本發(fā)明涉及生成新型調(diào)節(jié)性樹突狀細胞及其在免疫治療的用途的領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種利用間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)造血干祖細胞分化成irf4+irf8+調(diào)節(jié)性樹突狀細胞regDC的方法，及其聯(lián)合DC-CIK的新型免疫療法。

背景技術(shù)：

盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展迅速，惡性腫瘤仍然是無法攻克的一大難題。目前，治療惡性腫瘤的方法主要為外科手術(shù)、化學(xué)治療、放射治療和生物學(xué)治療。前三種治療方法為治療大部分早期局限性腫瘤以及放化療敏感性腫瘤提供了選擇。但針對復(fù)發(fā)難治性腫瘤，腫瘤殘留，腫瘤耐藥，生物學(xué)治療具有其他治療方法不可替代的優(yōu)勢。其中，腫瘤免疫學(xué)治療具有特異性強、適用性廣、副作用輕等優(yōu)點，可以有效地殺滅患者術(shù)后和放化療后體內(nèi)殘存的腫瘤細胞，達到治療腫瘤、預(yù)防復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移和最終根治腫瘤的目的。

過繼免疫療法是通過把在體外擴增的大量特異性效應(yīng)細胞回輸給患者后，產(chǎn)生直接殺傷腫瘤細胞的作用。CIK(Cytokine Induced Killer Cell)，細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞，是一種高效殺傷活性的異質(zhì)性細胞群，外周血單個核細胞在體外經(jīng)多種細胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生的一群以CD3+CD56+T為主的異質(zhì)細胞，包括CD4+輔助T細胞，CD8+殺傷性T細胞及NK/T細胞。具有顯著的抗病毒、抗腫瘤活性，具有高效、廣譜殺傷、非MHC限制的特點。其機制為：釋放顆粒酶和穿孔素直接殺傷腫瘤細胞及病毒感染細胞，F(xiàn)as/Fasl通路誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，及分泌細胞因子(IFN-,TNF-,IL-6等)抑制腫瘤生長和病毒復(fù)制，提高機體免疫功能。DC-CIK是將具有高表達MHC-I、II類分子及共刺激分子的樹突狀細胞(即傳統(tǒng)型樹突狀細胞conventional dendritic cell)負載腫瘤抗原，提呈給CIK細胞，進一步增強CIK免疫治療功能的方法。目 前，DC-CIK免疫過繼治療技術(shù)較成熟，在國內(nèi)外得到大量應(yīng)用。

間充質(zhì)干細胞(MSC)是存在于人體多種組織中的具有多系分化潛能的一種亞全能干細胞群。MSCs通過構(gòu)成HSC耐以生存的“niche”(微環(huán)境)以及對造血功能的免疫調(diào)節(jié)兩方面來調(diào)節(jié)骨髓造血功能。在動物實驗及一些臨床研究報道中已證實了其具有體外擴增造血干祖細胞的作用。而且，MSC具有調(diào)節(jié)多種免疫細胞功能的作用。

本發(fā)明擬開發(fā)一種造血干祖細胞來源的irf4+irf8+新的調(diào)節(jié)性樹突狀細胞，其具有增強T及NK細胞分泌IFN-γ及向腫瘤區(qū)遷移免疫功調(diào)節(jié)作用。并且，在腫瘤免疫過繼治療中，采用這種新的調(diào)節(jié)性樹突狀細胞聯(lián)合DC-CIK方案，增強CIK對腫瘤的殺傷作用，達到清除機體內(nèi)殘留腫瘤細胞，消除復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的因素，增大治愈的可能性，延長生存時間，提高生活質(zhì)量。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

因此，本發(fā)明的技術(shù)目的在于，提供一種利用間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)造血干祖細胞分化成富含irf4+irf8+調(diào)節(jié)性樹突狀細胞(irf4+irf8+regDC)的方法，以獲得irf4+irf8+調(diào)節(jié)性樹突狀細胞。該新型調(diào)節(jié)性樹突狀細胞具有獨特的免疫調(diào)節(jié)能力：經(jīng)過CpG ODN刺激，irf4+irf8+regDC促進T細胞增殖及促進CD4+T細胞及CD8+T細胞分泌IFN-γ的免疫調(diào)節(jié)功能；成熟irf4+irf8+regDC能刺激NK細胞擴增及增加其細胞毒性；促進cDC(conventional dendritic cell)，NK細胞和CD8+T細胞向腫瘤組織區(qū)域趨化。利用irf4+irf8+regDC上述三個調(diào)節(jié)免疫功能的作用，將其與DC-CIK細胞免疫治療聯(lián)合，提高DC-CIK抗腫瘤免疫的能力。

