括下述步驟：(1)將本發(fā)明的HPVL1基因分別各自克隆入表達載體中；(2)將步驟(1)所得的表達載體轉(zhuǎn)化至畢赤酵母菌株中；(3)使用抗生素對步驟(2)所得的轉(zhuǎn)化菌株進行篩選，獲得生長情況最好的一個或多個菌株；(4)通過測試各HPVL1基因的表達量對步驟(3)所得的菌株進行進一步篩選，獲得表達量最高的一個或多個菌株；(5)使用步驟(4)所得的菌株進行表達，分別獲得HPVL1蛋白。根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施方案，所述步驟(1)中所述的表達載體為pPICZαB載體，并且所述步驟(3)中使用的抗生素為Zeocin。。根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施方案，所述步驟(2)中使用的畢赤酵母菌株為畢赤酵母X‐33菌株。根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施方案，所述步驟(4)中測試HPVL1基因的表達量的操作是通過Westernblot方法進行的。根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施方案，所述步驟(5)中的表達步驟為在發(fā)酵罐中進行的發(fā)酵步驟。根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供了含有本發(fā)明的各HPVL1基因的表達載體。根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施方案，所述含有本發(fā)明的各HPVL1基因的表達載體來源于pPICZαB載體。根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供了含有本發(fā)明的HPVL1基因或表達載體的畢赤酵母菌株，所述菌株能夠高水平地表達生產(chǎn)各HPVL1蛋白，更利于針對HPV的預(yù)防性疫苗的研發(fā)與生產(chǎn)。附圖說明圖1顯示了HPV31L1基因雙酶切后瓊脂糖電泳圖。1：DL5000DNAMarker(Takara公司)；2：pPICZαB‐31L1樣品1；3：BstBI+KpnI雙酶切pPICZαB‐31L1樣品2。圖2顯示了HPV31L1蛋白樣品SDS‐PAGE電泳圖。條帶1：PageRulerPrestainedProtein Ladder；條帶2：重組純化蛋白樣品。圖3顯示了HPV31L1純化后病毒樣顆粒透射電鏡照片；圖4顯示了蛋白免疫原性在小鼠上的實驗測定結(jié)果。序列說明SEQIDNO：1為野生型HPV31L1氨基酸序列。SEQIDNO：2為本發(fā)明的HPV31L1基因的核苷酸序列。具體實施方式通過以下實施例詳細描述本發(fā)明，以便本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明。下述實施例僅僅出于示例性目的，并非意在限制本發(fā)明的范圍。已經(jīng)努力確保有關(guān)數(shù)字(如數(shù)量、溫度等)的準確性，但應(yīng)該考慮到會存在一些誤差和偏差。除非另有說明，溫度以℃為單位或者為環(huán)境溫度，壓力接近或等于大氣壓。除非另有說明，在下述各實施例中用到的限制性內(nèi)切酶均購自NewEnglandBiolab公司。應(yīng)當理解的是，除非另有說明，下述各實施例中所用到的儀器設(shè)備均為本領(lǐng)域的常規(guī)設(shè)備。除非另有說明，所使用的培養(yǎng)基均為市售可得的常規(guī)培養(yǎng)基，本領(lǐng)域技術(shù)人員均熟知其中的成分及含量。為了簡便起見，在本文中有可能使用各種通用的縮寫，本領(lǐng)域技術(shù)人員完全能夠理解其含義。實施例實施例1：HPVL1密碼子優(yōu)化設(shè)計遺傳密碼有64種，但是絕大多數(shù)生物傾向于利用這些密碼子中的一部分。畢赤酵母和人的基因?qū)γ艽a子的利用有各自的偏愛。