本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種三維仿生人體肝組織的體外構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

肝臟是人體最大的內(nèi)臟器官，擔(dān)負(fù)著解毒、代謝、分泌膽汁和免疫防御等多種重要功能。我國(guó)是肝病大國(guó)，每年約有30萬(wàn)人死于肝臟疾病，約有十分之一的人口是乙肝病毒攜帶者，用于肝病治療的費(fèi)用超過(guò)300億。對(duì)于肝癌和急性肝衰竭等嚴(yán)重疾病，治療的最佳途徑是肝移植，但器官供體來(lái)源的限制仍是不可避免的問(wèn)題。另一方面，平均一種新藥的研發(fā)成本約是50億美元，歷時(shí)12年時(shí)間的專注投入，大部分經(jīng)費(fèi)和時(shí)間都花費(fèi)在化合物篩選和藥物檢測(cè)階段。然而，藥物上市后仍可能出現(xiàn)人體毒性和副作用事件，這也是藥物發(fā)生召回的主要原因，而其中約有50％源于藥物的肝臟毒性問(wèn)題。

現(xiàn)階段常用的藥物檢測(cè)模型是動(dòng)物模型和二維單層培養(yǎng)的細(xì)胞。但由于多種病原體(如丙型肝炎等)的種屬特異性以及鼠類與人類的端粒酶調(diào)節(jié)機(jī)制的巨大差別，導(dǎo)致動(dòng)物體的肝臟代謝規(guī)律在許多方面都與人體有著本質(zhì)的差別，因此，動(dòng)物模型經(jīng)常無(wú)法有效檢測(cè)出藥物對(duì)于人體肝臟的毒性等副作用。

平面培養(yǎng)的人肝細(xì)胞是藥物毒性相關(guān)研究的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”，應(yīng)用于包括藥物代謝、藥物毒性、肝炎病毒感染、抗病毒藥物開(kāi)發(fā)和肝臟疾病的新療法等研究領(lǐng)域。但健康的人體肝細(xì)胞來(lái)源極其有限，而平面單層培養(yǎng)條件又限制了細(xì)胞表面受體的分布和群聚狀態(tài)，干擾了正常組織中細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的信號(hào)傳導(dǎo)，因此二維單層培養(yǎng)的肝細(xì)胞很 快喪失其表型和功能特征(小于7天)，極大限制了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。因此，基于人體原代肝臟細(xì)胞或人體來(lái)源的干細(xì)胞，在三維結(jié)構(gòu)中誘導(dǎo)分化形成功能性的肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)體，是現(xiàn)階段研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)問(wèn)題。

基于組織工程的原理與技術(shù)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者使用生物材料作為肝細(xì)胞培養(yǎng)的支架材料，目標(biāo)是重建細(xì)胞生長(zhǎng)極性和功能，進(jìn)而形成功能性的三維肝組織。

人體肝細(xì)胞的分化成熟對(duì)于細(xì)胞-細(xì)胞相互作用、細(xì)胞-外基質(zhì)相互作用和氧氣含量都有較高的需求，以上所述的傳統(tǒng)組織工程技術(shù)很難將多種細(xì)胞成分植入固體支架中，特別是難以在三維支架結(jié)構(gòu)中控制不同種類的細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的空間分布，因此，體外構(gòu)建大體積的、長(zhǎng)期具有功能的人體肝組織具有很高難度，目前未見(jiàn)到相關(guān)報(bào)道。基于3d打印的生物制造技術(shù)在個(gè)性化體外生物結(jié)構(gòu)模型制造上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，此技術(shù)的應(yīng)用逐漸成為一個(gè)多學(xué)科交叉的新興領(lǐng)域—細(xì)胞3d打印。該技術(shù)能夠快速形成內(nèi)部含有細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)體而不需細(xì)胞種植過(guò)程；能在空間上準(zhǔn)確沉積不同種類的細(xì)胞；能在結(jié)構(gòu)體中設(shè)計(jì)貫通管道以提高物質(zhì)傳輸?shù)哪芰?，為?gòu)建較大體積的活性組織提供了可能，目前已經(jīng)應(yīng)用在多種組織的體外構(gòu)建研究以及藥物檢測(cè)中，包括脂肪組織、能量代謝系統(tǒng)、癌癥組織等。2014年1月，美國(guó)生物技術(shù)公司organovo利用細(xì)胞噴墨打印技術(shù)(inkjetcellprintingtechnology)構(gòu)建出含有肝細(xì)胞、星形細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的微型化“mini人肝臟”，收到社會(huì)廣泛關(guān)注，顯示了細(xì)胞3d打印技術(shù)的巨大前景，但由于改技術(shù)打印速度的限制，該迷你肝臟的最大尺寸為2mm，且目前尚未看到正式文獻(xiàn)的報(bào)道，售價(jià)非常昂貴。除此之外，目前尚未見(jiàn)到三維打印技術(shù)構(gòu)建人體肝細(xì)胞的其他報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

