本發(fā)明涉及藥物合成技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利那洛肽的合成方法。
背景技術(shù)：
利那洛肽是一種GC-C(腸上皮細(xì)胞尿苷酸環(huán)化酶C)受體激動(dòng)劑，2012年8月美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療成人慢性特發(fā)性便秘和便秘型腸易激綜合癥(IBS-C)。該藥物由Ironwood制藥公司開發(fā)，化合物結(jié)構(gòu)為14個(gè)氨基酸組成的含有三對(duì)二硫鍵的多肽，可以通過(guò)細(xì)胞表達(dá)和化學(xué)合成制得，其結(jié)構(gòu)如下：
Benitez等人2010年在Peptide Science上進(jìn)行了相關(guān)的報(bào)道。文獻(xiàn)中采用三種方法對(duì)利那洛肽進(jìn)行嘗試性的合成。方法(1)：采用Trt為Cys的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，用Fmoc固相肽合成方法完成線性肽的合成，得到粗肽后用液相氧化的方法一步氧化得到目標(biāo)肽；方法(2)：采用Trt和Acm為Cys側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，F(xiàn)moc固相肽合成方法得到部分保護(hù)的線性肽，然后用半選擇的策略完成二硫鍵的合成；方法(3)：分別采用[2Mmt+2Acm+2Trt]、[2Acm+2Trt+2pMeOBzl]、[2StBu+2Trt+2pMeOBzl]三種完全選擇性策略合成利那洛肽。
方法(1)中，雖然合成步驟簡(jiǎn)單，只使用了一種Cys的保護(hù)基團(tuán)。但是，對(duì)于需要定位形成三對(duì)二硫鍵的肽來(lái)說(shuō)，隨機(jī)氧化會(huì)得到許多種不同的二硫鍵錯(cuò)配異構(gòu)體，盡管可以通過(guò)一些緩沖溶液體系來(lái)使得氧化過(guò)程中盡可能大的轉(zhuǎn)變?yōu)槟繕?biāo)分子，但是始終無(wú)法避免其他異構(gòu)體的產(chǎn)生。這種操作容易使得目標(biāo)肽粗肽純化偏低，收率不高，很難進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。同時(shí)，采用該方法進(jìn)行氧化，對(duì)外界條件比如溫度 等的依賴性也非常高，在不同的環(huán)境下，自然氧化所得到的產(chǎn)品收率相差也非常大，不利于產(chǎn)品質(zhì)量的控制。方法(2)為一種半選擇性定位氧化的方法，相對(duì)于方法(1)，定位氧化了一對(duì)二硫鍵，降低了形成不同異構(gòu)體形成的數(shù)量，但是同樣無(wú)法避免異構(gòu)體的產(chǎn)生。同時(shí)，論文中也直接提到，采用碘氧化形成兩對(duì)二硫鍵，粗肽收率將嚴(yán)重下降。方法(3)中，研究者選擇采用三種不同的完全選擇性形成三對(duì)二硫鍵，但均未得到目標(biāo)產(chǎn)物。
目前，針對(duì)利那洛肽還未有比較高效的制備方法。中國(guó)專利CN 104231051A、CN 104628826A、CN 104163853A、CN 104844693A、CN 102875655A介紹了一步氧化形成三對(duì)二硫鍵的方法：首先合成利那洛肽樹脂，然后將利那洛肽樹脂裂解脫除所有保護(hù)基和樹脂固相載體得到利那洛肽線性粗肽，最后對(duì)線性肽采用氧化體系進(jìn)行一步氧化反應(yīng)。其中CN 104231051A、CN 104163853A、CN 102875655A采用GHS/GSSH氧化體系；CN 104628826A采用單質(zhì)碘在pH＝6-13的磷酸鈉緩沖溶液中氧化；CN 104844693A采用半胱氨酸鹽酸鹽/DMSO緩沖溶液氧化體系。雖然一步氧化法能夠通過(guò)緩沖體系使線性肽盡量向目標(biāo)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，但仍然無(wú)法避免二硫鍵錯(cuò)配異構(gòu)體雜質(zhì)的產(chǎn)生，收率較低。
