本發(fā)明涉及醫(yī)藥合成領(lǐng)域，具體涉及一種合成etelcalcetide的方法。
背景技術(shù)：
繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)(shpt，簡稱繼發(fā)性甲旁亢)，是指在慢性腎功能不全、腸吸收不良綜合征、fanconi綜合征和腎小管酸中毒、維生素d缺乏或抵抗以及妊娠、哺乳等情況下，甲狀旁腺長期受到低血鈣、低血鎂或高血磷的刺激而分泌過量的甲狀旁腺激素(pth)，以提高血鈣、血鎂和降低血磷的一種慢性代償性臨床表現(xiàn)，長期的甲狀旁腺增生最終導(dǎo)致形成功能自主的腺瘤。
etelcalcetide是由kaipharmaceuticals,inc.開發(fā)的一種新穎的擬鈣劑(calcimimeticagent)，能夠抑制甲狀旁腺激素(pth)的分泌。繼發(fā)性甲旁亢(shpt)是接受透析治療的慢性腎臟病(ckd)患者中一種常見且嚴(yán)重的代償失調(diào)疾病。目前已知，持續(xù)升高的甲狀旁腺激素(pth)與ckd患者的關(guān)鍵臨床結(jié)局相關(guān)。etelcalcetide可結(jié)合并激活甲狀旁腺上的鈣敏感受體，實(shí)現(xiàn)甲狀旁腺激素(pth)水平的降低。
etelcalcetide有3個(gè)d構(gòu)型的精氨酸、2個(gè)d構(gòu)型的丙氨酸、1個(gè)d構(gòu)型的精氨酰胺、1個(gè)d構(gòu)型半胱氨酸與1個(gè)l構(gòu)型半胱氨酸(n段被乙?；忾])構(gòu)成，其中d構(gòu)型半胱氨酸與l構(gòu)型半胱氨酸以二硫鍵連接在一起(n-acetyl-d-cysteinyl-d-alanyl-d-arginyl-d-arginyl-d-arginyl-d-alanyl-d-argininamide,disulfidewithl-cysteine)，其結(jié)構(gòu)如下所示：
專利cn201080045024.9首度報(bào)道了該化合物，但是未見該化合物的合成工藝報(bào)道。該化合物合成的關(guān)鍵在于分子間二硫鍵的構(gòu)建，常規(guī)的分子間二硫鍵構(gòu)建一般需要先將兩個(gè)肽片段進(jìn)行純化制備，然后活化其中一個(gè)巰基，純化制備后再與另一巰基進(jìn)行反應(yīng)形成二硫鍵，最后純化制備后得到相應(yīng)的產(chǎn)物。但是該方法的反應(yīng)步驟比較繁瑣，需要進(jìn)行多步純化制備，生產(chǎn)成本相應(yīng)較高，且最后的總收率較低。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種合成etelcalcetide的方法，使得所述方法無需多步純化即能獲得較高純度和收率的粗肽產(chǎn)品，同時(shí)提高精肽的總收率。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
一種合成etelcalcetide的方法，包括以下步驟：
步驟1、固相合成在seqidno:1所示氨基酸序列d-cys側(cè)鏈上、d-arg側(cè)鏈上偶聯(lián)有保護(hù)基，且在seqidno:1所示氨基酸序列c端偶聯(lián)有氨基樹脂以及在n端乙酰化的肽樹脂片段a；
步驟2、脫除肽樹脂片段a中d-cys側(cè)鏈保護(hù)基，獲得肽樹脂片段b；
步驟3、用2,2'-二硫二吡啶活化肽樹脂片段b中d-cys側(cè)鏈巰基，獲得肽樹脂片段c；
步驟4、n端偶聯(lián)有保護(hù)基的l-cys與肽樹脂片段c在偶聯(lián)體系作用下進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)構(gòu)建二硫鍵，獲得全保護(hù)肽樹脂，加入裂解液脫除所有保護(hù)基以及氨基樹脂獲得etelcalcetide粗肽，粗品可直接用乙醚沉淀出。
本發(fā)明以全固相方法合成全保護(hù)的etelcalcetide的主鏈肽樹脂，并脫除肽樹脂中cys側(cè)鏈的保護(hù)基，以2,2’-二硫二吡啶活化肽樹脂上d-cys側(cè)鏈的巰基(用巰基吡啶基取代氫)，再加入n端偶聯(lián)有保護(hù)基的l-cys與其偶聯(lián)反應(yīng)，固相形成分子間二硫鍵，避免了多次純化制備步驟，且所獲得的粗肽產(chǎn)品純度和收率也較高。etelcalcetide主鏈七肽(本發(fā)明seqidno:1所示氨基酸序列)以n端到c端的氨基酸順序編號(hào)，如下式：