由于遺傳密碼是簡并的，每個氨基酸都由一個以上的密碼子編碼，同一氨基酸的密碼子在野生型的基因中的使用頻率是不同的。畢赤酵母的密碼子偏好可能導(dǎo)致重組蛋白低的翻譯效率和表達水平，本發(fā)明人根據(jù)野生型的HPV31L1氨基酸序列(AAA46956.1)進行基因序列改造：對其所有的氨基酸基因全部采用使用頻率最高和較高的密碼子。Pichia酵母密碼子使用頻率見表1(參見http://www.kazusa.or.jp/codon/)。然后在此基礎(chǔ)上，為了使翻譯出來的mRNA的GC含量保持在適當?shù)乃?，，又為了避免mRNA的二級結(jié)構(gòu)影響翻譯的效率和一些常用的酶切位點，本發(fā)明人對最高頻率的密碼子進行一定的修正，例如將一些天冬酰胺(Asn)最高頻率密碼子AAC修正為AAT，賴氨酸(Lys)最高頻率密碼子AAG修正為AAA，天冬氨酸(Asp)最高頻率密碼子GAT修正為GAC，苯丙氨酸(Phe)最高頻率密碼子TTT修正為TTC，酪氨酸(Tyr)最高頻率密碼子TAC修正為TAT，甘氨酸(Gly)最高頻率密碼子GGT修正為GGA。改造后的HPVL1基因序列不含有以下內(nèi)含子識別序列及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點：ATGACTCAT和TGACTA(轉(zhuǎn)錄因子GCN4結(jié)合位點)；ATATAA(GAL4的結(jié)合位點)；TATTTAA(TBP結(jié)合位點)；TTAGTAA和TTACTAA(YAP1結(jié)合位點)；ATGACTAAT；ACTAATTAGG。由此，本發(fā)明人優(yōu)化設(shè)計出若干種適于畢赤酵母表達的HPVL1基因的核苷酸序列，按照所述的序列全合成了HPVL1基因，將其克隆到現(xiàn)有畢赤酵母表達載體中，通過同源重組及高濃度抗生素的篩選構(gòu)建重組畢赤酵母表達菌株；利用重組畢赤酵母進行發(fā)酵培養(yǎng)和甲醇誘導(dǎo)胞內(nèi)表達HPVL1蛋白。從中分別篩選出全新的HPVL1基因的核苷酸序列，可分別在畢赤酵母中高表達HPVL1蛋白，并在胞內(nèi)同時形成病毒樣顆粒(VLPs)，破菌上清經(jīng)過層析方法純化后，純化的病毒樣顆粒純度大于95％，吸附鋁佐劑后，具有極高的免疫原性，可作為人用預(yù)防宮頸癌的疫苗。這些優(yōu)化設(shè)計的HPVL1基因的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。表1Pichia酵母密碼子表實施例2：HPV31L1重組表達載體構(gòu)建合成所得的HPV31L1基因序列通過下列方法克隆入pPICZalphaB載體(Invitrogen)。以PCR的方式擴增得到兩端分別帶有BstBI和KpnI的HPVL1DNA片段，PCR引物。HPV31L1,正向 引物：5’‐CGATGGAACTTCGAAACGATGTGGAGACC‐3’(BstBI)(SEQIDNO：3)；反向引物：5’‐GACCTGGGTACCCTATTATCTCTTGGTTTTAG‐3’(KpnI)(SEQIDNO：4)。PCR程序：94℃5分鐘，94℃30秒、55℃30秒、72℃1分50秒循環(huán)30次，72℃10分鐘，10℃10分鐘，運行結(jié)束。PCR產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收1500bp處條帶(Qiagengelextractionkit)?；厥掌闻cpPICZalphaB以BstBI和KpnI(NewEnglandBiolab)聯(lián)合酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定并分別回收約1500bp和3600bp片段?；厥蘸驢PVL1與pPICZalphaB以摩爾比為5:1的比例用T4連接酶(Takara)16℃過夜連接，第二天連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α，涂布于低鹽LB平板(含25ug/mLZeocin)，37℃過夜培養(yǎng)。