由此可見，亟需探索一種反應(yīng)條件溫和、成本低、收率高、產(chǎn)物純度高、工藝簡(jiǎn)單且工藝穩(wěn)定、適用于規(guī)?；a(chǎn)的利那洛肽合成方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明針對(duì)上述合成方法中存在的由于二硫鍵錯(cuò)配而產(chǎn)生異構(gòu)體雜質(zhì)，致使產(chǎn)物的純度和收率偏低的問(wèn)題，提供一種采用完全選擇性形成三對(duì)二硫鍵合成利那洛肽的方法，從而實(shí)現(xiàn)定向高效合成三對(duì)全交叉的二硫鍵。
本發(fā)明方法中所使用的原料成本較低，特別是在形成第三對(duì)二硫鍵過(guò)程中采用較便宜的甲基保護(hù)的半胱氨酸，并且一步同時(shí)脫甲基和形成第三對(duì)二硫鍵，操作簡(jiǎn)單、成本低，具有經(jīng)濟(jì)實(shí)用的價(jià)值。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下：
一種利那洛肽的制備方法，包括如下步驟：
1)制備利那洛肽前體樹脂：Fmoc-Tyr(tBu)-OH和載體樹脂反應(yīng)，獲得Fmoc-Tyr(tBu)-樹脂；以Fmoc-Tyr(tBu)-樹脂為固相載體，采用逐一偶聯(lián)的方式按照C端到N端的順序偶聯(lián)Fmoc-AA-OH，獲得利那洛肽前體樹脂，其中對(duì)應(yīng)利那洛肽第5、13位的Cys側(cè)鏈采用Me保護(hù)，對(duì)應(yīng)利那洛肽第1、6位的Cys側(cè)鏈采用Mmt保護(hù)，對(duì)應(yīng)利那洛肽第2、10位的Cys側(cè)鏈采用Dpm保護(hù)；
2)用脫保護(hù)劑脫除步驟1)所得的利那洛肽前體樹脂的Mmt保護(hù)基團(tuán)；
3)用氧化劑氧化步驟2)所得的利那洛肽前體樹脂，形成第一對(duì)二硫鍵，得到含單二硫環(huán)的利那洛肽前體樹脂；
4)用裂解液切割步驟3)所得的含單二硫環(huán)的利那洛肽前體樹脂中的樹脂，同時(shí)脫除Dpm保護(hù)基團(tuán)，得到單二硫環(huán)肽；
5)用氧化劑氧化步驟4)所得的單二硫環(huán)肽，形成第二對(duì)二硫鍵，得到雙二硫環(huán)肽；
6)脫除步驟5)所得的雙二硫環(huán)肽中Cys的甲基保護(hù)基團(tuán)，同時(shí)氧化形成第三對(duì)二硫鍵，得到利那洛肽。
在本發(fā)明的制備利那洛肽的方法中，步驟1)中所述的載體樹脂為wang樹脂或2-氯樹脂，樹脂替代度為0.1-1.0mmol/g，優(yōu)選0.2-0.8mmol/g，更優(yōu)選0.2-0.5mmol/g。
在本發(fā)明的制備利那洛肽的方法中，步驟1)中所述的按照C端到N端的順序偶聯(lián)Fmoc-AA-OH依次為Fmoc-Cys(Me)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Dpm)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Mmt)-OH、Fmoc-Cys(Me)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Dpm)-OH、Fmoc-Cys(Mmt)-OH。獲得利那洛肽前體樹脂的方法包括：
a)Fmoc-Tyr(tBu)-OH和載體樹脂反應(yīng)，獲得Fmoc-Tyr(tBu)-樹脂；
b)脫除Fmoc，接著用溶劑洗滌樹脂，直至用檢測(cè)方法檢測(cè)到完全脫除Fmoc為止；
c)將合適量的待偶聯(lián)氨基酸和偶聯(lián)劑在溶劑中溶解并活化后，一起加入到固相反應(yīng)柱中，直至用檢測(cè)方法檢測(cè)到反應(yīng)終止為止；
d)重復(fù)b)和c)；
其中，應(yīng)用的檢測(cè)方法是本領(lǐng)域已知的可實(shí)現(xiàn)此目的的任意方法，例如色譜法或化學(xué)標(biāo)定法，優(yōu)選使用可判定反應(yīng)終點(diǎn)的試劑，優(yōu)選茚三酮。當(dāng)使用茚三酮時(shí)，若樹脂顯色則說(shuō)明多肽中有游離的胺，即胺上無(wú)保護(hù)基。
其中，在步驟b)中脫除Fmoc的試劑為20％的哌啶/DMF溶液(DBLK)，即哌啶：DMF(體積比)為1:4的混合溶液。