(一)要解決的技術(shù)問(wèn)題

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中構(gòu)建的體外人體肝組織存在功能特征不好，大小尺寸不可控的缺陷，本發(fā)明首先提供一種體積結(jié)構(gòu)可調(diào)的、長(zhǎng)期具有功能的體外人體肝組織的構(gòu)建方法。

(二)技術(shù)方案

本發(fā)明所述的技術(shù)方案包括以下步驟：

(1)將種子細(xì)胞的溶液與生物墨水溶液均勻混合得到細(xì)胞打印溶液；

(2)在計(jì)算機(jī)控制下，利用細(xì)胞打印機(jī)將所述細(xì)胞打印溶液按照設(shè)計(jì)的路徑和速度均勻擠出，并在一定的溫度下使細(xì)胞打印溶液快速凝結(jié)形成凝膠微絲；重復(fù)以上操作，以層層掃描的方式完成多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的構(gòu)建；

(3)對(duì)所述多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)體進(jìn)行二次交聯(lián)處理，并使用細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)，得到結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)體；

(4)使用誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)所述結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)體，得到體外三維人體肝組織。

本發(fā)明中，所述生物墨水選自包含以下的一種或多種物質(zhì)的溶液：明膠、明膠衍生物、海藻酸鹽、海藻酸鹽衍生物、瓊脂、基質(zhì)膠、膠原蛋白、蛋白多糖、糖蛋白、透明質(zhì)酸、殼聚糖、層連接蛋白、纖連接蛋白、纖維蛋白、玻連蛋白、骨橋蛋白、肽段水凝膠。

本發(fā)明中，所述生物墨水優(yōu)選為明膠和海藻酸鹽的混合液、明膠、海藻酸鈉和基質(zhì)膠的混合液或海藻酸鈉、膠原蛋白和纖維蛋白原的混合液；優(yōu)選的，其中所述生物墨水中，海藻酸鹽的濃度為0.1％～5％。以上材料均為天然生物材料，細(xì)胞相容性好。海藻酸鹽可在生理濃度的鈣離子作用下快速交聯(lián)，并長(zhǎng)期維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的在培養(yǎng)環(huán)境下的穩(wěn)定性；明膠具有溫敏特性，可通過(guò)調(diào)節(jié)成形條件保持低剪切力條件從而保證細(xì)胞存活；基質(zhì)膠、纖維蛋白原、明膠等材料具有極好的細(xì)胞誘導(dǎo)性和組織誘導(dǎo)性，利于三維肝細(xì)胞的分化、 成熟和肝組織形成。

本發(fā)明中，所述種子細(xì)胞包括人肝臟干細(xì)胞、人肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞、人肝臟細(xì)胞系、人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化形成的肝臟細(xì)胞、人誘導(dǎo)性全能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化形成的肝臟細(xì)胞、人間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化形成的肝臟細(xì)胞、人組織干細(xì)胞誘導(dǎo)分化形成的肝臟細(xì)胞、人內(nèi)皮細(xì)胞、人成纖維細(xì)胞、人膽管上皮細(xì)胞、人枯氏細(xì)胞、人星形細(xì)胞中的一種或多種混合物。

本發(fā)明中，所述細(xì)胞打印溶液中種子細(xì)胞的密度為10⁵～10⁷個(gè)/ml。

本發(fā)明中，所述二次交聯(lián)溶液包括選自以下的一種或多種物質(zhì)的溶液：氯化鈣、京尼平、戊二醛、凝血酶溶液；優(yōu)選的，所述二次交聯(lián)溶液為濃度100mm～500mm的氯化鈣或濃度為10ng/ml～1mg/ml的凝血酶。

本發(fā)明中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為在肝細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液中添加濃度為0.5％～2％的dmso。

