本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體的，涉及試劑盒及其用途，更具體的，本發(fā)明涉及一種試劑盒、試劑盒的用途、一種構(gòu)建目標(biāo)區(qū)域測序文庫的方法、一種測序方法、一種檢測目標(biāo)區(qū)域變異的方法和裝置。
背景技術(shù)：
：胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一,在全球腫瘤致死原因中排名第二位，2012年全球胃癌的新患者人數(shù)約95萬，胃癌死亡人數(shù)約70萬，胃癌在東亞的發(fā)病率最高。我國是胃癌的高發(fā)國家，據(jù)國家癌癥中心的數(shù)據(jù)顯示：2011年胃癌在我國惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率均居第三位[陳萬青,鄭榮壽,曾紅梅等.2011年中國惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析.中國腫瘤.2015；24(1):2.]。由于缺乏有效的治療手段，胃癌整體治療效果并不理想，患者5年生存率在5％-20％左右，總體平均生存時間小于1年。胃癌的發(fā)生是一個多因素共同作用的復(fù)雜過程，目前認(rèn)為幽門螺桿菌慢性感染是最重要的致病因素，約90％的新發(fā)非賁門胃癌的發(fā)生與之相關(guān)。幽門螺桿菌產(chǎn)生的細(xì)菌毒力因子(如caga)導(dǎo)致炎癥發(fā)生和激活致癌信號通路，在這一持續(xù)的慢性炎癥環(huán)境中，過度的氧化應(yīng)激導(dǎo)致胃上皮細(xì)胞dna損傷發(fā)生，誘發(fā)癌基因、抑癌基因、細(xì)胞周期調(diào)控因子、細(xì)胞粘附分子、dna損傷修復(fù)基因的遺傳改變及表觀遺傳改變，促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展。胃癌是一種異質(zhì)性很高的腫瘤，有顯著的表型多樣性，包括不同的分子亞型。早在1965年，lauren將胃癌分為腸型和彌漫型，后者侵襲性強(qiáng)、患者預(yù)后差。2013年lei等基于248例胃癌標(biāo)本的基因分析，將胃癌分為增殖型、代謝型和間質(zhì)型。其中增殖型胃癌細(xì)胞存在高度的遺傳不穩(wěn)定性、tp53突變和dna的低甲基化；代謝型胃癌對5-fu敏感，患者術(shù)后是否接受5-fu輔助治療的生存差異明顯；間質(zhì)型胃癌具有腫瘤干細(xì)胞的特性，對pi3k/akt/mtor抑制劑敏感。根據(jù)分子分類系統(tǒng)，胃癌分為四種類型：eb病毒感染型胃癌、微衛(wèi)星不穩(wěn)定型胃癌、基因穩(wěn)定型胃癌和染色體不穩(wěn)定型胃癌。腫瘤治療已進(jìn)入分子靶向藥物和個體化治療時代。大量的研究顯示，患者對抗腫瘤藥物(化療藥物、靶向藥物)是否敏感與其癌細(xì)胞的基因組突變直接相關(guān)。2012年10月，中國第一個能明顯降低her2陽性晚期胃癌患者死亡風(fēng)險、提高總生存期的靶向藥物赫賽 汀(曲妥珠單抗)正式上市，意味著胃癌靶向治療時代的到來。其他幾種靶向her2、c-met和vegf等受體的胃癌新藥已經(jīng)取得了可觀的研究成果。進(jìn)行胃癌個體化治療，首先需要對胃癌患者的靶藥基因進(jìn)行檢測。隨著癌癥認(rèn)知領(lǐng)域的發(fā)展和科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，基因組測序技術(shù)逐漸進(jìn)入到腫瘤臨床應(yīng)用中。在科研及臨床轉(zhuǎn)化領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)中，對于體細(xì)胞基因突變的檢測方法主要有pcr-sanger法、pcr-mass法和arms-pcr法等。這幾種方法所應(yīng)用的樣本均為腫瘤組織樣本。pcr-sanger法準(zhǔn)確性好，能檢測新的點(diǎn)突變類型及indel，但靈敏度很低，僅能檢測突變率大于20％的高頻突變，且難以勝任多基因多位點(diǎn)檢測。pcr-mass法不能檢測未知突變，也無法檢測indel，靈敏度在5％左右，該技術(shù)局限性較大。arms-pcr法特異性好，靈敏度高，能檢測1％-5％的低頻突變，但不能檢測未知突變，且同樣難以勝任多基因多位點(diǎn)的同時檢測。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在至少解決上述問題至少之一或者提供至少一種可選擇的商業(yè)手段。依據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供一種試劑盒，其包含探針，所述探針固定在固相基質(zhì)上或者游離于溶液中，所述探針能夠特異性識別表1里的17個基因中的每個基因的至少一部分區(qū)域。本發(fā)明的試劑盒中的探針能夠特異性識別的基因區(qū)域組合，是發(fā)明人經(jīng)過信息收集、多次篩選、針對性地設(shè)計探針和試驗(yàn)獲得的，這些基因區(qū)域組合與結(jié)胃癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。該試劑盒能夠用于獲取胃癌相關(guān)基因序列、和/或在檢測胃癌相關(guān)基因序列中的突變、和/或在輔助指導(dǎo)胃癌用藥、和/或在輔助預(yù)測胃癌風(fēng)險。從而能夠用于預(yù)測個體的患胃癌風(fēng)險、預(yù)測胃癌患者使用相應(yīng)抗腫瘤靶向藥物的療效，輔助指導(dǎo)臨床用藥，輔助用于胃癌的個體化治療。表1根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的這一方面的試劑盒還可以具有以下附加技術(shù)特征至少之一：根據(jù)本發(fā)明的一個較佳實(shí)施例，所述探針能夠特異性識別表2中的區(qū)域。這些區(qū)域包含表1中17個基因的332個外顯子，是發(fā)明人結(jié)合cosmic、ncbi等數(shù)據(jù)庫的記載數(shù)據(jù)，利用迭代算法對已選入表1中的17個基因的外顯子進(jìn)行分析并確定各外顯子的目標(biāo)區(qū)域的 序列，使目標(biāo)區(qū)域能對記載病例進(jìn)行最大化的覆蓋，即表2中的區(qū)域。