本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一種親和層析介質(zhì)及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

親和層析是一種蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)。在生物分子中有些分子的特定結(jié)構(gòu)部位能夠同其他分子相互識(shí)別并結(jié)合，如酶與底物的識(shí)別結(jié)合、受體與配體的識(shí)別結(jié)合、抗體與抗原的識(shí)別結(jié)合，這種結(jié)合既是特異的，又是可逆的，改變條件可以使這種結(jié)合解除。親和層析就是根據(jù)這樣的原理設(shè)計(jì)的。

葡萄球菌蛋白a(staphylococcusaureusproteina，spa，proteina，蛋白a)為金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁相關(guān)蛋白，其具有與人類和其它哺乳動(dòng)物血液中免疫球蛋白分子的fc段特異性結(jié)合的能力，可以吸附igg和含igg的免疫復(fù)合物?；谶@些特性，蛋白a親和層析柱已成為生物技術(shù)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的純化抗體的親和柱，通常在制備蛋白a親和層析介質(zhì)時(shí)，所用到的環(huán)氧氯丙烷活化瓊脂糖都以水為反應(yīng)介質(zhì)，環(huán)氧氯丙烷在水中的溶解度約為6.58％左右，因此該反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的油(環(huán)氧氯丙烷)-水-固(凝膠)三相反應(yīng)體系，反應(yīng)速率較慢；同時(shí)環(huán)氧化過程中環(huán)氧基在堿性條件下極易發(fā)生水解副反應(yīng)，需要對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行全面優(yōu)化和嚴(yán)格控制才能獲得較高的活化效率。史清洪等通過在反應(yīng)介質(zhì)中引入dmso有效消除了環(huán)氧氯丙烷對(duì)瓊脂糖活化過程中的相界面，使環(huán)氧基密度有效提高到了100μmol/ml左右，但反應(yīng)介質(zhì)為水，水解反應(yīng)仍較嚴(yán)重【史清洪等。環(huán)氧氯丙烷活化瓊脂糖凝膠過程強(qiáng)化及性能評(píng)價(jià)[j].過程工程學(xué)報(bào),2007,7(4):743-746.】。

目前，隨著生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)，尤其是生物制藥產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，蛋 白a的市場(chǎng)需求迅速增加，且對(duì)蛋白a親和柱的親和力、純化效率等要求越來越高。但在使用含有蛋白a的親和層析技術(shù)時(shí)，存在親和力低、純化效率低等問題，因此在施用該親和層析技術(shù)時(shí)，需要一種改進(jìn)的親和層析介質(zhì)，提高純化效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明經(jīng)過大量研究，開發(fā)一種新型親和層析介質(zhì)。具體的，本發(fā)明提供了：

1、一種親和層析介質(zhì)，其特征在于，所述親和層析介質(zhì)包含如seqidno.1所示重組蛋白a。

2、上述1所述的親和層析介質(zhì)，其特征在于，還包含固相載體，所述固相載體與重組蛋白a偶聯(lián)。

3、上述2所述的親和層析介質(zhì)，其特征在于，所述固相載體是瓊脂糖凝膠、葡聚糖、纖維素、硅膠或帶羥基的高分子聚合物。

4、上述3所述的親和層析介質(zhì)，其特征在于，所述固相載體是瓊脂糖或葡聚糖凝膠。

5、一種制備上述1-4任一所述的親和層析介質(zhì)的方法，所述方法包括以下步驟：

(1)通過化學(xué)合成的方法設(shè)計(jì)合成重組蛋白a基因單體，5‘端ala-asp突變成asn-val，以形成acli酶切位點(diǎn)，各重組蛋白a基因單體間以acli酶切位點(diǎn)相連，第一個(gè)重組蛋白a基因單體前端加入與表達(dá)載體相連的ncoi酶切位點(diǎn)，6個(gè)his和ek酶切位點(diǎn)，最后一個(gè)重組蛋白a基因單體末端加入中止密碼子taa和與表達(dá)載體pet32a相連的bamhi酶切位點(diǎn)；

(2)將步驟(1)的重組蛋白a基因單體酶切后接入載體pet32a的相應(yīng)酶切位點(diǎn)之間，再以acli內(nèi)切酶酶切，篩選具有氨芐青霉素抗 性的轉(zhuǎn)化子，經(jīng)質(zhì)粒提取，酶切篩選獲得含有4個(gè)蛋白a基因單體的葡萄球菌蛋白a的表達(dá)載體pet32a-p；

