本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種蛋白ast及其編碼基因以及在植物耐逆性中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

砷屬于一級(jí)致癌性重金屬，在自然界廣泛存在。地殼砷平均濃度為3mg·kg^-1左右,位于構(gòu)成地殼元素的第20位。自然界的砷化合物多以砷酸鹽的形態(tài)存在。砷通過自然原因和人為原因進(jìn)入大氣、水和土壤中。自然原因包括：巖石風(fēng)化、火山噴發(fā)、溫泉流出等。人為原因包括：礦物質(zhì)的開采冶煉、煤的燃燒、含砷殺蟲劑除草劑化肥等的使用、以及生產(chǎn)制造玻璃有色金屬電子設(shè)備等。人類活動(dòng)使得釋放到環(huán)境中的砷急劇增加,全球很多地區(qū)的土壤以及水資源中的砷濃度都顯著超過安全標(biāo)準(zhǔn)。隨著工農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化的發(fā)展，越來越多的砷酸鹽流入農(nóng)田和灌溉用水，長(zhǎng)期生長(zhǎng)在砷污染的土壤以及使用砷污染的水澆灌農(nóng)作物使得糧食作物的砷含量增加，砷經(jīng)由植物進(jìn)入食物鏈，污染到糧食，最終被端上餐桌，影響人類健康。由于飲用了受到砷污染的水而導(dǎo)致砷中毒也是世界上許多地區(qū)面臨的一個(gè)嚴(yán)重健康問題。

獲得能夠增強(qiáng)植物耐受砷酸鹽脅迫能力的基因及其編碼蛋白，進(jìn)而通過基因工程、等位變異等方法得到能夠耐受砷酸鹽脅迫的植物/作物，對(duì)于在砷污染高危地區(qū)培育可安全食用的農(nóng)作物具有重要作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種蛋白ast及其編碼基因。

本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，命名為ast蛋白，獲自擬南芥(columbia生態(tài)型)，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。

為了使(a)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。

表1標(biāo)簽的序列

上述(b)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的dna序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。

編碼上述蛋白質(zhì)的dna分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，將其命名為ast基因。

上述dna分子是如下1)-3)中任一種的dna分子：

1)編碼區(qū)如序列表中序列2所示的dna分子；

2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的dna序列雜交且編碼具有相同功能蛋白質(zhì)的dna分子；

3)與1)或2)限定的dna序列具有90％以上同源性且編碼具有相同功能蛋白質(zhì)的dna分子。

上述嚴(yán)格條件可為在6×ssc、0.5％sds的溶液中，在65℃下雜交，然后用2×ssc、0.1％sds和1×ssc、0.1％sds各洗膜一次。

含有上述dna分子的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有ast基因的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mrna加工或基因表達(dá)的dna片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mrna前體的3’端。使用ast基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用ast基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素標(biāo)記物或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。

上述重組表達(dá)載體具體可為將ast基因插入載體pcxsn得到的重組質(zhì)粒，重組表達(dá)載體35s:ast為在載體pcxsn的xcmi酶切位點(diǎn)間插入了序列表的序列2所示的ast基因。

擴(kuò)增上述dna分子全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上述蛋白、上述dna分子或上述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在調(diào)控植物抗逆性中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上述應(yīng)用中，所述抗逆性為抗砷酸鹽，所述砷酸鹽具體為砷酸鈉；

所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；

所述雙子葉植物具體為十字花科植物；所述十字花科植物具體為擬南芥。

上述蛋白、上述dna分子或上述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在培育抗逆性提高轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；

所述抗逆性為抗砷酸鹽，所述砷酸鹽具體為砷酸鈉；

所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；

所述雙子葉植物具體為十字花科植物；所述十字花科植物具體為擬南芥。

本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種培育抗逆性提高轉(zhuǎn)基因植物的方法。

本發(fā)明提供的方法，為將編碼上述蛋白的dna分子導(dǎo)入目的植物，獲得轉(zhuǎn)基因植物，

所述轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性高于所述目的植物。

上述中，所述抗逆性為抗砷酸鹽，所述砷酸鹽具體為砷酸鈉；

所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；

所述雙子葉植物具體為十字花科植物；所述十字花科植物具體為擬南芥。

本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了擬南芥中增強(qiáng)植物耐受砷酸鹽脅迫的蛋白和基因，對(duì)于進(jìn)一步闡明植物耐受砷酸鹽脅迫的分子機(jī)理并通過基因工程等技術(shù)手段培育耐受砷酸鹽脅迫的作物或在砷污染高危地區(qū)培育可安全食用的農(nóng)作物具有重要的理論意義和實(shí)踐意義。

