本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，更具體地，涉及一種重組腺相關(guān)病毒的制備方法及重組桿狀病毒。

背景技術(shù)：

重組腺相關(guān)病毒(raav)具有安全性高、免疫原性低、宿主范圍廣、能介導(dǎo)外源基因在動(dòng)物體內(nèi)長期穩(wěn)定表達(dá)等特點(diǎn)，是基因治療領(lǐng)域最具應(yīng)用前景的載體之一。raav在神經(jīng)科學(xué)研究以及疾病的基因治療等領(lǐng)域具有重要作用和巨大需求。有研究數(shù)據(jù)表明，一次大型靈長類動(dòng)物試驗(yàn)或臨床基因治療試驗(yàn)就需要約1015vg(vg，virusgenomes)的raav，是一般體外細(xì)胞試驗(yàn)或小鼠試驗(yàn)用量的成百上千倍(humgenether.2002nov1；13(16):1935-43.)。

目前利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)大規(guī)模制備raav的方法主要有以下兩種：兩桿狀病毒系統(tǒng)(twobacsystem)和依賴包裝細(xì)胞系的一桿狀病毒系統(tǒng)(onebacsystem)。兩桿狀病毒系統(tǒng)的主要流程是，將aav的rep基因和cap基因整合在一個(gè)桿狀病毒基因組中，將itr核心表達(dá)元件整合到另外一個(gè)桿狀病毒基因組中，然后將上述兩種重組桿狀病毒共同感染宿主細(xì)胞，產(chǎn)生出raav(molther.2008may；16(5):924-30，molther.2009nov；17(11):1888-96.)。依賴包裝細(xì)胞系的一桿狀病毒系統(tǒng)的主要流程是，先建立誘導(dǎo)表達(dá)rep基因和cap基因的包裝細(xì)胞系，這種包裝細(xì)胞系整合了rep基因和cap基因表達(dá)元件，rep基因和cap基因分別置于桿狀病毒晚期基因表達(dá)強(qiáng)啟動(dòng)子ph調(diào)控下，在ph啟動(dòng)子的上游加入了hr2增強(qiáng)子序列和aav的rep蛋白結(jié)合序列。在感染整合了itr核心表達(dá)元件的重組桿狀病毒后，包裝細(xì)胞系中的rep基因和cap基因被誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生raav(procnatlacadsciusa.2009mar31；106(13):5059-64，humgenether.2014mar；25(3):212-22.)。

然而，前者由于兩種桿狀病毒共同感染細(xì)胞效率較低，無法充分利用每個(gè)細(xì)胞的產(chǎn)能，而且感染是個(gè)隨機(jī)的過程，容易產(chǎn)生不含核酸的空殼缺陷raav顆粒，制備工藝條件優(yōu)化起來比較復(fù)雜，不同批次制備的raav質(zhì)量不穩(wěn)定。后者由于依賴誘導(dǎo)表達(dá)rep基因和cap基因的包裝細(xì)胞系，構(gòu)建復(fù)雜，優(yōu)良包裝細(xì)胞系的篩選難度大，制備不同血清型的raav，就需要建立表達(dá)相應(yīng)血清型cap基因的包裝細(xì)胞系，靈活性和通用性較差，難以推廣。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的以上缺陷或改進(jìn)需求，本發(fā)明提供了一種基因治療用重組腺相關(guān)病毒的制備方法及重組桿狀病毒，其目的在于通過將aav的rep基因、cap基因和itr核心表達(dá)元件進(jìn)行優(yōu)化整合，構(gòu)建到桿狀病毒基因組中或者整合到宿主包裝細(xì)胞基因組中，實(shí)現(xiàn)利用一種重組桿狀病毒感染宿主包裝細(xì)胞系制備raav，由此解決現(xiàn)有的大規(guī)模制備raav方法存在的構(gòu)建復(fù)雜、靈活性差、 通用性低的技術(shù)問題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種重組腺相關(guān)病毒的制備方法，包括以下步驟：

(1)將構(gòu)建有重組腺相關(guān)病毒itr核心表達(dá)元件和cap基因或rep基因的重組型桿狀病毒感染相應(yīng)的宿主包裝細(xì)胞系；

(2)將步驟(1)中感染了重組桿狀病毒的宿主包裝細(xì)胞系擴(kuò)大培養(yǎng)，使產(chǎn)生重組腺相關(guān)病毒；

(3)將步驟(2)中獲得的重組腺相關(guān)病毒分離并純化。

優(yōu)選地，所述制備方法，其步驟(1)利用pfast.bac.dual穿梭載體構(gòu)建所述重組型桿狀病毒。

優(yōu)選地，所述制備方法，其所述步驟(1)具體操作方法如下：

a.將itr核心表達(dá)元件克隆到pfast.bac.dual穿梭載體的p10啟動(dòng)子和ph啟動(dòng)子間隔序列中；

b.將cap基因或rep基因克隆到pfast.bac.dual穿梭載體的p10啟動(dòng)子或ph啟動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)中，得到相應(yīng)的穿梭質(zhì)粒。

優(yōu)選地，所述制備方法，其所述構(gòu)建有重組腺相關(guān)病毒itr核心表達(dá)元件和cap基因(或rep基因)的重組型桿狀病毒其itr核心表達(dá)元件中攜帶有目標(biāo)基因。

