本發(fā)明涉及藥物化學技術領域，具體涉及的說，涉及一種pla-peg-pla樹枝狀聚合物、制備方法及其應用。

背景技術：

聚合物膠束是近年來發(fā)展起來的一種主要針對難溶性藥物的納米藥物控釋系統。聚合物膠束給藥系統能顯著提高藥物的溶解度；減少藥物毒副反應，從而提高治療劑量；藥物包裹于核中，可避免藥物降解失活；膠束粒徑很小，通常在l00nm以下，可以躲避網狀內皮系統(res)的吞噬，延長體循環(huán)時間，通過增強滲透效應(epr效應)達到對腫瘤被動靶向的效果，從而提高治療效果。至今為止，形成膠束最重要的材料依然是兩親性嵌段共聚物。膠束中共聚物疏水端向內，親水端向外，呈典型的核-殼結構，而疏水性的內核主要用來增溶難溶性藥物。

對于膠束這種納米藥物控釋系統，核心為高分子輔料，載藥膠束中高分子輔料和藥物之間的相互作用在很大程度上決定了該膠束體內外的性質，同時在很大程度上影響著藥效及毒副反應。然而，至今為止，在fda批準上市的藥物釋放系統中，真正經過人體檢驗并被證明具有高度安全性的合成高分子輔料只有聚乙二醇(peg)和丙交酯/乙交酯共聚物(plga)兩類。這兩類高分子及其共聚物也在其他大量進行中的臨床實驗中作為輔料使用。一般認為peg可經過腎臟排泄，因此不會在體內聚集；而plga最終的降解產物為二氧化碳和水，對人體也沒有毒害。目前，用于制備膠束的高分子輔料中研究最廣泛，應用最成熟的是甲氧基聚乙二醇和聚消旋丙交酯的嵌段共聚物(mpeg-pla)。

mpeg-pla共聚物不是藥典收載成分。根據peg的分子量和mpeg/pla比例的不同，可以形成不同結構和分子量的共聚物。此類共聚物具有兩親性，當在溶液中形成膠束時，膠束外圍為親水性的mpeg鏈段，內核為疏水性的pla鏈段，利用共聚物材料的這一性質可以對一些難溶性藥物進行增溶。mpeg-pla生物相容性良好，且合成過程簡單、易行，其本身可生物降解，體內降解為乳酸和peg，二者均可直接排出體外。研究表明：mpeg-pla無致癌性、無生殖毒性、無致畸、無致突變性，可以順利以原形從腎臟排泄。

目前，以mpeg-pla為載體的聚合物膠束藥物釋放系統較為成熟，并在實驗室階段取得了一定的進展，但臨床轉化的例子依然極少，至今沒有fda批準上市的該類膠束制劑。其中最大的原因是mpeg-pla膠束很不穩(wěn)定(尤其是體內穩(wěn)定性更差)。例如以mpeg-pla為載體的多西他賽膠束即使在較低的濃度下(2mg/ml)，室溫下6個小時即發(fā)生藥物沉淀， 研究發(fā)現：這種膠束在進入體內以后迅速解體，藥物隨即和血液中的蛋白(如白蛋白)結合然后往組織轉運，因此無法發(fā)揮膠束的增強滲透效應(epr效應)。

雖然膠束作為一種比較有希望的難溶性抗癌藥載體受到廣泛關注，但以mpeg-pla為輔料的膠束的不穩(wěn)定性(尤其是體內表現)使得這一納米制劑的epr效應無法發(fā)揮，無法實現靶向給藥，因此藥效也難以提高。另一方面，在現階段，主動靶向的膠束前景并不樂觀。因此，現階段對于mpeg-pla膠束比較可行的開發(fā)思路是提高膠束的穩(wěn)定性，尤其是體內穩(wěn)定性，既保留該高分子優(yōu)良的生物相容性，同時通過發(fā)揮膠束epr效應來提高載體的靶向性，進而提高藥效。為此，人們做了大量的努力。如專利201010001047公開了一種在膠束溶液中添加氨基酸提高膠束穩(wěn)定性的方法，而作為輔助添加劑的氨基酸成分是否在進入體內后經過血液的稀釋是否依然能保持膠束的穩(wěn)定性不得而知，因此體內使用的效果并不明確；添加的氨基酸作為非惰性成分，對藥效的發(fā)揮是否產生影響同樣存在不確定性。另外有研究認為將紫杉醇和多西他賽一起包埋于嵌段共聚物膠束中可顯著提高膠束的穩(wěn)定性，但這種復合藥物膠束在臨床上使用較難得到認可，體內穩(wěn)定性目前不得而知。