附圖說明

圖1為砷酸鹽脅迫時(shí)ast基因的表達(dá)檢測(cè)。

圖2為轉(zhuǎn)ast擬南芥的分子鑒定。

圖3為砷酸鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)ast擬南芥的表型鑒定結(jié)果。

圖4為砷酸鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)ast擬南芥的主根長(zhǎng)度和鮮重的測(cè)定結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。

下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。

以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

農(nóng)桿菌菌株gv3101：參考文獻(xiàn)：leeetal.agrobacteriumtumefacienspromotestumorinductionbymodulatingpathogendefenseinarabidopsisthaliana.plantcell2009,21:2948-2962。

實(shí)施例中的野生型擬南芥(wt)為哥倫比亞(columbia)擬南芥col-0(從nasc訂購(gòu)，貨號(hào)n28166，nasc:www.arabidopsis.info)。

ms培養(yǎng)基的制備方法：將1650mgnh4no3、1900mgkno3、370mgmgso4·7h2o、170mgkh2po4、440mgcacl2·2h2o、22.3mgmnso4·4h2o、0.83mgki、0.025mgcuso4·5h2o、6.25mgh3bo5、0.025mgcocl·6h2o、8.65mgznso4·7h2o、0.25mgna2moo4·2h2o、27.8mgfeso4·7h2o和37.3mgna2-edta溶于水并定容至1l。固體培養(yǎng)基中，每升加入8g瓊脂粉。

1/2ms培養(yǎng)基：ms培養(yǎng)基的鹽濃度減少一半，定容至1l。固體培養(yǎng)基中，每升加入8g瓊脂粉。

砷酸鹽培養(yǎng)基的制備方法：在1/2ms培養(yǎng)基中加入一定濃度的砷酸鈉。固體培養(yǎng)基中，每升加入8g瓊脂粉。

實(shí)施例1、ast蛋白及其編碼基因的發(fā)現(xiàn)及獲得

一、ast蛋白及其編碼基因的克隆

trizol(invitrogen)法提取擬南芥(columbia)col-0幼苗的總rna(100-200mg)，經(jīng)甲醛變性rna瓊脂糖凝膠電泳檢查rna的完整性。按照superscriptⁱⁱ的使用說明合成單鏈cdna。將合成的單鏈cdna稀釋10倍并作為模板dna，采用primer1和primer2組成的引物對(duì)進(jìn)行pcr反應(yīng)。

primer1：5'-atggggagaaaaccgtgctgtg-3'；

primer2：5'-tcataagaggaaaagattatcat-3'。

pcr體系(50μl)：10μl5×phusionhfbuffer，4μl2.5mmdntpmix，2.5μlprimer1(10μm)，2.5μlprimer2(10μm)，1μl模板dna,1.5μldmso,0.5μlphusiondnapolymerase(2u/μl)，余量為水。

pcr程序：98℃預(yù)變性3min；98℃15s，58℃30s，72℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

回收約792bp的pcr產(chǎn)物，連接到pmd18-t載體，依次進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果表明，pcr產(chǎn)物中具有序列表的序列2所示的開放閱讀框，編碼序列表的序列1所示的蛋白質(zhì)。

將序列表的序列1所示蛋白質(zhì)命名為ast蛋白。將ast蛋白的編碼基因命名為ast基因，其開放閱讀框如序列表的序列2所示。

二、砷酸鹽脅迫時(shí)ast基因的表達(dá)檢測(cè)

野生型擬南芥col-0種子在1/2ms培養(yǎng)基上萌發(fā)生長(zhǎng)7天,移至外加200μm砷酸鈉的1/2ms培養(yǎng)基上，分別在移苗12、24、36、48和72小時(shí)時(shí)取樣,提取rna。用qrt-pcr方法檢測(cè)ast基因的表達(dá)。qrt-pcr方法描述如下：首先以隨機(jī)引物(randomprimer，貨號(hào):c1181)合成的單鏈cdna稀釋10倍并作為qrt-pcr的模板dna；接著利用abi公司7500型real-timepcr儀(appliedbiosystems,fostercity,ca,usa)和abipowersybrgreenpcrmastermix試劑盒(貨號(hào):4367659),采用primer3和primer4組成的引物對(duì)進(jìn)行qrt-pcr鑒定。同時(shí)以primer5和primer6組成的actin2/8引物對(duì)進(jìn)行qrt-pcr，作為內(nèi)標(biāo)。