h-d-cys1-d-ala2-d-arg3-d-arg4-d-arg5-d-ala6-d-arg7-nh2
在seqidno:1所示氨基酸序列中，xaa表示d型氨基酸，其中xaa(1)＝d-cys；xaa(2，6)＝d-ala；xaa(3，4，5)＝d-arg，括號(hào)中的數(shù)字表示seqidno:1所示氨基酸序列中氨基酸編號(hào)。
其中，作為優(yōu)選，步驟1為：
保護(hù)的d-arg在偶聯(lián)體系作用下與氨基樹脂進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)得到保護(hù)的d-arg-氨基樹脂，按照seqidno:1所示氨基酸序列n端到c端的順序，將保護(hù)的d-ala、保護(hù)的d-arg、n端乙?；谋Ｗo(hù)的d-cys與保護(hù)的d-arg-氨基樹脂進(jìn)行偶聯(lián)，獲得肽樹脂片段a。
進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟1為：
步驟1.1、fmoc-d-arg(pbf)-oh在偶聯(lián)體系作用下與氨基樹脂進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)得到fmoc-d-arg(pbf)-氨基樹脂；
步驟1.2、脫除fmoc保護(hù)基得到h-d-arg(pbf)-氨基樹脂，fmoc-d-ala-oh在偶聯(lián)體系作用下與h-d-arg(pbf)-氨基樹脂進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)得到fmoc-d-ala-d-arg(pbf)-氨基樹脂；
步驟1.3、按照seqidno:1所示氨基酸序列n端到c端的順序，依次逐個(gè)將3個(gè)fmoc-d-arg(pbf)-oh、fmoc-d-ala-oh和n-ac-d-cys(mmt)-oh按照步驟1.2偶聯(lián)方式進(jìn)行氨基酸延伸偶聯(lián)，得到n-ac-d-cys(mmt)-d-ala-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-ala-d-arg(pbf)-氨基樹脂，即肽樹脂片段a；
其中，所述fmoc為氨基酸n端保護(hù)基，所述pdf、mmt為氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基。
作為優(yōu)選，步驟2為：
肽樹脂片段a中加入tfa的dcm溶液脫除肽樹脂片段a中d-cys側(cè)鏈保護(hù)基，獲得肽樹脂片段b。所述tfa的dcm溶液中tfa的體積百分比優(yōu)選為1-3％，余量為dcm。
作為優(yōu)選，本發(fā)明所述方法中涉及的偶聯(lián)體系為hobt/dic單試劑偶聯(lián)體系或hbtu/hobt/dipea三試劑偶聯(lián)體系。其中的hobt/dic試劑偶聯(lián)體系各偶聯(lián)試劑之間的摩爾比優(yōu)選為：hobt/dic為1：(1～3)；hbtu/hobt/dipea三試劑偶聯(lián)體系各偶聯(lián)試劑之間的摩爾比優(yōu)選為：hbtu:hobt:dipea為1：(1～3):(1～5)，所述各保護(hù)氨基酸與偶聯(lián)試劑的摩爾比優(yōu)選為1:(1～5)。
作為優(yōu)選，所述裂解液為tfa的水溶液；更優(yōu)選地，所述裂解液中tfa體積百分比為90-99％，余量為水。
作為優(yōu)選，n端偶聯(lián)有保護(hù)基的l-cys優(yōu)選為boc-l-cys-oh。
在本發(fā)明技術(shù)方案中，所述氨基樹脂為0.2-1.0mmol/g的rinkamideresin樹脂、rinkamideamresin樹脂或rinkamidembharesin樹脂。