綜上所述，膠束制劑的開發(fā)面臨較大困難，一方面，是已被臨床證明安全的用于藥物釋放系統的高分子輔料的選擇極其有限，而開發(fā)一種全新的新型高分子輔料無疑面臨巨大風險。其次，已經見諸報道的各類膠束制劑的藥效較傳統制劑難以顯著提升，例如韓國三養(yǎng)社研發(fā)的紫杉醇膠束genexolpm雖在美國完成三期臨床實驗，但由于藥效不明顯，至今未獲得fda上市批準。第三，目前見諸報道的膠束輔料通用性較差，通常一種輔料只能針對一兩種藥物有效成分形成膠束，影響了其推廣應用。

技術實現要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明以具有公認的安全性的mpeg-pla嵌段共聚物為基礎，提供一種新型的pla-peg-pla樹枝狀聚合物、制備方法及其應用。

本發(fā)明提供一種pla-peg-pla樹枝狀聚合物，分子結構式如下所示：

其中：r4是疏水性基團封端的聚丙交酯鏈段。

上述樹枝狀聚合物中，所述r4為疏水性基團封端的聚丙交酯鏈段，其分子式為其中y是疏水性基團。

本發(fā)明中，端基改性方面所選擇的疏水性基團y主要考慮三個方面的作用：第一，能夠增加高分子輔料中疏水鏈段的疏水性，從而提高膠束對藥物的包裹能力。由于mpeg-pdlla中末尾端羥基具有一定的親水性，和疏水性的藥物如多西他賽之間難以形成較強的作用力，影響膠束對藥物的包核，而通過接枝疏水性端基可以顯著提高其疏水性；第二，通過改善藥物分子和嵌段共聚物中疏水性鏈段的相容性，增加藥物分子和疏水鏈的作用力，使藥物分子被膠束內核中不易溶出；第三，能夠形成分子間作用力，包括氫鍵、共軛效應，從而有助于將藥物包裹在膠束的內核中，進一步增加膠束的穩(wěn)定性。

上述樹枝狀聚合物中，所述的疏水性基團y包括下述基團中的任何一種：烷基、叔丁氧羰基、芐基、芴甲氧羰基或者苯環(huán)。優(yōu)選的，為芴甲氧羰基或者苯環(huán)。

上述樹枝狀聚合物中，總數均分子量為2000-60000，其中peg鏈段的數均分子量為1000-10000。

本發(fā)明還提供一種上述的pla-peg-pla樹枝狀聚合物的制備方法，包括如下步驟如下：

(1)合成端基樹枝化聚乙二醇g4-peg-g4

將nhs-peg-nhs和4代樹枝化聚酯g4-nh2溶解于有機溶劑后，加入三乙胺tea室溫攪拌反應，反應物用乙醚沉淀后的白色粉末狀物質為g4-peg-g4；其中：nhs-peg-nhs、g4-nh2和tea的摩爾比為1：(1-5：(0.1-5)；

(2)含有32個羥基的樹枝化聚乙二醇peg-g4-(oh)32合成

g4-peg-g4溶解于有機醇，分批加入dowexh+交換樹脂，室溫反應12h后過濾除去樹脂，溶液用乙醚沉淀后的白色粉末狀固體即為peg-g4-(oh)32；

(3)啞鈴型嵌段共聚物plan合成

將dl-丙交酯和peg-g4-(oh)32加入到干燥的聚合瓶中，以丙交酯摩爾比例0.05-0.5％的snoct2作為催化劑，真空熔封聚合瓶后將反應物于130-150℃下聚合6-24h，產物用氯仿溶解，甲醇沉淀后所得白色固體為目標共聚物啞鈴型嵌段共聚物plan。