挑取部分轉(zhuǎn)化后克隆抽提質(zhì)粒，雙酶切(BstBI+KpnI)鑒定，瓊脂糖電泳檢測(圖1)，其中條帶1為Marker，自上而下分別對應(yīng)10000bp、7000bp、4000bp、2000bp、1000bp、500bp以及250bp,條帶2為質(zhì)粒，條帶3位聯(lián)合酶切后的質(zhì)粒，條帶3靠下圖的片段為L1DNA片段。鑒定所得陽性重組克隆經(jīng)DNA測序驗證正確后保存，重組載體命名為Ppicz31L1。實施例3：HPVL1重組表達菌株構(gòu)建與表達以SacI線性化pPICZ31L1，酶切反應(yīng)結(jié)束后酚：氯仿去除蛋白，再加入2.5倍體積無水乙醇，1/10體積3MNaAc(pH5.2)沉淀DNA，所得沉淀經(jīng)75％乙醇洗滌、烘干后以少量無菌ddH2O溶解沉淀，電轉(zhuǎn)畢赤酵母宿主菌(Invitrogen)，涂布于YPDS平板(含180μg/mLZeocin)，30℃培養(yǎng)3天，得數(shù)百克隆。從中挑取數(shù)十克隆接種于YPD平板(含1500μg/mLZeocin)，篩選質(zhì)粒高拷貝菌株，30℃培養(yǎng)2天。部分克隆生長較快，挑取生長情況最好的數(shù)個克隆接種于5mLYPD液體培養(yǎng)基，24小時后更換BMMY培養(yǎng)基，0.5％甲醇誘導(dǎo)48小時后收集菌體。菌體經(jīng)玻璃珠破碎后，離心所得上清液以Western‐blot鑒定，所用一抗為自制兔多抗。取表達量最高的菌株凍存于‐80℃，作為發(fā)酵罐培養(yǎng)工作種子。實施例4：HPVL1重組蛋白的發(fā)酵罐培養(yǎng)從實施例3所得的表達HPV31L1的基因工程菌工作種子庫中，取1支甘油凍存管，融化后吸取100μL接入5mLYPG培養(yǎng)基，250‐300轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)，30℃培養(yǎng)16‐24小時，直到OD600達到2‐6，鏡檢無雜菌污染。將檢驗合格的活化菌液按0.2％接種量接入YPG培養(yǎng)基，250‐300rpm，30℃培養(yǎng)16‐24小時。直到OD600達到2‐6。鏡檢無雜菌污染。將上述活化后菌種液接種于發(fā)酵罐內(nèi)，接種量5‐10％。發(fā)酵溫度30.0±0.5℃，初始pH5.00±0.1，起始轉(zhuǎn)速300rpm，通氣量0.5‐1.0vvm，初始溶氧(DO)校準至100％。發(fā)酵用基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基BSM，配制后高壓濕熱滅菌，滅菌條件為121℃，30分鐘，滅菌結(jié)束后冷卻至30℃。按4ml/LBSM的比例添加PTM1痕量鹽類。初始增殖階段在18‐24小時，發(fā)酵過程中維持溶氧值不低于20％，當碳源消耗完畢時，溶氧值迅速地上升,菌體濕重達到90‐150g/L。此后進入甘油補料階段，甘油補料液濃度為50％，每升補料液添加12mlPTM1，甘油補料速度為8‐18ml/h/升初始發(fā)酵體積，菌體濕重達到180‐220g/L時，停止補料。此階段發(fā)酵液中甘油最大濃度不應(yīng)超過4％。甘油補料結(jié)束后維持一定時間，待培養(yǎng)基中甘油消耗完全后開始進行甲醇誘導(dǎo)，每升甲醇加入12mlPTM1，同時將pH值控制調(diào)為6.00±0.1。最初甲醇補加速度控制在1.5‐2.5ml/h/升初始發(fā)酵體積,之后緩慢增加甲醇補加速度，甲醇誘導(dǎo)4小時后將補料速度提升至2.5‐7.5ml/h/升初始發(fā)酵體積。維持溶氧(DO)不低于20％，溫度維持在30±0.5℃，pH值控制為6.00±0.1。誘導(dǎo)結(jié)束時放出發(fā)酵液，菌體濕重達200‐400g/L。4℃，4800rpm離心20分鐘收集菌體，‐20℃保存。