本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)合成領(lǐng)域，具體是一種金黃色葡萄球菌黏附素蛋白的制備方法。
背景技術(shù)：
奶牛乳房炎(bovinemastitis)是奶牛的常見疾病，是奶牛乳腺組織的炎癥，主要為乳腺組織感染病原微生物所致，是奶牛的常見病、多發(fā)病。幾十年來，國內(nèi)外針對奶牛乳房炎的防治作了很多努力，但該病一直是困擾我國奶牛業(yè)養(yǎng)殖發(fā)展最為嚴(yán)重的疾病之一。它使奶牛泌乳和生殖機能受到損傷，不僅降低奶牛的產(chǎn)奶量，使奶牛淘汰，影響乳的品質(zhì)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重時甚至影響到人類健康。
s.aureus黏附到乳頭管被認(rèn)為是乳腺感染的第一步，因此，黏附到乳腺上皮細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)上的能力對于s.aureus的致病性至關(guān)重要。s.aureus黏附的過程中有多種黏附因子參與，其中纖連結(jié)合蛋白b(fibronectin-bindingproteinb，fnbpb)是重要的黏附素之一，介導(dǎo)s.aureus結(jié)合與細(xì)胞表面的纖維連結(jié)素與纖維蛋白原，使細(xì)胞黏附與宿主細(xì)胞表面，促進(jìn)細(xì)菌對宿主的侵入。因此，目前研究表明以fnbpb為靶位進(jìn)行疫苗的研制可能是預(yù)防奶牛s.aureus乳房炎的有效方法。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種金黃色葡萄球菌黏附素蛋白的制備方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
一種金黃色葡萄球菌黏附素蛋白的制備方法，具體步驟如下：
(1)重組質(zhì)粒pet-fnbpb-d的構(gòu)建
根據(jù)genbank登錄的基因序列，用primer5.0設(shè)計上游引物和下游引物，
上游引物：5‘-cggaattcgcccataataacggtaaccagt-3’
下游引物：5’-cgcaagcttgcacgattggaggtgatgtat-3’；
pcr擴增條件：93.5～94.5℃2min；93.5～94.5℃30s；63.5～64.5℃45s；71.5～72.5℃ 1min，30個循環(huán)；71.5～72.5℃10min，pcr擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測；
經(jīng)測序正確后進(jìn)行表達(dá)；
(2)pet-fnbpb-d的誘導(dǎo)表達(dá)和可溶性鑒定
上述構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞bl21(de3)中，用終濃度為1.0mm的iptg進(jìn)行誘導(dǎo)，取不同時間段的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行sds-page檢測；
(3)蛋白的大量表達(dá)及純化
經(jīng)鑒定，目的蛋白以可溶性形式存在，擴大培養(yǎng)后，根據(jù)預(yù)實驗確定的最佳誘導(dǎo)時間和iptg的濃度，進(jìn)行大量表達(dá)和純化。
作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述步驟(2)中的不同時間段為開始誘導(dǎo)后的1h、2h、3h、4h、5h。
作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案：所述步驟(3)中的最佳誘導(dǎo)時間為5h，最佳iptg的濃度為1mmol/l。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：通過本發(fā)明方法可以制備fnbpb靶位的金黃色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗，為以fnbpb為靶位的疫苗研究，對金黃色葡萄球菌性奶牛乳房炎疫苗的研究提供試驗依據(jù)，為今后奶牛乳房炎的防治提供了基礎(chǔ)。
具體實施方式
下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
金黃色葡萄球菌黏附素蛋白的制備步驟：
(1)重組質(zhì)粒pet-fnbpb-d的構(gòu)建
根據(jù)genbank登錄的基因序列(x62992)，用primer5.0設(shè)計上下游引物，
序列為上游：5‘-cggaattcgcccataataacggtaaccagt-3’和
下游：5’-cgcaagcttgcacgattggaggtgatgtat-3’；
pcr擴增條件：94℃2min；94℃30s；64℃45s；72℃1min，30個循環(huán)；72℃10min，pcr擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測；
經(jīng)測序正確后進(jìn)行表達(dá)；
(2)pet-fnbpb-d的誘導(dǎo)表達(dá)和可溶性鑒定
上述構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞bl21(de3)中，用終濃度為1.0mm的iptg進(jìn)行誘導(dǎo)，取不同時間段的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行sds-page檢測；
(3)蛋白的大量表達(dá)及純化
經(jīng)鑒定，目的蛋白以可溶性形式存在，擴大培養(yǎng)后，根據(jù)預(yù)實驗確定的最佳誘導(dǎo)時間和iptg的濃度，進(jìn)行大量表達(dá)和純化。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應(yīng)將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。