優(yōu)選地，所述制備方法，其所述宿主包裝細(xì)胞系用于輔助重組腺相關(guān)病毒的復(fù)制和組裝。

優(yōu)選地，所述制備方法，其所述宿主細(xì)胞基因組上相應(yīng)整合有誘導(dǎo)表達(dá)腺相關(guān)病毒rep基因的表達(dá)框元件或誘導(dǎo)表達(dá)腺相關(guān)病毒cap基因的表達(dá)框元件。

按照本發(fā)明的另一方面，提供了一種重組桿狀病毒，其基因組上構(gòu)建有腺相關(guān)病毒itr核心表達(dá)元件和相應(yīng)血清型的cap基因。

優(yōu)選地，所述重組桿狀病毒，其cap基因其序列為依據(jù)核糖體泄露掃描原理進(jìn)行密碼子優(yōu)化的序列。

按照本發(fā)明的另一方面，提供了一種重組桿狀病毒，其基因組上構(gòu)建有腺相關(guān)病毒itr核心表達(dá)元件和相應(yīng)血清型的rep基因。

優(yōu)選地，所述重組桿狀病毒，其rep基因其序列為依據(jù)核糖體泄露原理進(jìn)行密碼子優(yōu)化的序列。

總體而言，通過本發(fā)明所構(gòu)思的以上技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，能取得以下有益效果：

由于將aav的cap基因(或rep基因)與itr核心表達(dá)元件放在一個(gè)重組桿狀病毒中，相應(yīng)的將rep基因(或cap基因)整合到宿主細(xì)胞基因組中，由宿主包裝細(xì)胞系提供包裝raav所需的部分輔助功能。相比現(xiàn)有的依賴包裝細(xì)胞系的一桿狀病毒系統(tǒng)將rep基因和cap基因全部都整合到宿主細(xì)胞系中，構(gòu)建包裝細(xì)胞系的難度大大降低；尤其是將cap基因與itr核心元件置于一個(gè)桿狀病毒基因組中的方法，由于通常采用2型aav的rep基因就可以輔助各種血清型raav的包裝，所以只需要建立一種誘導(dǎo)表達(dá)2型aav的rep基因就可以滿足不同血清型raav的制備，靈活性和通用性也將大大增強(qiáng)。

附圖說明

圖1是raav的包裝原理圖(a)和桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(bactobac)中穿梭質(zhì)粒pfast.bac.dual (pfbd)的結(jié)構(gòu)示意圖(b)；

圖2是實(shí)施例中整合了制備raav所需的重組桿狀病毒和包裝細(xì)胞系所需組件的結(jié)構(gòu)示意圖。其中，圖2a是實(shí)例1中重組穿梭質(zhì)粒pfd/cap-(itr-gfp)的結(jié)構(gòu)圖；圖2b是實(shí)例2中重組穿梭質(zhì)粒pfd/cap-(itr-gfp)的結(jié)構(gòu)圖；圖2c是實(shí)例3中重組穿梭質(zhì)粒pfd/rep-(itr-gfp)的結(jié)構(gòu)圖；圖2d是實(shí)例4中重組穿梭質(zhì)粒pfd/rep-(itr-gfp)的結(jié)構(gòu)圖；圖2e是實(shí)例1和實(shí)例2中建立sf9/rep包裝細(xì)胞系所用pir-rep78-hr2-rbe-bsd-gfp質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖；圖2f是實(shí)例3和實(shí)例4中建立sf9/cap包裝細(xì)胞系所用pir-vp-hr2-rbe-bsd-gfp質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖；

圖3是實(shí)施例中利用重組桿狀病毒感染宿主包裝細(xì)胞系制備raav的過程示意圖。其中，圖3a是實(shí)施例1和實(shí)施例2的過程示意圖；圖3b是實(shí)施例3和實(shí)施例4的過程示意圖；

圖4是實(shí)施例1中重組桿狀病毒感染包裝細(xì)胞系制備raav以及raav細(xì)胞水平轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的驗(yàn)證圖；其中，圖4a是重組桿狀病毒bev/cap-(itr-gfp)感染sf9細(xì)胞，篩選出的sf9/rep包裝細(xì)胞系及其被重組bev感染后的熒光顯微成像圖；圖4b是實(shí)例1制備的raav感染hek293和sf9細(xì)胞后的熒光顯微成像圖；圖4c是實(shí)例1純化的raav感染hek293細(xì)胞的熒光顯微成像圖；

圖5是實(shí)施例2中制備純化的raav感染hek293細(xì)胞的熒光顯微成像圖；

圖6是實(shí)施例3中重組桿狀病毒感染包裝細(xì)胞系制備raav以及raav細(xì)胞水平轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的驗(yàn)證圖。其中，圖6a是重組桿狀病毒bev/rep-(itr-gfp)感染sf9細(xì)胞，篩選出的sf9/cap包裝細(xì)胞系及其被重組bev感染后的熒光顯微成像圖；圖6b是實(shí)例4制備的raav感染hek293和sf9細(xì)胞后的熒光顯微成像圖；圖6c是實(shí)例4純化的raav感染hek293細(xì)胞的熒光顯微成像圖；

圖7是實(shí)施例4中制備純化的raav感染hek293細(xì)胞的熒光顯微成像圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。此外，下面所描述的本發(fā)明各個(gè)實(shí)施方式中所涉及到的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互組合。

