背景技術(shù)：
目前抗體藥物發(fā)展迅速，2013年全球十大暢銷藥物中就有五個(gè)是單抗藥物，而于2011年3月9日被fda批準(zhǔn)上市的belimumab是近50年來第一個(gè)獲準(zhǔn)的用于治療sle的藥物，預(yù)計(jì)至2015年，其銷售總額將高達(dá)30億美元，這無疑又是一顆重磅炸彈，因而在未來的臨床治療上，抗體藥物的需求將會(huì)越來越大。單鏈抗體(singlechainvariablefragment，scfv)是通過基因工程將抗體的重鏈可變區(qū)(variableregionofheavychain，vh)與輕鏈可變區(qū)(variableregionoflightchain，vl)通過一段連接肽而形成的一種重組蛋白。單鏈抗體既保持了親本抗體與抗原的結(jié)合特異性和相當(dāng)?shù)挠H和力，又有其分子量小、半衰期短、免疫原性更低等特點(diǎn)，并且單鏈抗體不具有完整抗體的fc段，因而其不易與具有fc受體的靶細(xì)胞結(jié)合且能更易進(jìn)入腫瘤組織和細(xì)胞，發(fā)揮相應(yīng)的作用。
b淋巴細(xì)胞刺激因子的過表達(dá)與多種自身免疫性疾病有著密切的聯(lián)系，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemiclupuserythematosus，sle)，肖格倫綜合征(sjogren'ssyndrome，ss)，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis，ra)，重癥肌無力(myastheniagravis，mg)等等。以blys為作用靶點(diǎn)的藥物，尤其以貝利木單抗為代表的單抗藥物等，在治療sle等自身性免疫疾病方面取得非常好的臨床效果。blys具有明顯的b細(xì)胞趨向性并能特異性的結(jié)合b細(xì)胞，其對(duì)于b細(xì)胞的增殖、分化、成熟以及生存等方面發(fā)揮著非常重要的調(diào)控作用，而blys對(duì)由b細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病的過程以及t淋巴細(xì)胞瘤起著重要的影響。
blys可大量發(fā)現(xiàn)于外周血及淋巴組織細(xì)胞的培養(yǎng)上清中，其主要表達(dá)于諸如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等先天固有的免疫細(xì)胞中；在ifnγ、il-10以及g-csf(granulocytecolony-stimulatingfactor，g-csf)等細(xì)胞因子的刺激下會(huì)增強(qiáng)blys的表達(dá)。
雖然目前噬菌體抗體庫(kù)為相對(duì)最成熟且應(yīng)用最多的抗體庫(kù)技術(shù)，但是噬菌體抗體庫(kù)屬于原核表達(dá)體系，與真核表達(dá)體系存在差異，而表達(dá)系統(tǒng)差異越大，抗體改構(gòu)后的活性發(fā)生改變的可能性就越大。哺乳動(dòng)物細(xì)胞抗體庫(kù)屬于真核表達(dá)體系，它具有原核表達(dá)體系所不具備翻譯后修飾功能，而這也是決定蛋白生物活性的關(guān)鍵之一。由于本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的哺乳動(dòng)物細(xì)胞抗體庫(kù)是應(yīng)用人源293t細(xì)胞建庫(kù)，因此獲得的抗體最近接天然人源抗體，在保證親和力的同時(shí)，也使所獲的候選抗體的免疫原性大大降低。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供能抗b淋巴細(xì)胞刺激因子抗體。
本發(fā)明提供了一種抗人b淋巴細(xì)胞刺激因子單克隆抗體，其具有選自下列可變區(qū)：(a)重鏈可變區(qū)包括seqidno:4所示氨基酸序列；(b)輕鏈可變區(qū)包括seqidno:9所示氨基酸序列；(c)重鏈可變區(qū)包括seqidno:4所示氨基酸序列，且輕鏈可變區(qū)包括seqidno:9所示氨基酸序列；(d)重鏈可變區(qū)與seqidno:4所示氨基酸序列具有至少90％同一性；或(e)輕鏈可變區(qū)與seqidno:9所示氨基酸序列具有至少90％同一性。
因此，目標(biāo)抗體可能包含a)一個(gè)重鏈可變區(qū)，其氨基酸序列與seqidno:4所示序列至少有約91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性和b)一個(gè)輕鏈可變區(qū)，其氨基酸序列與seqidno:9所示序列至少有約91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述本發(fā)明所述單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為seqidno:4，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為seqidno:9。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，編碼所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列的核苷酸序列為seqidno:3，編碼所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列的核苷酸序列為seqidno:8。
另一方面，本發(fā)明提供了具有選自下列可變區(qū)的單克隆抗體：