(3)用cacl2法將步驟(2)的表達(dá)載體pet32a-p轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21de3，篩選、酶切，獲得重組轉(zhuǎn)化子bl21de3/pet32a-p；

(4)將步驟(3)的菌株bl21de3/pet32a-p進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵，使其高效表達(dá)重組蛋白a，再收集菌體，經(jīng)分離、純化得到重組蛋白a產(chǎn)品；

(5)用環(huán)氧氯丙烷、氫氧化鈉與瓊脂糖或葡聚糖凝膠在介質(zhì)中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物與步驟(4)獲得的重組蛋白a在5-25℃溫度下反應(yīng)15-20小時(shí)，反應(yīng)完后清洗再抽干，獲得重組蛋白a凝膠。

6、上述5所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(5)瓊脂糖凝膠為5％的交聯(lián)瓊脂糖凝膠。

7、如上述6所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(5)中，環(huán)氧氯丙烷、氫氧化鈉與瓊脂糖凝膠在dmso介質(zhì)中進(jìn)行反應(yīng)。

8、上述1-4任一所述的親和層析介質(zhì)在蛋白質(zhì)分離純化中應(yīng)用。

9、上述8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述蛋白質(zhì)為抗體。

10、上述9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抗體為抗egfr抗體。

本發(fā)明的親和層析介質(zhì)，其包含固相載體以及與固相載體偶聯(lián)的重組葡萄球菌蛋白a，其中重組葡萄球菌蛋白a核苷酸序列由757個(gè)核苷酸構(gòu)成。本發(fā)明重組葡萄球菌蛋白a基因序列如seqidno.2所示，氨基酸序列如seqidno.1所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的親和層析介質(zhì)具有蛋白結(jié)合特異性強(qiáng)，親和力高，純化效率高的優(yōu)點(diǎn)，與市售的sp-瓊脂糖凝膠ff相比，其動(dòng)態(tài)吸附載量明顯提高。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，下述實(shí)施例不應(yīng)理解為對(duì)本 發(fā)明的限制。實(shí)施例不包括對(duì)傳統(tǒng)方法的詳細(xì)描述，如那些用于構(gòu)建載體和質(zhì)粒的方法，將編碼蛋白的基因插入到這樣的載體和質(zhì)粒的方法或?qū)①|(zhì)粒引入宿主細(xì)胞的方法以及經(jīng)典的細(xì)胞融合和單克隆抗體篩選及純化的方法等。這樣的方法對(duì)于本領(lǐng)域中具有普通技術(shù)的人員是眾所周知的，并且在許多出版物中都有所描述。

實(shí)施例1重組葡萄球菌蛋白a的制備

1、構(gòu)建重組葡萄球菌蛋白a基因單體

通過化學(xué)合成的方法，設(shè)計(jì)合成葡萄球菌蛋白a基因一個(gè)重復(fù)片段(重復(fù)片段序列如seqidno:2所示的第47-217位核苷酸所示)的序列單體，其包括長(zhǎng)度為171bp的重復(fù)片段，以及前端加入與表達(dá)載體相連的ncoi酶切位點(diǎn)、6個(gè)his(用于親和層析，與鎳柱結(jié)合，減少純化步驟)、ek酶切位點(diǎn)(用于將his和ddddk切去，形成正確的proteina)和acli酶切位點(diǎn)(aacgtt，用于連入多個(gè)重復(fù)片段)。另外，還包括終止密碼子taa，及克隆用bamhi限制性內(nèi)切酶接頭共9bp。標(biāo)記為“單體1”。

另外，通過化學(xué)合成的方法，設(shè)計(jì)合成葡萄球菌蛋白a基因一個(gè)重復(fù)片段(重復(fù)片段序列如seqidno:2的第47-217位核苷酸所示)的序列單體，其序列包括長(zhǎng)度為171bp重復(fù)片段，以及兩端acli酶切位點(diǎn)。標(biāo)記為“單體2”。

2、構(gòu)建重組葡萄球菌蛋白a基因的表達(dá)載體

用限制型內(nèi)切酶ncoi和bamhi酶切實(shí)施例1所獲得的單體1，然后與經(jīng)ncoi及bamhi酶切的載體pet32a連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選具有氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，經(jīng)質(zhì)粒提取，酶切鑒定后證明葡萄球菌蛋白a基因單體已克隆至pet32a中，從而成功構(gòu)建汗一個(gè)葡萄球菌蛋白a基因單體的pet32a載體。