一方面，本發(fā)明提供了一種生成成熟的irf4+irf8+調(diào)節(jié)性樹突狀細胞的方法，所述方法包括步驟：

a)分離哺乳動物間充質(zhì)干細胞和造血干細胞；

b)在適合細胞生長和增殖的條件下，共同培養(yǎng)步驟a)中獲得的哺乳動物間充質(zhì)干細胞和造血干細胞；

c)共同培養(yǎng)1至7天后，從懸浮培養(yǎng)液中回收、鑒定得到不成熟的irf4+irf8+調(diào)節(jié)性樹突狀細胞；

d)從步驟c)獲得不成熟的irf4+irf8+調(diào)節(jié)性樹突狀細胞在誘導(dǎo)劑存在下，在適合細胞生長和增殖的條件下培養(yǎng)；

e)從步驟的d)的懸浮培養(yǎng)液中回收成熟irf4+irf8+調(diào)節(jié)性樹突狀細胞。

進一步地，根據(jù)本發(fā)明的方法，其中所述造血干細胞中CD34+造血干細胞含量為80％以上。

進一步地，根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中所述哺乳動物間充質(zhì)干細胞分離自胎盤、骨髓、脂肪組織。

進一步地，根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中步驟b)中的哺乳動物間充質(zhì)干細胞是體外培養(yǎng)至第1至10代的間充質(zhì)干細胞。

進一步地，根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟d)中的誘導(dǎo)劑是CpG ODN?；蚱渌T導(dǎo)本樹突狀細胞成熟的誘導(dǎo)劑。

另一方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的成熟irf4+irf8+調(diào)節(jié)性樹突狀細胞在制備調(diào)節(jié)免疫的藥物中的用途。

另一方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的方法所獲得的細胞懸液，其中所述細胞懸液含有1-99％的成熟irf4+irf8+調(diào)節(jié)性樹突狀細胞。

再一方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的細胞懸液在制備調(diào)節(jié)免疫的藥物中的用途。

另一方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的成熟irf4+irf8+調(diào)節(jié)性樹突狀細胞在制備抗腫瘤的藥物中的用途。

再一方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的細胞懸液在制備抗腫瘤的藥物中的用途。

附圖說明

圖1：體外培養(yǎng)人間充質(zhì)干細胞的形態(tài)。

圖2A至2H：人間充質(zhì)干細胞的免疫表型。

圖3：分選后獲得的外周血CD34+造血干祖細胞形態(tài)。

圖4：分選后獲得的外周血CD34+造血干祖細胞流式檢測表型。

圖5：人間充質(zhì)干細胞與外周血造血干祖細胞共培養(yǎng)細胞形態(tài)，第1天。

圖6：人間充質(zhì)干細胞與外周血造血干祖細胞共培養(yǎng)細胞形態(tài)，第 7天。

圖7：流式檢測間充質(zhì)干細胞與造血干祖細胞共培養(yǎng)后獲得細胞為較單一群體。

圖8：共培養(yǎng)獲得細胞為樹突狀細胞樣形態(tài)。

圖9：流式檢測共培養(yǎng)獲得的樹突狀細胞表型，提示為調(diào)節(jié)性樹突狀細胞。

圖10：western blot檢測共培養(yǎng)獲得樹突狀細胞為irf4、irf8低表達。經(jīng)過含CpG ODN 10μg/ml孵育6h誘導(dǎo)成熟體外刺激后，irf4、irf8表達明顯增強，為成熟調(diào)節(jié)性樹突狀細胞。

圖11-12.irf4+irf8+regDC促進CD4+T淋巴細胞及CD8+T淋巴細胞增殖。

圖13.irf4+irf8+regDC促進CD4+T淋巴細胞及CD8+T淋巴細胞分泌IFN-γ。

圖14.irf4+irf8+regDC對NK細胞的促增殖作用。

圖15.irf4+irf8+regDC促進NK細胞分泌IFN-γ。

圖16.irf4+irf8+regDC與NK細胞及CD8+T細胞具有協(xié)同抗腫瘤作用。

圖17.irf4+irf8+regDC促進cDC，NK細胞及CD8+T細胞向腫瘤組織遷移。

具體實施方式

為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明涉及以下幾個方面：

第一方面，本發(fā)明方法的涉及一種獲得新型樹突狀細胞的方法：

1.間充質(zhì)干細胞的獲?。?/p>

適用于選自不同來源健康無關(guān)供者或親屬(胎盤，骨髓，脂肪等)的，符合國際公認的定義間充質(zhì)干細胞，常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法，體外培養(yǎng)至第2-5代后進行后續(xù)處理。

2.造血干祖細胞的獲?。?/p>

(采用已經(jīng)明確的成熟標(biāo)準(zhǔn)方法獲得)在人體：經(jīng)過G-CSF標(biāo)準(zhǔn)方法動員的外周血單個核細胞混合物，或收集健康供者骨髓，CD34+造血干祖細胞含量為80％以上；

3.間充質(zhì)干細胞與造血干祖細胞共培養(yǎng)：

1)共培養(yǎng)的時機，在共培養(yǎng)前12h先以2×10^4/ml的細胞濃度，將常規(guī)方法獲得的第3代間充質(zhì)干細胞接種于加入24孔板培養(yǎng)，以使其貼壁。12h后加入分離純化的CD34+造血干祖細胞進行共培養(yǎng)。

2)兩種細胞數(shù)目比：間充質(zhì)干細胞與造血干祖細胞之比為1:5～1:10。

3)共培養(yǎng)條件：含100U/ml鏈霉素，100U/ml青霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，5％CO2，37℃恒溫培養(yǎng)。

