本發(fā)明屬于海洋生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種海綿的化學(xué)成分提取方法。

背景技術(shù)：

海洋生物堿作為海洋生物的一種特征次級代謝產(chǎn)物，以其結(jié)構(gòu)的新穎性、多樣性和顯著的生物活性成為海洋天然產(chǎn)物的重要研究對象。到目前為止，海洋來源的天然產(chǎn)物已經(jīng)超過20000個，其中約三分之一的化合物含有氮原子，在46個海洋藥物中，33個屬于生物堿。海綿一直是海洋生物堿的主要來源，研究報道Calcarea綱中富含咪唑生物堿，在過去的30年中，共分離得到60多個咪唑生物堿。這類生物堿具有顯著的抗菌、抗炎和細胞毒活性。

海綿是生物堿的主要來源，這些生物堿具有結(jié)構(gòu)類型新穎，生物活性好的特征。Calcarea綱的海綿分布與全球各個海域，其中Leucetta和Clathrina屬海綿被報道其特征性化學(xué)成分為咪唑類生物堿，在過去30年中，從這兩個屬中分離到的咪唑類生物堿已超過60個。咪唑類生物堿的結(jié)構(gòu)以2-氨基咪唑環(huán)為基本母核，2位氨基通常連有取代基乙內(nèi)酰脲，N1，C-4，C-5位常連有苯環(huán)取代基，C-4，C-5位連有苯環(huán)的稱為naamines或naamidines，N1，C-4位連有苯環(huán)的結(jié)構(gòu)類型稱作isonaamines或isonaamidines。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種全面提取海綿中化學(xué)成分的方法。

海綿的化學(xué)成分提取方法，步驟如下：將海綿樣品攪碎后，室溫下用甲醇冷浸提取4次，每次浸泡3天；合并提取液，減壓濃縮，用無水甲醇脫鹽三次，得到總浸膏36.2g。經(jīng)100~200目的減壓硅膠柱層析，石油醚/丙酮梯度洗脫(100:1到1:2,v/v)，得到粗組分。

對上述粗組分進行進一步分離純化，首先用手性柱進行分離，然后采用半制備高效液相色譜HPLC進行分離純化。

本發(fā)明綜合利用TCL、CC、ODS、SephadexLH-20、HPLC等現(xiàn)代色譜分離技術(shù)，從海綿Pericharaxheteroraphis中分離得到7個化合物。包括5個咪唑類生物堿(PH-1~PH-5)，1個聚酮類化合物(PH-6)，1個核苷類化合物(PH-7)。除化合物PH-2其余化合物均為首次從本屬海綿中獲得。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。

將海綿樣品攪碎后，室溫下用甲醇冷浸提取4次，每次浸泡3天；合并提取液，減壓濃縮，用無水甲醇脫鹽三次，得到總浸膏36.2g。經(jīng)100~200目的減壓硅膠柱層析，石油醚/丙酮梯度洗脫(100:1到1:2,v/v)，得到粗組分。

在過減壓柱的過程中，發(fā)現(xiàn)有很多黃色物質(zhì)，對其進行HPLC分析，所示，推測是咪唑類生物堿的物質(zhì)，因此對其進行針對性的分離。

生物堿段（6.7g）取部分樣品，經(jīng)過中壓液相砍段，洗脫條件如下：

流速：20mL/min；檢測波長：230nm 320nm

經(jīng)過中壓砍段后，分為3個主峰，主峰1~3，主峰1在C18柱上為一個單峰，但是核磁譜圖信號顯示為混合物，因此用手性柱進行分離，選用IC手性柱，液相條件為：流動相：100%甲醇；流速：0.7mL/min，檢測波長：210nm，進一步分離得化合物PH-1(3.5mg)和PH-2(4.3mg)，主峰2進一步用半制備高效液相色譜HPLC進行分離純化(YMC-PackODSC8,10×250mm,5μm；流動相：乙腈/水(65:35)：1‰HCOOH，流速：1.5mL/min，檢測波長：210nm)得到化合物PH-3(30mg)，主峰3也進一步用半制備高效液相色譜HPLC進行分離純化(YMC-Pack ODSC8,10×250mm,5μm；流動相：乙腈/水(64:36)：1‰HCOOH，流速：1.5mL/min，檢測波長：210nm)得到化合物PH-4(8mg)和PH-5(5.3mg)。從其他組分中以石油醚/丙酮(35:1)洗脫的硅膠柱層析后，再通過半制備高效液相色譜HPLC(流動相為甲醇/水80:20)進步純化得化合物PH-6(5.0mg)。PH-7(3.4mg)是經(jīng)過HPLC用10%甲醇/水制備出來的。

分離得到的化合物的理化數(shù)據(jù)如下

化合物PH-1：leucettamineC

分子式：C12H13N3O2，分子量：231，黃色油狀物。ESI-MS:m/z232[M+H]+。1H-NMR(500MHz，DMSO,TMS,δ)H：8.01(2H,d,J=8.6Hz,H-9,11),7.44 (2H,s,NH2),6.92 (2H,d,J=8.7Hz,H-8,12), 6.36(1H,s,H-6),3.77(3H,s,13-OCH3),3.03(3H,s,N-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻對照一致，鑒定化合物PH-1為leucettamineC。