其中，在步驟c)中所述偶聯(lián)劑為DIC和化合物A的組合物或DIPEA和化合物A和化合物B的組合物，其中化合物A為HOBt或HOAt，化合物B為PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU或TBTU，優(yōu)選為DIC和化合物A的組合物。進(jìn)一步地，偶聯(lián)劑中各成分的比例以摩爾比計(jì)為DIC:A＝1.2:1.1，DIPEA:A:B＝2.0:1.1:1.0。
其中，步驟c)的反應(yīng)在固相反應(yīng)柱中進(jìn)行。對(duì)固相反應(yīng)柱無(wú)特別限制，可為可實(shí)現(xiàn)此目的的任意固相反應(yīng)柱。此外，每種氨基酸進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)的時(shí)間通常為1.5-4小時(shí)，優(yōu)選2-3小時(shí)；壓力優(yōu)選為常壓，也可在適當(dāng)提高或降低的壓力下進(jìn)行；溫度優(yōu)選為室溫(即20±5℃)，也可在適當(dāng)提高或降低的溫度下進(jìn)行。
其中，將樹脂在各偶聯(lián)步驟之前進(jìn)行溶脹，所述溶脹步驟中所使用的溶劑可以為本領(lǐng)域中能實(shí)現(xiàn)該目的的任何試劑，例如DMF、NMP、二氯甲烷等，優(yōu)選DMF。
其中，所述洗滌步驟中所使用的溶劑可以為本領(lǐng)域中能實(shí)現(xiàn)該目的的任何試劑，例如DMF、NMP、二氯甲烷等，優(yōu)選DMF。
在本發(fā)明的制備利那洛肽的方法中，步驟2)中所述的脫保護(hù)劑為TFA/DCM的混合液，混合液中TFA的體積濃度為1％-10％，優(yōu)選1％-5％，反應(yīng)終點(diǎn)為溶液由紅色變?yōu)闊o(wú)色。
在本發(fā)明的制備利那洛肽的方法中，步驟3)中所述的氧化劑選自H2O2、NCS，優(yōu)選NCS；所用溶劑選自DMF、NMP、二氯甲烷，優(yōu)選DMF。
在本發(fā)明的制備利那洛肽的方法中，步驟4)中所述的裂解液為TFA、H2O、PhOMe、苯甲硫醚的不同比例的混合物，優(yōu)選TFA、H2O、PhOMe、苯甲硫醚按照體積比為90:5:4:1混合。
在本發(fā)明的制備利那洛肽的方法中，步驟5)中所述的氧化劑選自 H2O2、NCS，氧化劑與步驟4)所得的單二硫環(huán)肽的摩爾比為1:10-10:1；優(yōu)選氧化劑為NCS，其用量為與步驟4)所得的單二硫環(huán)肽的摩爾比為1:1-10:1，優(yōu)選2:1。所用溶劑選自甲醇、乙醇、丙酮、四氫呋喃、乙腈以及上述溶劑與水的不同比例的混合溶液。優(yōu)選乙腈與水的混合液，乙腈與水的體積比例為1:1-1:5，優(yōu)選1:1。
在本發(fā)明的制備利那洛肽的方法中，步驟6)中所用的使脫甲基和氧化同步實(shí)現(xiàn)的試劑選自辣根過(guò)氧化酶、蘑菇酪氨酸酶、單胺氧化酶，使脫甲基和氧化同步實(shí)現(xiàn)的試劑與步驟5)所得的雙二硫環(huán)肽的質(zhì)量比例為0.5:1000-10:100；優(yōu)選辣根過(guò)氧化酶，其用量與步驟5)所得的雙二硫環(huán)肽的質(zhì)量比例為0.5:100-10:100，更優(yōu)選1.5:100-2.5:100，最優(yōu)選2.0:100。
在本發(fā)明的制備利那洛肽的方法中，采用反相高壓液相色譜法進(jìn)行純化。雙二硫環(huán)肽和最終產(chǎn)物利那洛肽均可采用反相高壓液相色譜法進(jìn)行純化。進(jìn)一步地，所述反相高壓液相色譜法包括：以反相十八烷基硅烷為固定相，以0.1體積％醋酸水溶液/乙腈為流動(dòng)相，流動(dòng)相0.1體積％醋酸水溶液與乙腈的體積比例優(yōu)選為98:2至50:50，更優(yōu)選80:20至60:40，最優(yōu)選70:30。收集目的峰餾分，濃縮凍干。
在本發(fā)明中，盡管形成第一對(duì)二硫鍵和第二對(duì)二硫鍵所使用的氧化劑可以相同(例如NCS)，但是由于第1位、第6位Cys的保護(hù)基團(tuán)Mmt在稀TFA溶液中脫除，而第2位、第10位Cys的保護(hù)基團(tuán)Dpm則必須在濃TFA中脫除，因此為實(shí)現(xiàn)選擇性地形成第一對(duì)二硫鍵和第二對(duì)二硫鍵，所采取的策略為首先使利那洛肽前體樹脂在TFA/DCM的混合液中脫除Mmt保護(hù)基團(tuán)，再固相氧化形成第一對(duì)二硫鍵；隨后在裂解含單二硫環(huán)的利那洛肽前體樹脂中的樹脂同時(shí)，裂解液也使保護(hù)基團(tuán)Dpm脫除，再液相氧化形成第二對(duì)二硫鍵。