primer3：5'-ggctacgcacaaaccgatga-3'；

primer4：5-tttcgccacaagttcctcatcat-3’。

primer5：5'-acggtaacattgtgctcagtggtg-3'；

primer6：5-cttggagatccacatctgctgga-3’。

qrt-pcr的反應(yīng)體系(20μl)：含10μlkitmix,1μl1μmprimer3和1μl1μmprimer4(或1μl1μmprimer5和1μl1μmprimer6)，1μl模板dna，余量為水。

qrt-pcr的反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10min，95℃15s，60℃1min，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

結(jié)果如圖1所示：在砷酸鹽脅迫條件下,ast基因表達(dá)上調(diào),并且隨著砷酸鹽處理時(shí)間的延長(zhǎng),ast基因的表達(dá)量逐漸升高,說明ast受砷酸鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。

實(shí)施例2、ast基因的功能鑒定

一、ast重組表達(dá)載體的構(gòu)建

1、合成序列表的序列2所示的雙鏈dna分子并作為模板dna，采用primer1和primer2組成的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。

pcr體系(50μl)：10μl5×phusionhfbuffer，4μl2.5mmdntpmix，2.5μlprimer1(10μm)，2.5μlprimer2(10μm)，1μl模板dna,1.5μldmso,0.5μlphusiondnapolymerase(2u/μl)，余量為水。

pcr程序：98℃預(yù)變性3min；98℃15s，58℃30s，72℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

2、使用taq酶對(duì)步驟1得到的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的平末端進(jìn)行補(bǔ)a，使其具有a粘末端。

3、采用限制性內(nèi)切酶xcmi(neb公司)酶切載體pcxsn(genbank:fj905214.1，提交日：2009年7月6日，參考文獻(xiàn)：chenetal.aversatilezerobackgroundt-vectorsystemforgenecloningandfunctionalgenomics.plantphysiol.2009,150:1111-1121.)，使其線性化并具有t粘末端。

4、通過ta克隆方法，將步驟2的產(chǎn)物與步驟3的產(chǎn)物連接，得到重組質(zhì)粒35s:ast。經(jīng)過測(cè)序，重組質(zhì)粒35s:ast為在載體pcxsn的xcmi酶切位點(diǎn)間插入了序列表的序列2所示的ast基因。

二、轉(zhuǎn)ast擬南芥的獲得

1、將重組質(zhì)粒35s:ast導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株gv3101，得到重組農(nóng)桿菌。

2、利用花芽浸泡法(參考文獻(xiàn)cloughandbent,floraldip:asimplifiedmethodforagrobacterium-mediatedtransformationofarabidopsisthaliana.plantj.1998,16:735-743)，用步驟1得到的重組農(nóng)桿菌侵染野生型擬南芥(columbia)clo-0中，收獲t1代種子。t2代表示t1代自交產(chǎn)生的種子及由它所長(zhǎng)成的植株，t3代表示t2代自交產(chǎn)生的種子及由它所長(zhǎng)成的植株。在含50μg/l潮霉素的ms固體培養(yǎng)基平板上篩選t1代植株并進(jìn)行t2代和t3代的分離比統(tǒng)計(jì)，在t3代得到t3代轉(zhuǎn)ast擬南芥單拷貝純合株系，隨機(jī)取兩個(gè)株系并分別命名為oe11和oe26。

三、轉(zhuǎn)ast擬南芥的分子鑒定

分別將oe11，oe26的t3代轉(zhuǎn)ast擬南芥純合株系和野生型擬南芥植株進(jìn)行ast基因的表達(dá)鑒定。

提取各植株的總rna并反轉(zhuǎn)錄為cdna，采用primer3和primer4組成的引物對(duì)進(jìn)行pcr鑒定。同時(shí)以actin2/8作為內(nèi)標(biāo)。具體方法見實(shí)施例2。

結(jié)果見圖2。oe11，oe26的t3代轉(zhuǎn)ast擬南芥純合株中ast基因的表達(dá)量顯著高于野生型擬南芥，說明oe11和oe26是ast過量表達(dá)株系。