3、含葡萄球菌蛋白a基因單體的pet32a-p載體的構(gòu)建

將上述步驟1所獲得的單體2以acli酶切，回收相應(yīng)片段，然后與上述步驟2所構(gòu)建的含有一個(gè)重組葡萄球蛋白a基因單體的pet32a載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選具有氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，經(jīng)質(zhì)粒提取，酶切篩選獲得含有4個(gè)蛋白a基因單體的葡萄球菌蛋白a的表達(dá)載體，標(biāo)記為“pet32a-p”，經(jīng)檢測(cè)，pet32a-p表達(dá)載體包含如seqidno：2所示基因序列。

4、構(gòu)建表達(dá)重組葡萄球菌蛋白a的大腸桿菌菌株

用cacl2法將上述步驟3所獲得的pet32a-p轉(zhuǎn)化bl21de3，在含有氨芐青霉素的lb平板上篩選轉(zhuǎn)化子，經(jīng)質(zhì)粒檢測(cè)和酶切分析獲得含有pet32a-p的重組轉(zhuǎn)化子，標(biāo)志為“bl21de3/pet32a-p”。

5、重組葡萄球菌蛋白a的生產(chǎn)與純化

(1)菌種的培養(yǎng)發(fā)酵

挑取大腸桿菌工程菌bl21de3/pet32a-p，接種于lb培養(yǎng)基中，接種量1～2％v/v，于35℃培養(yǎng)過夜，次日在無菌條件下將上述培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)基按l:8-1:4接種于發(fā)酵培養(yǎng)基上，35℃發(fā)酵至o.d600達(dá)到0.4～0.7，升溫至48℃誘導(dǎo)，3～5小時(shí)后離心收菌。

取少量細(xì)胞加2×上樣緩沖液，進(jìn)行sds-page凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示葡萄球菌蛋白a已誘導(dǎo)可溶表達(dá)。

(2)重組葡萄球菌蛋白a的純化

將步驟(1)收集的菌體用磷酸鹽緩沖液(0.2m，ph7.0-8.0，含有0.1mnacl)懸浮，超聲破碎，4℃離心，收集上清，得粗提液。

將粗提液使用sds-page電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示大部分葡萄球菌蛋白a被粗提，殘存于菌體的量極微：將粗提液進(jìn)行sephacryl5200分子篩純化，收集特征峰(第二洗脫峰)即為純化的重組葡萄球菌蛋白 a(命名為“proteina1”)，經(jīng)檢測(cè)，proteina1氨基酸序列如seqidno：1所示。

實(shí)施例2elisa法檢測(cè)重組葡萄球菌蛋白a與抗體結(jié)合活性

采用elisa法檢測(cè)上述實(shí)施例1制備的proteina1與抗體結(jié)合活性，具體過程如下：

1)包被：在96孔板中每孔包被proteina1樣品200u1，38℃，1h；

2)封閉：每孔以200u1的1％的bsa封閉，38℃，1h；

3)加一抗：每孔加入約150ug人igg抗體(購(gòu)自mlbio公司)，38℃，1h；

4)加二抗：每孔加入約200u1，1:1000辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體(購(gòu)自mlbio公司)，38℃，1h；

5)顯色。

同樣的方法檢測(cè)市售proteina(購(gòu)自古朵生物)與抗體結(jié)合活性。

elisa檢測(cè)結(jié)果：本發(fā)明的proteina1與人igg抗體結(jié)合，每孔包被0.8-1.9ng葡萄球菌蛋白a即可獲得明顯的檢測(cè)信號(hào)，而市售的proteina需每孔包被7.5-10.5ng葡萄球菌蛋白a時(shí)才獲得明顯的檢測(cè)信號(hào)?？梢姳景l(fā)明的proteina1具有更強(qiáng)的抗體結(jié)合活性。

