本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說，涉及一種糞腸球菌的培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

近年來(lái)，抗生素作為飼用添加劑的副作用已引起人們的廣泛關(guān)注，很多國(guó)家和地區(qū)都已限制了抗生素在飼料中的直接添加，因此尋找一種綠色、安全的飼料添加劑尤為重要。研究表明，糞腸球菌作為一種無(wú)毒副作用的飼料添加劑具有以下一些功能：1)糞腸球菌由于繁殖速度快，能夠很快的定植于動(dòng)物胃腸上皮細(xì)胞上，達(dá)到抑制病原菌的目的；2)糞腸球菌能夠發(fā)酵糖類代謝生成乳酸和乙酸(audisio，2001)，迅速降低動(dòng)物腸道中ph，也可抑制病原菌的繁殖；3)糞腸球菌可以作為一種非特異性的免疫調(diào)節(jié)因子，提高動(dòng)物腸道的免疫力，同時(shí)還能夠增加動(dòng)物血液中免疫細(xì)胞的數(shù)量。

由于糞腸球菌具有以上一些優(yōu)良的特性，吸引了國(guó)內(nèi)外很多的研究者進(jìn)行研究，大多集中在糞腸球菌菌株的篩選(孫衛(wèi).優(yōu)良糞腸球菌的篩選制備方法及其應(yīng)用:，cn101275158[p].2008.)、糞腸球菌液體發(fā)酵工藝研究(杜志琳，李雪平，尹望.一株糞腸球菌發(fā)酵罐發(fā)酵條件的研究[j].飼料研究，2015，(19):23-26.)、糞腸球菌固體發(fā)酵工藝研究(黃明媛.乳酸糞腸球菌固態(tài)發(fā)酵的初步研究[j].飼料研究，2013，(11).)等方面，對(duì)于飼用糞腸球菌液固兩相發(fā)酵的具體工藝報(bào)道較少。

例如，cn102286417a號(hào)專利公開了一種高密度糞腸球菌及其發(fā)酵培養(yǎng)工藝，用高密度固體發(fā)酵培養(yǎng)工藝，以米糠、麩皮、玉米粉、豆粕中任意一種或幾種原料，和活性炭作固態(tài)培養(yǎng)基料，于固態(tài)培養(yǎng)基料中加入營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)基作為固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基；將固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后，接種糞腸球菌種液， 經(jīng)培養(yǎng)，干燥，粉碎制得高密度糞腸球菌產(chǎn)品；所述的營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)基各質(zhì)量組分組成為:葡萄糖5～20.0，蛋白胨1～10.0，牛肉膏1～5.0，酵母膏1～5.0，硫酸鎂0～0.5，硫酸錳0～0.2，磷酸氫二鉀:0.5～3.0，去離子水1000，ph6.0～7.5。該專利中，使用液固兩相發(fā)酵法主要是通過液體發(fā)酵來(lái)獲取大量的種子液，然后再接種到固體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵。這種工藝能有效的降低液體發(fā)酵在接種過程中的染菌風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)也改進(jìn)了傳統(tǒng)固體發(fā)酵的接種方式，能夠縮短種子制備時(shí)間，同時(shí)還能夠發(fā)揮固體發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)，解決了高耗能、后處理困難等問題。但是，液體菌種直接接種至固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基會(huì)出現(xiàn)不適應(yīng)的現(xiàn)象，導(dǎo)致培養(yǎng)初期菌體增長(zhǎng)緩慢、雜菌滋生，另外，一般的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基很難滿足糞腸球菌快速增殖過程中的營(yíng)養(yǎng)需求，向固態(tài)培養(yǎng)基中流加液態(tài)營(yíng)養(yǎng)液又會(huì)出現(xiàn)不均勻等問題，進(jìn)而影響飼用糞腸球菌的品質(zhì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之一在于，提供一種糞腸球菌的培養(yǎng)方法，解決現(xiàn)有液固兩相發(fā)酵法在發(fā)酵初期不適應(yīng)、菌體增長(zhǎng)緩慢、培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、染菌風(fēng)險(xiǎn)高等問題。

