本發(fā)明屬于海洋生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種肉芝軟珊瑚提取物的生物活性SRB測定方法。
背景技術(shù)：
肉芝軟珊瑚(Sarcophyton sp.)，分類學(xué)上屬腔腸動物門(Cnidaria)，珊瑚蟲綱(Anthozoa)，軟珊瑚目動物(Alcyonacea)，軟珊瑚科(Alcyoniidae)，肉芝軟珊瑚屬(Sarcophyton)動物，是一種在熱帶與亞熱帶比較常見的海洋生物。肉芝軟珊瑚顏色多種，包括褐色、綠色或棕色，帶有白色或金色的水螅體，隨著生長會長出褶皺。珊瑚體呈平鋪的盆形，群體肥厚，中央凹入，表面常具有略呈輻射狀的脊，脊寬約1至3公分；群體的柱部低矮、粗大。
全球有肉芝軟珊瑚約41種，到目前為止，國內(nèi)外研究者已對該屬的17個種開展了化學(xué)成分研究。該屬的化學(xué)成分主要有萜類(包括倍半萜、二萜、三萜、四萜，尤其以西松烷二萜居多)、甾醇(尤其以多羥基甾醇居多)、糖苷類、前列腺素、神經(jīng)酰胺、吡啶衍生物及脂肪酸等化合物。這其中不乏許多結(jié)構(gòu)新穎、生理活性顯著的化學(xué)成分，因此我們選擇南海肉芝軟珊瑚(Sarcophyton sp.)進(jìn)行化學(xué)成分及其生物活性的研究。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明旨在為肉芝軟珊瑚的提取物提供一種方便可靠的生物活性測定方法。
一種肉芝軟珊瑚提取物的生物活性SRB測定方法，步驟如下：
(1)取對數(shù)期的腫瘤細(xì)胞，用新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞懸液的濃度為2×105個/ml，每孔200μL加入96孔板中，每孔加入不同濃度的樣品溶液2μL；
(2)37oC培養(yǎng)17h；
(3)離心3min(4oC、3000prm)，吸去上清；
(4)每孔加入50μL預(yù)冷的80%TCA溶液，移入4oC冰箱中固定1.5h，再用去離子水沖洗5次，室溫晾干；
(5)每孔加入0.5%SRB染液(1%的TCA溶液)50μL，室溫靜置30min后，用預(yù)冷的1%TCA水溶液沖洗4次，去除未結(jié)合的染料，室溫晾干；
(6)每孔加入150μL非緩沖Tris溶液溶解(10mM，pH=10.5)與蛋白結(jié)合的染料，用酶標(biāo)儀在520nm下測定每孔吸光度OD值。在96孔板中每個樣品濃度設(shè)3孔，另設(shè)空白對照3孔，取3孔平均值，按公式IR(%)=(OD空白-OD樣品)/OD空白×100%計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(IR%)，再利用Bliss方法由各種濃度的IR求出半數(shù)抑制濃度(IC50)的標(biāo)準(zhǔn)差和平均值。
本發(fā)明的測定原理：磺酰羅丹明B(SulforhodamineB，SRB)比色法，主要用來檢測細(xì)胞增殖情況。SRB是一種粉紅色陰離子染料，易溶于水，在酸性條件下可特異性地與細(xì)胞內(nèi)組成蛋白質(zhì)的堿性氨基酸結(jié)合；在520nm波長下產(chǎn)生吸收峰，吸光值與細(xì)胞量成線性正相關(guān)，故可用作細(xì)胞數(shù)的定量檢測。
本發(fā)明的測定方法相對于現(xiàn)有技術(shù)簡單快速、而且檢測結(jié)果可靠，適于推廣應(yīng)用。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
選擇HeLa腫瘤細(xì)胞株用SRB法對從肉芝軟珊瑚分離得到的多羥基甾醇SAR 1 - SAR 11進(jìn)行體外抗腫瘤活性篩選，包括如下步驟：
(1)取對數(shù)期的腫瘤細(xì)胞，用新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞懸液的濃度為2×105個/ml，每孔200μL加入96孔板中，每孔加入不同濃度的樣品溶液2μL；
(2)37oC培養(yǎng)17h；
(3)離心3min(4oC、3000prm)，吸去上清；
(4)每孔加入50μL預(yù)冷的80%TCA溶液，移入4oC冰箱中固定1.5h，再用去離子水沖洗5次，室溫晾干；
(5)每孔加入0.5%SRB染液(1%的TCA溶液)50μL，室溫靜置30min后，用預(yù)冷的1%TCA水溶液沖洗4次，去除未結(jié)合的染料，室溫晾干；
(6)每孔加入150μL非緩沖Tris溶液溶解(10mM，pH=10.5)與蛋白結(jié)合的染料，用酶標(biāo)儀在520nm下測定每孔吸光度OD值。在96孔板中每個樣品濃度設(shè)3孔，另設(shè)空白對照3孔，取3孔平均值，按公式IR(%)=(OD空白-OD樣品)/OD空白×100%計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(IR%)，再利用Bliss方法由各種濃度的IR求出半數(shù)抑制濃度(IC50)的標(biāo)準(zhǔn)差和平均值。
測定結(jié)果見表1，分析表中數(shù)據(jù)可以看出在濃度為50μM濃度水平，化合物SAR 3、6、9對HeLa細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，SAR1、2、7表現(xiàn)出中等的細(xì)胞毒活性，其中化合物SAR4、10對HeLa細(xì)胞無抑制活性。
表1 多羥基甾醇化合物 SAR 1-SAR 11 對Hela腫瘤細(xì)胞株的抑制率(%)