4)耗材：可根據(jù)實驗需要在24孔板、6孔板或其他具備相同功能材料。

5)培養(yǎng)天數(shù)：1～7天。

6)收獲細胞方法：吸取共陪養(yǎng)體系懸液，PBS洗滌后，收集懸浮細胞待鑒定。

7)鑒定方法：用流式細胞儀法和westernblot檢測誘導(dǎo)生成的調(diào)節(jié)性樹突狀細胞表型及irf4+和irf8+蛋白表達。

第二方面，本發(fā)明的涉及一種新型irf4+irf8+樹突狀細胞：

來源于共培養(yǎng)后獲得的移植物成分：含有1％～99％調(diào)節(jié)性樹突狀細胞造血干祖細胞混合物。

第三方面，本發(fā)明涉及這種新型irf4+irf8+樹突狀細胞具有調(diào)節(jié)多種免疫細胞的能力。

1.經(jīng)過CpG ODN刺激成熟后，irf4+irf8+regDC促進T細胞及NK細胞增殖；

2.成熟irf4+irf8+regDC能促進T細胞及NK細胞分泌IFN-γ；

3.成熟irf4+irf8+regDC能促進多種免疫細胞向腫瘤組織趨化；

4.成熟irf4+irf8+regDC能抑制腫瘤生長。

第四方面，本發(fā)明涉及應(yīng)用這種新型irf4+irf8+調(diào)節(jié)性樹突狀細胞聯(lián)合DC-CIK進行腫瘤免疫治療。

1.irf4+irf8+regDC的應(yīng)用時間

在開始DC-CIK治療每個療程的前一天進行回輸上述誘導(dǎo)獲得的irf4+irf8+regDC，第二天開始，進行DC-CIK細胞的誘導(dǎo)、培養(yǎng)、擴增和回輸(根據(jù)臨床常規(guī)方案)。

2.irf4+irf8+regDC的應(yīng)用劑量

經(jīng)靜脈給予輸注10⁶/kg含1％-99％的irf4+irf8+regDC的造血干祖細胞混合物。

3.irf4+irf8+regDC的回輸方式：

與DC-CIK回輸方式相同。靜脈輸注。

4.DC-CIK回輸?shù)陌才牛?根據(jù)臨床情況可靈活安排)

1)效應(yīng)T淋巴細胞回輸：2～3個療程，8次/療程，1×10^9/次。細胞擴增至第4-5天后，凍存細胞，回輸前復(fù)蘇。

2)DC-CIK回輸：1×10^9/次，2～4次/療程。每次取出部分細胞回輸，余下細胞添加培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

本發(fā)明的共培養(yǎng)誘導(dǎo)方法適用于各種組織來源的2～5代次間充質(zhì)干細胞。該誘導(dǎo)培養(yǎng)方法無病毒導(dǎo)入、易操作、效率較高。

本發(fā)明還利用共培養(yǎng)收獲的irf4+irf8+調(diào)節(jié)性樹突狀細胞對機體多種免疫細胞具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能。通過間充質(zhì)干細胞與造血干祖細胞移植物共培養(yǎng)的方法，誘導(dǎo)后者生成富含irf4+irf8+調(diào)節(jié)性樹突狀細胞移植物，并聯(lián)合臨床DC-CIK細胞治療針對腫瘤免疫過繼治療的過程，可簡述為：

將脂肪組織或骨髓以標(biāo)準(zhǔn)方法收獲的間充質(zhì)干細胞，標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)獲得的第3代間充質(zhì)干細胞以一定密度接種于培養(yǎng)瓶，待其長滿后，以1：5～1：10比例加入來源于骨髓或外周血造血干祖細胞共培養(yǎng)1～7天后，分離共培養(yǎng)體系產(chǎn)生的懸浮細胞，鑒定占收獲共培養(yǎng)細胞的1％～99％的irf4+irf8+調(diào)節(jié)性樹突狀細胞的產(chǎn)生，并對該細胞的特殊免疫功能進行驗證。即:1.經(jīng)過CpG ODN刺激成熟后，irf4+irf8+regDC促進T細胞及NK細胞增殖；2.成熟irf4+irf8+regDC能促進T細胞及NK細胞分泌IFN-γ；3.成熟irf4+irf8+regDC能促進多種免疫細胞向腫瘤組織趨化；4.成熟irf4+irf8+regDC能抑制腫瘤生長。最后，將這種新型irf4+irf8+的regDC與臨床DC-CIK方案聯(lián)合進行抗腫瘤免疫治療。

本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，本發(fā)明所列出的上述培養(yǎng)和誘導(dǎo)的方法步驟僅是例證的目的，可能并非實現(xiàn)本發(fā)明所述方法的最佳方案，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對上述方法步驟做出適當(dāng)?shù)母淖兌阅軐崿F(xiàn)本發(fā)明的目的，這樣的改動也落入本發(fā)明要求保護的范圍。當(dāng)然，本發(fā)明所述 方法所使用的間充質(zhì)干細胞并不限于第3代間充質(zhì)干細胞，其來源可選擇骨髓、脂肪組織、臍帶以及其他國際認可的間充質(zhì)干細胞來源組織。應(yīng)用本發(fā)明的irf4+irf8+調(diào)節(jié)性樹突狀細胞進行聯(lián)合DC-CIK治療的方法、劑量及應(yīng)用時間并不局限本發(fā)明的方案。