在本發(fā)明中，采用Fmoc-Cys(Me)-OH作為原料，有利于最后脫除半胱氨酸的保護(hù)基團(tuán)甲基的同時(shí)氧化偶聯(lián)第三對(duì)二硫鍵得到利那洛肽。該步驟中優(yōu)選辣根過(guò)氧化酶，其既用作脫甲基試劑，也用作氧化劑，從而達(dá)到脫甲基和氧化同步實(shí)現(xiàn)的目的。
綜上，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用完全選擇性地形成三對(duì)二硫鍵而合成利那洛肽的方法：先固相合成利那洛肽前體樹脂，然后固相氧化形成第一對(duì)二硫鍵，在進(jìn)行裂解反應(yīng)之后再次液相氧化形成第二對(duì)二硫鍵，最 后脫除甲基保護(hù)的半胱氨酸的甲基，同時(shí)氧化偶聯(lián)第三對(duì)二硫鍵得到利那諾肽。
本發(fā)明的方法通過(guò)完全選擇性地形成三對(duì)二硫鍵，避免了二硫鍵錯(cuò)配異構(gòu)體的產(chǎn)生，以得到較高的純度和收率；同時(shí)，在利那洛肽前體樹脂發(fā)生裂解反應(yīng)之前，固相氧化第一對(duì)二硫鍵，以降低第一對(duì)二硫鍵形成的難度；并且在第三對(duì)二硫鍵的制備中采用的原料為較便宜的甲基保護(hù)的半胱氨酸，而且使半胱氨酸的保護(hù)基團(tuán)甲基的脫除和氧化偶聯(lián)同步實(shí)現(xiàn)。
該合成方法具有產(chǎn)物純度高、收率高、原料簡(jiǎn)單易得、成本低、工藝簡(jiǎn)單且工藝穩(wěn)定，適用于規(guī)模化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)在多肽藥物合成技術(shù)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。
附圖說(shuō)明
圖1為本發(fā)明的合成路線方案圖。
具體實(shí)施方式
下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，旨在用于說(shuō)明本發(fā)明而非限定本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)人員而言，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也同樣落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明所使用的縮寫的含義列于下表中。
利那洛肽的制備方法中所用原料和試劑均可由市場(chǎng)購(gòu)得，分別購(gòu)于吉爾生化(上海)有限公司、成都鄭源生化科技有限公司和蘇州天馬精細(xì)化學(xué)品股份有限公司。
實(shí)施例1：替代度為0.50mmol Fmoc-Tyr(tBu)-Wang樹脂的制備
稱取替代度為1.0mmol/g的Wang樹脂100g于固相反應(yīng)柱中，加入150ml DMF，氮?dú)夤呐萑苊?0分鐘；稱取Fmoc-Tyr(tBu)-OH(45.9g，100mmol)、HOBt(16.2g，120mmol)、DMAP(1.2g，10mmol)，用100ml DMF溶解，0℃下加入DIC(20.3ml，117.1mmol)，活化5分鐘，加入反應(yīng)柱。反應(yīng)兩小時(shí)后，加入醋酸酐(70ml)和(60ml)吡啶，混合封閉24小時(shí)，DCM洗滌3次(100ml/次)。用甲醇收縮樹脂，抽干得到Fmoc-Tyr(tBu)-Wang樹脂150g，檢測(cè)替代度為0.50mmol/g。
實(shí)施例2：利那洛肽前體樹脂的制備