本發(fā)明使用的肝細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基為dmem培養(yǎng)液中添加10％fbs血清，0.05％胰島素，5×10^-5m氫化可的松琥珀酸酯，1％青鏈霉素，1％glutamax^tmsupplement和1％memnon-essentialaminoacidssolution。dmso的濃度添加不同，誘導(dǎo)形成的肝組織的結(jié)構(gòu)不同，當(dāng)添加濃度為0.5％dmso時(shí)，既可形成肝細(xì)胞，也可形成膽管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；當(dāng)添加濃度為2％的dmso時(shí)，僅可形成肝細(xì)胞，當(dāng)添加濃度為1％時(shí)，前期可形成膽管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，后期消失。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是保護(hù)利用本發(fā)明的方法構(gòu)建的體外三維人體肝組織。

本發(fā)明的最后一個(gè)目的是保護(hù)本發(fā)明的體外三維人體肝組織在1)制備體內(nèi)組織修復(fù)或再生的材料；2)制備體外檢測(cè)藥物肝毒性的材料；3)肝病治療；4)藥物開(kāi)發(fā)、藥物篩選、藥物檢測(cè)5)構(gòu)建 藥理模型、病理模型、組織/器官模型方面的應(yīng)用。

(三)有益效果

本發(fā)明所述的方法，具有如下的有益效果

1)體積和尺寸可控

本發(fā)明中的肝組織由擠出式細(xì)胞三維打印技術(shù)制備而成，相比噴墨式細(xì)胞打印技術(shù)而言，打印速度快、效率高、結(jié)構(gòu)內(nèi)部可方便實(shí)現(xiàn)貫通通道以便營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)傳輸，既可形成毫米級(jí)尺度的微型肝組織，也可形成厘米、甚至分米級(jí)尺度的大型肝組織。兩者都可作為肝病治療研究平臺(tái)、病理/藥理模型和組織器官模型，前者更適合用于高通量藥物檢測(cè)研究，并可配合生物芯片裝置使用，后者更適合作為體內(nèi)病損組織修復(fù)材料。

2)肝組織結(jié)構(gòu)可控

本發(fā)明中，干細(xì)胞在三維結(jié)構(gòu)中可同時(shí)向多個(gè)方向分化，形成肝組織中的多種細(xì)胞，而且，可通過(guò)調(diào)節(jié)誘導(dǎo)溶液的濃度，形成具有或不具有微米級(jí)的貫通的多分支膽管網(wǎng)絡(luò)。

3)肝組織功能好

干細(xì)胞向肝臟細(xì)胞誘導(dǎo)分化的成熟度和長(zhǎng)期的功能維持對(duì)于載體材料、周圍其他細(xì)胞和氧氣濃度三個(gè)方面的要求都較高，現(xiàn)有報(bào)道中或者干細(xì)胞分化效率低、成熟度較差，或者肝細(xì)胞的功能維持時(shí)間較短。本發(fā)明的細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)體中含有多種對(duì)肝細(xì)胞功能有促進(jìn)作用的載體材料，如膠原、基質(zhì)膠等。此外，基于三維打印技術(shù)，可保證每根材料微絲的最大寬度以及微絲間的間距，在微絲間充滿了細(xì)胞培養(yǎng)液，以滿足肝臟細(xì)胞和干細(xì)胞對(duì)較高氧氣濃度的要求。與二維培養(yǎng)的在相同誘導(dǎo)條件下的相同細(xì)胞相比，本發(fā)明的三維細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的白蛋白分泌水平是711倍，尿素分泌水平是16倍，如圖3所示。肝細(xì)胞關(guān)鍵基因白蛋白的表達(dá)水平是18倍，膽管細(xì)胞關(guān)鍵基因ck19的表達(dá)水平是18.6倍， 肝細(xì)胞分泌功能關(guān)鍵基因mrp2的表達(dá)水平是10倍，肝細(xì)胞藥物代謝功能關(guān)鍵基因cyp3a4基因的表達(dá)水平是189倍，如圖4所示。

4)透明

本發(fā)明的細(xì)胞結(jié)構(gòu)體透明度高，能夠通過(guò)光學(xué)顯微鏡監(jiān)測(cè)其所負(fù)載的細(xì)胞的生長(zhǎng)情況并且有利于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)三維肝組織的生物學(xué)性能。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明肝組織形貌。