(4)封端反應

將啞鈴型嵌段共聚物plan和疏水性的封端劑反應，經過純化后得到目標pla-peg-pla樹枝狀聚合物。

進一步的，本發(fā)明還提供一種上述的pla-peg-pla樹枝狀聚合物作為藥物載體在制備藥物制劑中的應用。

本發(fā)明的有益效果在于：首先樹枝化的疏水鏈段由于其特殊的分子結構，膠束核中鏈段的纏繞程度遠高于線型聚合物，藥物包埋于其中更不易溶出，由此可提高載藥膠束的穩(wěn)定性；樹枝化結構的端基數量明顯高于線性聚合物，因此針對端基改性的效果也比線性聚合物明顯；樹枝化的聚合物形成的膠束結構緊密，粒徑較小，更容易發(fā)揮epr效應，對腫瘤瘤組織靶向性較好。

附圖說明

圖1是合成pla-peg-pla樹枝狀聚合物步驟的化學反應方程式示意圖。

圖2是g4-peg-g4的¹hnmr譜圖。

圖3是peg-g4-(oh)32的¹hnmr譜圖。

圖4是啞鈴型嵌段共聚物(plan)的¹hnmr譜圖。

圖5是實施例2實測得到的紫杉醇膠束粒徑分布圖，粒徑為25.4±4.5nm

圖6是實施例3實測得到的紫杉醇膠束粒徑分布圖,粒徑為25.6±4.6nm。

圖7是實施例4實測得到的多西他賽膠束粒徑分布圖，粒徑為24.1±4.4nm。

圖8是阿霉素膠束粒徑分布圖，粒徑為26.2±4.5nm。

圖9是姜黃素膠束粒徑分布圖，粒徑為24.9±4.6nm。

圖10是膠束穩(wěn)定性對比示意圖。

圖11是腫瘤體積變化圖示。

具體實施方式

本發(fā)明的pla-peg-pla樹枝狀聚合物中，樹枝化羥基的數量可以是16個、32個或64 個，反應路徑基本相同。

實施例1合成32個羥基的pla-peg-pla樹枝狀聚合物

其具體反應方式如圖1所示。

(1)合成nhs封端聚乙二醇(nhs-peg-nhs)

羧基聚乙二醇(分子量為2000)10g溶解于50ml無水二氯甲烷，加入1.16gn羥基琥珀酰亞胺(nhs，10mmol)，2.08g環(huán)己基碳二亞胺(dcc)，0.12g二羥甲基丙酸(bis-mpa)，和1.1g4-二甲胺基吡啶-p-甲苯磺酸鹽(dpts)，室溫下攪拌反應48h得到反應液。將反應液過濾除去不溶物后，倒入1l乙醚中沉淀，將沉淀物重新溶解于有機溶劑，如四氫呋喃，乙酸乙酯，二氯甲烷或氯仿等，隨后去除副反應產生的不溶于水的雜質，優(yōu)選采用離心分離法，將沉淀物除去并將清液重新沉淀于乙醚后，真空干燥得白色粉末狀固體即為nhs封端聚乙二醇(nhs-peg-nhs)。

(2)合成端基樹枝化聚乙二醇(g4-peg-g4)

3.47g(0.34mmol)nhs-peg-nhs和4.37g(2.04mmol)4代樹枝化聚酯(g4-nh2，合成方法參考文獻macromolecules2002；35:8307方法合成)溶解于25ml無水二氯甲烷后加入1ml(7.33mmol)三乙胺室溫攪拌反應48h。反應物用乙醚沉淀后的白色粉末狀物質為g4-peg-g4。將所得到的g4-peg-g4進行核磁共振檢測，檢測條件為：bruker400m核磁共振儀，氘代氯仿為容液，tms為內標，氫譜。得到的圖譜如圖2所示，從a峰和b峰可以明顯看出成功將樹枝化的結構接枝到聚乙二醇的兩端。

(3)含有32個羥基的樹枝化聚乙二醇(peg-g4-(oh)32)合成

1.05gg4-peg-g4溶解于75ml甲醇，分批加入0.5克-1克dowexh+交換樹脂，室溫反應12h后過濾除去樹脂，溶液用乙醚沉淀后的白色粉末狀固體即為peg-g4-(oh)32。