本發(fā)明提供的重組腺相關(guān)病毒的制備方法，包括以下步驟：

(1)將構(gòu)建有重組腺相關(guān)病毒itr核心表達(dá)元件和cap基因或rep基因的重組型桿狀病毒感染相應(yīng)的宿主包裝細(xì)胞系。

所述重組桿狀病毒用于提供制備raav所需的itr核心表達(dá)元件和cap基因或rep基因，并通過感染宿主包裝細(xì)胞系激活桿狀病毒特異性啟動(dòng)子ph或p10，誘導(dǎo)宿主包裝細(xì)胞系表達(dá)rep基因或cap基因從而輔助raav的復(fù)制和組裝。

所述重組桿狀病毒優(yōu)選利用bactobac系統(tǒng)的pfast.bac.dual(pfbd)穿梭載體(如圖1b)構(gòu)建，具體方法如下：

a.將itr核心表達(dá)元件克隆到pfbd載體的p10啟動(dòng)子和ph啟動(dòng)子間隔序列中。

b.將cap基因或rep基因克隆到pfbd載體的p10啟動(dòng)子或ph啟動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)中， 得到相應(yīng)的穿梭質(zhì)粒。

c.然后按照bactobac系統(tǒng)的方法制備相應(yīng)的重組桿狀病毒。

所述itr核心表達(dá)元件通過5’端連接核酸片段或3’端連接核酸片段與所述cap基因或rep基因的表達(dá)框相連，itr核心表達(dá)元件包括位于兩端的aav基因組中的一段末端反向重復(fù)序列(itr)以及位于中間的目標(biāo)基因序列(goi)。itr核心表達(dá)元件在實(shí)例中選用含cmv啟動(dòng)子、gfp基因、sv40ploya組件的gfp基因表達(dá)框，便于技術(shù)方案的驗(yàn)證。

所述cap基因編碼aav的三種結(jié)構(gòu)蛋白vp1、vp2、vp3，構(gòu)成病毒的衣殼。aav通過衣殼蛋白與細(xì)胞表面的受體結(jié)合吸附到宿主細(xì)胞表面，不同血清型的aav在感染不同類型組織或細(xì)胞時(shí)存在感染的范圍和效率的差異，主要是由于不同血清型cap基因的差異造成的。因此，制備不同血清型的raav，就要使用相應(yīng)血清型的cap基因。所述cap基因依據(jù)核糖體泄露掃描原理進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，通過p10啟動(dòng)子或ph啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄出一條mrna，實(shí)現(xiàn)vp1、vp2、vp3三種衣殼蛋白以接近天然比例(1:1:10)的功能性表達(dá)。

所述rep基因編碼aav的四種非結(jié)構(gòu)蛋白rep78、rep68、rep52和rep40，主要負(fù)責(zé)病毒基因組的復(fù)制，轉(zhuǎn)錄調(diào)控，位點(diǎn)特異性整合等。目前，通常使用2型aav的rep基因制備不同血清型的raav。所述rep基因依據(jù)核糖體泄露掃描原理進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，通過p10啟動(dòng)子或ph啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄出一條mrna，實(shí)現(xiàn)rep基因的功能性表達(dá)。

本發(fā)明提供的重組桿狀病毒，可按照如下方法制備：

a、采用基因人工合成的方法獲得密碼子優(yōu)化的cap基因、rep基因；

采用基因人工合成、pcr擴(kuò)增和酶切連接的方法獲得itr核心表達(dá)元件。

b、通過分子克隆的方法將步驟a中獲得的itr核心表達(dá)元件以及cap基因或rep基因構(gòu)建到pfast.bac.dual(pfbd)穿梭載體上，根據(jù)bactobac系統(tǒng)操作方法，獲得重組桿狀病毒。

所述宿主包裝細(xì)胞，優(yōu)選為sf9細(xì)胞，用于輔助raav的復(fù)制和組裝。優(yōu)選地，所述重組桿狀病毒不含有rep基因時(shí)，所述宿主細(xì)胞其基因組上須整合誘導(dǎo)表達(dá)aav的rep基因表達(dá)框元件；所述重組桿狀病毒不含有cap基因時(shí)，所述宿主細(xì)胞其基因組上須整合誘導(dǎo)表達(dá)aav的cap基因表達(dá)框元件，可通過將攜帶有相應(yīng)基因表達(dá)元件的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞的基因組中。

所述隨機(jī)整合了誘導(dǎo)表達(dá)aav的rep基因表達(dá)框元件的宿主細(xì)胞，優(yōu)選sf9細(xì)胞，具體制備方法如下:首先，在現(xiàn)有pir-rep78-hr2-rbe質(zhì)粒(參考procnatlacadsciusa.2009mar31；106(13):5059-64)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改造，在殺稻瘟菌素(blasticidin,bsd)基因的c端通過fmdv自剪切多肽2a融合了綠色熒光蛋白(gfp)基因，如圖2e所示。然后，將改造后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，通過bsd抗生素篩選得到整合了誘導(dǎo)表達(dá)aav的rep基因表達(dá)元件的sf9/rep包裝細(xì)胞系。該細(xì)胞系組成性表達(dá)gfp，可通過單克隆分離培養(yǎng)或流式細(xì)胞儀分選，進(jìn)一步得到raav產(chǎn)量較高的sf9/rep包裝細(xì)胞系。