發(fā)酵基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(BSM)配方(1L)：PTM1痕量鹽配方(1L)：成分含量5水硫酸銅6.0g碘化鈉0.08g1水硫酸錳3.0g2水鉬酸鈉0.2g硼酸0.02g氯化鈷0.5g氯化鋅20.0g7水硫酸亞鐵65.0g生物素0.2g硫酸5.0ml純化水加至1L實施例5：HPVL1蛋白純化收集HPV31L1發(fā)酵菌體經(jīng)破菌(破菌緩沖液：200mMMOPS，pH7.0，0.7NaCl，0.05％Tween‐80)離心后，離心上清液經(jīng)過層析方法純化，得到L1蛋白自組裝形成的病毒樣顆粒。具體步驟如下：將表達HPV31L1VLP的畢赤酵母細胞，按1：5(m/v)比例加入破菌緩沖液，充分混勻后，以機械高壓破碎均勻上述細胞懸液，并重復(fù)操作，使90％的細胞破碎。將高壓破碎的破菌液于4℃冰箱靜置過夜，于9000rpm，30min，10℃離心分離，收集離心后上清液。破菌上清液通過陽離子交換層析柱(POROS50HSAppliedBiosystems公司層析柱)進行初步純化，洗脫方式為：100％緩沖液A(0.5MNaCl，50mMMOPS，pH7.0，0.05％Tween‐80)至100％的緩沖液B(1.5MNaCl，50mMMOPS，pH7.0，0.05％Tween‐80)的線性梯度洗脫，收集洗脫組分，并采用SDS‐PAGE，Western‐blot檢測目標蛋白。將含有HPV31VLP蛋白的洗脫組分合并后，經(jīng)羥基磷灰石層析柱(CHTBIO‐RADTypeII)進一步純化，洗脫方式為：100％緩沖液A(5mMPB,0.6MNaCl,50mMMOPS，pH6.5,0.05％Tween‐80)至100％的緩沖液B(200mMPB，0.6MNaCl,pH6.5，0.05％Tween‐80)的線性梯度洗脫。收集洗脫組分，并采用SDS‐PAGE和Western‐blot檢測目標蛋白，將含有HPV31VLP的組分合并，即為最后的純化樣品，如圖2所示(含量約為95％)。此外，通過CE(毛細管電泳)檢測可知，純化后樣品主峰面積大于97％。經(jīng)過電鏡(復(fù)旦大學(xué)化學(xué)3系電鏡室)觀察純化樣品中呈現(xiàn)病毒樣顆粒(圖3)，結(jié)果顯示顆粒直徑在30‐60nm之間。實施例6：本發(fā)明的HPV31L1重組蛋白的表達量測定本實施例根據(jù)Bradford法測得的發(fā)酵后菌體破菌上清液中總蛋白含量和Elisa夾心法測得的HPV31L1VLP的表達量，計算得到HPV31L1VLP在破菌后總蛋白中的含量。具體步驟如下：取0.1g發(fā)酵菌體，加入1ml破菌緩沖液，經(jīng)玻璃珠破菌后，離心，取上清，用Elisa夾心法測定重組菌株發(fā)酵后菌體破菌上清液中HPV31L1VLP的含量，具體如下：使用純化的HPV31L1VLP做標準蛋白濃度曲線，誘導(dǎo)前的菌體作為陰性對照。用包被液(1.6gNa2CO3，2.95gNaHCO3)將兔抗HPV31L1VLP多抗稀釋2000倍，然后向酶標板的各凹孔中各加入0.1ml稀釋后的兔多抗，4℃過夜。移去包被液，用0.3mlPBST(PBS，pH7.0，0.05％Tween‐20)洗滌凹孔，再用0.3ml封閉液(5％脫脂奶粉+PBST)于37℃保溫2小時。用稀釋液(PBS，pH7.0)以連續(xù)二倍稀釋的方式，將實施例5中獲得的純化HPV31L1VLP從濃度2μg/ml梯度稀釋到0.0625μg/ml，以此作為標準樣品。同時將實施例4中獲得的發(fā)酵菌體的破菌上清液稀釋200倍，然后分別向凹孔中加入0.1ml梯度稀釋后的不同濃度的HPVL1VLP溶液或稀釋后的破菌上清液，于37℃保溫1小時后，移去抗原液，并用0.3mlPBST洗滌凹孔。然后用抗體稀釋緩沖液(PBS，pH7.0，2％脫脂奶粉)將MAB885鼠抗HPV31L1VLP單抗(購自CHEMICON公司)1000倍稀釋后加入到凹孔中，每孔加0.1ml，37℃保溫1小時。移去單抗溶液，用0.3mlPBST洗滌凹孔。