將所得到的peg-g4-(oh)32進行核磁共振檢測，檢測條件為：bruker400m核磁共振儀，氘代氯仿為容液，tms為內標，氫譜。得到的圖譜如圖3所示，圖3中可以看出樹枝化結構表面端羥基脫保護完全。

(4)啞鈴型嵌段共聚物(plan)合成

(plan)式中的代表單個丙交酯鏈段的聚合度。下述步驟得到的產物其中的n＝10。

1gdl-丙交酯(6.94mmol)和1gpeg-g4-(oh)32加入到干燥的聚合瓶中，加入5mgsnoct2作為催化劑，真空熔封聚合瓶后將反應物于130℃下聚合12h，產物用氯仿溶解，甲醇沉淀后所得白色固體為目標共聚物，其數均分子量為4000。

將所得到的(plan)進行核磁共振檢測，檢測條件為：bruker400m核磁共振儀，氘代 氯仿為溶劑，四甲基硅烷(tetramethylsilane，簡稱tms)為nmr內標，測得其核磁共振氫譜包括以下特征峰，在1.6，5.2ppm處可見表示聚丙交酯的特征峰，在3.6ppm處可見表示聚乙二醇的特征峰，在1.1ppm和4.2-4.4ppm處可見表示樹枝化聚酯結構的特征峰。得到的圖譜如圖4，圖4中可以明顯看到peg和pla的特征吸收。

(5)封端反應

將反應量的啞鈴型嵌段共聚物和疏水性的封端劑反應，經過純化后得到目標高分子共聚物，共聚物的分子式如下所示：

其中r4為疏水性基團封端的聚丙交酯鏈段，數據分子量為1000-50000。

實施例2芐基封端共聚物包裹紫杉醇

將第一步所得到的樹枝化la-peg-pla樹枝狀聚合物5g和2g苯甲酰氯加入到圓底燒瓶中，氮氣保護下加熱至100℃反應6h，產物冷卻至室溫后用二氯甲烷溶解，乙醚沉淀后得白色粉末狀固體既為芐基封端的共聚物輔料bzendcappedmpeg-pla。

將上述步驟所得到的芐基封端的聚合物輔料1g和適量紫杉醇共同溶解于乙酸乙酯，50℃旋轉蒸發(fā)去除溶劑，加入50ml注射用水溶解后，溶液經0.22μmpvdf膜過濾除去未被包裹的紫杉醇，隨后所述溶液凍干得的紫杉醇膠束凍干粉。該凍干粉復溶后測定粒徑為25.4nm(見圖5粒徑分布圖)。

通過調節(jié)投入紫杉醇的投入數量，可以得到紫杉醇含量不等的膠束凍干粉。每100份共聚物最多可包裹85份紫杉醇，共聚物與紫杉醇的重量比例為100：1～85。

圖5為本實施例實測得到的紫杉醇膠束粒徑分布圖，粒徑為25.4±4.5nm 粒徑分布均一。

實施例3fmoc基團封端包裹紫杉醇

1.84gfmoc賴氨酸溶解于10ml無水乙酸乙酯后加入三乙胺0.7ml，溶液冷卻至-10℃，加入新戊酰氯0.61ml攪拌下升溫至0℃反應2h，然后升溫至室溫再反應1h，過濾去除不溶物，濾液旋轉蒸發(fā)去除溶劑后得白色固體溶解于5ml干燥二氯甲烷，加入三乙胺0.7ml，4-吡咯烷基吡啶74mg，溶液冷卻至0℃后加入所述pla-peg-pla樹枝狀聚合物1g，反應2h后室溫繼續(xù)反應24h得fmoc封端聚合物fmoc-lysendcappedmpeg-pla。

將上述步驟得到的fmoc封端聚合物1g與適量紫杉醇溶解于乙醇，45℃旋轉蒸發(fā)去除溶劑，加入50ml注射用水溶解后，液經0.22μmpvdf膜過濾除去未被包裹的紫杉醇，隨后凍干得紫杉醇膠束凍干粉。該凍干粉復溶后測定粒徑為25.6nm。

通過調節(jié)投入紫杉醇的投入數量，可以得到紫杉醇含量不等的膠束凍干粉。每100份共聚物最多可包裹100份紫杉醇，共聚物與紫杉醇的重量比例為100：1～100。