本發(fā)明所述保護(hù)基是在氨基酸合成領(lǐng)域中用以保護(hù)氨基酸主鏈以及側(cè)鏈上氨基、羧基、巰基等干擾合成的基團(tuán)的保護(hù)基團(tuán)，防止氨基、羧基等在制備目標(biāo)產(chǎn)物過程中發(fā)生反應(yīng)，生成雜質(zhì)，而被保護(hù)基保護(hù)的氨基酸稱為保護(hù)氨基酸。在本技術(shù)領(lǐng)域，對(duì)于氨基酸側(cè)鏈需要保護(hù)的基團(tuán)、側(cè)鏈結(jié)構(gòu)以及如何偶聯(lián)保護(hù)基為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。本發(fā)明中對(duì)偶聯(lián)有保護(hù)基的氨基酸表示形式也是本領(lǐng)域常用表示形式，為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，如fmoc-d-arg(pbf)-oh，fmoc為氨基酸n端保護(hù)基，括號(hào)里的pbf為arg側(cè)鏈保護(hù)基，本發(fā)明其他保護(hù)氨基酸合成原料除非特殊說明均可參照此解釋。特別說明的是對(duì)于boc-l-cys-oh保護(hù)氨基酸，boc為其n端保護(hù)基。
本發(fā)明在固相合成中優(yōu)選通過逐一偶聯(lián)方式合成目的多肽片段，逐一偶聯(lián)是指以第一個(gè)氨基酸為起始，剩余氨基酸按照seqidno:1所示氨基酸序列的順序逐個(gè)和前一個(gè)偶聯(lián)的氨基酸發(fā)生縮合反應(yīng)(主鏈氨基和羧基的縮合反應(yīng))進(jìn)行偶聯(lián)。在偶聯(lián)中，由于每個(gè)氨基酸n端都有保護(hù)基，因此需要先脫除n端fmoc保護(hù)基再偶聯(lián)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知常識(shí)，本發(fā)明優(yōu)選用dblk(即20％哌啶的dmf溶液，體積比)脫除n端保護(hù)基。由于不斷有氨基酸偶聯(lián)，所合成的多肽片段是不斷變化的，作為優(yōu)選，每個(gè)待偶聯(lián)的保護(hù)氨基酸原料與之前已經(jīng)合成的肽樹脂片段的摩爾比為(2～10)：1，
此外，etelcalcetide主鏈七肽c末端的酰胺化本發(fā)明是通過將精氨酸與氨基樹脂偶聯(lián)，最后裂解脫除所有保護(hù)基和樹脂時(shí)，可見氨基樹脂上的氨基保留進(jìn)而實(shí)現(xiàn)酰胺化；而n末端的乙?；赏ㄟ^對(duì)半胱氨酸的n端進(jìn)行乙?；?，使其作為n端進(jìn)行液相合成，也可采用市售的乙?；腚装彼徇M(jìn)行合成。
本發(fā)明在獲得etelcalcetide粗肽后還可進(jìn)行rp-hplc純化：所述rp-hplc純化具體為：
得到的etelcalcetide粗肽，采用novaseprp-hplc系統(tǒng)，波長220nm，色譜柱為反相c18柱，常規(guī)0.1％tfa/乙腈為流動(dòng)相純化，除鹽，收集目的峰餾分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，凍干得到白色精肽。
由本發(fā)明所述方法合成的etelcalcetide粗肽無需進(jìn)行多次純化，所得純度為80％-90％、收率在95％以上；同時(shí)經(jīng)rp-hplc純化后檢測(cè)，精肽純度大于98％，總收率為45-60％。
由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明采用固相合成的策略，先合成etelcalcetide主鏈肽樹脂，再脫除肽鏈中d-cys的側(cè)鏈保護(hù)基，而后以2,2’-二硫二吡啶活化肽樹脂上d-cys側(cè)鏈的巰基并與l-cys構(gòu)建二硫鍵，經(jīng)裂解得到etelcalcetide粗肽，整個(gè)過程不用經(jīng)過多場(chǎng)純化，所獲粗肽收率和純度較高，且純化后精肽的總收率大幅提高。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明公開了一種合成etelcalcetide的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的的化合物和制備方法進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
在本發(fā)明具體實(shí)施方式中，所有偶聯(lián)由保護(hù)基的氨基酸均可通過市售獲得，本發(fā)明中的保護(hù)氨基酸購自于吉爾生化有限公司，所用樹脂購自于天津南開和成有限公司，申請(qǐng)文件中所用英文縮寫對(duì)應(yīng)的中文含義見表1。
表1英文縮寫釋義
下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