本發(fā)明方法得到的間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)供者造血干祖細胞分化成富含irf4+irf8+調(diào)節(jié)性樹突狀細胞，利用后者的免疫調(diào)節(jié)特性，聯(lián)合DC-CIK方案對腫瘤患者體內(nèi)殘留惡性細胞進行殺傷，以達到進一步提高腫瘤免疫療效的目的。為臨床上清楚手術(shù)及放化療后病人體內(nèi)殘留惡性細胞，減少復(fù)發(fā)率，提高治愈率提供了新的免疫過繼療法。

實施例

實施例1主要實驗試劑及耗材

(1)主要實驗試劑

青霉素、鏈霉素和胰蛋白酶-EDTA購自GIBCO公司。

人淋巴細胞分離液(Ficoll，天津灝洋生物制品公司)

抗體：小鼠抗人CD11c，CD80,CD40,CD86,CD29、CD34、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106，CD117、Flk-1、HLA-ABC、CD3單抗、CD28單抗和HLA-DR抗體，抗小鼠NK1.1mAb，抗小鼠CD8+T細胞mAb，兔抗小鼠CD16/CD56,CD8,CD3,CD19流式抗體(Becton Dickinson公司，biolegend公司)；

CpG ODN(invitrogen公司)；

磁珠分選試劑盒：CD34，CD4，CD8，NK細胞(MiltenyiBiotec公司)；

ELISA試劑盒：IFN-γ(BD Pharmingen公司)；

CFSE染色液試劑盒(碧云天公司)

細胞培養(yǎng)液成分：MCDB(Sigma公司)，DMEM/F-12(GibcoBRL公司)，RPMI-1640(GibcoBRL公司)，X-VIVO-15，gt-t551無血清培養(yǎng)基(BioWhittaker公司)；D-Hanks平衡鹽溶液，F(xiàn)icoll(1.077g/cm3)(Pharmacia公司)；胎牛血清(Gibco公司)；

胰蛋白酶(GibcoBRL公司)，EDTA(天津市化學(xué)試劑一廠)；谷氨酰胺(GibcoBRL公司)，地塞米松，β-甘油磷酸鈉，抗壞血酸， 牛血清白蛋白(Sigma公司)；

(2)主要實驗相關(guān)耗材

15ml，50ml離心管，T-25cm2、T-75cm2細胞培養(yǎng)瓶(costar公司)、24孔板，96孔凹底培養(yǎng)板(Corning公司)

(3)實驗動物和細胞

B16黑色素瘤細胞系購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細胞中心；SPF級C57BL/6小鼠購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，飼養(yǎng)在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所動物中心。

實施例2、irf4+irf8+調(diào)節(jié)性樹突狀細胞(irf4+irf8+regDC)的體外誘導(dǎo)方法

步驟1.人骨髓來源的第三代間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定(圖1-2)

(1)分離

1.無菌采集健康志愿者的骨髓5-10ml于無菌的肝素管中。

2.取一無菌的離心管，用D-Hanks液適當(dāng)稀釋骨髓。

3.取一新的離心管，分別加入恢復(fù)至室溫的Ficoll和上述稀釋后的骨髓，加入時仔細操作勿破壞界面,二者的比例為1:1。

4.將上述離心管配平后放入常溫臺式離心機中,20℃以1800轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心20分鐘。取出離心管后，無菌操作仔細吸取白膜層即獲得了單個核細胞，將單個核細胞用D-Hanks液洗滌兩次并計數(shù)。

(2)培養(yǎng)

1.將上述單個核細胞以1×10^6/cm2的密度接種于25cm2的培養(yǎng)瓶中，細胞培養(yǎng)體系均為含58％DMEM/F12+40％MCDB-201、2％胎牛血清(FCS)、10ng/ml EGF、10ng/ml PDGF，1×胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸(Insulin-Transferrin-Selenium，ITS)、1×亞油酸-牛血清白蛋白(linoleic acid-bovine serum albumin，LA-BSA)，50μMβ巰基乙醇，2mM L-谷氨酰胺，100μg/ml青霉素和100U/ml硫酸鏈霉素的培養(yǎng)液，37℃、5％CO2、95％濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2. 24小時后，去除懸浮細胞，補充培養(yǎng)基，細胞每隔三天換液一次，待細胞長至70-80％匯合時，用0.125％胰蛋白酶+0.01％EDTA消化傳代。3-4代的間充質(zhì)干細胞凍存于液氮罐備用。

當(dāng)然，本發(fā)明也可以使用本領(lǐng)域公知的其他間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)方法來獲得第3代間充質(zhì)干細胞或者直接使用市售可得的第3代間充質(zhì)干細胞而無需自行分離培養(yǎng)獲得。