所述隨機(jī)整合了誘導(dǎo)表達(dá)aav的cap基因表達(dá)框元件的宿主細(xì)胞，優(yōu)選為sf9細(xì)胞，具體制備 方法如下:首先，在現(xiàn)有pir-vp-hr2-rbe質(zhì)粒(參考procnatlacadsciusa.2009mar31；106(13):5059-64)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改造，在殺稻瘟菌素(blasticidin,bsd)基因的c端通過fmdv自剪切多肽2a融合了綠色熒光蛋白(gfp)基因，如圖2f所示。然后，將改造后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，通過bsd抗生素篩選得到整合了誘導(dǎo)表達(dá)aav的cap基因表達(dá)元件的sf9/cap包裝細(xì)胞系。該細(xì)胞系組成性表達(dá)gfp，可通過單克隆分離培養(yǎng)或流式細(xì)胞儀分選，進(jìn)一步得到raav產(chǎn)量較高的sf9/cap包裝細(xì)胞系。

由于基因整合是隨機(jī)的，宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后用抗生素篩選，只有基因整合拷貝數(shù)比較高的細(xì)胞抗性基因表達(dá)量高，報(bào)告基因gfp表達(dá)量也高，在被桿狀病毒感染后誘導(dǎo)表達(dá)的輔助基因量也高?？股睾Y選后的細(xì)胞基因組上隨機(jī)整合的誘導(dǎo)表達(dá)rep基因或cap基因的表達(dá)框至少有一個(gè)拷貝，也可能有多拷貝的。但宿主包裝細(xì)胞系的優(yōu)劣(raav產(chǎn)量高低)與拷貝數(shù)沒有絕對的關(guān)系，表達(dá)量高須處于合適的范圍之內(nèi)，所以包裝細(xì)胞系的優(yōu)劣需要通過最終感染重組桿狀病毒后制備raav的產(chǎn)量來做最終評(píng)價(jià)指標(biāo)。

利用上述重組桿狀病毒(bev)感染相應(yīng)的宿主包裝細(xì)胞系(如圖3所示)。

(2)將步驟(1)中感染了重組桿狀病毒的宿主包裝細(xì)胞系擴(kuò)大培養(yǎng)，使產(chǎn)生大量重組腺相關(guān)病毒。

具體可按照如下步驟操作：搖瓶培養(yǎng)所述宿主包裝細(xì)胞至細(xì)胞密度達(dá)到3×106cells/ml，以感染復(fù)數(shù)(moi＝5)感染重組桿狀病毒(bev)，27℃、120rpm/min搖床培養(yǎng)。感染3天后，將細(xì)胞懸液3000rpm離心5min，收集培養(yǎng)液上清和細(xì)胞沉淀。

(3)將步驟(2)中獲得的重組腺相關(guān)病毒分離并純化。

raav主要存在于細(xì)胞沉淀中。對制備出的raav進(jìn)行分離純化操作，

就能夠得到進(jìn)一步應(yīng)用所需的raav。具體方法步驟可參考文獻(xiàn)(jvirolmethods,2007.139(1):p.61-70，jvirolmethods,2012.179(1):p.276-80.)。

本發(fā)明提供的重組桿狀病毒，其特征在于，其基因組上構(gòu)建有腺相關(guān)病毒itr核心表達(dá)元件和相應(yīng)血清型的cap基因或rep基因。所述cap基因或rep基因其序列為依據(jù)核糖體泄露掃描原理進(jìn)行密碼子優(yōu)化的序列。

下面僅以二型腺相關(guān)病毒(aav2)為例，具體說明如下：

實(shí)施例1：重組桿狀病毒bev/cap-(itr-gfp)感染sf9/rep包裝細(xì)胞系制備raav

(1)將構(gòu)建有重組腺相關(guān)病毒itr核心表達(dá)元件和相應(yīng)血清型的cap基因的重組桿狀病毒感染相應(yīng)的宿主包裝細(xì)胞系

所述構(gòu)建有重組腺相關(guān)病毒itr核心表達(dá)元件和相應(yīng)血清型的cap基因的重組桿狀病毒，即重組桿狀病毒bev/cap-(itr-gfp)，按照如下方法制備并擴(kuò)增：

為了將制備raav所需的itr核心表達(dá)元件以及cap基因置于一個(gè)重組桿狀病毒中。我們利用了桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(bactobac)中的pfast.bac.dual(pfbd)穿梭載體(如圖1b)。實(shí)例中基于2型aav的cap基因依據(jù)核糖體泄露掃描原理進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，并將cap基因置于p10啟動(dòng)子的 調(diào)控之下(如組合方案1，如圖2a)或ph啟動(dòng)子(如組合方案2，如圖2b)的調(diào)控之下，實(shí)現(xiàn)vp1、vp2、vp3三種衣殼蛋白以接近天然比例(1:1:10)的功能性表達(dá)。cap基因序列為如seqidno.1、seqidno.2(2種對應(yīng)為capa、capb)所示的序列。實(shí)例中itr核心表達(dá)元件，itr選用2型aav的itr核酸序列，即如seqidno.3所示的序列，itr的核心表達(dá)元件采用了含有綠色熒光蛋白(gfp)的表達(dá)框，由cmv啟動(dòng)子控制gfp的表達(dá)，便于檢測重組病毒的活性。itr核心表達(dá)元件通過5’端連接核酸片段或3’端連接核酸片段與cap基因表達(dá)框或載體相連。5’端或3’端連接核酸片段為如seqidno.4(linka)或seqidno.5(linkb)所示的序列。

