本發(fā)明屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種海洋生物細(xì)胞的復(fù)蘇及傳代方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)也叫細(xì)胞克隆技術(shù)，在生物學(xué)中的正規(guī)名詞為細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。不論對(duì)于整個(gè)生物工程技術(shù)，還是其中之一的生物克隆技術(shù)來說，細(xì)胞培養(yǎng)都是一個(gè)必不可少的過程，細(xì)胞培養(yǎng)本身就是細(xì)胞的大規(guī)模克隆。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可以由一個(gè)細(xì)胞經(jīng)過大量培養(yǎng)成為簡(jiǎn)單的單細(xì)胞或極少分化的多細(xì)胞，這是克隆技術(shù)必不可少的環(huán)節(jié)，而且細(xì)胞培養(yǎng)本身就是細(xì)胞的克隆。通過細(xì)胞培養(yǎng)得到大量的細(xì)胞或其代謝產(chǎn)物。因?yàn)樯锂a(chǎn)品都是從細(xì)胞得來，所以可以說細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是生物技術(shù)中最核心、最基礎(chǔ)的技術(shù)。
細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：能長期傳代，保持活性，便于監(jiān)控檢測(cè)結(jié)構(gòu)功能和生命活動(dòng)。培養(yǎng)條件可以人為的控制便于研究細(xì)胞代謝、物理、化學(xué)、生物因素的影響?？捎糜诟鞣N觀察和檢測(cè)手段研究活細(xì)胞的變化（變異、分化），可從細(xì)胞水平開展亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和代謝分子的表達(dá)。研究范圍和細(xì)胞來源廣泛，選擇性廣。不同代次細(xì)胞可長期保存，既可開展同代次不同條件和方法研究，又可觀察不同代次的動(dòng)態(tài)變化。耗資少、經(jīng)濟(jì)、成本低、可大量培養(yǎng)，利于生物制品的生產(chǎn)。
因此，海洋生物的研究也越來越多的用到細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，在實(shí)際操作中，細(xì)胞經(jīng)常要經(jīng)歷凍存、復(fù)蘇、傳代等操作。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)上述問題，本發(fā)明正是提供一種海洋生物細(xì)胞的復(fù)蘇及傳代方法。
一種海洋生物細(xì)胞的復(fù)蘇及傳代方法，包括如下步驟：
（1）細(xì)胞的復(fù)蘇：
將凍存的細(xì)胞從液氮中取出，迅速放入37℃水浴，在1分鐘內(nèi)解凍；在超凈工作臺(tái)里，用75%的酒精將凍存管外壁消毒；另將3.5mL RPMI1640培養(yǎng)液、0.5mL血清加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，再將1mL凍存管中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，逐滴加入并不時(shí)的搖動(dòng)培養(yǎng)瓶使其均勻；12h后給細(xì)胞換液，除去細(xì)胞凍存液中的DMSO。
（2）細(xì)胞的傳代：
待細(xì)胞長滿80%細(xì)胞培養(yǎng)瓶時(shí)即細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期，傾去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入少量的胰酶蕩洗一次，再加入1.5mL胰酶消化，顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞間質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙清晰時(shí)，棄去胰酶，加入4mL Ham’sF-12K/DMEM/RPMI1640培養(yǎng)液充分吹打至顯微鏡下觀察為單細(xì)胞懸液；分裝懸液細(xì)胞于若干培養(yǎng)瓶中，含10%血清的Ham’sF-12K/DMEM/RPMI1640，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
本發(fā)明的海洋生物細(xì)胞復(fù)蘇及傳代方法，操作簡(jiǎn)單方便，對(duì)細(xì)胞的損傷小，污染幾率降低，細(xì)胞的生長狀態(tài)良好。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
一種海洋生物細(xì)胞的復(fù)蘇及傳代方法，包括如下步驟：
（1）細(xì)胞的復(fù)蘇：
將凍存的細(xì)胞從液氮中取出，迅速放入37℃水浴，在1分鐘內(nèi)解凍；在超凈工作臺(tái)里，用75%的酒精將凍存管外壁消毒；另將3.5mL RPMI1640培養(yǎng)液、0.5mL血清加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，再將1mL凍存管中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，逐滴加入并不時(shí)的搖動(dòng)培養(yǎng)瓶使其均勻；12h后給細(xì)胞換液，除去細(xì)胞凍存液中的DMSO。
（2）細(xì)胞的傳代：
待細(xì)胞長滿80%細(xì)胞培養(yǎng)瓶時(shí)即細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期，傾去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入少量的胰酶蕩洗一次，再加入1.5mL胰酶消化，顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞間質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙清晰時(shí)，棄去胰酶，加入4mL Ham’sF-12K/DMEM/RPMI1640培養(yǎng)液充分吹打至顯微鏡下觀察為單細(xì)胞懸液；分裝懸液細(xì)胞于若干培養(yǎng)瓶中，含10%血清的Ham’sF-12K/DMEM/RPMI1640，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。