本發(fā)明涉及一種潑尼松龍的制備方法，是通過(guò)生物發(fā)酵進(jìn)行1，2位脫氫和21醋酸酯水解反應(yīng)，從醋酸氫化可的松一步制備潑尼松龍。
背景技術(shù)：
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潑尼松龍一種常見的皮質(zhì)激素，既可以作為皮質(zhì)激素治療藥物，也可以作為其他皮質(zhì)激素藥物的原料，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，十分重要。國(guó)內(nèi)外對(duì)于該產(chǎn)品的制備研究持續(xù)不斷。
國(guó)內(nèi)生產(chǎn)潑尼松龍常用的起始原料為來(lái)源于雙烯的霉菌氧化物，它先經(jīng)過(guò)C11位氧化后再經(jīng)過(guò)C1、2位脫氫，之后再在側(cè)鏈進(jìn)行修飾得到21位酯化。此工藝的難點(diǎn)在于C11位羰基和C1、2位雙鍵的引入，由于在C11位周圍，沒(méi)有活性功能基團(tuán)對(duì)其起影響，常規(guī)條件下很難將C11位羥基氧化成C11位羰基；而且沃式氧化物經(jīng)過(guò)C11位氧化后，下一步的C1、2位脫氫很難進(jìn)行，存在著收率低、成本高的問(wèn)題。
肖俊等人報(bào)道(氫化潑尼松試制和分析的研究，南昌大學(xué)學(xué)報(bào)(工科版)，第24卷第4期，63-65)以醋酸潑尼松為起始物，經(jīng)過(guò)酮基與脲縮合、硼氫化鈉還原、水解制得。當(dāng)然保護(hù)酮基的手段還有很多，例如用乙二醇進(jìn)行縮合，也可以進(jìn)行類似的反應(yīng)。
孫新宇等人報(bào)道(雙水相體系中甾類化合物6-甲基氫化可的松的生物轉(zhuǎn)化研究，浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，第35卷第6期，617-620)報(bào)道對(duì)6-甲基氫化可的松進(jìn)行1,2位脫氫制備6-甲基潑尼松龍。
潑尼松龍的結(jié)構(gòu)是在孕甾母核上具有1位和4位雙鍵、11位羥基、21位羥基、17位羥基多個(gè)基團(tuán)，而醋酸氫化可的松通過(guò)1，2位脫氫和21位水解兩個(gè)單元反應(yīng)形成1，2位雙鍵和21位羥基。常見的制備方法，是通過(guò)生物法得出1，2位雙鍵， 如江蘇遠(yuǎn)大仙樂(lè)藥業(yè)有限公司申請(qǐng)的發(fā)明CN201510076695.6；再通過(guò)堿水解得到21位羥基，如天津天藥藥業(yè)股份有限公司申請(qǐng)的CN200510016229.5發(fā)明。而通常認(rèn)為直接用醋酸氫化可的松作起始原料，進(jìn)行C1、2位的生物發(fā)酵，得到醋酸潑尼松龍，此工藝的缺點(diǎn)在于生物發(fā)酵的收率低，導(dǎo)致成本高。
事實(shí)上，1，4位雙鍵、21位羥基是目前抗炎甾體激素的常用基本結(jié)構(gòu)。由于上世紀(jì)五十年代以來(lái)，科學(xué)家對(duì)上述基團(tuán)合成方法反復(fù)摸索，已經(jīng)形成了成熟的制備工藝，一般是通過(guò)生物脫氫制備1,2位雙鍵，而21-羥基通過(guò)對(duì)21位進(jìn)行碘化，再置換得出21位醋酸酯，在水解得出羥基。這條工藝路線的單元反應(yīng)經(jīng)過(guò)數(shù)代人的摸索，被認(rèn)為是最為合理的制備路線，已經(jīng)形成了行業(yè)的共識(shí)。近年來(lái)科研人員努力地方向更多的是對(duì)于單步工藝進(jìn)行革新和改良，但是囿于傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)思維，目前還沒(méi)有開展工藝路線的調(diào)整。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了提高收率，實(shí)驗(yàn)人員通過(guò)不斷地研究，在研究中驚奇的發(fā)現(xiàn)在以醋酸氫化可的松為原料，通過(guò)采用簡(jiǎn)單節(jié)桿菌Arthrobacter Simple ATCC 21032經(jīng)過(guò)生物發(fā)酵可以一步直接生成潑尼松龍，