實(shí)施例3重組葡萄球菌蛋白a瓊脂糖凝膠親和層析介質(zhì)的制備

利用實(shí)施例1的proteina1制備瓊脂糖凝膠親和層析介質(zhì)，包括以下步驟：

1、瓊脂糖凝膠的活化：用環(huán)氧氯丙烷、氫氧化鈉與瓊脂糖(5％的交聯(lián)瓊脂糖凝膠)在二甲基亞砜(dmso,購(gòu)自日本東麗集團(tuán))介質(zhì)中進(jìn)行反應(yīng)，在45-60℃的溫度下反應(yīng)2-3小時(shí)，反應(yīng)完后用蒸餾水清洗至中性后抽干，獲得活化的瓊脂糖凝膠；

2、重組葡萄球菌蛋白a與活化的瓊脂糖凝膠的化學(xué)偶聯(lián)：將上述步驟1獲得的活化瓊脂糖凝膠與實(shí)施例1制備的proteina1在10-28℃溫度下反應(yīng)15-20小時(shí)，反應(yīng)完后清洗抽干，獲得葡萄球菌蛋白a瓊脂糖凝膠親和層析介質(zhì)。

經(jīng)檢測(cè)，制備的重組葡萄球菌蛋白a瓊脂糖凝膠親和層析介質(zhì)特性如表1所示：

表1、重組葡萄球菌蛋白a瓊脂糖凝膠親和層析介質(zhì)特性

實(shí)施例4重組葡萄球菌蛋白a葡聚糖凝膠親和層析介質(zhì)的制備

利用實(shí)施例1的proteina1制備葡聚糖凝膠親和層析介質(zhì),包括以下步驟：

1、用環(huán)氧氯丙烷、氫氧化鈉與葡聚糖凝膠在水介質(zhì)中進(jìn)行反應(yīng)，在45-60℃的溫度下反應(yīng)2-3小時(shí)，反應(yīng)完后用蒸餾水清洗至中性后抽干，獲得活化的葡聚糖凝膠；

2、將上述步驟1獲得的活化葡聚糖凝膠與實(shí)施例1制備的proteina1在10-28℃溫度下反應(yīng)15-20小時(shí)，反應(yīng)完后清洗再抽干，即得到葡萄球菌蛋白a葡聚糖凝膠親和層析介質(zhì)。

經(jīng)檢測(cè)，制備的重組葡萄球菌蛋白a葡聚糖凝膠親和層析介質(zhì)特性如表2所示：

表2、重組葡萄球菌蛋白a葡聚糖凝膠親和層析介質(zhì)特性

實(shí)施例5親和層析介質(zhì)分離純化抗體

使用上述實(shí)施例3、實(shí)施例4中制備的重組葡萄球菌蛋白a親和層析介質(zhì)從抗體培養(yǎng)液中分離純化抗體(按照201010148069.0所述的方法制備抗egfr單克隆抗體)，具體過程如下：

1、重組葡萄球菌蛋白a瓊脂糖凝膠親和層析介質(zhì)分離純化抗體

1)、上述實(shí)施例3制備的重組葡萄球菌蛋白a瓊脂糖凝膠親和層析介質(zhì)裝柱，1.6×20cm，柱床體積為l0ml；

2)、用緩沖液a(ph7.4的pbs溶液，以下同)平衡5-10個(gè)床體積，流速為lml/min；

3)、將2m1抗egfr單克隆抗體培養(yǎng)液用緩沖液a稀釋到20m1，0.45μm濾膜過濾，上樣，流速為lml/min；

4)、用緩沖液a再洗5-10個(gè)床體積，流速為lml/min；

5)、用緩沖液b(ph4.0的20mm檸檬酸緩沖液，其配制方法如下：檸檬酸2.1g加水950m1，用5mnaoh調(diào)至ph4.0，加水至1000ml)洗脫，流速為lml/min，收集洗脫峰；

6)、用純水流洗10個(gè)柱床體積，再用20％的乙醇流洗10個(gè)柱床體積，流速為2ml/min，柱子置于4-8℃環(huán)境中保存；

7)、將分離純化的抗egfr單克隆抗體與對(duì)照品同時(shí)進(jìn)行sds-page電泳分析。

(備注：柱子每使用幾次后應(yīng)該用以緩沖液c(ph3.0的0.5m醋酸緩沖液，其配制方法如下：0.5m醋酸溶液用固體naoh調(diào)至ph3.0)流洗1次，以便將吸附更牢的蛋白去除。)

sds-page電泳結(jié)果：本發(fā)明的重組葡萄球菌蛋白a瓊脂糖凝膠親和層析介質(zhì)一次純化獲得的抗egfr單克隆抗體純度約97.2％。

2、重組葡萄球菌蛋白a葡聚糖凝膠親和層析介質(zhì)分離純化抗體

使用上述實(shí)施例4中制備的重組葡萄球菌蛋白a葡聚糖凝膠親和層析介質(zhì)從抗體培養(yǎng)液中分離純化抗體(按照201010148069.0所述的方法制備抗egfr單克隆抗體)，具體過程如下：