表2根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，試劑盒包含的探針的長度為25～300nt，較佳的為100nt左右。為獲得能夠在同一反應(yīng)體系中同時特異性捕獲所說的區(qū)域組合，根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施例，探針是通過先獲得初始探針集，再篩選所述初始探針集來確定的。獲取所述初始探針集包括：確定所述區(qū)域的參考序列，從所述基因的參考序列的一端開始，在所述參考序 列上依次獲取dna片段直至所述參考序列的另一端，其中，一條dna片段為一條初始探針，全部所述dna片段構(gòu)成所述初始探針集，所述dna片段之間完全重疊、部分重疊或完全不重疊，所述初始探針集能夠覆蓋所述基因區(qū)域至少一次。所說的區(qū)域的參考序列可以從參考基因組上獲取，例如從人參考基因組hg19上獲得對應(yīng)的基因區(qū)域，所有的hg19上的對應(yīng)區(qū)域構(gòu)成所說的區(qū)域的參考序列，hg19可以從ncbi數(shù)據(jù)庫下載。根據(jù)本發(fā)明的一個較佳實(shí)施例，利用迭代算法設(shè)計獲取所述初始探針集，包括：確定所述區(qū)域在參考基因組上的位置，獲取所述基因區(qū)域的參考序列，從所述參考序列的第一個核苷酸開始拷貝所述參考序列獲取第一條dna片段，從所述參考序列的第二個核苷酸開始拷貝所述參考序列獲取第二條dna片段，從所述參考序列的第三個核苷酸開始拷貝所述參考序列獲取第三條dna片段，這樣依次獲取后續(xù)dna片段直至第n條dna片段的一端超出所述參考序列，其中，一條dna片段為一條初始探針，全部所述dna片段構(gòu)成所述初始探針集，n為所述初始探針集中包含的初始探針的總數(shù)，以獲得能夠全面覆蓋目標(biāo)基因區(qū)域的初始探針集。而且為使最終的探針具高特異性，根據(jù)本發(fā)明的一個較佳實(shí)施例，進(jìn)一步對所述初始探針集進(jìn)行篩選，包括：將所述dna片段(初始探針集)與所述參考序列比對，獲得每一條dna片段在參考序列上的比對次數(shù)，過濾掉比對次數(shù)超過1的dna片段。為使最終的探針能在同一反應(yīng)體系中捕獲所說的基因區(qū)域，和/或使捕獲的基因區(qū)域在同一反應(yīng)條件下被一起洗脫下來，進(jìn)一步對所述初始探針集進(jìn)行篩選，包括：去除掉gc含量不在35-70％的dna片段。最終，獲得的芯片/探針最終覆蓋的區(qū)域包含了17個基因的332個外顯子，總大小為79kb。依據(jù)本發(fā)明另一方面，提供上述任一實(shí)施例中的試劑盒在獲取胃癌相關(guān)基因序列、和/或在檢測胃癌相關(guān)基因序列中的突變、和/或在輔助指導(dǎo)胃癌用藥、和/或在輔助預(yù)測胃癌風(fēng)險中的用途。利用本發(fā)明上述一方面或者任一實(shí)施例中的試劑盒，能夠一次性、簡單方便且高特異性的獲取胃癌的相關(guān)基因序列，檢測分析這些相關(guān)基因序列，檢測分析結(jié)果可以用于或者輔助用于胃癌的風(fēng)險預(yù)測和用藥指導(dǎo)。上述對本發(fā)明一方面的或者任一實(shí)施例中的試劑盒的優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)特征的描述，同樣適用本發(fā)明這一方面的試劑盒的用途，在此不再贅述。依據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供一種構(gòu)建目標(biāo)區(qū)域測序文庫的方法，所述方法包括：(a)獲取待測樣本中的核酸，所述核酸由多個核酸片段組成，所述核酸片段來自斷裂的基因組dna和/或游離的dna；(b)末端修復(fù)所述核酸片段，獲得末端修復(fù)片段；(c)加堿基a 至所述末端修復(fù)片段的兩端，獲得粘性末端片段；(d)連接接頭于所述粘性末端片段的兩端，獲得接頭連接片段；(e)對所述接頭連接片段進(jìn)行第一擴(kuò)增，獲得第一擴(kuò)增產(chǎn)物；(f)利用上述本發(fā)明一方面或者任一實(shí)施例中的試劑盒對所述第一擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行捕獲，獲得所述目標(biāo)區(qū)域；以及(g)對所述目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行第二擴(kuò)增，獲得第二擴(kuò)增產(chǎn)物，所述第二擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)成所述目標(biāo)區(qū)域測序文庫；任選地，所述接頭末端為t-粘性末端。本發(fā)明的這一方面的測序文庫構(gòu)建方法，特別適用于樣本含微量核酸的測序文庫的構(gòu)建。根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施例，樣本為含微量游離dna片段的血漿樣本，包含極其微量的目標(biāo)游離dna片段，第一擴(kuò)增使得核酸的量能滿足芯片/探針雜交捕獲的需求，而因芯片雜交捕獲會損耗一定量的核酸，第二擴(kuò)增能使捕獲下的目標(biāo)片段獲得再次擴(kuò)增以滿足上機(jī)測序和質(zhì)控檢測的要求。本發(fā)明的這一文庫構(gòu)建方法特別適用于總游離核酸不低于10ng或者常規(guī)組織基因組dna不低于1μg的樣本的測序文庫構(gòu)建，利用本發(fā)明的這一方面的方法構(gòu)建的目標(biāo)區(qū)域文庫，測序后的下機(jī)數(shù)據(jù)質(zhì)量高，基于高質(zhì)量的下機(jī)數(shù)據(jù)利于后續(xù)的準(zhǔn)確檢測分析。