一種在以醋酸氫化可的松為原料，通過(guò)采用簡(jiǎn)單節(jié)桿菌Arthrobacter Simple ATCC 21032經(jīng)過(guò)生物發(fā)酵一步直接生成潑尼松龍的制備方法。
上述的制備方法，其特征是將醋酸氫化可的松粉碎或以溶劑溶解，投入已培養(yǎng)好節(jié)桿菌的發(fā)酵罐中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后提取得到潑尼松龍。
上述的制備方法，其特征是所述溶解底物的溶劑選自甲醇、乙醇、四氫呋喃、二氧六環(huán)、DMF中的一種或幾種，溶解倍數(shù)優(yōu)選常溫下能將底物溶解的最小倍數(shù)。
上述的制備方法，其特征是：所述的底物優(yōu)選微粉化為D90≤30μm的微粒。
上述的制備方法，其特征是作為底物的化合物(1)的投料濃度為≤4％。
上述的制備方法，其特征是作為底物的醋酸氫化可的松的投料濃度優(yōu)選1％～3％，發(fā)酵溫度為29℃～32℃，反應(yīng)時(shí)間為36～72小時(shí)。
上述的生物脫氫方法，其特征是所述的生物脫氫反應(yīng)可以采用以下發(fā)酵工藝。
上述的制備方法，其特征是所述方法采用的斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)基采用以下配比：葡萄糖1.3％，酵母膏1.3％，瓊脂2.0％，以及余量的蒸餾水，用無(wú)機(jī)堿溶液調(diào)至pH7.0-7.2，用于斜面培養(yǎng)。
上述的制備方法，其特征是所述方法采用的斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)基采用以下％配比：酵母膏0.5％，蛋白胨0.5％，葡萄搪1％，瓊脂2％，自來(lái)水配制，用無(wú)機(jī)堿溶液調(diào)至pH至7.0-7.2，用于斜面培養(yǎng)。
上述的制備方法，其特征是所述方法采用的發(fā)酵培養(yǎng)基為以下配比：葡萄糖1.0，酵母膏0.16％，KH2PO40.25％，玉米漿1％，以及余量的蒸餾水，用無(wú)機(jī)堿溶液調(diào)至pH 7.0-7.2，用于一級(jí)、二級(jí)培養(yǎng)和最終的生物反應(yīng)中。
上述的制備方法，其特征是所述方法采用的發(fā)酵培養(yǎng)基為以下配比：蛋白陳0.4％，葡萄糖0.6％，玉米漿0.6％，磷酸二氫鉀0.07％，磷酸氫二鉀0.05％，以及余量的蒸餾水，用無(wú)機(jī)堿溶液調(diào)至pH 7.0-7.2，用于一級(jí)、二級(jí)培養(yǎng)和最終的生物反應(yīng)中。
上述的制備方法，其特征是所述方法采用的無(wú)機(jī)堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸鈉、碳酸鉀中的一種或幾種。
如權(quán)利要求8-11所述的制備方法，其特征是所述方法采用的無(wú)機(jī)堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀中的一種或幾種。
上述的制備方法，其特征是所述方法在采用粉碎醋酸氫化可的松投料前向發(fā)酵液中加入0.01～3％(v/v)促溶劑。上述的制備方法，其特征是所述的促溶劑為優(yōu)選吐溫-80。
將醋酸氫化可的松粉碎或以溶劑全溶或半溶，投入已培養(yǎng)好節(jié)桿菌或簡(jiǎn)單節(jié)桿菌的發(fā)酵罐中進(jìn)行生物脫氫反應(yīng)，轉(zhuǎn)化后提取得到潑尼松龍。所述溶劑選自但不僅限于甲醇、乙醇、四氫呋喃、二氧六環(huán)，DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中的一種或幾種，所述粉碎投料的醋酸氫化可的松優(yōu)選微粉化D90(90％通過(guò)粒徑)≤40μm的微粒。優(yōu)選粉碎投料時(shí)向發(fā)酵液中加入0.01～3％(v/v)促溶劑，所述的促溶劑為優(yōu)選吐溫-80。