(a)肝組織顯微形貌，類球形為肝細(xì)胞團(tuán)簇，如藍(lán)色箭頭所示，梭形為膽管細(xì)胞，如黑色箭頭所示；

(b)只含有肝細(xì)胞的肝組織顯微形貌，類球形為肝細(xì)胞團(tuán)簇，如藍(lán)色箭頭所示；

圖2表示肝組織中多種細(xì)胞的關(guān)鍵標(biāo)志性蛋白表達(dá)情況；

圖3表示肝組織白蛋白和尿素分泌水平，與二維培養(yǎng)的同種條件比較，*表示數(shù)據(jù)有顯著性差異；

圖4表示肝組織的關(guān)鍵標(biāo)志性基因表達(dá)情況，與二維培養(yǎng)的同種條件比較，*表示數(shù)據(jù)有顯著性差異。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。

本文中使用的術(shù)語(yǔ)“三維打印”是指：經(jīng)由與自動(dòng)的或半自動(dòng)的、計(jì)算機(jī)輔助的三維成型裝置(例如三維打印機(jī))相匹配的方法，利用三維打印相容的原料進(jìn)行的三維精確沉積。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的三維結(jié)構(gòu)體是工程化的。術(shù)語(yǔ)“工程化的”是指：根據(jù)計(jì)算機(jī)腳本，通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助的裝置(例如三維打印機(jī))，將原料(例如生物墨水原料和/或細(xì)胞打印溶液)和它們的層放置以形成三維結(jié)構(gòu)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，計(jì)算機(jī)腳本，例如 是一個(gè)或多個(gè)計(jì)算機(jī)程序、計(jì)算機(jī)應(yīng)用或計(jì)算機(jī)模塊。

在一些實(shí)施方案中，三維打印方法是連續(xù)的和/或基本連續(xù)的。連續(xù)三維打印方法的非限制性實(shí)例是：經(jīng)由連接到打印墨水儲(chǔ)存器的分配末端(例如，注射器、毛細(xì)管等)從三維打印機(jī)分配打印墨水(例如生物墨水原料和/或細(xì)胞打印溶液)。在進(jìn)一步的非限制性實(shí)施方案中，連續(xù)三維打印方法是按功能單元的重復(fù)圖案(pattern)分配打印墨水。

在各個(gè)實(shí)施方案中，重復(fù)功能單元具有任何適宜的幾何形狀，包括例如：圓形、正方形、矩形、三角形、多邊形和不規(guī)則的幾何形狀，從而產(chǎn)生具有通過(guò)獨(dú)特打印墨水和/或間隙空間的空間圖案化而獲得的平面幾何形狀的一個(gè)或多個(gè)組織層。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，三維打印的功能單元的一個(gè)重復(fù)圖案包括一個(gè)層，相鄰地三維打印(例如堆疊)多個(gè)層以形成具有層狀幾何形狀的工程化結(jié)構(gòu)體。在各個(gè)實(shí)施方案，相鄰地三維打印(例如堆疊)了2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個(gè)或更多個(gè)層，以形成工程化結(jié)構(gòu)體。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，具有層狀幾何形狀的組織的一個(gè)或多個(gè)層也具有平面幾何形狀。

在一些實(shí)施方案中，連續(xù)三維打印的方法包括：獨(dú)立地或相對(duì)于彼此優(yōu)化和/或平衡諸如打印高度、泵速、機(jī)撲速度或其組合的參數(shù)。在一個(gè)實(shí)例中，用于沉積的三維打印機(jī)頭速度為3mm/s，第一層的分配高度為0.5mm，而后面每個(gè)層的分配高度增加0.4mm。在一些實(shí)施方案中，該分配高度與三維打印機(jī)分配末端的直徑基本相等。不受限制地，適宜的和/或最佳的分配距離不會(huì)導(dǎo)致材料變平或附著到分配針上。在各個(gè)實(shí)施方案中，三維打印機(jī)分配末端具有約20、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000μm或更大的內(nèi)徑，包括其中任意范圍。在各個(gè)實(shí)施方案中，三維打印機(jī)的打印墨水儲(chǔ)存器具有約0.05、 0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100cm³或更大的容積，包括其中任意范圍。在一些情況下，當(dāng)系統(tǒng)中的殘余壓力積累較低時(shí)，該泵速是適宜的或最佳的。在一些情況下，有利的泵速取決于儲(chǔ)存器的橫截面積與分配針之間的比例，該比例越大，則需要越低的泵速。在一些實(shí)施方案中，適宜的和/或最佳的打印速度使得能夠沉積均勻的線，而不影響材料的機(jī)械完整性。