(a)重鏈可變區(qū)的編碼基因包括seqidno:3所示核苷酸序列；(b)輕鏈可變區(qū)的編碼基因包括seqidno:8所示核苷酸序列；(c)重鏈可變區(qū)的編碼基因包括seqidno:3所示核苷酸序列，且輕鏈可變區(qū)的編碼基因包括seqidno:8所示核苷酸序列；(d)重鏈可變區(qū)的編碼基因能與seqidno:3所示核苷酸序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交；或(e)輕鏈可變區(qū)的編碼基因能與seqidno:8所示核苷酸序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交。
一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述單鏈抗體的重鏈可變區(qū)的編碼核苷酸序列為seqidno:3，輕鏈可變區(qū)的編碼核苷酸序列為seqidno:8。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明所述單克隆抗體的氨基酸序列為seqidno:2。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明所述單鏈抗體的編碼基因的核苷酸序列為seqidno:1。
另一方面，本發(fā)明提供了重組表達(dá)載體，其中含有編碼本發(fā)明所述單鏈抗體全長(zhǎng)或可變區(qū)的核酸序列。
另一方面，本發(fā)明提供了宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞被本發(fā)明所述的重組表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的單鏈抗體與blys具有高親和力，blys過表達(dá)與多種自身免疫性疾病有著密切的聯(lián)系，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemiclupuserythematosus，sle)、 肖格倫綜合征(sjogren'ssyndrome，ss)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis，ra)、重癥肌無力(myastheniagravis，mg)等。以blys為作用靶點(diǎn)的藥物在治療sle等自身性免疫疾病方面取得非常好的臨床效果。
因此，另一方面，本發(fā)明提供了一種用于治療自身免疫病的藥物組合物，其包含有效量的作為活性成分的本發(fā)明所述的單鏈抗體和藥用載體。
術(shù)語“有效量”指可有效治療哺乳動(dòng)物中的疾病或病癥的藥物量。
術(shù)語“藥效上可接受的載體”指一種或多種有機(jī)或無機(jī)成分，它可以使天然的或合成的，與抗體組合后可促進(jìn)其應(yīng)用。可接受的載體包括無菌的生理鹽水或是其他藥學(xué)上可獲得的且為本領(lǐng)域所熟知的水或非水的等滲溶液或滅菌混懸劑。
另一方面，本發(fā)明提供了一種針對(duì)自身免疫病的診斷試劑，其包含本發(fā)明所述的單鏈抗體、能夠產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的標(biāo)記物及使用說明書。
另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明所述單鏈抗體在制備用于治療自身免疫病的藥物中的用途。
另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明所述單鏈抗體在制備自身免疫病的診斷試劑中的用途。
本發(fā)明中所述的自身免疫病包括但不限于系統(tǒng)性紅斑狼瘡、肖格倫綜合征、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎或重癥肌無力等。
本發(fā)明所述單鏈抗體的重鏈可變區(qū)中的cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分別如seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14所示；輕鏈可變區(qū)中cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分別如seqidno:15、wgs、seqidno:16所示。因此，
另一方面，本發(fā)明提供了一種抗人b淋巴細(xì)胞刺激因子單克隆抗體，其重鏈可變區(qū)中cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列為seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14；和/或其輕鏈可變區(qū)中cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列為seqidno:15、wgs、seqidno:16。
可變區(qū)cdr的變體與上述cdr區(qū)可以有至多6個(gè)氨基酸殘基(例如，1、2、3、4或5個(gè)氨基酸取代)的取代，在具有cdr變體的單克隆抗體中，cdr區(qū)變體具有與b淋巴細(xì)胞刺激因子結(jié)合活性。
本發(fā)明所述單克隆抗體除了重鏈和輕鏈中的高度可變區(qū)cdr1、cdr2和cdr3和鏈接序列外，其它為框架區(qū)。框架區(qū)可在結(jié)合所需的三維結(jié)構(gòu)不受影響的條件下倍其他序列置換，抗體特異性的分子基礎(chǔ)主要來源于它的高變區(qū)cdr1、cdr2和cdr3。這些區(qū)域是與抗原結(jié)合的關(guān)鍵部位。為維持優(yōu)選的結(jié)合特性，cdr的序列應(yīng)盡可能保留，然而，可能需要一些氨 基酸改變使結(jié)合特性最優(yōu)化，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以用標(biāo)準(zhǔn)做法來達(dá)到此目的。
所述的單克隆抗體為單鏈抗體、雙鏈抗體、嵌合抗體、抗體片段或含有所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽。