醋酸氫化可的松的投料濃度為≤4％(相對(duì)于發(fā)酵液容積)；優(yōu)選投料濃度為1％～3％，發(fā)酵溫度30～34℃，優(yōu)選促溶劑加入量為0.2～0.5％(v/v)。生物脫氫反應(yīng)時(shí)間30～72小時(shí)。
生物反應(yīng)結(jié)束后終止反應(yīng)，優(yōu)選采用將發(fā)酵液升溫至70～90℃而使菌體滅活的方法，終止反應(yīng)后用優(yōu)選采用溶媒萃取發(fā)酵液的形式提取潑尼松龍。所述萃取 用溶媒優(yōu)選乙酸乙酯。
所述生物反應(yīng)所使用簡(jiǎn)單節(jié)桿菌(拉丁命名：Arthrobacter simplex)優(yōu)選以下菌株Arthrobacter Simple ATCC 21032。
簡(jiǎn)單節(jié)桿菌(拉丁命名：Arthrobacter simplex)AS 1.754、AS 1.94*(均由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所提供)。
所述的生物脫氫反應(yīng)可以采用以下發(fā)酵工藝：
斜面培養(yǎng)→一級(jí)培養(yǎng)→一級(jí)培養(yǎng)→加入化合物(1)發(fā)酵進(jìn)行生物脫氫反應(yīng)→終止反應(yīng)。
所述的生物發(fā)酵工藝還可采用任何公知的生物發(fā)酵工藝方法，如參考《生物合成藥物學(xué)》(化學(xué)工業(yè)出版社，2000年出版，褚志義主編；666～675頁(yè))中公開的生物發(fā)酵工藝。
所述的生物脫氫所用的培養(yǎng)基優(yōu)選采用以下配比：
斜面培養(yǎng)基(％)：葡萄糖1.3，酵母膏1.3，瓊脂2.0，以及余量的蒸餾水，pH7.0-7.2，用于斜面培養(yǎng)
發(fā)酵培養(yǎng)基(％)：葡萄糖1.0，酵母膏0.16，KH2PO40.25，玉米漿1，以及余量的蒸餾水，pH 7.0-7.2，用于一級(jí)、二級(jí)培養(yǎng)和最終的生物脫氫反應(yīng)中。
實(shí)施例
底物轉(zhuǎn)化率的測(cè)定：轉(zhuǎn)化率用反應(yīng)過(guò)程中轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的底物質(zhì)量占初始底物總質(zhì)量的百分比來(lái)表示。采用HPLC測(cè)定，分離柱為C18柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為240nm，流動(dòng)相是乙腈：水(體積比)＝60：40的溶于流速為1.5mL/min。采用面積歸一法計(jì)算底物轉(zhuǎn)化率。
斜面培養(yǎng)：將斜面培養(yǎng)基分裝于20×200mm的試管中，滅菌30min后擺成斜面。斜面于37℃培養(yǎng)箱中放置2d，觀察無(wú)染菌情況即可進(jìn)行接種。接種后斜面于30℃下培養(yǎng)2d，然后置于4℃冰箱中保存。
一級(jí)培養(yǎng)：從生長(zhǎng)良好的簡(jiǎn)單節(jié)桿菌斜面上取菌體，接入裝有30ml培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30～34℃，180r/min振蕩培養(yǎng)，24小時(shí)
二級(jí)培養(yǎng)：將完成一級(jí)培養(yǎng)后的發(fā)酵液以5％～10％接種量接入裝有150ml培養(yǎng) 基的1000mL二級(jí)種子培養(yǎng)三角瓶中，以同樣的條件進(jìn)行二級(jí)培養(yǎng)，二級(jí)培養(yǎng)時(shí)間為24小時(shí)
生物脫氫和水解：與二級(jí)培養(yǎng)相同的接種量接入5L發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度29～32℃，攪拌轉(zhuǎn)速150r/min，通氣量2.0L/min，培養(yǎng)24小時(shí)后加入底物進(jìn)行生物脫氫反應(yīng)。