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之二在于，提供一種糞腸球菌的培養(yǎng)方法，解決目前市場(chǎng)上的飼用糞腸球菌存在貨架期較短、有效活菌數(shù)不高的問題。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的方案在于：提供一種糞腸球菌的培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

s100、種子液制備：將糞腸球菌的菌種接種至種子培養(yǎng)基，經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)獲得種子液；

s200、配制固體培養(yǎng)基：麩皮50～60份，水40～50份，葡萄糖0.5～1份、磷酸二氫鉀0.2～0.5份，磷酸氫二鉀0.1～0.2份，生石灰0.1～0.2份；其中，所述固體培養(yǎng)基包括的各組分以質(zhì)量比計(jì)，滅菌后待用；

s300、大料固體發(fā)酵：稱取固體培養(yǎng)基投料量1.0～2.0％的硫酸銨、0.5～1.0％的尿素、0.5～1.5％的復(fù)合酶制劑，與所述種子液混合后接種至固體培養(yǎng)基，攪拌均勻得到大料固體，30～35℃發(fā)酵培養(yǎng)20～30h。

在本發(fā)明提供的糞腸球菌的培養(yǎng)方法中，所述步驟s100中使用的所述種子培養(yǎng)基包括如下質(zhì)量分?jǐn)?shù)的組分：葡萄糖8.0～10.0g/l，蛋白胨8.0～12.0g/l，酵母浸出物10.0～15.0g/l，磷酸二氫鉀0.5～1.0g/l，磷酸氫二鉀0.3～0.8g/l，硫酸錳0.1～0.3g/l，余量為水。

在本發(fā)明提供的糞腸球菌的培養(yǎng)方法中，所述步驟s100之前還包括如下步驟：

s001、菌種活化及復(fù)壯：將保存的糞腸球菌凍干管菌種用無(wú)菌水制作成菌懸液，并將菌液稀釋到10^-7時(shí)，在裝有活化培養(yǎng)基的平板中進(jìn)行劃線分離進(jìn)行培養(yǎng)挑取單菌落，再次進(jìn)行劃線分離培養(yǎng)，得到單菌落；

s002、斜面菌種制備：將所述單菌落接種至裝有活化培養(yǎng)基的試管斜面中，30～35℃培養(yǎng)至少20h，制得斜面菌種。

在本發(fā)明提供的糞腸球菌的培養(yǎng)方法中，所述斜面菌種作為所述步驟s100中糞腸球菌的菌種；所述活化培養(yǎng)基包括如下質(zhì)量分?jǐn)?shù)的組分：葡萄糖5.0～8.0g/l，蛋白胨6.0～10.0g/l，酵母浸出物9.0～12.0g/l，磷酸二氫鉀0.4～0.6g/l，磷酸氫二鉀0.2～0.5g/l，硫酸錳0.1～0.2g/l，瓊脂粉12～15g/l，余量為水。

在本發(fā)明提供的糞腸球菌的培養(yǎng)方法中，所述步驟s300中，稱取的硫酸銨、尿素溶于水后煮沸，冷卻待用；稱取的復(fù)合酶制劑先置于35～40℃的無(wú)菌水中活化1～2h，每1g所述復(fù)合酶制劑包括蛋白酶1000～1500u、淀粉酶1000～2000u。u指每克消化酶中所含的單酶的活性，具體定義如下：

蛋白酶(u)：1g固體酶粉(或1ml液體酶)，在30℃、ph7.5的條件下，1min水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸，即為1個(gè)酶活力單位(u)。

淀粉酶(u)：1g固體酶粉(或1ml液體酶)，在40℃、ph7.5的條件下，1min水解淀粉產(chǎn)生1μmol葡萄糖，即為1個(gè)酶活力單位(u)。

在本發(fā)明提供的糞腸球菌的培養(yǎng)方法中，所述步驟s300中，所述大料固體淺盤裝樣，裝樣厚度為2～3cm，疏松均勻；發(fā)酵過程中需要對(duì)淺盤中的大料固體進(jìn)行翻料2～3次。