圖6為本實施例實測得到的紫杉醇膠束粒徑分布圖,粒徑為25.6±4.6nm。

實施例4，boc-苯丙氨酸封端包裹多西他賽

1.33gboc-苯丙氨酸溶解于10ml無水乙酸乙酯后加入三乙胺0.7ml，溶液冷卻至-10℃，加入新戊酰氯0.61ml攪拌下升溫至0℃反應2h，然后升溫至室溫再反應1h，過濾去除不溶物，濾液旋轉蒸發(fā)去除溶劑后得白色固體溶解于5ml干燥二氯甲烷，加入三乙胺0.7ml，吡咯烷基吡啶74mg，溶液冷卻至0℃后加入所述pla-peg-pla樹枝狀聚合物1g，反應2h后室溫繼續(xù)反應24h得boc-苯丙氨酸封端聚合物boc-pheendcappedmpeg-pla。

將上述步驟得到的boc-苯丙氨酸封端高分子輔料1g和適量多西他賽溶解于乙酸乙酯，40℃旋轉蒸發(fā)去除溶劑，加入50ml注射用水溶解藥物，溶液經0.22μmpvdf膜過濾除去未被包裹的藥物，隨后凍干得多西他賽膠束凍干粉。圖7為本實施例實測得到的多西他賽膠束粒徑分布圖,粒徑為24.1±4.4nm。該凍干粉復溶后測定粒徑為24.1nm。通過調節(jié)投入紫杉醇的投入數量，可以得到紫杉醇含量不等的膠束凍干粉。每100份共聚物最多可包裹50份多西他賽，共聚物與多西他賽的重量比例為100：1～50。

實施例5：包裹阿霉素

20mg鹽酸阿霉素溶解于1ml氯仿，加入0.5ml三乙胺避光室溫攪拌12h后加入實施例3所得的高分子共聚物100mg，將上述溶液轉移至透析袋中(截留分子量為3000)透析24h后凍干得到膠束阿霉素膠束凍干粉。

通過調節(jié)投入阿霉素的投入數量，可以得到阿霉素含量不等的膠束凍干粉。每100份 共聚物最多可包裹33份阿霉素，共聚物與阿霉素的重量比例為100：1～33。

圖8為阿霉素膠束粒徑分布圖，粒徑分布均一,粒徑為26.2±4.5nm。

實施例6：包裹姜黃素

20mg姜黃素和300mg實施例1所得共聚物溶解于5ml丙酮，45℃旋蒸去除溶劑丙酮后加入5ml超純水溶解藥膜后得到姜黃素膠束溶液，

通過調節(jié)投入姜黃素的投入數量，可以得到姜黃素含量不等的膠束凍干粉。每100份共聚物最多可包裹20.5份姜黃素，共聚物與姜黃素的重量比例為100：1～20.5。

該膠束粒徑分布如圖9所示，粒徑分布均一,粒徑為24.9±4.6nm。

實驗例7，膠束穩(wěn)定性對比

將實施例2-4得到的載藥膠束，采用適量注射用水復溶。另按照專利cn1197396a所述的方法自行制備mpeg-pla紫杉醇膠束。所有溶液的藥物濃度統一調整為5mg/ml。然后加入胎牛血清(最后胎牛血清的濃度為50％)，用動態(tài)光散射記錄24h內膠束粒徑變化，如圖10所示：

如圖10所示，實施例1-3制備的三種膠束在高濃度的血清溶液中，24h內粒徑幾乎沒有變化，可見其穩(wěn)定性非常高。而mpeg-pla膠束在6h內粒徑已經顯著變大，說明其穩(wěn)定性較差。

實驗例8，抑瘤實驗

以a549肺腺癌為模型，采用實施例2和實施例3制備的紫杉醇膠束為藥物。采用市售genexolpm作為對比。當腫瘤長到大約為150mm³時分組給藥，每組6只裸鼠，共給藥4次，每3天一次，測量腫瘤體積并記錄如圖11：

由圖11可見，實施例2和實施例3得到的膠束在等劑量下的抑瘤效果顯著強于mpeg-pla-紫杉醇膠束(市售genexolpm)，統計學差異p<0.01，說明這兩種膠束的靶向性顯著高于線性的mpeg-pla紫杉醇膠束，具有較好的應用前景。