在本實(shí)例中，重組桿狀病毒中主要組件組合方案如下：

capa-linka-(itr-gfp)-linkb

利用常規(guī)分子克隆技術(shù)將itr核心表達(dá)元件(itr-gfp)通過連接核酸片段置于pfbd/cap載體的一側(cè)，構(gòu)建pfbd/cap-(itr-gfp)重組穿梭質(zhì)粒。

參照bactobac系統(tǒng)操作說明，將該重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化含有acmnpv桿狀病毒基因組的dh10bac菌。通過tn7轉(zhuǎn)座子元件介導(dǎo)的重組得到重組桿狀病毒基因組(bacmid)。通過藍(lán)白斑篩選和pcr鑒定獲得含有重組bacmid的陽性菌。抽提純化重組bacmid，將其轉(zhuǎn)染貼壁培養(yǎng)的sf9細(xì)胞。sf9細(xì)胞逐漸被轉(zhuǎn)染后產(chǎn)生的重組桿狀病毒完全感染并出現(xiàn)明顯的bev感染sf9細(xì)胞的細(xì)胞病變(cpe)現(xiàn)象。將細(xì)胞培養(yǎng)液3000rpm離心5min，上清中就含有產(chǎn)生的重組桿狀病毒。

將上清液感染貼壁培養(yǎng)的sf9細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)3天，可以看到對照組未感染病毒的sf9細(xì)胞狀態(tài)正常，沒有g(shù)fp的表達(dá)；而在實(shí)驗(yàn)組感染了重組桿狀病毒bev/cap-(itr-gfp)的sf9細(xì)胞都出現(xiàn)了明顯的cpe現(xiàn)象和明顯的gfp表達(dá)，結(jié)果如圖4a所示。將轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞后制備的bev感染貼壁或懸浮培養(yǎng)的sf9細(xì)胞，感染3天后細(xì)胞出現(xiàn)明顯cpe，將細(xì)胞培養(yǎng)液3000rpm離心5min，收上清即可獲得大量bev。病毒的滴度用熒光定量pcr的方法進(jìn)行測定，參考文獻(xiàn)(procnatlacadsciusa,2009.106(13):p.5059-64)中的方法。

所述相應(yīng)的宿主包裝細(xì)胞系，即誘導(dǎo)表達(dá)rep基因的sf9/rep包裝細(xì)胞系，按照如下方法建立：

為了便于包裝細(xì)胞系的篩選，在現(xiàn)有pir-rep78-hr2-rbe質(zhì)粒(procnatlacadsciusa.2009mar31；106(13):5059-64)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改造，在殺稻瘟菌素(blasticidin,bsd)基因的c端通過fmdv自剪切多肽2a融合了綠色熒光蛋白(gfp)基因，得到pir-rep78-hr2-rbe-bsd-gfp質(zhì)粒(如圖2e)。然后，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，通過bsd抗生素篩選得到整合了誘導(dǎo)表達(dá)aav的rep基因表達(dá)元件的sf9/rep包裝細(xì)胞系。該細(xì)胞系組成性表達(dá)gfp，可通過單克隆分離培養(yǎng)或流式細(xì)胞儀分選，進(jìn)一步得到raav產(chǎn)量較高的sf9/rep包裝細(xì)胞系，如圖4a所示。

(2)利用bev/cap-(itr-gfp)感染sf9/rep細(xì)胞系制備raav并驗(yàn)證其感染活性

將制備的bev/cap-(itr-gfp)以感染復(fù)數(shù)(moi＝5)感染培養(yǎng)的sf9/rep細(xì)胞系。感染72小時(shí)后，將細(xì)胞培養(yǎng)液3000rpm離心5min，分別收集培養(yǎng)上清和細(xì)胞沉淀。bev產(chǎn)生后，主要通過分泌釋放到培養(yǎng)基上清中，在sf9/rep細(xì)胞中也有部分未釋放的bev。raav產(chǎn)生后，主要存在于sf9/rep細(xì)胞核中，由于sf9/rep細(xì)胞感染后發(fā)生細(xì)胞病變(cpe)，部分細(xì)胞會(huì)裂解，raav也會(huì)有部分釋 放到上清中，如圖4a所示。而因此上清和細(xì)胞沉淀中會(huì)同時(shí)存在bev和raav。