(3)鑒定

1.前兩步得到的第3代間充質(zhì)干細胞的細胞形態(tài)見圖1。

2.用間接免疫熒光法檢測第3代間充質(zhì)干細胞的表型，用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的小鼠抗人CD29、CD34、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106，CD117、Flk-1、HLA-ABC和HLA-DR抗體(抗體均購自BD公司)標(biāo)記后進行流式檢測，流式細胞儀為ACCURI C6(Becton Dickinson)。

結(jié)果見圖2，橫坐標(biāo)表示細胞熒光強度，縱坐標(biāo)表示細胞數(shù)；P1表示所選細胞群體。表型結(jié)果顯示，第3代間充質(zhì)干細胞的CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、Flk-1和HLA-ABC均為陽性，CD34、和HLA-DR分子均為陰性。

步驟2.人外周血來源造血干祖細胞的提取和鑒定(圖3-4)

提取

1.采用rhG-CSF 5μg/kg/d，連續(xù)5天，皮下注射動員造血干祖細胞到外周血。

2.取用肝素抗凝管采血10ml，以含0.6％ACD-A的PBS 1:1體積稀釋一倍。

3.將Ficoll與外周血以1:2體積分層置于離心管，小心將血緩慢的加于Ficoll上，切勿使界面混淆，置于4℃水平離心機中離心(1800rpm，20min)。關(guān)閉離心機剎車，待自動緩慢停機后，取出離心管，可見管內(nèi)界面清楚，分為4層，自上而下依次為：血漿，單個核細胞層，F(xiàn)icoll液，粒細胞和紅細胞層。

4.用毛細吸管輕輕插到單個核細胞層(白膜層)上，小心將白膜層細胞吸入管內(nèi)，移入另一試管中，盡量勿吸下層的Ficoll液。加入含0.6％ACD-A的PBS離心洗滌3次(1000rpm,10min)。

5.棄上清，加入含0.6％ACD-A的PBS 300μl，準(zhǔn)備行免疫磁珠分離純化CD34+細胞。

6.檢查細胞活力，將1滴細胞懸液加1滴2％臺盼藍液，5min后 檢查200個細胞中有多少核染深藍色的細胞(死細胞)，求出百分比。活細胞比例要求在95％以上。

X＝配制培養(yǎng)體系總體積(ml)×4/4個大格的有核細胞總數(shù)(ml)

結(jié)果：其純度大于96％，臺盼蘭染色觀察單個核細胞活性，存活細胞率大于95％。

7.將1×10^8個單個核細胞層懸于300μl 0.5％BSA和0.6％ACD-A的PBS緩沖溶液中，加入Fc受體阻斷劑100μl，以阻斷Fc受體介導(dǎo)的非特異結(jié)合。

加入100μl抗CD34免疫磁珠，混勻后在4℃孵育30min。離心洗滌2次(1000rpm,10min)，加500μl緩沖溶液懸浮。

8.將分離柱固定于MACS磁場內(nèi)，將標(biāo)記細胞緩慢通過MiniMACS分離柱，洗脫去除CD34-細胞。

9.將分離柱移出磁場，加1ml MACS緩沖液加壓洗脫分離柱,收集組分為CD34+細胞并計數(shù)。

(2)鑒定

光鏡下觀察收獲的CD34+造血干祖細胞，呈小圓形。

用流式細胞儀分析磁珠分選后CD34+細胞純度，純度約98.9％。

步驟3.骨髓間充質(zhì)干細胞和造血干祖細胞共培養(yǎng)方法(圖5-6)

1.將骨髓間充質(zhì)干細胞以2×10^4/ml的細胞濃度加入24孔板培養(yǎng)，使其貼壁。

2.吸去間充質(zhì)干細胞原有培養(yǎng)基，加入免疫磁珠分選收獲的CD34+造血干祖細胞(兩者比例為5:1)及RPMI-1640完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

3.培養(yǎng)條件：含100U/ml鏈霉素，100U/ml青霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，5％CO2，37℃恒溫培養(yǎng)。

4.培養(yǎng)過程中，為防止間充質(zhì)干細胞分化及凋亡，每3-4天用新的間充質(zhì)干細胞置換。具體方法：

(1)先吸出懸浮細胞，置于離心管內(nèi)。

(2)用0.125％胰蛋白酶+0.01％EDTA消化貼在間充質(zhì)干細胞上的細胞。

(3)用Ficoll去除死細胞和間充質(zhì)干細胞。

(4)將獲得的細胞和(1)中懸浮細胞混合，洗滌后計數(shù)，并加入貼有新間充質(zhì)干細胞的24孔板繼續(xù)培養(yǎng)。

5.在培養(yǎng)結(jié)束時，細胞立即經(jīng)PBS洗滌后用流式細胞儀檢測細胞表型。

實施例3、irf4+irf8+調(diào)節(jié)性樹突狀細胞(irf4+irf8+regDC)的形態(tài)及鑒定

(1)形態(tài)(圖7)

由間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)造血干祖細胞生成的調(diào)節(jié)性樹突狀細胞(regDC)在光鏡下觀察，可見細胞膜有突觸生成。

(2)表面標(biāo)志因子鑒定(圖8)

檢測有關(guān)細胞表面標(biāo)志因子及共刺激分子的表達，提示誘導(dǎo)生成的新型調(diào)節(jié)性樹突狀細胞(regDC)低表達CD11c，弱表達CD80,CD86,CD40。