本發(fā)明所述“抗體”應(yīng)該解釋為涵蓋具有所需特異性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任意特異性結(jié)合因子。因而，這個(gè)術(shù)語涵蓋了與之同源的抗體片段、衍生物以及抗體的功能等同物和同源物，也包括含有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽，無論是天然的還是合成產(chǎn)生的?？贵w的實(shí)例是免疫球蛋白亞型(如igg，ige，igm，igd和iga)及其亞型亞類；也可以是包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的片段如fab、scfv、fv、dab或fd,或者雙鏈抗體。融合至另一多肽的、包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合體分子或者等同物也包括在其中。
抗體可以通過許多方式修飾，可用dna重組技術(shù)來產(chǎn)生保留原來抗原特異性的其他抗體或嵌合分子。這種技術(shù)可以包括將編碼抗體的免疫球蛋白可變區(qū)或互補(bǔ)性決定區(qū)(cdrs)的dna引入不同免疫球蛋白的恒定區(qū)或恒定區(qū)加框架區(qū)。還可以對(duì)表達(dá)抗體的細(xì)胞進(jìn)行遺傳突變或其它改變，這可以改變或者不改變所產(chǎn)生抗體的結(jié)合特異性。
一旦制得本發(fā)明的抗體分子，就可以通過本領(lǐng)域已知的純化免疫球蛋白分子的任何方法對(duì)其進(jìn)行純化，例如，通過色譜法(例如，離子交換色譜，親和色譜，特別是通過蛋白a對(duì)特異性抗原的親和色譜和其他柱色譜)、離心、利用溶解度差異，或通過任何其它純化蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。在許多實(shí)施方案中，抗體從細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基中，通過收集培養(yǎng)基并進(jìn)行純化得到抗體。
除另有說明外，本申請(qǐng)中的所有科技術(shù)語的都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。盡管與本申請(qǐng)中描述類似或等同的方法及材料都可用于實(shí)施或檢驗(yàn)本發(fā)明，但是下文仍還是對(duì)合適的方法和材料進(jìn)行了描述。本申請(qǐng)中引用的全部出版物、專利申請(qǐng)、專利及其他參考文獻(xiàn)其全部?jī)?nèi)容在此引入作為參考。如有抵觸，包括定義，以本申請(qǐng)為準(zhǔn)。
下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例說明實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體方式，而決不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不違背本發(fā)明的精神和原則的前提下，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行改動(dòng)得到的技術(shù)方案都將落入本發(fā)明的待批權(quán)利要求范圍內(nèi)。
實(shí)施例
實(shí)施例1：抗人blysscfv抗體的制備
1.1抗原制備
首先通過基因重組技術(shù)制備blys蛋白。將blys的dna序列克隆入本實(shí)驗(yàn)室保存的載 體p3457-his中，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入293e細(xì)胞株，經(jīng)過三天培養(yǎng)，收集上清液，以ni親和柱(ge)純化并收集blys蛋白。將純化的blys蛋白進(jìn)行fitc熒光蛋白標(biāo)記(武漢優(yōu)爾生)。
1.2篩選
用a抗原制備的blys蛋白對(duì)293t細(xì)胞人員抗體庫(kù)進(jìn)行篩選。每輪篩選均于轉(zhuǎn)染前24h對(duì)293t細(xì)胞進(jìn)行傳代并計(jì)數(shù)，確保其活率≥95％。其中每100mm培養(yǎng)皿接入細(xì)胞數(shù)為2-4×106個(gè)細(xì)胞，加入培養(yǎng)基8ml后培養(yǎng)24h。每皿加入的質(zhì)粒為12μg，與12μl的pei(濃度為3mg/ml)以及900μl的dmem混合振蕩并靜置15min后加入培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)60-72h后以無酶細(xì)胞分離液消化細(xì)胞并收集，以1×pbs緩沖液輕輕吹洗細(xì)胞，重懸后計(jì)數(shù)。將細(xì)胞與fitc標(biāo)記的blys抗原于37℃共孵育1h，并以1×pbs輕輕洗滌2-3次。將與抗原孵育后的細(xì)胞重懸于1ml的1×pbs緩沖液中，以流式細(xì)胞術(shù)分選出熒光(fitc)強(qiáng)度最強(qiáng)、占細(xì)胞總數(shù)為0.1％的細(xì)胞。分選獲得的細(xì)胞收集于約400μl的1×pbs緩沖液中，并于850rpm離心5min。用移液器小心吸去上清，按照試劑盒說明書提取細(xì)胞中的質(zhì)粒。所提質(zhì)粒轉(zhuǎn)化dh5α，一部分鋪板并進(jìn)行pcr鑒定；另一部分則培養(yǎng)后保存作為下一輪篩選的抗體庫(kù)。第一輪以哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示型人源scfv抗體庫(kù)為起始文庫(kù)，三輪篩選的抗原濃度依次為1μg/106細(xì)胞、0.1μg/106細(xì)胞及0.01μg/106細(xì)胞。第三輪篩選結(jié)束后所獲得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化dh5α后全部涂板，挑選全部單菌落做菌液pcr，選取陽(yáng)性結(jié)果送測(cè)序。