為了驗(yàn)證用重組桿狀病毒bev/cap-(itr-gfp)感染sf9/rep細(xì)胞制備出了具有活性的raav。通過病毒感染hek293細(xì)胞和sf9細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法證實(shí)該系統(tǒng)制備出了raav，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4b。具體實(shí)施過程和結(jié)果分析如下：將細(xì)胞沉淀反復(fù)凍融3次裂解后，5000rpm離心5min收集細(xì)胞裂解上清液。因?yàn)閞aav無包膜，經(jīng)60℃、30分鐘處理，活性不受影響；而重組桿狀病毒(bev)有包膜，經(jīng)60℃、30分鐘處理，失去活性。含有病毒的上清液感染hek293細(xì)胞2天后，利用傳統(tǒng)的三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞方法制備的raav對照組，在處理前后都有g(shù)fp表達(dá)，表明raav在處理前后都有感染活性。bev感染sf9細(xì)胞后的培養(yǎng)基上清組，未處理的有較強(qiáng)gfp表達(dá)，處理后僅有無gfp表達(dá)，表明bev可以感染hek293細(xì)胞，滅活處理后bev不感染。細(xì)胞沉淀裂解液上清實(shí)驗(yàn)組，未處理的有較強(qiáng)gfp表達(dá)，處理后gfp強(qiáng)度有降低但仍有較強(qiáng)熒光，表明滅活處理后bev不感染，但上清中大量的raav仍能夠感染。用與感染hek293細(xì)胞組相同的樣品感染sf9細(xì)胞2天后，結(jié)果顯示：利用傳統(tǒng)的三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞方法制備的raav對照組，沒有g(shù)fp熒光，表明raav對sf9細(xì)胞沒有感染性。bev感染sf9細(xì)胞后的培養(yǎng)基上清組，滅活前有較強(qiáng)gfp表達(dá)，滅活后的沒有g(shù)fp表達(dá)。細(xì)胞沉淀裂解液上清實(shí)驗(yàn)組，未處理的有較強(qiáng)gfp表達(dá)，處理后的沒有g(shù)fp表達(dá)。

(3)將步驟(2)中獲得的重組腺相關(guān)病毒分離并純化。

raav的純化、滴度測定與細(xì)胞水平轉(zhuǎn)導(dǎo)活性驗(yàn)證：

將重組bev感染后收集得到約為1×108cells的sf9/rep細(xì)胞沉淀，加入10ml裂解緩沖液(50mmtris-cl，150mmnacl，2mmmgcl2，ph8.0)，后反復(fù)凍融3次，5000rpm離心5min后收集上清，在上清中加入核酸酶benzonase至終濃度50u/ml，37℃水浴處理60min。處理后5000rpm離心10min收上清。上清用氯仿抽提，抽提后的上清再用含13.2％的(nh4)2so4和10％的peg8000的溶液進(jìn)行兩相沉淀的方法進(jìn)一步純化，方法參考文獻(xiàn)(jvirolmethods,2007.139(1):p.61-70，jvirolmethods,2012.179(1):p.276-80.)。兩相沉淀后的上清，用pbs溶液進(jìn)行透析脫鹽處理，用amiconultra-4(100kdcutoff)透析柱離心濃縮至終體積1ml，無菌分裝后-80℃凍存。raav的滴度測定采用熒光定量pcr的方法，滴度單位用vg/ml(vg，virusgenomes)表示。

純化過程的raav得率見表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單個(gè)sf9/rep包裝細(xì)胞raav的產(chǎn)量可達(dá)8.62×104vg，經(jīng)過本方法的純化后，回收率達(dá)到36.9％左右。

表1raav純化過程的得率分析

將hek293細(xì)胞以1×104cells/well接種到96孔板中，6h后感染相應(yīng)濃度梯度含量的純化的raav。感染48h后，用熒光顯微鏡觀察gfp的表達(dá)情況，如圖4c。結(jié)果表明，本發(fā)明的方法制備得到的raav具有較好的細(xì)胞水平轉(zhuǎn)導(dǎo)活性。

實(shí)施例2：重組桿狀病毒bev/cap-(itr-gfp)感染sf9/rep包裝細(xì)胞系制備raav

本實(shí)施例與實(shí)施例1相似，區(qū)別僅在于所述重組桿狀病毒，其主要組件組合方案如下：

linka-(itr-gfp)-linkb-capb

將本實(shí)例中的重組桿狀病毒bev/cap-(itr-gfp)感染sf9/rep包裝細(xì)胞系后，將制備得到的raav進(jìn)行純化。純化過程的raav得率見表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單個(gè)sf9/rep包裝細(xì)胞raav的產(chǎn)量可達(dá)7.20×104vg，經(jīng)過本方法的純化后，回收率達(dá)到31.3％左右。

表2raav純化過程的得率分析

將hek293細(xì)胞以1×104cells/well接種到96孔板中，6h后感染相應(yīng)濃度梯度含量的純化的raav。感染48h后，用熒光顯微鏡觀察gfp的表達(dá)情況，如圖5。結(jié)果表明，本發(fā)明的方法制備得到的raav具有較好的細(xì)胞水平轉(zhuǎn)導(dǎo)活性。

實(shí)施例3：重組桿狀病毒bev/rep-(itr-gfp)感染sf9/cap包裝細(xì)胞系制備raav

(1)將構(gòu)建有重組腺相關(guān)病毒itr核心表達(dá)元件和rep基因的重組桿狀病毒感染相應(yīng)的宿主包裝細(xì)胞系

所述構(gòu)建有重組腺相關(guān)病毒itr核心表達(dá)元件和相rep基因的重組桿狀病毒，即重組桿狀病毒bev/rep-(itr-gfp)，按照如下方法制備并擴(kuò)增：