采用同樣的方法將空載體pcxsn導(dǎo)入野生型擬南芥中，得到轉(zhuǎn)pcxsn擬南芥。

四、轉(zhuǎn)ast擬南芥的表型鑒定

一、表型鑒定

將t3代轉(zhuǎn)ast擬南芥純合株(oe11和oe26)、轉(zhuǎn)pcxsn擬南芥和野生型擬南的種子播種于1/2ms固體培養(yǎng)基或外加200μm砷酸鈉的1/2ms固體培養(yǎng)基，萌發(fā)生長(zhǎng)至7天和15天時(shí)，照相。培養(yǎng)條件：16h光照(光強(qiáng)80μmol·m^-2·s^-1)/8h黑暗，22℃。

照片見圖3。在含有200μm砷酸鈉的培養(yǎng)基上萌發(fā)生長(zhǎng)7天時(shí)，oe11和oe26的主根長(zhǎng)度明顯長(zhǎng)于野生型(圖3中a)；在含有200μm砷酸鈉的培養(yǎng)基上萌發(fā)生長(zhǎng)15天時(shí)，野生型葉片發(fā)黃發(fā)紫，表現(xiàn)明顯的砷酸鹽毒害表型，而oe11和oe26較野生型有明顯生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，葉片仍然保持綠色(圖3中b)，說明t3代轉(zhuǎn)ast擬南芥純合株(oe11和oe26)較野生型擬南芥耐受砷酸鹽脅迫。

轉(zhuǎn)pcxsn擬南芥和野生型擬南結(jié)果無顯著差異。

二、主根長(zhǎng)度檢測(cè)

將t3代轉(zhuǎn)ast擬南芥純合株(oe11和oe26)、轉(zhuǎn)pcxsn擬南芥和野生型擬南芥的種子播種于分別外加0、100、200、300和400μm砷酸鈉的1/2ms固體培養(yǎng)基，萌發(fā)生長(zhǎng)7天，測(cè)定主根長(zhǎng)度，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。每種植物材料在不同濃度砷酸鈉處理?xiàng)l件下統(tǒng)計(jì)60株苗。

結(jié)果見圖4中a。在不含有砷酸鈉的培養(yǎng)基上萌發(fā)生長(zhǎng)時(shí)，oe11和oe26的主根長(zhǎng)度與野生型擬南芥無顯著差異。在含有100、200、300和400μm砷酸鈉的培養(yǎng)基上萌發(fā)生長(zhǎng)時(shí)，oe11和oe26的主根長(zhǎng)度顯著長(zhǎng)于野生型的主根長(zhǎng)。主根長(zhǎng)度測(cè)定結(jié)果說明過量表達(dá)ast(oe11和oe26)能增強(qiáng)植物耐受砷酸鹽脅迫的能力。

轉(zhuǎn)pcxsn擬南芥和野生型擬南結(jié)果無顯著差異。

三、生物量指標(biāo)檢測(cè)

將t3代轉(zhuǎn)ast擬南芥純合株(oe11和oe26)、轉(zhuǎn)pcxsn擬南芥和野生型擬南芥的種子播種于分別外加0、100、200、300和400μm砷酸鈉的1/2ms固體培養(yǎng)基，萌發(fā)生長(zhǎng)7天，測(cè)定植物整株鮮重，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。每種植物材料在不同濃度砷酸鈉處理?xiàng)l件下，20株苗為一組，統(tǒng)計(jì)3組。

結(jié)果見圖4中b。在不含有砷酸鈉的1/2ms固體培養(yǎng)基上萌發(fā)生長(zhǎng)時(shí)，oe11和oe26的鮮重略低于野生型擬南芥；在含有100μm砷酸鈉的1/2ms固體培養(yǎng)基上萌發(fā)生長(zhǎng)時(shí)，oe11和oe26的鮮重與野生型擬南芥無顯著差異；在含有200、300和400μm砷酸鈉的1/2ms固體培養(yǎng)基上萌發(fā)生長(zhǎng)時(shí)，oe11和oe26的鮮重顯著高于野生型擬南芥。生物量測(cè)定結(jié)果說明：在砷酸鹽脅迫條件下，oe11和oe26較野生型擬南芥有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。

轉(zhuǎn)pcxsn擬南芥和野生型擬南結(jié)果無顯著差異。

表型鑒定結(jié)果說明：ast基因能顯著增強(qiáng)植物耐受砷酸鹽脅迫的能力。