依據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供一種測序方法，所述方法包括：根據(jù)本發(fā)明一方面或者任一實(shí)施例中的測序文庫構(gòu)建方法構(gòu)建目標(biāo)區(qū)域測序文庫；對所述目標(biāo)區(qū)域測序文庫進(jìn)行測序，獲得測序數(shù)據(jù)，所述測序數(shù)據(jù)由多個讀段組成。測序可以利用已知平臺進(jìn)行，包括但不限于illumina的hiseq2000/2500平臺、lifetechnologies的iontorrent平臺和單分子測序平臺。測序方式可以選擇單端測序，也可以是雙末端測序，在本發(fā)明的一個實(shí)施例中利用雙末端測序，所得的測序數(shù)據(jù)由多對讀段對組成。本發(fā)明這一方面的方法，通過結(jié)合上述任一實(shí)施例中的試劑盒和高通量捕獲測序技術(shù)，包括上述發(fā)明人優(yōu)化了的建庫方法，使芯片捕獲目標(biāo)區(qū)域的過程更高效率，能充分發(fā)揮高通量捕獲測序技術(shù)通量高、靈敏度高等優(yōu)勢。上述對任一本發(fā)明一方面或者任一實(shí)施例中的試劑盒和測序文庫構(gòu)建方法的優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)特征的描述，同樣適用本發(fā)明的這一方面的測序方法，在此不再贅述。依據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供一種檢測目標(biāo)區(qū)域變異的方法，所述方法包括：(1)利用前述本發(fā)明任一實(shí)施例中的測序方法，獲得目標(biāo)樣本的目標(biāo)區(qū)域測序數(shù)據(jù)；(2)基于所述測序數(shù)據(jù)，檢測所述目標(biāo)區(qū)域變異，獲得變異位點(diǎn)信息，所述變異包括snp和indel中的至少之一。根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施例，步驟(2)包括：將所述測序數(shù)據(jù)與參考序列進(jìn)行第一比對， 獲得第一比對結(jié)果；將所述第一比對結(jié)果與所述參考序列的一部分進(jìn)行第二比對，獲得第二比對結(jié)果；基于所述第一比對結(jié)果和所述第二比對結(jié)果，同時檢測所述目標(biāo)區(qū)域中的snp和indel。為使變異檢測結(jié)果更準(zhǔn)確可信，根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施例，在所述第一比對之前，對所述測序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，所述過濾包括去除掉不確定堿基比例超過10％的讀段和/或堿基質(zhì)量值不大于5的堿基數(shù)的比例不小于50％的讀段。并且較佳的，在所述第二比對之前，去除掉第一比對結(jié)果中的一個讀段對中的兩個讀段相同的讀段對。所稱的參考序列的一部分包括目標(biāo)區(qū)域參考序列中的每個已知indel位點(diǎn)，以及所述每個已知indel位點(diǎn)上下游各1000bp的參考序列。這里，所稱的第二比對為局部比對，第一比對為常規(guī)全局比對，可利用但不限于soap或bwa等軟件依照其默認(rèn)設(shè)置進(jìn)行，獲得第一比對結(jié)果，第一比對結(jié)果包括讀段在參考序列上的匹配位置及匹配情況信息。根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施例，進(jìn)行第二比對即基于第一比對結(jié)果，對與所捕獲的基因區(qū)域?qū)?yīng)的參考序列中的所有已知indel附近的所有序列信息(reads)進(jìn)行局部重新比對，能夠消除第一比對中的錯誤，提高后續(xù)變異檢測的準(zhǔn)確性，第二比對可利用gatk重比對軟件(https://www.broadinstitute.org/gatk/)進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施例，測序數(shù)據(jù)來自lifetechnologies公司的ionproton測序平臺，通過tvc工具使用其默認(rèn)參數(shù)同時檢測snp和indel變異。利用本發(fā)明的這一方面的變異檢測方法，能夠準(zhǔn)確檢測出突變頻率為1％的低頻突變。通過上述發(fā)明人優(yōu)化了的生物信息學(xué)分析的方法，能夠準(zhǔn)確地檢測到更低頻率的突變(1％)。綜上，前述提供的采用高通量捕獲的測序法，該方法是利用上述設(shè)計的芯片探針，對樣本dna中感興趣的目標(biāo)基因區(qū)域進(jìn)行雜交捕獲，并進(jìn)行高通量測序，對測序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，從而得到變異位點(diǎn)的信息。該方法較之前述方法存在的靈敏度不高、通量小、檢測內(nèi)容有限或只能檢測已知突變等缺點(diǎn)，有著多方面的優(yōu)勢：首先，通量高，可以同時檢測幾十甚至上百的基因，在得到更豐富信息的同時也大大降低了檢測成本；其次，靈敏度高，檢測靈敏度能夠達(dá)到1％-5％，且可以根據(jù)研究需要調(diào)整檢測閾值，如需更高靈敏度可以加大測序深度從而得到1％以下的超低頻突變，操作靈活；再次，特異性高，該方法能夠保證較低的假陽性率、假陰性率，確保得到的檢測結(jié)果能夠準(zhǔn)確的反映受檢者的突變情況；最后，利用生物信息學(xué)分析可以挖掘到更多的數(shù)據(jù)，不僅能夠提供已知突變位點(diǎn)的信息，還可以挖掘未知突變位點(diǎn)、indel、cnv等多方面數(shù)據(jù)，為科學(xué)研究提供更多有用 的信息。并且，與目前幾種方法相比，上述本發(fā)明一方面的方法能避免已知方法存在的諸多不足。該發(fā)明提供的試劑盒探針結(jié)合高通量捕獲測序，將有望為臨床胃癌個體化治療提供科學(xué)指導(dǎo)。為了能充分發(fā)揮高通量捕獲測序技術(shù)通量高、靈敏度高等優(yōu)勢，發(fā)明人對測序的建庫流程進(jìn)行了優(yōu)化，使芯片捕獲目標(biāo)區(qū)域的過程效率更高；同時，發(fā)明人也優(yōu)化了生物信息學(xué)分析的流程，從而能夠準(zhǔn)確地檢測到更低頻率的突變，包括突變頻率1％的突變。