為了將制備raav所需的itr核心表達(dá)元件以及rep基因置于一個(gè)重組桿狀病毒中。我們利用了桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(bactobac)中的pfast.bac.dual(pfbd)穿梭載體(如圖1b)。實(shí)例中基于2型aav的rep基因依據(jù)核糖體泄露掃描原理進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，并將rep基因置于p10啟動(dòng)子的調(diào)控之下(如圖2c)或ph啟動(dòng)子(如圖2d)的調(diào)控之下，實(shí)現(xiàn)rep基因的功能性表達(dá)。rep基因序列為如seqidno.6、seqidno.7(2種對應(yīng)為repa、repb)所示的序列。實(shí)例中itr核心表達(dá)元件，itr選用2型aav的itr核酸序列，即如seqidno.3所示的序列，itr的核心表達(dá)元件采用了含有綠色熒光蛋白(gfp)的表達(dá)框，由cmv啟動(dòng)子控制gfp的表達(dá)，便于檢測重組病毒的活性。itr核心表達(dá)元件通過5’端連接核酸片段或3’端連接核酸片段與rep基因表達(dá)框或載體相連。5’端或3’端連接核酸片段為如seqidno.4(linka)或seqidno.5(linkb)所示的序列。

在本實(shí)例中，重組桿狀病毒中主要組件組合方案如下：

repa-linka-(itr-gfp)-linkb

利用常規(guī)分子克隆技術(shù)將itr核心表達(dá)元件(itr-gfp)通過連接核酸片段置于pfbd/rep載體的一側(cè)，構(gòu)建pfbd/rep-(itr-gfp)重組穿梭質(zhì)粒。

參照bactobac系統(tǒng)操作說明，將該重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化含有acmnpv桿狀病毒基因組的dh10bac菌。通過tn7轉(zhuǎn)座子元件介導(dǎo)的重組得到重組桿狀病毒基因組(bacmid)。通過藍(lán)白斑篩選和pcr鑒定獲得含有重組bacmid的陽性菌。抽提純化重組bacmid，將其轉(zhuǎn)染貼壁培養(yǎng)的sf9細(xì)胞。sf9細(xì)胞逐漸被轉(zhuǎn)染后產(chǎn)生的重組桿狀病毒完全感染并出現(xiàn)明顯的bev感染sf9細(xì)胞的細(xì)胞病變(cpe)現(xiàn)象。將細(xì)胞培養(yǎng)液3000rpm離心5min，上清中就含有產(chǎn)生的重組桿狀病毒。

將上清液感染貼壁培養(yǎng)的sf9細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)3天，可以看到對照組未感染病毒的sf9細(xì)胞狀態(tài)正常，沒有g(shù)fp的表達(dá)；而在實(shí)驗(yàn)組感染了重組桿狀病毒bev/rep-(itr-gfp)的sf9細(xì)胞都出現(xiàn)了明顯的cpe現(xiàn)象和明顯的gfp表達(dá)，結(jié)果如圖6a所示。將轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞后制備的bev感染貼壁或懸浮培養(yǎng)的sf9細(xì)胞，感染3天后細(xì)胞出現(xiàn)明顯cpe，將細(xì)胞培養(yǎng)液3000rpm離心5min，收上清即可獲得大量bev。病毒的滴度用熒光定量pcr的方法進(jìn)行測定，參考文獻(xiàn)(procnatlacadsciusa,2009.106(13):p.5059-64)中的方法。

所述相應(yīng)的宿主包裝細(xì)胞系，即誘導(dǎo)表達(dá)cap基因的sf9/cap包裝細(xì)胞系，按照如下方法建立：

為了便于包裝細(xì)胞系的篩選，在pir-vp-hr2-rbe質(zhì)粒(參考procnatlacadsciusa.2009mar31；106(13):5059-64)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改造，在殺稻瘟菌素(blasticidin,bsd)基因的c端通過fmdv自剪切多肽2a融合了綠色熒光蛋白(gfp)基因，得到pir-vp-hr2-rbe-bsd-gfp質(zhì)粒(如圖2f)。然后，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，通過bsd抗生素篩選得到整合了誘導(dǎo)表達(dá)aav的cap基因表達(dá)元件的sf9/cap包裝細(xì)胞系。該細(xì)胞系組成性表達(dá)gfp，可通過單克隆分離培養(yǎng)或流式細(xì)胞儀分選，進(jìn)一步得到raav產(chǎn)量較高的sf9/cap包裝細(xì)胞系，如圖6a所示。

(2)利用bev/rep-(itr-gfp)感染sf9/cap細(xì)胞系制備raav并驗(yàn)證其感染活性

將制備的bev/rep-(itr-gfp)以感染復(fù)數(shù)(moi＝5)感染懸浮培養(yǎng)的獲得的sf9/cap細(xì)胞系。感染72小時(shí)后，將細(xì)胞培養(yǎng)液3000rpm離心5min，分別收集培養(yǎng)上清和細(xì)胞沉淀。bev產(chǎn)生后，主要通過分泌釋放到培養(yǎng)基上清中，在sf9/cap細(xì)胞中也有部分未釋放的bev。raav產(chǎn)生后，主要存在于sf9/cap細(xì)胞核中，由于sf9/cap細(xì)胞感染后發(fā)生細(xì)胞病變(cpe)，部分細(xì)胞會(huì)裂解，raav也會(huì)有部分釋放到上清中，如圖6a所示。而因此上清和細(xì)胞沉淀中會(huì)同時(shí)存在bev和raav。