在一些實(shí)施方案中，本文中公開(kāi)的技術(shù)和方法的速度和可放大性用來(lái)設(shè)計(jì)、構(gòu)建和操作用于生產(chǎn)供植入使用的三維結(jié)構(gòu)體或用于生成基于細(xì)胞的工具(用于研究和開(kāi)發(fā)，例如體外分析)的工業(yè)和/或商業(yè)設(shè)施。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，三維仿生人體肝組織及其陣列被生產(chǎn)、儲(chǔ)存、分發(fā)、上市、宣傳并銷售，例如作為用于生物分析和高通量藥物篩選的細(xì)胞陣列(例如微陣列或芯片)、組織陣列(例如微陣列或芯片)以及試劑盒。在其它實(shí)施方案中，三維仿生人體肝組織及其陣列被制造并用來(lái)進(jìn)行作為服務(wù)的生物分析和/或藥物篩選。

實(shí)施例1

本實(shí)施例涉及一種體外三維人體肝組織的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

準(zhǔn)備步驟：

1)生物墨水原溶液的配制

明膠溶液：將明膠粉末(sigma,g1890)與去離子水按照質(zhì)量比為15:100的比例混合，在80℃條件下加熱3小時(shí)使其均勻溶解，之后分裝，于4℃或者-20℃低溫保存。每次使用前在細(xì)胞培養(yǎng)箱中保溫10min后使其融化為均勻溶液。

海藻酸鈉溶液：將海藻酸鈉粉末(sigma,a0682)與去離子水按照質(zhì)量比為4:100的比例混合，在80℃條件下加熱3小時(shí)使其均勻溶解，之后分裝，于4℃或者-20℃低溫保存。每次使用前在細(xì)胞培養(yǎng)箱中保 溫10min后使其融化為均勻溶液。

2)種子細(xì)胞的培養(yǎng)

將heparg細(xì)胞(sigma，hprgc1)在細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液的成分為dmem(gibco,11960044)培養(yǎng)液中添加10％fbs血清(gibco,16000)，0.05％胰島素(sigma,i9278)，5×10^-5m氫化可的松琥珀酸酯(sigma,h4881)，1％青鏈霉素(gibco,15140122)，1％glutamax^tmsupplement(gibco,35050061)和1％memnon-essentialaminoacidssolution(gibco,11140050)。當(dāng)細(xì)胞90％匯合的時(shí)候按照1:5的比例傳代，每2-3天更換一次培養(yǎng)液。

具體實(shí)施步驟：

1)將預(yù)先制備的明膠溶液600μl與海藻酸鈉溶液450μl在室溫均勻混合，得生物墨水溶液，并將其存放在37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中預(yù)熱20min備用；將種子細(xì)胞用0.25％的trypsin/edta的消化液消化收集后以6×10⁶個(gè)/ml的密度懸浮在細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液中，得種子細(xì)胞溶液；取100μl種子細(xì)胞溶液和生物墨水均勻混合后得細(xì)胞打印溶液，并將其裝載到1ml一次性無(wú)菌注射器中；

2)將無(wú)菌注射器裝載到生物三維打印設(shè)備中(具體方法可參見(jiàn)ruiyao,etal.,invitroangiogenesisof3dtissueengineeredadiposetissue,journalofbioactiveandcompatiblepolymer,2009；24：5)，常溫下，在計(jì)算機(jī)軟件(microsoft,at640,redmond,wa)控制下，以步進(jìn)電機(jī)速度2mm/s，掃描速度10mm/s的參數(shù)條件下，在無(wú)菌的平面平臺(tái)上三維打印，形成體積為8mm×8mm×5mm的預(yù)凝膠三維結(jié)構(gòu)體。

3)將2)獲得的預(yù)凝膠結(jié)構(gòu)體用100mm的氯化鈣溶液交聯(lián)3min，然后吸去氯化鈣溶液并加入heparg細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液，常規(guī)條件下(37℃，5％co2孵箱)培養(yǎng)細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)體，培養(yǎng)過(guò)程中每2～3天換液。