實(shí)施例1：n-ac-d-cys(mmt)-d-ala-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-ala-d-arg(pbf)-rink-amideresin的合成
稱取替代度為0.20mmol/g的rink-amide樹脂25.00克，加入到固相反應(yīng)柱中，用dmf洗滌2次，用dmf溶脹樹脂30分鐘，加入20％哌啶/dmf(v/v)溶液5+10分鐘脫除fmoc，脫除完畢用dmf洗滌樹脂6次，茚三酮檢測(cè)樹脂有顏色。稱取16.30克(25mmol)fmoc-d-arg(pbf)-oh，4.05克(30mmol)hobt，9.51克(25mmol)hbtu，用75mldmf和75mldcm溶解，冰水浴下加入6.5ml(37.5mmol)dipea活化5分鐘，將混合液加入到反應(yīng)柱中，室溫反應(yīng)2小時(shí)，以茚三酮檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)(如樹脂無色透明則終止反應(yīng)；如樹脂顯色則延長反應(yīng)1小時(shí)，下同)。
反應(yīng)結(jié)束，用dmf洗滌樹脂3次，加入20％哌啶/dmf(v/v)溶液5+10分鐘脫除fmoc，脫除完畢用dmf洗滌樹脂6次，茚三酮檢測(cè)樹脂有顏色。稱取7.80克(25mmol)fmoc-d-ala-oh，4.05克(30mmol)hobt，9.51克(25mmol)hbtu，用75mldmf和75mldcm溶解，冰水浴下加入6.5ml(37.5mmol)dipea活化5分鐘，將混合液加入到反應(yīng)柱中，室溫反應(yīng)2小時(shí)，以茚三酮檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)。
按照同樣的方法依次偶聯(lián)后續(xù)的氨基酸，偶聯(lián)結(jié)束，樹脂收縮抽干，得到35.50克肽樹脂片段a：n-ac-d-cys(mmt)-d-ala-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-ala-d-arg(pbf)-rink-amideresin，樹脂增重率97.5％。
實(shí)施例2：n-ac-d-cys(mmt)-d-ala-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d -ala-d-arg(pbf)-rink-amideresin的合成
稱取替代度為0.45mmol/g的rink-amide樹脂11.10克，加入到固相反應(yīng)柱中，用dmf洗滌2次，用dmf溶脹樹脂30分鐘，加入20％哌啶/dmf(v/v)溶液5+10分鐘脫除fmoc，脫除完畢用dmf洗滌樹脂6次，茚三酮檢測(cè)樹脂有顏色。稱取16.30克(25mmol)fmoc-d-arg(pbf)-oh，4.05克(30mmol)hobt，9.51克(25mmol)hbtu，用75mldmf和75mldcm溶解，冰水浴下加入6.5ml(37.5mmol)dipea活化5分鐘，將混合液加入到反應(yīng)柱中，室溫反應(yīng)2小時(shí)，以茚三酮檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)。
反應(yīng)結(jié)束，用dmf洗滌樹脂3次，加入20％哌啶/dmf(v/v)溶液5+10分鐘脫除fmoc，脫除完畢用dmf洗滌樹脂6次，茚三酮檢測(cè)樹脂有顏色。稱取7.80克(25mmol)fmoc-d-ala-oh，4.05克(30mmol)hobt，9.51克(25mmol)hbtu，用75mldmf和75mldcm溶解，冰水浴下加入6.5ml(37.5mmol)dipea活化5分鐘，將混合液加入到反應(yīng)柱中，室溫反應(yīng)2小時(shí)，以茚三酮檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)。
按照同樣的方法依次偶聯(lián)后續(xù)的氨基酸，偶聯(lián)結(jié)束，樹脂收縮抽干，得到21.40克肽樹脂片段a，樹脂增重率95.7％。
實(shí)施例3：n-ac-d-cys(mmt)-d-ala-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-ala-d-arg(pbf)-rink-amideresin的合成