上述本發(fā)明一方面的芯片捕獲結(jié)合高通量捕獲測序，有助于胃癌個體用藥療效和復(fù)發(fā)風(fēng)險預(yù)測的研究，并有望將研究成果轉(zhuǎn)化并輔助用于臨床。依據(jù)本發(fā)明的一方面，還提供一種檢測目標(biāo)區(qū)域變異的裝置，用以實(shí)現(xiàn)或執(zhí)行上述本發(fā)明一方面的或者任一實(shí)施例的目標(biāo)區(qū)域變異檢測方法，所述裝置包括：數(shù)據(jù)獲取單元，用于實(shí)現(xiàn)上述本發(fā)明一方面的測序方法，獲取目標(biāo)區(qū)域的測序數(shù)據(jù)，所述測序數(shù)據(jù)由多個讀段組成；檢測單元，用于基于來自數(shù)據(jù)獲取單元的測序數(shù)據(jù)，檢測所述目標(biāo)區(qū)域變異，獲得變異位點(diǎn)信息，所述變異包括snp和indel中的至少之一。本領(lǐng)域人員可以理解，本發(fā)明的裝置中的全部或部分單元，可選擇的、可拆卸的包含一個或多個子單元以執(zhí)行或?qū)崿F(xiàn)前述本發(fā)明方法的各個實(shí)施例。例如，根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施例，如圖1所示，裝置1000中的檢測單元200包括第一比對子單元13、第二比對子單元15和變異識別子單元17，所述第一比對子單元13用以將來自數(shù)據(jù)獲取單元100的測序數(shù)據(jù)與參考序列進(jìn)行第一比對，獲得第一比對結(jié)果，所述第二比對子單元15用以將來自所述第一比對子單元13的第一比對結(jié)果與所述參考序列的一部分進(jìn)行第二比對，獲得第二比對結(jié)果，所述變異識別子單元17用以基于來自所述第一比對子單元13的第一比對結(jié)果和來自所述第二比對子單元15的第二比對結(jié)果，同時檢測所述目標(biāo)區(qū)域中的snv和indel，獲得變異位點(diǎn)信息，其中，所述參考序列的一部分包括目標(biāo)區(qū)域參考序列中的每個已知indel位點(diǎn)，以及所述每個已知indel位點(diǎn)上下游各1000bp的參考序列。再例如，根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施例，如圖2所示，所述裝置1000的檢測單元200還包括第一過濾子單元12，所述第一過濾子單元12與所述第一比對子單元13連接，用于在所述測序數(shù)據(jù)進(jìn)入所述第一比對子單13元之前，對所述測序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，所述過濾包括去除掉不確定堿基比例超過10％的讀段和/或堿基質(zhì)量值不大于5的堿基數(shù)的比例不小于50％的讀段。任選的，如圖3所示，所述檢測單元200還包括第二過濾子單元14，所述第二過濾子單元分別14與所述第一比對子單元13和所述第二比對子單元15連接，用于在所述第 一比對結(jié)果進(jìn)入所述第二比對子單元15之前，去除掉來自所述第一比對子單元13的第一比對結(jié)果中的一個讀段對中的兩個讀段相同的讀段對。上述參考序列可以為hg19，所述第一比對單元中進(jìn)行的第一比對為全局比對，所述第二比對子單元中進(jìn)行的第二比對為局部比對。本發(fā)明的方法/裝置，基于新一代測序技術(shù)的目標(biāo)區(qū)域捕獲測序，能夠在很短的時間內(nèi)同時進(jìn)行多例樣本檢測，并且在目標(biāo)區(qū)域捕獲芯片的使用下，相同數(shù)據(jù)量可進(jìn)行更高深度的數(shù)據(jù)挖掘。這樣，在相同成本下，可以研究更大的樣本量及獲得更高的測序深度，從而更有可能獲得所需的用藥及預(yù)后相關(guān)基因突變的信息。而相比于目前科研界對于胃癌體細(xì)胞突變運(yùn)用較多的arms-pcr等方法，利用實(shí)施例中的試劑盒包含的芯片/探針的多基因同時檢測的優(yōu)勢則頗為明顯。芯片/探針包含的17個基因的332個外顯子，代表了目前已有報道的在胃癌用藥及發(fā)生發(fā)展研究中的突變基因位點(diǎn)，這就可以在一次實(shí)驗(yàn)中獲得多個基因突變的信息，較之單個或少數(shù)幾個突變的檢測方法，通量上有優(yōu)勢，更容易對胃癌預(yù)后進(jìn)行全面、綜合的研究。附圖說明本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對實(shí)施方式的描述中將變得明顯和容易理解，其中：圖1是本發(fā)明的一個實(shí)施例中的目標(biāo)區(qū)域變異檢測裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2是本發(fā)明的一個實(shí)施例中的目標(biāo)區(qū)域變異檢測裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3是本發(fā)明的一個實(shí)施例中的目標(biāo)區(qū)域變異檢測裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；圖4是本發(fā)明的一個實(shí)施例中的變異位點(diǎn)的sanger測序驗(yàn)證的測序峰圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。所述實(shí)施方式在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。本發(fā)明中的“變異”、“核酸變異”、“基因變異”可通用，本發(fā)明中的“snp”(snv)、“插入缺失”(indel)和“結(jié)構(gòu)變異”(sv)同通常定義，但本發(fā)明中對各種變異的大小不作特別限定，這樣這幾種變異之間有的有交叉。這些類型變異的大小交叉并不妨礙本領(lǐng)域人員通過上述描述執(zhí)行實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法和/或裝置并且達(dá)到所描述的結(jié)果。