4)培養(yǎng)7天后更換為細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)7天，所述細(xì)胞 誘導(dǎo)培養(yǎng)液為細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液中添加濃度為0.5％dmso。

實(shí)施例2

同實(shí)施例1相比，本實(shí)施例的區(qū)別在于，步驟4)中，所述細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液為細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液中添加濃度為2％dmso。

實(shí)施例3

同實(shí)施例1相比，本實(shí)施例的區(qū)別在于，步驟4)中，所述細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液為細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液中添加濃度為1％dmso。

實(shí)驗(yàn)例

1、細(xì)胞和組織的形態(tài)變化

用光學(xué)顯微鏡(olympus,cx40)每天觀察細(xì)胞形態(tài)變化并照相。所得三維仿生人體肝組織微觀形貌如圖1所示，圖1(a)為實(shí)施例1獲得既有肝細(xì)胞(灰色箭頭所示)也有膽管網(wǎng)絡(luò)(黑色箭頭所示)的體外肝組織顯微形貌。圖1(b)為實(shí)施例2所獲得只含有肝細(xì)胞的肝組織顯微形貌，如灰色箭頭所示。

2、常規(guī)免疫熒光染色法檢測(cè)實(shí)施例1中三維肝組織相關(guān)的關(guān)鍵蛋白表達(dá)。具體操作步驟為：

吸去培養(yǎng)液，用磷酸緩沖液(sigma)沖洗實(shí)施例1所得三維仿生肝組織1次；

用2.5％戊二醛(sigma)在室溫下固定組織4小時(shí)，用磷酸緩沖液(sigma)沖洗組織3次，每次5分鐘；

用0.25％triton-x破膜處理20min，用磷酸緩沖液(sigma)沖洗組織3次，每次5分鐘；

用5％胎牛血清白蛋白封閉1h，用磷酸緩沖液(sigma)沖洗組織3次，每次5分鐘；

加入一抗溶液，如zo-1(ab59720，abcam，1μg/ml)、mrp2(ab3373，abcam，10μg/ml)、alb(ab83465，abcam，5μg/ml)、cyp3a4(ab3572，abcam，5μg/ml)、ck18(af7619，r&dsystems， 1μg/ml)、hnf-4α(mab4605，r&dsystems，15μg/ml)、ck19(mab3506，r&dsystems，15μg/ml)、afp(mab1368，r&dsystems，15μg/ml)，4℃過(guò)夜。用磷酸緩沖液(sigma)沖洗組織3次，每次5分鐘；

加入對(duì)應(yīng)二抗，如alexa594(abcam，150080，稀釋1000倍)、alexa488(abcam，150113，稀釋1000倍)，加入相應(yīng)二抗，室溫避光孵育2h后，用磷酸緩沖液(sigma)沖洗組織3次，每次5分鐘；

加入1μg/ml的dapi染色細(xì)胞核，室溫避光孵育15min；

使用激光共聚焦顯微鏡(lscm，nikon，z2)來(lái)進(jìn)行圖片觀察。

三維仿生肝組織的關(guān)鍵蛋白：alb、afp、cyp3a4、ck19、zo-1染色情況見(jiàn)圖2。

由圖2可知，這幾種蛋白均檢測(cè)到高表達(dá)，其中alb和cyp3a4是成熟肝細(xì)胞分泌功能和藥物代謝功能的標(biāo)志性蛋白；afp是肝祖細(xì)胞標(biāo)志物，ck19是膽管細(xì)胞的標(biāo)志物；zo-1是肝細(xì)胞形成組織性排列后出現(xiàn)極性和膽小管結(jié)構(gòu)的標(biāo)志性蛋白。由圖可見(jiàn)，肝細(xì)胞形成緊密排列的團(tuán)簇結(jié)構(gòu)并高表達(dá)白蛋白(alb)、藥物代謝蛋白(cyp3a4)和細(xì)胞極性蛋白(zo-1)，膽管細(xì)胞自組裝形成中空管狀結(jié)構(gòu)并高表達(dá)ck19蛋白。