稱取替代度為0.60mmol/g的rink-amide樹脂8.33克，加入到固相反應(yīng)柱中，用dmf洗滌2次，用dmf溶脹樹脂30分鐘，加入20％哌啶/dmf(v/v)溶液5+10分鐘脫除fmoc，脫除完畢用dmf洗滌樹脂6次，茚三酮檢測(cè)樹脂有顏色。稱取16.30克(25mmol)fmoc-d-arg(pbf)-oh，4.05克(30mmol)hobt，9.51克(25mmol)hbtu，用75mldmf和75mldcm溶解，冰水浴下加入6.5ml(37.5mmol)dipea活化5分鐘，將混合液加入到反應(yīng)柱中，室溫反應(yīng)2小時(shí)，以茚三酮檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)。
反應(yīng)結(jié)束，用dmf洗滌樹脂3次，加入20％哌啶/dmf(v/v)溶液5+10分鐘脫除fmoc，脫除完畢用dmf洗滌樹脂6次，茚三酮檢測(cè)樹脂有顏色。稱取7.80克(25mmol)fmoc-d-ala-oh，4.05克(30mmol)hobt，9.51克(25mmol)hbtu，用75mldmf和75mldcm溶解，冰水浴下加入6.5ml (37.5mmol)dipea活化5分鐘，將混合液加入到反應(yīng)柱中，室溫反應(yīng)2小時(shí)，以茚三酮檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)。
按照同樣的方法依次偶聯(lián)后續(xù)的氨基酸，偶聯(lián)結(jié)束，樹脂收縮抽干，得到18.40克肽樹脂片段a，樹脂增重率94.3％。
實(shí)施例4：mmt保護(hù)基的脫除
將實(shí)施例1中得到的10g肽樹脂片段a加入到反應(yīng)柱中，加入dmf溶脹30min，抽掉dmf，加入dmf洗滌兩次，再加入dcm洗滌兩次；加入100ml2％tfa/dcm溶液反應(yīng)2min，抽掉溶液，然后再加入100ml1％tfa/dcm溶液反應(yīng)2min，重復(fù)該操作15次，樹脂用100mldcm洗3遍，再用dmf洗3遍。樹脂收縮抽干，得到9.85克肽樹脂片段b：n-ac-d-cys-d-ala-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-ala-d-arg(pbf)-rink-amideresin
實(shí)施例5：mmt保護(hù)基的脫除
將實(shí)施例2中得到的10g肽樹脂片段a加入到反應(yīng)柱中，加入dmf溶脹30min，抽掉dmf，加入dmf洗滌兩次，再加入dcm洗滌兩次；加入100ml2％tfa/dcm溶液反應(yīng)2min，抽掉溶液，然后再加入100ml2％tfa/dcm溶液反應(yīng)2min，重復(fù)該操作15次，樹脂用100mldcm洗3遍，再用dmf洗3遍。樹脂收縮抽干，得到9.80克肽樹脂片段b：n-ac-d-cys-d-ala-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-ala-d-arg(pbf)-rink-amideresin
實(shí)施例6：mmt保護(hù)基的脫除
將實(shí)施例3中得到的10g肽樹脂片段a加入到反應(yīng)柱中，加入dmf溶脹30min，抽掉dmf，加入dmf洗滌兩次，再加入dcm洗滌兩次；加入100ml3％tfa/dcm溶液反應(yīng)2min，抽掉溶液，然后再加入100ml2％tfa/dcm溶液反應(yīng)2min，重復(fù)該操作15次，樹脂用100mldcm洗3遍，再用dmf洗3遍。樹脂收縮抽干，得到9.82克肽樹脂片段b： n-ac-d-cys-d-ala-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-ala-d-arg(pbf)-rink-amideresin
實(shí)施例7：肽樹脂片段b活化
稱取7.7g2,2'-二硫二吡啶，溶于100mldmf中，將實(shí)施例4的9.85g肽樹脂片段b緩慢加入反應(yīng)液中，攪拌反應(yīng)2小時(shí)，抽干反應(yīng)液，樹脂用dmf洗滌6遍，樹脂收縮抽干，得到9.70克cys側(cè)鏈巰基活化的肽樹脂片段c：n-ac-d-cys(spyridine)-d-ala-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-ala-d-arg(pbf)-rink-amideresin。