測(cè)得的全長(zhǎng)scfv核苷酸序列如seqidno：1所示，其編碼的氨基酸序列如seqidno：2所示。其中重鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seqidno：3，編碼的氨基酸序列如seqidno：4；輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seqidno：8，編碼的氨基酸序列如seqidno：9。經(jīng)與igblast數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，分析獲得氨基酸序列，進(jìn)一步比對(duì)cdr區(qū)推斷出重鏈cdr1氨基酸序列為gfslstsgvg(seqidno：12)，重鏈cdr2氨基酸序列為iywnddk(seqidno：13)，重鏈cdr3氨基酸序列為ahsqyyydssgyfaafdy(seqidno：14)；輕鏈cdr1氨基酸序列為qsvlyssnnkny(seqidno：15)，輕鏈cdr2氨基酸序列為wgs，輕鏈cdr3氨基酸序列為qqyfsapwt(seqidno：16)。
實(shí)施例2：分泌型真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定
2.1目的基因的擴(kuò)增
設(shè)計(jì)引物對(duì)獲得候選的6號(hào)scfv序列進(jìn)行pcr擴(kuò)增。其中上游引物為b-6f：5’-gtacgctcttcatgtaggtgcagctgcaggagtcg-3’；下游引物為b-6r：5’-gatcgctcttctagctcaccttggtccctggcc-3’。其中在引物中引入了酶切位點(diǎn)bspqi(序列中劃線部分)。pcr流程為：95℃10min；95℃30s；56℃1min；72℃1min；共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。pcr產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠電泳鑒定回收。
2.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
擴(kuò)增的b-6scfv與載體p3457his進(jìn)行普通的酶切酶連構(gòu)建成重組質(zhì)粒p3457b-6scfv。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至dh5α中，涂布含有100μg/ml的氨芐青霉素的lb平板。37℃過夜培養(yǎng)后隨機(jī)挑選其中的陽(yáng)性菌落，37℃搖菌5h后，以scfv基因的上下游特異性引物對(duì)菌液進(jìn)行pcr鑒定。菌液pcr結(jié)果在750處有一單一條帶，與scfv大小相符。在b-6scfv插入載體的上下游找到兩個(gè)不同的單一酶切位點(diǎn)，其中上游為sali，下游為noti，以相應(yīng)的內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定。
實(shí)施例3：抗blys單鏈抗體b-6scfv的表達(dá)、純化與鑒定
穩(wěn)定傳代的293e懸浮細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前24h進(jìn)行傳代并計(jì)數(shù)，其中細(xì)胞密度為0.7-0.9×106/ml，培養(yǎng)體積為30ml。培養(yǎng)24h后進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。每毫升培養(yǎng)體積加入1μg質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染采用pei介導(dǎo)，質(zhì)粒與pei的質(zhì)量比為1:3。其中。取培養(yǎng)體積10％的培養(yǎng)基，依次加入質(zhì)粒與pei后迅速振蕩混勻，室溫靜置15min后轉(zhuǎn)染293e細(xì)胞中。37℃co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后收取細(xì)胞上清。以鎳親和柱純化抗體蛋白并以sds-page凝膠電泳鑒定。電泳結(jié)果顯示在約30kda處有條帶，與預(yù)期相符。在westernblot中，將凝膠結(jié)果轉(zhuǎn)移到膜上并以5％的脫脂牛奶封閉1h。將膜與hrp標(biāo)價(jià)的山羊抗his標(biāo)簽的抗體共孵育1h并以tbst緩沖液清洗，最后以顯色液顯色后檢測(cè)。結(jié)果顯示，在約30kda處有目的條帶，表明該抗體能與抗his的抗體特異性結(jié)合。
實(shí)施例4：抗體親和力常數(shù)測(cè)定
以ph為7.4的pbs緩沖液稀釋生物素化的抗原blys至20μg/ml，并加入到第2列中，每孔200μl；以pbs緩沖液2倍梯度稀釋b-11scfv抗體蛋白并加入到第4列的a-f孔中，其濃度分別為25μg/ml，12.5μg/ml，6.25μg/ml，3.125μg/ml，1.5625μg/ml，0.78125μg/ml，以pbs稀釋貝利木單抗至50μg/ml作為陽(yáng)性對(duì)照，加入至第4列的g孔中，每孔均加入200μl；第1列、第3列所有的孔以及第4列的h孔均加入pbs緩沖液，每孔200μl。將加好樣的96孔板放入fortiebio儀器中檢測(cè)。測(cè)定結(jié)果為b-6scfv抗體的親和力常數(shù)為：10nm。表明本發(fā)明制備的單鏈抗體與b淋巴細(xì)胞刺激因子抗原具有很高的親和力，顯著優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)中的單鏈抗體。