1)、上述實(shí)施例4制備的重組葡萄球菌蛋白a葡聚糖凝膠親和層析介質(zhì)裝柱，1.6×20cm，柱床體積為l0ml；

2)、用緩沖液a(ph7.4的pbs溶液，以下同)平衡5-10個(gè)床體積，流速為lml/min；

3)、將2m1抗egfr單克隆抗體培養(yǎng)液用緩沖液a稀釋到20m1，0.45μm濾膜過濾，上樣，流速為lml/min；

4)、用緩沖液a再洗5-10個(gè)床體積，流速為lml/min；

5)、用緩沖液b(ph4.0的20mm檸檬酸緩沖液，其配制方法如下：檸檬酸2.1g加水950m1，用5mnaoh調(diào)至ph4.0，加水至1000ml)洗脫，流速為lml/min，收集洗脫峰；

6)、用純水流洗10個(gè)柱床體積，再用20％的乙醇流洗10個(gè)柱床體積，流速為2ml/min，柱子置于4-8℃環(huán)境中保存；

7)、將分離純化的抗egfr單克隆抗體與對(duì)照品同時(shí)進(jìn)行sds-page電泳分析。

(備注：柱子每使用幾次后應(yīng)該用以緩沖液c(ph3.0的0.5m醋酸緩沖液，其配制方法如下：0.5m醋酸溶液用固體naoh調(diào)至ph3.0)流洗1次，以便將吸附更牢的蛋白去除。)

sds-page電泳結(jié)果：本發(fā)明的重組葡萄球菌蛋白a葡聚糖凝膠親和層析介質(zhì)一次純化獲得的抗egfr單克隆抗體純度約96.3％。

3、市售sp-瓊脂糖凝膠ff分離純化抗體

另外，使用相同的方法，利用市售sp-瓊脂糖凝膠ff(購(gòu)自博爾西科技公司)從培養(yǎng)液中分離純化抗體(按照201010148069.0所述的方法制備抗egfr單克隆抗體)。sds-page電泳結(jié)果顯示，使用mabselectsure一次純化獲得的抗egfr單克隆抗體純度約87％。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明。本發(fā)明的重組葡萄球菌蛋白a瓊脂糖凝膠親和層析介質(zhì)及重組葡萄球菌蛋白a瓊脂糖凝膠親和層析介質(zhì)一步就能得到純度大于96％的抗egfr單克隆抗體，其純化效果明顯優(yōu)于市售產(chǎn)品。

實(shí)施例6親和層析介質(zhì)對(duì)抗體的動(dòng)態(tài)吸附載量的檢測(cè)

本發(fā)明的親和層析介質(zhì)與市售sp-瓊脂糖凝膠ff(購(gòu)自博爾西科技公司)對(duì)抗體動(dòng)態(tài)吸附載量比較(按照201010148069.0所述的方法制備抗egfr單克隆抗體)，步驟如下：

1、用緩沖液a(ph7.4的pbs溶液)平衡5-10個(gè)床體積，流速為lml/min；

2、2mg/ml濃度抗egfr單克隆抗體上樣，流速為lml/min，至10％穿透時(shí)停止；

3、根據(jù)樣品濃度、上樣體積及柱體積計(jì)算出10％穿透時(shí)各凝膠的動(dòng)態(tài)吸附載量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：本發(fā)明的重組葡萄球菌蛋白a瓊脂糖凝膠對(duì)抗體的動(dòng)態(tài)吸附載量為約45.2mg/ml，本發(fā)明的重組葡萄球菌蛋白a葡聚糖凝膠對(duì)抗體的動(dòng)態(tài)吸附載量為約42.6mg/ml，市售sp-瓊脂糖凝膠ff的動(dòng)態(tài)吸附載量約24mg/ml。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的親和層析介質(zhì)對(duì)抗體的動(dòng)態(tài)吸附載量明顯高于市售的sp-瓊脂糖凝膠ff的動(dòng)態(tài)吸附載量，具有更好的純化效果。