本發(fā)明中的“參考序列”為已知基因組序列或者已知基因組序列的至少一部分。在本文中，所使用的術(shù)語“第一”、“第二”等僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性、隱含指明所指示的技術(shù)特征的數(shù)量或者具有順序關(guān)系。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隱含地包括一個或者多個該特征。在本發(fā)明的描述中，除非另有說明，“多個”的含義是兩個或兩個以上。在本文中，除非另有明確的規(guī)定和限定，術(shù)語“順序連接”、“相連”、“連接”等術(shù)語應(yīng)做廣義理解，例如，可以是固定連接，也可以是可拆卸連接，或一體地連接；可以是機(jī)械連接，也可以是電連接；可以是直接相連，也可以通過中間媒介間接相連，可以是兩個元件內(nèi)部的連通。對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以根據(jù)具體情況理解上述術(shù)語在本發(fā)明中的具體含義。下文的公開了不同的具體實(shí)施方式或?qū)嵤├脕韺?shí)現(xiàn)本發(fā)明的不同方法步驟或裝置結(jié)構(gòu)。為了簡化本發(fā)明的公開，下文中對特定例子的步驟和設(shè)置進(jìn)行描述。當(dāng)然，它們僅僅為示例，并且目的不在于限制本發(fā)明。此外，本發(fā)明可以在不同例子中重復(fù)參考數(shù)字和/或參考字母，這種重復(fù)是為了簡化和清楚的目的，其本身不指示所討論各種實(shí)施方式和/或設(shè)置之間的關(guān)系。以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明的方法、裝置和/或系統(tǒng)進(jìn)行詳細(xì)的描述。下面示例，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。除另有交待，以下實(shí)施例中涉及的未特別交待的試劑、序列(接頭、標(biāo)簽和引物)、軟件及儀器，都是常規(guī)市售產(chǎn)品或者開源的，比如購自lifetechnologies等。實(shí)施例一獲得本發(fā)明一方面的試劑盒、實(shí)現(xiàn)本發(fā)明一方面的方法和/或裝置，一般包括目標(biāo)區(qū)域捕獲探針/芯片的設(shè)計、微量樣本建庫及雜交上機(jī)測序、下機(jī)數(shù)據(jù)的生物信息分析和變異數(shù)據(jù)解讀。(一)芯片入選基因的確定、序列設(shè)計及生產(chǎn)。首先，對cosmic數(shù)據(jù)庫中胃癌分類中突變率在前20位的基因進(jìn)行調(diào)研，篩選出與胃癌用藥相關(guān)的基因、胃癌中發(fā)現(xiàn)的重要癌基因和抑癌基因，并加入了胃癌的中高頻突變的基因，得到芯片的最終基因列表，共計17個，如表1所示。芯片的目標(biāo)區(qū)域由華大自主編寫并優(yōu)化的程序計算得來。該算法結(jié)合了cosmic、ncbi等數(shù)據(jù)庫的記載數(shù)據(jù)，利用迭代算法對已入選17個基因的外顯子進(jìn)行分析并得到捕獲目標(biāo)區(qū)域的序列。芯片最終目標(biāo)區(qū)域覆蓋了17個基因的332個外顯子，總大小為79kb。 詳細(xì)目標(biāo)區(qū)域如表2所示。利用迭代算法設(shè)計獲取所述初始探針集，包括：確定所述區(qū)域在參考基因組上的位置，獲取所述基因區(qū)域的參考序列，從所述參考序列的第一個核苷酸開始拷貝所述參考序列獲取第一條dna片段，從所述參考序列的第二個核苷酸開始拷貝所述參考序列獲取第二條dna片段，從所述參考序列的第三個核苷酸開始拷貝所述參考序列獲取第三條dna片段，這樣依次獲取后續(xù)dna片段直至第n條dna片段的一端超出所述參考序列，其中，一條dna片段為一條初始探針，全部所述dna片段構(gòu)成所述初始探針集，n為所述初始探針集中包含的初始探針的總數(shù)，以獲得能夠全面覆蓋目標(biāo)基因區(qū)域的初始探針集，而且為使最終的探針具高特異性，進(jìn)一步對所述篩選初始探針集，包括：將所述dna片段(初始探針集)與所述參考序列比對，獲得每一條dna片段在參考序列上的比對次數(shù)，過濾掉比對次數(shù)超過1的dna片段。進(jìn)一步的，為使最終的探針能在同一反應(yīng)體系中捕獲所說的基因區(qū)域，和/或使捕獲的基因區(qū)域在同一反應(yīng)條件下被一起洗脫下來，進(jìn)一步對所述初始探針集進(jìn)行篩選，包括：去除掉gc含量不在35-70％的dna片段。最終，獲得的芯片/探針最終覆蓋的區(qū)域包含了17個基因的332個外顯子，總大小為79kb。確定了的芯片探針的制備由華大基因自主芯片生產(chǎn)部門負(fù)責(zé)。(二)測序文庫的制備2.1對樣本提取dna片段，并檢測濃度；2.2對提取的dna片段進(jìn)行片段化處理；2.3對dna片段進(jìn)行末端修復(fù)；2.4連接adapter文庫接頭：文庫接頭(adapter)是指經(jīng)過設(shè)計的一段堿基序列，在dna文庫擴(kuò)增時與引物相結(jié)合，使dna擴(kuò)增進(jìn)行，并且在上機(jī)測序時與standardanchor相結(jié)合，利于探針與待測序位點(diǎn)結(jié)合輔助dna測序進(jìn)行；2.5文庫進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增；2.6純化，質(zhì)量控制，并進(jìn)行胃癌芯片雜交捕獲目的區(qū)域；2.7雜交后的文庫進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增；2.8文庫定量及質(zhì)量控制；2.9life公司的ionproton測序儀上機(jī)測序。