(3)誘導(dǎo)生成調(diào)節(jié)性樹突狀細胞數(shù)量(圖9)

經(jīng)過間充質(zhì)干細胞與造血干祖細胞共培養(yǎng)7天后，收獲懸浮細胞。流式檢測提示獲得較單一群細胞，約占全部懸浮細胞的56.9％。

(4)調(diào)節(jié)性樹突狀細胞的誘導(dǎo)成熟方法

共培養(yǎng)獲得的regDC以每孔5-10×10^4個細胞濃度接種于96孔板中，用含CpG ODN 10μg/ml孵育6h的X-VIVO-15無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3天。收獲懸浮細胞后即成熟regDC。

(5)Westernblot檢測共培養(yǎng)后不成熟及誘導(dǎo)成熟后regDC的特征性蛋白irf4，irf8的表達(圖10)

irf4，irf8為炎癥調(diào)控相關(guān)蛋白，同時也是樹突狀細胞的發(fā)育調(diào)控分子。在共培養(yǎng)1～7天后，兩個蛋白為低表達，即irf4+irf8+低表達的regDC。而當(dāng)使用CpG ODN誘導(dǎo)regDC成熟后，irf4，irf8兩個蛋白表達明顯增強，即irf4+irf8+強表達的regDC。而作為對照的GAPDH蛋白不變。具體方法參照westernblot常規(guī)實驗步驟。

實施例4、irf4+irf8+調(diào)節(jié)性樹突狀細胞(irf4+irf8+regDC)的免疫調(diào)節(jié)功能

(1)促進CD4+T淋巴細胞及CD8+T淋巴細胞增殖(見圖11-12)

本實驗檢測共培養(yǎng)誘導(dǎo)獲得的低表達irf4+irf8+的不成熟regDC和 誘導(dǎo)成熟后高表達irf4+irf8+的regDC對CD4+T淋巴細胞的促增殖反應(yīng)。見圖11,12。提示受激活成熟的irf4+irf8+regDC具有促進T細胞增殖作用。具體步驟如下：

1.收集共培養(yǎng)后irf4+irf8+regDC并使用CpG ODN 10μg/ml孵育6h誘導(dǎo)成熟，加入到96孔培養(yǎng)板中，每孔1×10^5個細胞。

2.取用肝素抗凝的健康志愿者外周血5ml，用含2mM EDTA和0.5％BSA的PBS緩沖溶液1:1體積稀釋。用Ficoll液分離白膜層單個核細胞。

3.依照Miltenyi MACS說明方法使用抗CD4及CD8免疫磁珠分選出CD4+T淋巴細胞及CD8+T淋巴細胞。用流式細胞儀分析兩種細胞純度。

4.分選后經(jīng)PBS洗滌，加等量CFSE稀釋液(5μM)入淋巴細胞懸液中，充分混勻，37℃下輕蕩10分鐘后，加入等量冰冷RPMI1640(10％胎牛血清)中止反應(yīng)，1分鐘后PBS洗滌兩次，懸浮于完全培養(yǎng)基備用；

5. 2×10^5人外周血CD4+T細胞及CD8+T細胞各100μl，加入含有共培養(yǎng)誘導(dǎo)獲得的未成熟和誘導(dǎo)成熟后irf4+irf8+regDC的96孔U型底培養(yǎng)板中。37℃，5％CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)7天。

6.收集培養(yǎng)的淋巴細胞，PBS洗滌后上流式細胞儀檢測CFSE陽性細胞數(shù)。

(2)促進CD4+T淋巴細胞及CD8+T淋巴細胞分泌IFN-γ(圖13)

將上述實驗獲得的CD4+T淋巴細胞及CD8+T淋巴細胞用ELISA法檢測其分泌IFN-γ的能力。相比不成熟rf4+irf8+regDC，CpG ODN激活的rf4+irf8+regDC具有促進兩種淋巴細胞分泌更多IFN-γ的能力。(共培養(yǎng)3天)

(3)刺激后對NK細胞的促增殖作用及促進NK細胞分泌IFN-γ(圖14-15)

本實驗檢測共培養(yǎng)誘導(dǎo)獲得的不成熟regDC和誘導(dǎo)成熟后的regDC促增殖作用及促進NK細胞分泌IFN-γ。見圖13,14。具體步驟如下：

1.首先從健康志愿者外周血單個核細胞中采用Miltenyi MACS磁 珠分選出NK細胞，方法同前。

2.將分選得到的NK細胞分別與irf4+irf8+regDC以1:1比例于RPMI-1640中共培養(yǎng)7天。

4.收集細胞上清，用ELISA測細胞因子IFN-γ的濃度。

5.應(yīng)用CFSE染色(具體方法同上)法檢測NK細胞增殖能力。

(4)irf4+irf8+regDC與NK細胞及CD8+T細胞具有協(xié)同抗腫瘤作用(圖16)