3、檢測(cè)肝組織白蛋白分泌和尿素的分泌功能

采用白蛋白分泌檢測(cè)試劑盒(bethyl，e80-129、e101、e115)和尿素分泌檢測(cè)試劑盒(bioassaysystems，diur-500)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)實(shí)施例1～3所得肝組織的白蛋白分泌和尿素分泌功能，結(jié)果如圖3所示，其中2d-0.5表示在2d打印的條件下dmso的濃度為0.5，2d-0.5表示在3d打印的條件下dmso的濃度為0.5，其他表示依次類推。結(jié)果顯示實(shí)施例2與常規(guī)平面培養(yǎng)的細(xì)胞相比，在細(xì)胞培養(yǎng)液和誘導(dǎo)培養(yǎng)液成分、培養(yǎng)環(huán)境完全一樣的情況下，三 維仿生肝組織的白蛋白分泌水平是平面培養(yǎng)細(xì)胞的711倍，尿素分泌水平是平面培養(yǎng)細(xì)胞的16倍。

4、檢測(cè)肝組織相關(guān)基因表達(dá)

采用標(biāo)準(zhǔn)定量基因檢測(cè)法(quantitativerealtimepolymerasechainreaction)檢測(cè)實(shí)施例1～3三維仿生肝組織的肝組織相關(guān)基因表達(dá)，肝組織rna提取操作步驟如下：

1)吸去培養(yǎng)液，用磷酸緩沖液(sigma)沖洗實(shí)施例3中所得三維仿生肝組織3次；

2)每個(gè)肝組織加入1mlreagent(gibco,15596026)，反復(fù)吹打混勻，然后室溫靜置10min；

3)加入0.2ml氯仿(takara)，劇烈振蕩30秒，室溫放置5min；

4)在4℃下，采用離心機(jī)(sigma3k15)12000g離心15分鐘；

5)吸取上清液，加入等體積異丙醇，室溫放置10min；

6)4℃10000×g離心10分鐘；

7)棄上清，用75％酒精洗滌rna沉淀；

8)風(fēng)干后，用depc(takara)水溶解。

9)用spectrophotometer(thermoscientific)來(lái)檢測(cè)rna濃度及純度。

rna反轉(zhuǎn)錄操作步驟：

采用primescript^tmii1ststrandcdnasynthesiskit(takara，6210)，完全按照試劑盒規(guī)范來(lái)進(jìn)行操作。rna含量均調(diào)整為5ng。引物為：oligodtprimer。反轉(zhuǎn)錄pcr程序?yàn)椋?2℃50min，95℃5min，4℃保溫，所用pcr儀(abi，simpliamptm熱循環(huán)儀)。

熒光定量pcr操作步驟：

試劑盒：maximasybrgreenqpcrmastermix(thermoscientific,k0251)，完全按照試劑盒規(guī)范進(jìn)行操作。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃10min，95℃15s，60℃30s，40個(gè)循環(huán)，72℃30s，72℃10min。 檢測(cè)儀器：bio-rad,cfx96。所用引物序列如下：

gapdh-ftgcaccaccaactgcttagc

gapdh-rggcatggactgtggtcatgag

alb-fgcacagaatccttggtgaacag

alb-ratggaaggtgaatgtttcagca

mrp2-ftgagcaagtttgaaacgcacat

mrp2-ragctcttctcctgccgtctct

cyp3a4-ftaacagtctttccattcctc

cyp3a4-rggactcagtttcttttgaat

ck19-fatggccgagcagaaccggaa

ck19-rccatgagccgctggtacttcc

其中，alb和cyp3a4是成熟肝細(xì)胞分泌功能和藥物代謝功能的標(biāo)志性蛋白；ck19是膽管細(xì)胞的標(biāo)志物；mrp2是肝細(xì)胞形成組織性排列后出現(xiàn)極性和膽小管結(jié)構(gòu)的標(biāo)志性蛋白。由圖4可知：三維打印結(jié)構(gòu)體各種基因的表達(dá)水平均高于二維打印中基因表達(dá)水平，是同等條件下二維培養(yǎng)細(xì)胞的7倍，三維打印結(jié)構(gòu)體中mrp2基因表達(dá)水平是同等條件下二維培養(yǎng)細(xì)胞的15倍，三維打印結(jié)構(gòu)體中cyp3a4基因表達(dá)水平是同等條件下二維培養(yǎng)細(xì)胞的20倍，三維打印結(jié)構(gòu)體中ck19基因表達(dá)水平是同等條件下二維培養(yǎng)細(xì)胞的19倍。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明、具體實(shí)施方式及試驗(yàn)，對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。