實(shí)施本發(fā)明，具有如下有益效果：本發(fā)明通過優(yōu)化糞腸球菌的培養(yǎng)基， 使得液體種子快速適應(yīng)固體培養(yǎng)環(huán)境，另外，固體培養(yǎng)基中添加合適種類的氮源和復(fù)合酶制劑，不用額外添加營(yíng)養(yǎng)成分也可以滿足發(fā)酵的營(yíng)養(yǎng)需求；本發(fā)明糞腸球菌的培養(yǎng)方法發(fā)酵周期短，制得的飼用糞腸球菌有效活菌數(shù)高、雜菌率低、產(chǎn)品貨架期長(zhǎng)、生產(chǎn)成本低，應(yīng)用前景巨大。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。附圖中：

圖1為本發(fā)明糞腸球菌的培養(yǎng)方法較佳實(shí)施例的流程圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。

現(xiàn)有的液固兩相發(fā)酵工藝，由于發(fā)酵適應(yīng)期的存在，液體菌種不適應(yīng)固體培養(yǎng)基會(huì)導(dǎo)致的菌體增長(zhǎng)緩慢、培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、染菌風(fēng)險(xiǎn)高等問題。本發(fā)明的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)在于，在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中添加合適種類的氮源和復(fù)合酶制劑，簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基組成即可滿足糞腸球菌的營(yíng)養(yǎng)需求而不用額外添加營(yíng)養(yǎng)成分，產(chǎn)品生產(chǎn)成本低、產(chǎn)品的耐受性較強(qiáng)，同時(shí)還能夠發(fā)揮固體發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)，解決了高耗能、后處理困難等問題。

圖1示出了本發(fā)明糞腸球菌的培養(yǎng)方法較佳實(shí)施例的流程，如圖1所示，該培養(yǎng)方法包括如下步驟：

s100、種子液制備：將糞腸球菌的菌種接種至種子培養(yǎng)基，經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)獲得種子液；本發(fā)明使用的種子培養(yǎng)基配方簡(jiǎn)單，特別是減少了無(wú)機(jī)氮源的添加，有機(jī)氮源含量也較低，制得的種子液抗逆性強(qiáng)，縮短種子液接種至固體培養(yǎng)基的適應(yīng)期；

s200、配制固體培養(yǎng)基：麩皮50～60份，水40～50份，葡萄糖0.5～1份、磷酸二氫鉀0.2～0.5份，磷酸氫二鉀0.1～0.2份，生石灰0.1～0.2份；其中，固體培養(yǎng)基包括的各組分以質(zhì)量比計(jì)，滅菌后待用；麩皮作為固體培 養(yǎng)基最核心的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在復(fù)合酶制劑的作用下會(huì)分解為容易被糞腸球菌利用的小分析多肽、寡糖，滿足糞腸球菌快速增殖過程的需要；另外，固體培養(yǎng)基的滅菌過程時(shí)間較長(zhǎng)，利用高溫蒸汽的作用軟化、爆破麩皮，便于復(fù)合酶制劑的酶解作用；

s300、大料固體發(fā)酵：稱取固體培養(yǎng)基投料量1.0～2.0％的硫酸銨、0.5～1.0％的尿素、0.5～1.5％的復(fù)合酶制劑，與種子液混合后接種至固體培養(yǎng)基，攪拌均勻得到大料固體，種子液的接種量為8～12％(v/m)，即每噸固體培養(yǎng)基接種種子液80～120l，30～35℃發(fā)酵培養(yǎng)20～30h；由于發(fā)酵過程中無(wú)需流加額外的營(yíng)養(yǎng)液，淺盤裝樣發(fā)酵，發(fā)酵過程簡(jiǎn)單易操作，不會(huì)出現(xiàn)不同區(qū)域菌體生長(zhǎng)不均勻的狀況，且發(fā)酵時(shí)間大大縮短，成品的雜菌率低于0.5％，有效活菌數(shù)可達(dá)300～500億/克。