1.構(gòu)建B16皮下移植瘤小鼠模型：每組6只C57BL/6小鼠。腋下皮下注射5×10^5B16腫瘤細胞連續(xù)6天；

2.第7天瘤內(nèi)注射未活化或CpG處理6h后的regDC 2×10^6，檢測腫瘤大小變化；

3.PBS對照組為空白對照；

4.另外兩組對照組處理：

1)去除體內(nèi)CD8+T細胞：-2～0天，使用抗小鼠CD8+T細胞mAb靜脈注射200μg/只/天，此外實驗期間每6天重復(fù)劑量腹腔注射一次。協(xié)同CpG活化的regDC處理；

2)去除體內(nèi)NK細胞：-2，-1，0，2天，使用抗小鼠NK1.1mAb100μg/只/天協(xié)同CpG活化的regDC處理；

5.處死動物，取出腫瘤組織，計算腫瘤最寬處橫斷面面積以評估大?。?/p>

6.可見CpG活化的regDC具有抗腫瘤生長的功能，并且與NK細胞及CD8+T細胞具有協(xié)同抗腫瘤的作用。

(5)促進cDC，NK細胞及CD8+T細胞向腫瘤組織遷移(圖17)

1.上述條件干預(yù)第14天，處死B16荷瘤小鼠，膠原酶消化腫瘤組織，提取單個核細胞，流式分析腫瘤組織中cDC(傳統(tǒng)型樹突狀細胞，表達CD11+,CD3-,CD19-)、NK細胞(CD3-,CD16+/CD56+)及CD8+T細胞的數(shù)目(每立方厘米體積腫瘤組織)；

2.提示相比PBS及未活化regDC組，CpG活化的regDC處理組誘導(dǎo)cDC、NK細胞及CD8+T細胞向腫瘤組織區(qū)遷移。

實施例5、irf4+irf8+調(diào)節(jié)性樹突狀細胞聯(lián)合DC-CIK進行腫瘤免疫 治療。

步驟1.irf4+irf8+regDC的應(yīng)用劑量及時間

在開始DC-CIK治療的第一天，經(jīng)靜脈給予輸注10⁶/kg含1％-99％的經(jīng)CpG ODN-2216(10ug/ml)激活的irf4+irf8+regDC的造血干祖細胞混合物；第二天開始，進行DC-CIK細胞的誘導(dǎo)、培養(yǎng)、擴增和回輸(根據(jù)臨床常規(guī)方案)。

步驟2.進行DC-CIK治療的準(zhǔn)備

采集患者外周血70ml(也可通過血液分離機采集)，常規(guī)分離白膜層單個核細胞。生理鹽水重懸細胞后分成三份，各50ml。分別做DC-CIK(第一療程培養(yǎng))，DC-CIK(第二療程培養(yǎng)，先凍存)，效應(yīng)T淋巴細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)(兩療程)。離心2300rpm，10min，棄上清后，用2ml的gt-t551培養(yǎng)基重懸DC-CIK，效應(yīng)T淋巴細胞加入40ml的X-15培養(yǎng)基。

步驟3.效應(yīng)性T淋巴細胞的誘導(dǎo)、培養(yǎng)和擴增

1)CD3包被瓶的準(zhǔn)備：取192ul的CD3單抗(1mg/ml)加入到96ml的PBS(PH為8.6-9.2)，混勻后加入到8個T75培養(yǎng)瓶中，每瓶12ml，搖勻后平置于4°冰箱，24h后方可使用(一個療程需要4個包被瓶)。使用前，每瓶15ml鹽水靜置兩分鐘，洗兩遍；

2)向包被瓶中各加入20ml X-15培養(yǎng)基+2.5ml的細胞懸液，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)；剩余的20ml細胞懸液置于超凈臺內(nèi)(大離蓋子不要蓋緊)，6h后使用；

3)3h后加入anti-CD28(以下均為終濃度)2μg/ml，IL-2100U/ml，IL-1210ng/ml，IL-410μg/ml；

4)6h后將超凈臺內(nèi)剩余的20ml細胞懸液平均加入到8個培養(yǎng)瓶內(nèi)，放入培養(yǎng)箱后繼續(xù)培養(yǎng)；

5)22h后收集培養(yǎng)基和瓶底細胞，鹽水洗滌兩次，2300rpm，10min離心后將8個培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞合并在1個離心管中；

6)將細胞懸液離心去上清，加入20ml X-15重懸細胞，并加入CD3單抗1μg/ml，anti-CD281μg/ml，IL-2(10μg/L)，IL-7(10μg/L)，到8個T175瓶中(每個培養(yǎng)瓶各含80-100ml X-15+8ml血漿)，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

7)觀察細胞的生長情況，第4-5天凍存細胞。

步驟4.DC-CIK的準(zhǔn)備

1)準(zhǔn)備3個T75瓶，分別標(biāo)記DC、CIK、CIK，向DC瓶中加入19ml 1640，另兩個CIK瓶內(nèi)各加入19ml T551培養(yǎng)基+1ml血漿；

2)將分離好的第一療程的DC-CIK(2ml細胞懸液)以700ul，600ul，600ul的分別加入到DC瓶和兩個CIK瓶內(nèi)；

3)向兩個CIK瓶內(nèi)分別加入20ul的rhIFN-γ1000u/ml后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)；