(三)測序下機(jī)數(shù)據(jù)生物信息分析獲得下機(jī)數(shù)據(jù)后需進(jìn)行如下的生物信息分析，并得到最終的突變位點(diǎn)注釋結(jié)果：3.1去除低質(zhì)量reads；3.2與reference序列比對，產(chǎn)生bam文件；3.3標(biāo)記重復(fù)序列；3.4比對結(jié)果不好的序列重新比對，并校正質(zhì)量值；3.5去除錯配序列；3.4和3.5中，為使變異檢測結(jié)果更準(zhǔn)確可信，在比對之前，對所述測序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，所述過濾包括去除掉不確定堿基比例超過10％的讀段和/或堿基質(zhì)量值不大于5的堿基數(shù)的比例不小于50％的讀段。并且，在進(jìn)行重新比對(第二比對)之前，去除掉前一次比對結(jié)果中的一個讀段對中的兩個讀段相同的讀段對。所說的第二比對為局部比對，第一比對為常規(guī)全局比對，可利用但不限于soap或bwa等軟件依照其默認(rèn)設(shè)置進(jìn)行，獲得第一比對結(jié)果，第一比對結(jié)果包括讀段在參考序列上的匹配位置及匹配情況信息，進(jìn)行第二比對即基于第一比對結(jié)果，對與所捕獲的基因區(qū)域?qū)?yīng)的參考序列中的所有已知indel附近的所有序列信息(reads)進(jìn)行局部重新比對，能夠消除第一比對中的錯誤，提高后續(xù)變異檢測的準(zhǔn)確性，第二比對可利用gatk重比對軟件(https://www.broadinstitute.org/gatk/)進(jìn)行。3.6分析下機(jī)數(shù)據(jù)qc；3.7尋找變異；3.8對變異結(jié)果進(jìn)行注釋，得到最終數(shù)據(jù)結(jié)果。(四)靶向藥物數(shù)據(jù)庫構(gòu)建及腫瘤變異解讀靶向藥物在腫瘤治療中具有藥效顯著、毒副作用小的特點(diǎn)，但其對靶點(diǎn)(包括蛋白、基因等)有特異性依賴，必須先對患者做靶點(diǎn)分析，才能確定患者是否適合用藥。整合目前fda批準(zhǔn)用于治療胃癌的靶向藥物、用于其他癌癥治療的靶向藥物、以及處于臨床ii、iii期藥物，依據(jù)nccn臨床治療指南，最新的臨床藥物基因研究，整理藥物靶點(diǎn)基因與靶向藥物療效關(guān)系，形成腫瘤個體化靶向藥物解讀數(shù)據(jù)庫。并將靶向藥物數(shù)據(jù)庫整合入腫瘤個體化生物信息分析流程，完成靶向藥物的數(shù)據(jù)庫構(gòu)建及自動化解讀。對生物信息分析后的變異數(shù)據(jù)進(jìn)行個體化解讀，參考構(gòu)建的腫瘤數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)，對患者檢出的變異進(jìn)行分析，判斷最適合的獲益靶向藥物及耐藥性靶向藥物，輔助讓臨床醫(yī)生對于腫瘤患者的用藥治療更有針對性，免去無效用藥所耽誤的寶貴時間以及毒副作用給患者帶去的治療痛苦。在腫瘤個體化用藥指導(dǎo)領(lǐng)域，目標(biāo)區(qū)域捕獲高通量測序技術(shù)是目前基因組學(xué)研究中的一個熱點(diǎn)技術(shù)。通過對受檢者治療過程中切除的病灶組織進(jìn)行高通量捕獲測序，可有以下 臨床應(yīng)用：(1)胃癌靶向治療關(guān)鍵基因變異情況分析；(2)胃癌患者術(shù)后靶向治療指導(dǎo)建議。相比于前述的其他技術(shù)手段，上述應(yīng)用具有如下優(yōu)勢：1、高通量?；谛乱淮鷾y序技術(shù)的目標(biāo)區(qū)域捕獲測序，能夠在很短的時間內(nèi)同時進(jìn)行多例樣本檢測，并且在目標(biāo)區(qū)域捕獲芯片的使用下，相同數(shù)據(jù)量可進(jìn)行更高深度的數(shù)據(jù)挖掘。2、高靈敏度：通過高深度的目標(biāo)區(qū)域捕獲測序，可以檢測出突變頻率為1％的低頻變異，對于胃癌患者個體的體細(xì)胞變異能夠準(zhǔn)確地檢出。3、高特異性：該應(yīng)用能夠保證較低的假陽性率、假陰性率，確保得到的檢測結(jié)果能夠準(zhǔn)確的反映受檢者的突變情況。4、應(yīng)用廣：對于每個經(jīng)手術(shù)切除病灶組織的胃癌患者，均可運(yùn)用該項(xiàng)技術(shù)。樣本采集過程不會額外給受檢者造成負(fù)擔(dān)。實(shí)施例21、樣本選擇與dna提取。在本發(fā)明的實(shí)施例中選擇1個帶有已知突變tp53基因i195f突變的福爾馬林固定石蠟包埋(ffpe)的胃癌組織樣本，具體樣本信息見表3。表3樣本編號組織類型來源突變位點(diǎn)獲得途徑sc1ffpe低分化胃腺癌患者tp53-i195f臨床樣本sc1樣本所帶的tp53基因i195f突變經(jīng)過sanger測序驗(yàn)證，測序峰圖見圖4。采用dneasyblood&tissuekit基因組提取試劑盒(qiagen，貨號：69504)提取其中的基因組dna。利用qubit2.0熒光分光光度計(lifetechnologies，貨號：q32866)檢測提取所獲得的dna濃度。2、基因組dna片段化樣品打斷采用ab公司的covarissystem可將樣品dna片段控制在100～500bp范圍。樣品打斷結(jié)束后，取少量(約總量的1/30)打斷后樣品在2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行1*tae電泳檢測，并保存好膠圖。打斷效果一般以所要求制備的文庫片段大小在所打斷dnasmea的主帶位置較為理想。例如，若要求制備插入100bp的pairedend文庫，則打斷后dnasmear主帶在100bp處即可，若打斷效果不理想則需要進(jìn)行重新打斷。樣品片段化步驟也 可使用其他打斷系統(tǒng)，具體參數(shù)可根據(jù)儀器的要求進(jìn)行調(diào)整。covarissystem打斷具體操作為：1)每天使用前須更換covariss2儀器有機(jī)玻璃水槽中的水，水面須達(dá)到“waterline”的界線。使用的水須是milli-q的水或超純水，每天儀器使用完畢后需將水槽中的水及時倒掉，每個月須用超純水清理有機(jī)玻璃水槽至少一次。2)開啟covaris專用的筆記本電腦，檢查其與各儀器終端是否連接。打開covariss2儀器和制冷儀開關(guān)并檢查制冷儀的溫度設(shè)置是否為4℃。