實(shí)施例1

1)菌種活化及復(fù)壯

將保存的糞腸球菌凍干管菌種用無(wú)菌水制作成菌懸液，并將菌液稀釋到10^-7時(shí)，在裝有固體的活化培養(yǎng)基的平板中進(jìn)行劃線分離進(jìn)行培養(yǎng)挑取單菌落，再次進(jìn)行劃線分離培養(yǎng)，得到單菌落。

其中，活化培養(yǎng)基包括如下質(zhì)量分?jǐn)?shù)的組分：葡萄糖5.0g/l，蛋白胨6.0g/l，酵母浸出物12.0g/l，磷酸二氫鉀0.4g/l，磷酸氫二鉀0.2g/l，硫酸錳0.1g/l，瓊脂粉12g/l，余量為水。加熱融化后分裝于平板或試管，于121℃、0.1mpa條件下滅菌20min，取出冷卻待用。

2)斜面菌種制備

將單菌落接種至裝有固體的活化培養(yǎng)基的試管斜面中，30℃培養(yǎng)至少20h，制得斜面菌種。

3)種子液制備

將糞腸球菌的斜面菌種接種至種子培養(yǎng)基，經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)獲得種子液。

其中，種子培養(yǎng)基包括如下質(zhì)量分?jǐn)?shù)的組分：葡萄糖8.0g/l，蛋白胨8.0g/l，酵母浸出物15.0g/l，磷酸二氫鉀0.5g/l，磷酸氫二鉀0.3g/l，硫酸錳0.1g/l，余量為水。于121℃、0.1mpa條件下滅菌20min，冷卻待用。

4)配制固體培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基包括如下質(zhì)量比的組分：麩皮50份，水40份，葡萄糖0.5份、磷酸二氫鉀0.2份，磷酸氫二鉀0.1份，生石灰0.1份。于121℃、0.1mpa條件下滅菌1h，冷卻待用。

5)大料固體發(fā)酵

稱取固體培養(yǎng)基投料量1.0％的硫酸銨、0.5％的尿素、0.5％的復(fù)合酶制劑，硫酸銨、尿素溶于水后煮沸，冷卻待用；稱取的復(fù)合酶制劑先置于35℃的無(wú)菌水中活化2h，與種子液混合后接種至固體培養(yǎng)基，種子液的接種量為8％(v/m)，攪拌均勻得到大料固體，淺盤裝樣厚度為3cm，疏松均勻；發(fā)酵過程中需要對(duì)淺盤中的大料固體進(jìn)行翻料2次，30℃發(fā)酵培養(yǎng)30h。結(jié)束發(fā)酵，出料烘干粉碎制得成品，雜菌率低于0.5％，有效活菌數(shù)可達(dá)350億/克。

實(shí)施例2

1)菌種活化及復(fù)壯

將保存的糞腸球菌凍干管菌種用無(wú)菌水制作成菌懸液，并將菌液稀釋到10^-7時(shí)，在裝有固體的活化培養(yǎng)基的平板中進(jìn)行劃線分離進(jìn)行培養(yǎng)挑取單菌落，再次進(jìn)行劃線分離培養(yǎng)，得到單菌落。

其中，活化培養(yǎng)基包括如下質(zhì)量分?jǐn)?shù)的組分：葡萄糖8.0g/l，蛋白胨10.0g/l，酵母浸出物9.0g/l，磷酸二氫鉀0.6g/l，磷酸氫二鉀0.5g/l，硫酸錳0.2g/l，瓊脂粉15g/l，余量為水。加熱融化后分裝于平板或試管，于121℃、0.1mpa條件下滅菌20min，取出冷卻待用。

2)斜面菌種制備

將單菌落接種至裝有固體的活化培養(yǎng)基的試管斜面中，35℃培養(yǎng)至少20h，制得斜面菌種。

3)種子液制備

將糞腸球菌的斜面菌種接種至種子培養(yǎng)基，經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)獲得種子液。

其中，種子培養(yǎng)基包括如下質(zhì)量分?jǐn)?shù)的組分：葡萄糖10.0g/l，蛋白胨12.0g/l，酵母浸出物10.0g/l，磷酸二氫鉀1.0g/l，磷酸氫二鉀0.8g/l，硫酸 錳0.3g/l，余量為水。于121℃、0.1mpa條件下滅菌20min，冷卻待用。