為了驗(yàn)證用重組桿狀病毒bev/rep-(itr-gfp)感染sf9/cap細(xì)胞制備出了具有活性的raav。通過病毒感染hek293細(xì)胞和sf9細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法證實(shí)該系統(tǒng)制備出了raav，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6b。具體實(shí)施過程和結(jié)果分析如下：將細(xì)胞沉淀反復(fù)凍融3次裂解后，5000rpm離心5min收集細(xì)胞裂解上清液。因?yàn)閞aav無包膜，經(jīng)60℃、30分鐘處理，活性不受影響；而重組桿狀病毒(bev)有包膜，經(jīng)60℃、30分鐘處理，失去活性。含有病毒的上清液感染hek293細(xì)胞2天后，利用傳統(tǒng)的三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞方法制備的raav對照組，在處理前后都有g(shù)fp表達(dá)，表明raav在處理前后都有感染活性。bev感染sf9細(xì)胞后的培養(yǎng)基上清組，未處理的有較強(qiáng)gfp表達(dá)，處理后僅有 無gfp表達(dá)，表明bev可以感染hek293細(xì)胞，滅活處理后bev不感染。細(xì)胞沉淀裂解液上清實(shí)驗(yàn)組，未處理的有較強(qiáng)gfp表達(dá)，處理后gfp強(qiáng)度有降低但仍有較強(qiáng)熒光，表明滅活處理后bev不感染，但上清中大量的raav仍能夠感染。用與感染hek293細(xì)胞組相同的樣品感染sf9細(xì)胞2天后，結(jié)果顯示：利用傳統(tǒng)的三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞方法制備的raav對照組，沒有g(shù)fp熒光，表明raav對sf9細(xì)胞沒有感染性。bev感染sf9細(xì)胞后的培養(yǎng)基上清組，滅活前有較強(qiáng)gfp表達(dá)，滅活后的沒有g(shù)fp表達(dá)。細(xì)胞沉淀裂解液上清實(shí)驗(yàn)組，未處理的有較強(qiáng)gfp表達(dá)，處理后的沒有g(shù)fp表達(dá)。

(3)將步驟(2)中獲得的重組腺相關(guān)病毒分離并純化。

raav的純化、滴度測定與細(xì)胞水平轉(zhuǎn)導(dǎo)活性驗(yàn)證

將重組bev感染后收集得到約為1×108cells的sf9/cap細(xì)胞沉淀，加入10ml裂解緩沖液(50mmtris-cl，150mmnacl，2mmmgcl2，ph8.0)，后反復(fù)凍融3次，5000rpm離心5min后收集上清，在上清中加入核酸酶benzonase至終濃度50u/ml，37℃水浴處理60min。處理后5000rpm離心10min收上清。上清用氯仿抽提，抽提后的上清再用含13.2％的(nh4)2so4和10％的peg8000的溶液進(jìn)行兩相沉淀的方法進(jìn)一步純化，方法參考文獻(xiàn)(jvirolmethods,2007.139(1):p.61-70.和jvirolmethods,2012.179(1):p.276-80.)。兩相沉淀后的上清，用pbs溶液進(jìn)行透析脫鹽處理，用amiconultra-4(100kdcutoff)透析柱離心濃縮至終體積1ml，無菌分裝后-80℃凍存。raav的滴度測定采用熒光定量pcr的方法，滴度單位用vg/ml(vg，virusgenomes)表示。

純化過程的raav得率見表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單個(gè)sf9/cap細(xì)胞raav的產(chǎn)量可達(dá)6.84×104vg，經(jīng)過本方法的純化后，回收率達(dá)到28.8％左右。

表3raav純化過程的得率分析

將hek293細(xì)胞以1×104cells/well接種到96孔板中，6h后感染相應(yīng)濃度梯度含量的純化的raav。感染48h后，用熒光顯微鏡觀察gfp的表達(dá)情況，如圖6c。結(jié)果表明，本發(fā)明的方法制備得到的raav具有較好的細(xì)胞水平轉(zhuǎn)導(dǎo)活性。

實(shí)施例4：重組桿狀病毒bev/rep-(itr-gfp)感染sf9/cap包裝細(xì)胞系制備raav

本實(shí)施例與實(shí)施例3相似，區(qū)別僅在于所述重組桿狀病毒，其主要組件組合方案如下：

linka-(itr-gfp)-linkb-repb

將本實(shí)例中的重組桿狀病毒bev/rep-(itr-gfp)感染sf9/cap包裝細(xì)胞系后，將制備得到的raav進(jìn)行純化。純化過程的raav得率見表4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單個(gè)sf9/cap包裝細(xì)胞raav的產(chǎn) 量可達(dá)8.16×104vg，經(jīng)過本方法的純化后，回收率達(dá)到34.7％左右。

表4raav純化過程的得率分析

將hek293細(xì)胞以1×104cells/well接種到96孔板中，6h后感染相應(yīng)濃度梯度含量的純化的raav。感染48h后，用熒光顯微鏡觀察gfp的表達(dá)情況，如圖7。結(jié)果表明，本發(fā)明的方法制備得到的raav具有較好的細(xì)胞水平轉(zhuǎn)導(dǎo)活性。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。