化合物PH-2：leucettaamineB

分子式：C12H11N3O3，分子量：245，黃色油狀物。ESI-MS:m/z246[M+H]+。1H-NMR(500MHz，DMSO,TMS,δ)H:7.92(1H,s,H-9),7.50(2H,s,NH2), 7.40(1H,d,J=8.0Hz,H-13), 6.90(1H,d,J=8.1Hz,H-12),6.34(1H,s,H-7),6.02(2H,s,H-14),3.03(3H,s,N-CH3).。以上數(shù)據(jù)與文獻對照一致，鑒定化合物PH-2為leucettamineB。

化合物PH-3：pyronaamidine

分子式：C25H27N5O6，分子量：493，黃色油狀物。ESI-MS:m/z494[M+H]+。1H-NMR(500MHz，CDCl3,TMS,δ)H：8.01(2H,d,J=8.6Hz,H-9,11),7.44(2H,s,NH2), 6.92(2H,d,J=8.7Hz,H-8,12),6.36(1H,s,H-6),3.77(3H,s,13-OCH3),3.03(3H,s,N-CH3);13CNMR(150MHz，CDCl3,TMS,δ)c147.8(s,C-2), 126.8(s,C-4), 132.7(s,C-5),153.9(s,C-7),161.2(s,C-9), 164.8(s,C-11),31.0(t,C-12),22.9(t,C-13),30.2(q,C-14),24.3(q,C-15),130.0(s,C-1′), 128.6(s,C-2′6′),113.3(s,C-3′5′),157.8(s,C-4′), 115.9(s,C-1′′), 147.0(s,C-2′′), 135.4(s,C-3′′), 151.2(s,C-4′′),103.8(d,C-5′′),123.2(d,C-6′′), 55.0(q,4′-OCH3), 60.9(q,3′′-OCH3),55.8(q,4′′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻對照一致，鑒定化合物PH-3為pyronaamidine。

化合物PH-4：naamidineH

分子式：C25H27N5O6，分子量：493，黃色油狀物。ESI-MS:m/z494[M+H]+。1H-NMR(500MHz，CDCl3,TMS,δ)H：7.08(2H,d,J=8.6Hz,H-3′,5′), 6.79(2H,s,J=8.6Hz,H-2′,6′), 6.38(1H,d,J=8.6Hz,H-5′′), 6.29(1H,s,d,J=8.6Hz,H-6′′), 3.90(3H,s,3′′-OCH3),3.82(3H,s,4′′-OCH3),3.77(3H,s,4′-CH3), 3.56(3H,s,14-CH3), 3.16(3H,s,15-CH3)。 以上數(shù)據(jù)與文獻對照一致，鑒定化合物PH-4化合物PH-1：leucettamineC為naamidineH。

化合物PH-5:leucettamineJ

分子式：C25H27O5N5，分子量：477，黃色油狀物。UV(MeOH):λmax(logε)225(4.27),275(3.77),392(3.97)nm；IR(KBr):3427, 2960,2873,1731,1710,1377, 1250,1068, 1025cm-1；1H-NMR(500MHz,CDCl3)和13C-NMR(125MHz,CDCl3)數(shù)據(jù)見表2-1;HR-ESI-MSpositiveionmode):m/z=478.2091[M+H]+(計算值為478.2085)，m/z=500.1906[M+Na]+(計算值為500.1904)。

化合物PH-6：(-)-Methyl(2Z,6R,8R,9E)-3,6-epoxy-4,6,8-triethyl-2,4,9-dodecatrienoate

分子式：C19H30O3，分子量：306，無色油狀物；10%H2SO4/EtOH顯紫紅色；EIMSm/z:329.0[M+Na]+；1HNMRCDCl3,600MHz)δ:0.75 (3H,t,J=5Hz,H-16), 0.76 (3H,t,J= 5Hz,H-18), 0.93(3H,t,J=7.5Hz,H-12),1.13(3H,t,J=7.5Hz,H-14), 3.69(3H,s,OCH3),4.80(1H,s,H-2), 5.00(1H,dd,J=17.5,7.5Hz,H-9), 5.20(1H,dt,J=15.0,5.0Hz,H-10), 6.18(1H,s,H-5); 13CNMR(DMSO-d6, 150MHz) δ7.7(C-16,q),11.7(C-18,q),11.7(C-14,q),13.8(C-12,q),17.9(C-13,t), 25.0(C-11,t),28.0(C-17,t),31.0(C-15,t),39.1(C-8,d),42.0(C-7,t),50.0(CH3O-),82.0(C-2,d),97.0(C-6,s),131.0(C-10,t),133.0(C-9,t),138.0(C-4,s),141.0(C-5,d),165.0(C-1,s),172.0(C-3,s)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致，鑒定化合物12為(-)-Methyl(2Z,6R,8R,9E)- 3,6-epoxy -4,6,8-triethyl- 2,4,9-dodecatrienoate。

化合物PH-7:2′-脫氧腺嘌呤核苷

分子式：C10H13N5O3，分子量：215，白色粉末；10%H2SO4/EtOH顯灰黃色；1HNMR(DMSO,600MHz)δ:8.15(1H,s,H-2),7.33(2H,s,5-NH2),8.35(1H,s,H-7),6.36(1H,dd,J=7.8,7.8Hz,H-1′),2.28,2.73(2H,m,H-2′),4.43(1H,m,H-3′),3.88(1H,dd,J=6.9,4.1Hz,H-4′),3.59(2H,dd,J=11.9,4.1Hz,H-5′),5.35(1H,brs,3′-OH),5.29(1H,brs,5′-OH)。以上數(shù)據(jù)與文獻[6]報道基本一致，鑒定化合物PH-7為2′-脫氧腺嘌呤核苷。