斜面培養(yǎng)基1采用以下配比：葡萄糖1.3％，酵母膏1.3％，瓊脂2.0％，以及余量的蒸餾水，用無(wú)機(jī)堿溶液調(diào)至pH7.0-7.2，用于斜面培養(yǎng)。
斜面培養(yǎng)基2采用以下配比：酵母膏0.5％，蛋白胨0.5％，葡萄搪1％，瓊脂2％，自來(lái)水配制，用無(wú)機(jī)堿溶液調(diào)至pH至7.0-7.2，用于斜面培養(yǎng)。
發(fā)酵培養(yǎng)基1為以下配比：葡萄糖1.0，酵母膏0.16％，KH2PO40.25％，玉米漿1％，以及余量的蒸餾水，用無(wú)機(jī)堿溶液調(diào)至pH 7.0-7.2，用于一級(jí)、二級(jí)培養(yǎng)和最終的生物反應(yīng)中。
發(fā)酵培養(yǎng)基2為以下配比：蛋白陳0.4％，葡萄糖0.6％，玉米漿0.6％，磷酸二氫鉀0.07％，磷酸氫二鉀0.05％，以及余量的蒸餾水，用無(wú)機(jī)堿溶液調(diào)至pH 7.0-7.2，用于一級(jí)、二級(jí)培養(yǎng)和最終的生物反應(yīng)中。
DMF：N，N-二甲基甲酰胺
實(shí)施例1：
將簡(jiǎn)單節(jié)桿菌(Arthrobacter Simple ATCC 21032)依次進(jìn)行分別使用斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)、一級(jí)培養(yǎng)和二級(jí)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為29-32℃，將溶于有機(jī)溶劑的醋酸氫化可的松投入發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，投料濃度見下表，反應(yīng)溫度為31±1℃。反應(yīng)時(shí)間見下表，反應(yīng)完成后升溫至70℃終止反應(yīng)，采用乙酸乙酯萃取提取發(fā)酵液，將有機(jī)相濃縮，測(cè)得潑尼松龍轉(zhuǎn)化率。
實(shí)施例2：
具體制備方法培養(yǎng)基、投料濃度均同實(shí)施例1，僅是在醋酸可的松投入前在發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中加入吐溫80。
對(duì)照實(shí)施例1：
將簡(jiǎn)單節(jié)桿菌(AS 1.94*)依次進(jìn)行分別使用斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)、一級(jí)培養(yǎng)和二級(jí)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為29-32℃，將溶于有機(jī)溶劑的醋酸氫化可的松投入發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，投料濃度見下表，反應(yīng)溫度為31±1℃。反應(yīng)時(shí)間見下表，反應(yīng)完成后升溫至70℃終止反應(yīng)，采用乙酸乙酯萃取提取發(fā)酵液，將有機(jī)相濃縮，測(cè)得潑尼松龍轉(zhuǎn)化率為4.5％。
對(duì)照實(shí)施例2：
將簡(jiǎn)單節(jié)桿菌(AS 1.754)依次進(jìn)行分別使用斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)、一級(jí)培養(yǎng)和二級(jí)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為29-32℃，將溶于有機(jī)溶劑的醋酸氫化可的松投入發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，投料濃度見下表，反應(yīng)溫度為31±1℃。反應(yīng)時(shí)間見下表，反應(yīng)完成后升溫至70℃終止反應(yīng)，采用乙酸乙酯萃取提取發(fā)酵液，將有機(jī)相濃縮，測(cè)得潑尼松龍轉(zhuǎn)化率。
經(jīng)檢測(cè)，對(duì)照實(shí)施例得到的基本上是醋酸潑尼松龍(大于70％)和極少量的醋酸氫化可的松，而潑尼松龍極少。