3)雙擊打開covaris主程序“sonolabs-seriesv2.54”后點(diǎn)擊“start[enter]”，待儀器排氣30min，且水溫降為10℃左右后方可使用。打開主程序之前須先確定打碎儀和冷卻儀的電源開關(guān)是否打開，否則主程序會提示錯誤并重試。4)將樣品加入待用的100μl的covarismicrotube中，樣品加入量5μg，最后將終體積用te補(bǔ)至100μl，用移液器將樣品溶液吹打混勻。點(diǎn)擊“configure”，按下表設(shè)置參數(shù)：選擇模式為“frequencysweeping”。所有設(shè)置完成后點(diǎn)擊“save”或“saveas...”保存好程序，再點(diǎn)擊“returntomainpanel”回到主界面。將打斷管放入covaris裝置中，選擇好程序，開始打碎。按所設(shè)置的程序打碎完成后便可以進(jìn)行下一個樣品的打碎，若無其他樣品須打碎可以關(guān)閉打碎儀和制冷儀的電源然后關(guān)閉打碎主程序和電腦。5)將打斷后的樣品從玻璃管中吸出，放入1.5mlep管中。取出3μl的樣品用于2％瓊脂糖凝膠進(jìn)行1*tae電泳檢測，并用1.8倍beckmancoulter公司的agencourtampurexp磁珠(a63881)進(jìn)行回收，產(chǎn)物溶于32μl的elutionbuffer(eb)中。3、末端修復(fù)預(yù)先從-20℃保存的試劑盒中取出10xpolynucleotidekinasebuffer和10mmdntpsmix，將其置于冰上融解并充分混勻10xpolynucleotidekinasebuffer。在1.5ml的離心管中配制末100μl端修復(fù)反應(yīng)體系：30μl的片段化回收產(chǎn)物、12μl超純水、5μl10xpolynucleotidekinasebuffer(b904)、0.4μldntpsolutionset(自己稀釋混合為25mmeach)、1.2μlt4dnapolymerase、0.2μlklenowfragment與1.2μlt4polynucleotidekinase。20℃ 溫浴30min后，用1.8倍agencourtampurexp磁珠回收純化反應(yīng)體系中的dna，產(chǎn)物dna溶于33.5μl的eb中。4、primeradapter連接1)在產(chǎn)物離心管中按照如下體系配制接頭連接反應(yīng)體系，充分混勻后輕微離心；試劑體積(μl)dna31.52×ligationbuffer37.5p1_adapters(10um,自合成)1.5a_adapters(10um,自合成)1.5dnaligase3totalvolume752)將離心管放置在thermomixer中20℃孵育30min；3)用1.5×體積agencourtampurebeads純化反應(yīng)產(chǎn)物，最后用52μlelutionbuffer回溶產(chǎn)物；4)用1.5×體積agencourtampurebeads純化第一次純化的回溶產(chǎn)物，最后用33μlelutionbuffer回溶產(chǎn)物；5)用qubit2.0檢測接頭連接之后的產(chǎn)物濃度。5、雜交前pcr擴(kuò)增pre-pcr雜交體系如下：試劑體積(μl)dna15nuclease-freewater312×phusionhfpcrmastermix50p1primer(10μm自合成)2aprimer(10μm自合成)2totalvolume100將試劑完全轉(zhuǎn)入一個新的pcr管中，按照如下程序進(jìn)行pcr反應(yīng)：反應(yīng)后先加入0.9倍agencourtampurexp磁珠進(jìn)行大片段選擇，然后轉(zhuǎn)移上清加入0.15倍agencourtampurexp磁珠進(jìn)行純化，用33μlnucleas-free水回溶，取上清后用qubit2.0質(zhì)控并進(jìn)行芯片雜交。6、目標(biāo)區(qū)域捕獲芯片雜交1)雜交體積計算：用qubit定量后將不同pcr產(chǎn)物等量混合(pooling)，共750ng。2)取750ngpooling產(chǎn)物轉(zhuǎn)入一個新的離心管中，使用真空濃縮儀60℃約40min將產(chǎn)物蒸干。3)將所需的試劑置于冰上融化，充分混勻后輕微離心；4)在離心管中按照下表配制用于富集目的片段的樣品文庫體系；試劑體積(μl)pre-pcrlibrary750ngnuclease-freewater補(bǔ)水至2.8μlbgiblock#12.5bgiblock#22.5ionxpress_p1block(500μm)0.6ionxpress_a_xblock(500μm)0.6totalvolume95)將反應(yīng)體系全部轉(zhuǎn)入一個新的pcr管中，按照如下反應(yīng)條件進(jìn)行預(yù)雜交；溫度時間95℃5min65℃holding6)在一個新的1.5ml離心管中按照下表配制雜交緩沖液反應(yīng)體系；試劑體積(μl)hybridizationbuffer125hybridizationbuffer21hybridizationbuffer310hybridizationbuffer414totalvolume507)根據(jù)樣品反應(yīng)個數(shù)，按每個反應(yīng)13μl的量分別加入到pcr管中，蓋好管蓋，然后將其放入pcr儀中65℃孵育至少5min，確認(rèn)體系中沒有晶體沉淀才能使用；8)在一個新的96孔pcr管中按照下表配制oligolibrarymix；試劑體積(μl)nuclease-freewater1.5rnaseblock0.5oligocapturelibrary5totalvolume7注意事項(xiàng)：此操作在冰上進(jìn)行。9)將反應(yīng)體系放入pcr儀中65℃孵育2min；10)保持各反應(yīng)體系于65℃，揭開樣品文庫管和雜交buffer管的管蓋，迅速把13μl的雜交buffer轉(zhuǎn)移到樣品文庫管中；11)保持各反應(yīng)體系于65℃，揭開96孔板上的oligolibrarymix管蓋，迅速將樣品文庫管中的所有反應(yīng)體系全部轉(zhuǎn)移到oligolibrarymix管中，用移液器吹打混勻；12)保持pcr板于65℃，雜交24h。