再向各凹孔中加入用抗體稀釋緩沖液稀釋5000倍的HRP標記的羊抗鼠IgG0.1ml，37℃保溫1小時。移去抗體溶液，并用0.3mlPBST洗滌凹孔，向凹孔中各加入0.1mlDAB顯色液(購自Amresco公司)，室溫作用10分鐘。向每個凹孔中加入0.05ml2MH2SO4終止液以終止反應(yīng)，并用酶標比色儀測定OD450吸光值。利用梯度稀釋的HPV31L1VLP的OD450的檢測結(jié)果，制作標準蛋白濃度曲線，再通過標準蛋白濃度曲線換算得HPV31L1蛋白的發(fā)酵表達量。本實施例的結(jié)果示于表2。表2：本發(fā)明的HPV31L1基因的表達量由表2可以看出，本發(fā)明的HPV31L1基因的表達量最高可達到673μg/g(破菌上清液中的HPV31L1VLP/濕菌。實施例7：HPVL1疫苗制備參考《中華人民共和國藥典》(2005年版)中的方法，將實施例5中純化獲得的HPVL1蛋白，吸附磷酸鋁佐劑，制備獲得具有免疫原性的HPV疫苗。實施例8：HPV31L1基因表達產(chǎn)物免疫原性的測定HPV31L1基因表達產(chǎn)物免疫原性的測定選取6～8周齡的SPF級BALB/c小鼠(上海西普爾必凱實驗動物有限公司)，分為3組，每組10只小鼠。第1～2組分別注射0.25μg和0.05μg吸附500μg鋁佐劑的HPV31L1VLP(即實施例7中所制備得到的產(chǎn)物)，注射體積為0.5mL(作為檢測組)，第3組小鼠用0.5mL鋁佐劑進行免疫(作為陰性對照組)。于0天和14天分別腹腔注射免疫一次，每次免疫后第14天采血。將采集得到的血液于37℃放置1小時后，5000rpm離心10min，吸取上清，即得到小鼠免疫血清，56℃滅活30分鐘后于‐20℃存放，并檢測小鼠血清中針對HPV31L1的中和抗體滴度，具體方法如下：將293FT細胞按1.5×104/孔的密度預(yù)鋪于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加細胞液100μl，于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞貼壁(約24h)。同時，將血清樣品用DMEM完全培養(yǎng)基稀釋到合適的起始稀釋度后，再進行連續(xù)2倍稀釋7個梯度。根據(jù)HPV31假病毒原液的TCID50/0.1ml計算稀釋倍數(shù)，用DMEM完全培養(yǎng)基將假病毒液稀釋至‐log(TCID50/0.1ml)＝3.2，混勻，同時設(shè)置不同稀釋度質(zhì)控血清對照組。在70μl血清稀釋液中加入70μl假病毒稀釋液，振蕩混勻1分鐘后置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育60分鐘。準確吸取血清‐假病毒混合液100μl，緩慢小心加入預(yù)鋪的96孔細胞板中。于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時后用熒光顯微鏡觀察結(jié)果。同時進行假病毒回滴以保證實驗的有效。若待檢血清孔 熒光數(shù)不高于假病毒陽性對照孔熒光數(shù)一半時所在的最大稀釋倍數(shù)即為該血清標本的中和抗體滴度，具體結(jié)果如圖4所示。綜上所述，本發(fā)明提供的人乳頭狀瘤病毒31主要衣殼蛋白L1基因是一種優(yōu)化過的L1基因，具有以下優(yōu)點：經(jīng)過優(yōu)化的基因適合在酵母宿主中高效率表達目標蛋白，而且能夠滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求；同時，本發(fā)明提供的人乳頭狀瘤病毒疫苗，能夠自組裝形成VLPs結(jié)構(gòu)，純化的VLPs吸附佐劑后，通過中和反應(yīng)的測定，說明該疫苗能在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生較強的免疫原性，而且由于采用畢赤酵母表達系統(tǒng)，因此該方法具有以下優(yōu)點：成本低，產(chǎn)量高，產(chǎn)品性質(zhì)更加均一穩(wěn)定。當前第1頁1 2 3