稱取實(shí)施例1制備的替代度為0.50mmol/g的Fmoc-Tyr(tBu)-Wang樹脂50g(25mmol)于固相反應(yīng)柱中，加入50ml DMF，氮?dú)夤呐萑苊?0分鐘；然后用DBLK脫保護(hù)2次(50ml/次)，分別為6min、8min，DMF洗滌6次(100ml/次)。稱取Fmoc-Cys(Me)-OH(48.7g，75mmol)和HOBt(11.7g，75mmol)用100ml DMF溶解，冰水浴下加入DIC(13ml，75mmol)活化3min后，將混合液加入到反應(yīng)柱中，室溫反應(yīng)2小時(shí)，以茚三酮檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)(如樹脂無(wú)色透明則終止反應(yīng)；如樹脂顯色則延長(zhǎng)反應(yīng)1小時(shí))。反應(yīng)結(jié)束，用DMF洗滌樹脂3次(100ml/次)，加入DBLK脫保護(hù)2次(100ml/次)，分別為6min、8min，DMF洗滌樹脂6次(100ml/次)，茚三酮檢測(cè)樹脂有顏色。
重復(fù)上述偶聯(lián)操作，按照從C端到N端的肽序依次偶聯(lián)Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Dpm)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Mmt)-OH、Fmoc-Cys(Me)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Dpm)-OH、Fmoc-Cys(Mmt)-OH。在各偶聯(lián)步驟中，加入替代度為0.50mmol/g由上一步所得的樹脂50g，上述各氨基酸、HOBt、DIC75mmol。在以上偶聯(lián)操作全部結(jié)束后，用甲醇收縮樹脂，抽干，得到利那洛肽前體樹脂107.6g。
實(shí)施例3：脫除保護(hù)基Mmt
將實(shí)施例2得到的利那洛肽前體樹脂107.6g，用1升DMF溶液溶脹1小時(shí)，減壓抽掉溶液，用DCM洗滌兩次(500ml/次)。樹脂用2％TFA/DCM(v/v)的溶液250ml洗滌，每次2分鐘，直到樹脂顏色由紅色變?yōu)闊o(wú)色，然后用DCM洗滌2次(500ml/次)，DMF洗滌2次(500ml/次)，減壓抽掉溶液。
實(shí)施例4：含單二硫環(huán)的利那洛肽前體樹脂的制備
向?qū)嵤├?得到的脫除保護(hù)基Mmt的樹脂中加入1升DMF，然后 加入NCS(5.34g，40mmol)，反應(yīng)半小時(shí)后，減壓抽掉溶液，用DMF洗滌3次(500ml/次)，加入甲醇500ml收縮30分鐘，抽掉甲醇，真空干燥得樹脂92.2g。
實(shí)施例5：?jiǎn)味颦h(huán)肽的制備
將實(shí)施例4得到的樹脂92.2g加入到1L三口瓶中，加入預(yù)先配置好的TFA:H2O:PhOMe:苯甲硫醚＝90:5:4:1(V:V)900ml，室溫反應(yīng)2小時(shí)，減壓過(guò)濾樹脂，收集濾液。用少量TFA洗滌樹脂，合并濾液。將濾液緩慢加入10L冰乙醚中沉淀，離心，冰乙醚洗滌5次(5L/次)，減壓干燥得到粗肽25.3g，HPLC純度70.6％。
實(shí)施例6：雙二硫環(huán)肽的制備
將實(shí)施例4得到的16.1g單二硫環(huán)肽溶于50％乙腈/水(v/v)的溶液500ml中，加入NCS(2.67mg，0.02mmol)，室溫反應(yīng)2小時(shí)，氧化完畢后，將該混合物直接上樣10cm×25cm制備柱純化制備。純化條件：以反相十八烷基硅烷為固定相；流動(dòng)A相為0.1％醋酸/水(v/v)的溶液，B相為乙腈，A：B＝70:30(體積比)等梯度洗脫；流速：70-80ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm；收集目的峰餾分，濃縮凍干，得純品14.5g，純度96％，收率90％。
實(shí)施例7：利那洛肽的制備
將實(shí)施例5得到的14.5g雙二硫環(huán)肽溶解于300ml乙腈中，加入磷酸二氫鈉緩沖溶液280ml(pH＝6)，然后加入辣根過(guò)氧化酶300mg，反應(yīng)1小時(shí)后，將該混合物直接上樣10cm×25cm制備柱純化制備。以反相十八烷基硅烷為固定相；流動(dòng)A相為0.1％醋酸/水(v/v)的溶液，B相為乙腈，A：B＝70:30(體積比)等梯度洗脫；流速：70-80ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm；收集目的峰餾分，濃縮凍干，得純品10.0g，純度為99.5％，收率70％。