7、芯片洗脫及第二輪pcr擴(kuò)增1)每一個雜交反應(yīng)取50μldynabeadsm-280streptavidinbeads于一新的1.5ml離心管；2)將200μlbindingbuffer加入磁珠中，用漩渦混合儀劇烈振蕩5s重懸磁珠；3)將離心管置于磁力架上2min，待液體完全澄清；小心吸取并棄去上清；4)重復(fù)步驟2)到步驟3)2次；5)加入200μlbindingbuffer重懸磁珠(重懸磁珠和雜交體系一起在垂直混勻儀上旋轉(zhuǎn)混勻)；6)從pcr儀中直接將全部雜交混合液轉(zhuǎn)移到準(zhǔn)備好的磁珠中，上下顛倒離心管3到5次直到混勻；7)將裝有雜交混合液和磁珠的離心管在垂直混勻儀上旋轉(zhuǎn)混勻，室溫下混勻30min；8)將樣品從混勻裝置取下，瞬時離心5s確保管蓋上沒有液體殘留；9)將1.5ml離心管轉(zhuǎn)移放置在磁力架上，靜置3-5min待液體完全澄清，小心吸取并棄去上清；10)用500μlwashbuffer#1重懸磁珠，并于漩渦混合儀上振蕩5s混勻樣品，室溫下孵育樣品15min；11)將離心管瞬時離心3s，然后放置在磁力架上，靜置3-5min待液體完全澄清，小心吸取并棄去上清；12)用500μlwashbuffer#2重懸磁珠，并于漩渦混合儀上振蕩5s以混勻樣品，將其置于thermomixer中65℃孵育10min；13)顛倒離心管以混勻樣品，瞬時離心3s，然后將其放置在磁力架上，靜置3-5min待液體完全澄清，小心吸取并棄去上清；14)重復(fù)步驟12)到步驟13)2次；15)用28μlnuclease-freewater重懸磁珠。16)在離心管中按照下表配制反應(yīng)體系，充分混勻后輕微離心：試劑體積(μl)dna30nuclease-freewater162×phusionhfpcrmastermix50p1primer(10μm自合成)2aprimer(10μm自合成)2totalvolume10017)將試劑完全轉(zhuǎn)入一個新的pcr管中，按照如下程序進(jìn)行pcr反應(yīng)：反應(yīng)后加入1.5倍agencourtampurexpreagent，磁珠純化后，使用52μlnuclease-freewater回溶，再次加入1.5倍agencourtampurexpreagent磁珠純化，最后用33μlnuclease-freewater回溶，qubit2.0和安捷倫2100質(zhì)控后上機(jī)測序。8、測序及結(jié)果分析。運(yùn)用iontorrent公司的proton測序儀(lifetechnologies)對構(gòu)建好的文庫進(jìn)行高通量測序。測序?qū)嶒?yàn)操作按照制造商提供的操作說明書操作。得到下機(jī)的數(shù)據(jù)后，對得到的測序結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾和質(zhì)量控制，然后按照下列流程進(jìn)行生物信息學(xué)分析：1)tmap：與reference序列比對，產(chǎn)生bam文件；2)bamduplicates：對pcr過程中生成的重復(fù)reads進(jìn)行標(biāo)記；3)qc：統(tǒng)計芯片的捕獲效率、有效reads數(shù)、平均深度、重復(fù)率、覆蓋度及未被覆蓋的區(qū)間等信息；4)callsnp/indel：用tvc工具默認(rèn)參數(shù)檢測snp/indel變異；5)注釋注釋變異的功能、reads支持?jǐn)?shù)、變異頻率、氨基酸變異及cosmic中的變異等；本實(shí)例得到的下機(jī)數(shù)據(jù)結(jié)果如表4所示。表4實(shí)例測序下機(jī)數(shù)據(jù)結(jié)果樣本測序數(shù)據(jù)量(bp)≥q20reads數(shù)量平均長度sc1465,768,497391,700,8613,102,543132bp數(shù)據(jù)質(zhì)量結(jié)果如表5所示。表5實(shí)例測序結(jié)果數(shù)據(jù)質(zhì)量分析樣本sc1總有效數(shù)據(jù)量(mb)69.25目標(biāo)區(qū)域捕獲效率26.00％目標(biāo)區(qū)域平均測序深度166.55目標(biāo)區(qū)域覆蓋度99.70％重復(fù)率81.61％同時，發(fā)明人在測序結(jié)果中驗(yàn)證了樣本所攜帶的已知基因突變是否能被檢測到，結(jié)果如表6所示。表6已知突變的檢測結(jié)果樣本陽性突變位點(diǎn)是否檢出突變測序深度突變頻率sc1tp53-i195f是16441％根據(jù)以上的數(shù)據(jù)分析結(jié)果，發(fā)明人得到以下結(jié)論：①根據(jù)表4的數(shù)據(jù)，此次測序的測序數(shù)據(jù)量、q20數(shù)據(jù)量、reads平均長度等指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)，說明此次測序結(jié)果數(shù)據(jù)可靠；②根據(jù)表5的數(shù)據(jù)，目標(biāo)區(qū)域捕獲效率均在26％左右，目標(biāo)區(qū)域平均測序深度在166x左右，數(shù)值均在正常范圍內(nèi)，說明該芯片的捕獲結(jié)果正常。同時，該芯片對于目標(biāo)區(qū)域的覆蓋度為99.7％，能較好地覆蓋芯片設(shè)計的目標(biāo)區(qū)域；③根據(jù)表6的結(jié)果，此次測試的ffpe樣本所包含的已知突變成功被檢測到，說明該芯 片可以正確檢測出樣本中所包含的基因突變。綜上所述，本發(fā)明所涉及的芯片在實(shí)例中實(shí)現(xiàn)了對樣本dna目標(biāo)區(qū)域的捕獲以及樣本所包含基因突變的檢測。本發(fā)明可以應(yīng)用于胃癌個體用藥指導(dǎo)的研究之中。在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不一定指的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任何的一個或多個實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。當(dāng)前第1頁12