步驟5.DC的誘導(dǎo)、培養(yǎng)和擴增(這里的DC指的是傳統(tǒng)型樹突狀細胞cDC)

1)細胞懸液DC瓶放入培養(yǎng)箱1.5h后換液，加入14ml gt-t551(含300U/L IL-2)培養(yǎng)基+1ml血漿+15ul 1000U/ml IL-4+10.65ul 1000U/L GM-CSF(加入的時候不要吹打細胞面，DC是貼壁細胞)；

2)第3天，補加1ml血漿+15ul 1000U/ml IL-4+15ul 1000U/L GM-CSF；

3)第5天，未成熟DC收獲(豎直培養(yǎng))：

用培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)基吹打細胞面，鹽水洗瓶2次，離心1500rpm，6min去上清，吸取10ml培養(yǎng)基，8ml加入到1個T75瓶中，2ml加入到離心管中，重懸細胞；

4)向離心管中分別加入10ul 1000U/ml IL-4+10ul 1000U/L GM-CSF+10ul 10ng/ml TNF-α+500ul血漿，轉(zhuǎn)移至T75瓶中于培養(yǎng)箱中豎直培養(yǎng)；

5)第7天，收獲成熟DC：

培養(yǎng)基吹打瓶底，用10ml鹽水洗瓶底2次，將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，轉(zhuǎn)移至離心管中，離心，1500rpm，8min，去上清，加入2ml gt-t551(含300U/L IL-2)，混勻，用5ml注射器轉(zhuǎn)移至DC-CIK培養(yǎng)袋中。

步驟6.CIK細胞的誘導(dǎo)、培養(yǎng)和擴增

1)上接4.-3)，24h后補加因子：20ul 300U/L IL-2，60ul 100U/L IL-1α，20ul anti-CD3抗體50ng/L；

2)第4天，補加19ml gt-t551(含300U/L IL-2)和1ml血漿，置 于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；

3)第6天，轉(zhuǎn)袋(最終體系為240ml)：將2瓶CIK瓶中的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)袋中，按順序加入下述液體：15ml GT-T551(含300U/L IL-2)(洗瓶后)，8ml血漿(5％)，152ml T551(含300U/L IL-2)，培養(yǎng)袋中最終的體系為240ml。蓋帽，加緊管子，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4)第8天，填液480ml(5％血漿+gt-t551培養(yǎng)基(含il-2))，最終體系為720ml；

5)第10天，填液720ml(5％血漿+gt-t551培養(yǎng)基(含il-2))，最終體系為1440ml(抽取袋中的5ml留樣，同時在這一天進行效應(yīng)T淋巴細胞的第一次回輸)

步驟7.DC-CIK的回輸

1)DC-CIK回輸：1×10^9/次，4次/療程。每次取出部分回輸，余下添加培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

2)將培養(yǎng)袋搖勻后，倒出500ml的培養(yǎng)液于10個50ml離心管中，并留取200ul用于計數(shù)，離心，2000rpm，8min；

3)離心結(jié)束后，去上清，用10ml鹽水重懸細胞，10管并1管，再用10ml鹽水洗管2次，補充鹽水至50ml；

4)離心，2000rpm，8min，去上清，用移液槍吸取3ml鹽水吹勻細胞，再吸取2ml鹽水洗槍頭，補充鹽水至50ml；

5)離心，1800rpm，8min，上清留樣(內(nèi)毒素檢測)，用移液槍從離心管中取3ml鹽水吹勻細胞，再取1ml鹽水洗槍頭(2次)，加入1ml血漿，200ul 300U/L IL-2(鹽水混勻)，混勻，用20ml注射器將細胞懸液轉(zhuǎn)移至100ml轉(zhuǎn)移袋中；

6)取10ml鹽水洗管，再轉(zhuǎn)移到100ml轉(zhuǎn)移袋內(nèi)，補充80ml鹽水至100ml轉(zhuǎn)移袋中，熱合管子，送樣；

7)向培養(yǎng)袋中補加適量的GT-T551(含300U/L IL-2)(第一次280ml；第2次補加180ml，第3次補加100ml)混勻，取5ml培養(yǎng)液菌檢，蓋帽，放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

步驟8.效應(yīng)T淋巴細胞回輸

1)效應(yīng)T淋巴細胞回輸：共三個療程，8次/療程，1×10^9/次。細胞擴增至第4-5天后，凍存細胞，回輸前復(fù)蘇。

2)將化凍的效應(yīng)T淋巴細胞轉(zhuǎn)移到大離中，混勻，離心，1200rpm，6min；

3)去上清，加入20ml鹽水混勻，離心，1200rpm，6min；

4)上清留樣(內(nèi)毒素檢測)，取2ml鹽水重懸細胞，再取7ml鹽水洗移液管，加入1ml7號液；用注射器將細胞懸液轉(zhuǎn)入100ml轉(zhuǎn)移袋中；留取20ul細胞懸液用于計數(shù)和活力；

5)向大離中加入10ml鹽水洗管，用注射器轉(zhuǎn)移至100ml轉(zhuǎn)移袋中，再向轉(zhuǎn)移袋中補充鹽水40ml，熱合管子，準(zhǔn)備回輸。