4)配制固體培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基包括如下質(zhì)量比的組分：麩皮60份，水50份，葡萄糖1份、磷酸二氫鉀0.5份，磷酸氫二鉀0.2份，生石灰0.2份。于121℃、0.1mpa條件下滅菌1.5h，冷卻待用。

5)大料固體發(fā)酵

稱取固體培養(yǎng)基投料量2.0％的硫酸銨、1.0％的尿素、1.5％的復(fù)合酶制劑，硫酸銨、尿素溶于水后煮沸，冷卻待用；稱取的復(fù)合酶制劑先置于40℃的無(wú)菌水中活化1h，與種子液混合后接種至固體培養(yǎng)基，種子液的接種量為12％(v/m)，攪拌均勻得到大料固體，淺盤裝樣厚度為2cm，疏松均勻；發(fā)酵過程中需要對(duì)淺盤中的大料固體進(jìn)行翻料3次，35℃發(fā)酵培養(yǎng)20h。結(jié)束發(fā)酵，出料烘干粉碎制得成品，雜菌率低于0.5％，有效活菌數(shù)可達(dá)400億/克。

實(shí)施例3

1)菌種活化及復(fù)壯

將保存的糞腸球菌凍干管菌種用無(wú)菌水制作成菌懸液，并將菌液稀釋到10^-7時(shí)，在裝有固體的活化培養(yǎng)基的平板中進(jìn)行劃線分離進(jìn)行培養(yǎng)挑取單菌落，再次進(jìn)行劃線分離培養(yǎng)，得到單菌落。

其中，活化培養(yǎng)基包括如下質(zhì)量分?jǐn)?shù)的組分：葡萄糖7.0g/l，蛋白胨8.0g/l，酵母浸出物10.0g/l，磷酸二氫鉀0.5g/l，磷酸氫二鉀0.25g/l，硫酸錳0.15g/l，瓊脂粉13g/l，余量為水。加熱融化后分裝于平板或試管，于121℃、0.1mpa條件下滅菌20min，取出冷卻待用。

2)斜面菌種制備

將單菌落接種至裝有固體的活化培養(yǎng)基的試管斜面中，33℃培養(yǎng)至少20h，制得斜面菌種。

3)種子液制備

將糞腸球菌的斜面菌種接種至種子培養(yǎng)基，經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)獲得種子液。

其中，種子培養(yǎng)基包括如下質(zhì)量分?jǐn)?shù)的組分：葡萄糖9.0g/l，蛋白胨 10.0g/l，酵母浸出物12.0g/l，磷酸二氫鉀0.8g/l，磷酸氫二鉀0.4g/l，硫酸錳0.2g/l，余量為水。于121℃、0.1mpa條件下滅菌20min，冷卻待用。

4)配制固體培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基包括如下質(zhì)量比的組分：麩皮55份，水45份，葡萄糖0.8份、磷酸二氫鉀0.4份，磷酸氫二鉀0.2份，生石灰0.15份。于121℃、0.1mpa條件下滅菌1.5h，冷卻待用。

5)大料固體發(fā)酵

稱取固體培養(yǎng)基投料量1.5％的硫酸銨、0.8％的尿素、1.0％的復(fù)合酶制劑，硫酸銨、尿素溶于水后煮沸，冷卻待用；稱取的復(fù)合酶制劑先置于37℃的無(wú)菌水中活化1h，與種子液混合后接種至固體培養(yǎng)基，種子液的接種量為10％(v/m)，攪拌均勻得到大料固體，淺盤裝樣厚度為2cm，疏松均勻；發(fā)酵過程中需要對(duì)淺盤中的大料固體進(jìn)行翻料3次，33℃發(fā)酵培養(yǎng)24h。結(jié)束發(fā)酵，出料烘干粉碎制得成品，雜菌率低于0.5％，有效活菌數(shù)可達(dá)500億/克。

顯然，上面描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。