實(shí)施例8：肽樹脂片段b活化
稱取15.4g2,2'-二硫二吡啶，溶于100mldmf中，將實(shí)施例5的9.80g肽樹脂b緩慢加入反應(yīng)液中，攪拌反應(yīng)2小時(shí)，抽干反應(yīng)液，樹脂用dmf洗滌6遍，樹脂收縮抽干，得到9.60克cys側(cè)鏈巰基活化的肽樹脂片段c：n-ac-d-cys(spyridine)-d-ala-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-ala-d-arg(pbf)-rink-amideresin。
實(shí)施例9：肽樹脂片段b活化
稱取30.8g2,2'-二硫二吡啶，溶于100mldmf中，將實(shí)施例6的9.82g肽樹脂b緩慢加入反應(yīng)液中，攪拌反應(yīng)2小時(shí)，抽干反應(yīng)液，樹脂用dmf洗滌6遍，樹脂收縮抽干，得到9.95克cys側(cè)鏈巰基活化的肽樹脂片段c：n-ac-d-cys(spyridine)-d-ala-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-ala-d-arg(pbf)-rink-amideresin。
實(shí)施例10：boc-l-cys-oh偶聯(lián)
將實(shí)施例7得到的9.70g已活化cys側(cè)鏈巰基的肽樹脂片段c加入到固相反應(yīng)柱中，加入dmf溶脹30分鐘。加入3.12gboc-l-cys-oh，1.0mldipea室溫反應(yīng)3小時(shí)。偶聯(lián)結(jié)束，抽干反應(yīng)液，用dmf洗滌6遍，樹脂收縮抽干，得到全保護(hù)肽樹脂10.21克。
實(shí)施例11：boc-l-cys-oh偶聯(lián)
將實(shí)施例8得到的9.60g已活化cys側(cè)鏈巰基的肽樹脂片段c加入到固相反應(yīng)柱中，加入dmf溶脹30分鐘。加入6.24gboc-l-cys-oh，1.0mldipea室溫反應(yīng)3小時(shí)。偶聯(lián)結(jié)束，抽干反應(yīng)液，用dmf洗滌6遍，樹脂收縮抽干，得到全保護(hù)肽樹脂11.12克。
實(shí)施例12：boc-l-cys-oh偶聯(lián)
將實(shí)施例9得到的9.95g已活化cys側(cè)鏈巰基的肽樹脂片段c加入到固相反應(yīng)柱中，加入dmf溶脹30分鐘。加入9.36gboc-l-cys-oh，1.0mldipea室溫反應(yīng)3小時(shí)。偶聯(lián)結(jié)束，抽干反應(yīng)液，用dmf洗滌6遍，樹脂收縮抽干，得到全保護(hù)肽樹脂12.20克。
實(shí)施例13：粗產(chǎn)品裂解
將實(shí)施例10得到的肽樹脂10.21g加入到圓底燒瓶中，用三氟乙酸：h2o(90:10)102ml，室溫振蕩2小時(shí)，過濾，裂解液加入無水乙醚中，得到黃色固體1.42g，粗肽純度81.5％，粗肽收率為96.20％。
實(shí)施例14：粗產(chǎn)品裂解
將實(shí)施例11得到的肽樹脂11.12g加入到圓底燒瓶中，用三氟乙酸：h2o(95:5)112ml，室溫振蕩2小時(shí)，過濾，裂解液加入無水乙醚中，得到黃色固體2.40g，粗肽純度80.8％，粗肽收率為98.01％。
實(shí)施例15：粗產(chǎn)品裂解
將實(shí)施例12得到的肽樹脂11.80g加入到圓底燒瓶中，用三氟乙酸：h2o(97.5:2.5)122ml，室溫振蕩2小時(shí)，過濾，裂解液加入無水乙醚中，得到黃色固體2.71g，粗肽純度81.0％，粗肽收率為95.16％。
實(shí)施例16：粗肽的純化
取實(shí)施例13制備得到的etelcalcetide粗肽1.42g，采用novaseprp-hplc系統(tǒng)，波長220nm，色譜柱為反相c18柱，常規(guī)0.1％tfa/乙腈為 流動(dòng)相純化，除鹽，收集目的峰餾分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，凍干得到白色精肽固體0.85g，純化收率為59.86％，質(zhì)譜信號(hào)為1048.5。hplc純度98.50％，總收率57.81％。
實(shí)施例17：粗肽的純化
取實(shí)施例14制備得到的etelcalcetide粗肽1.50g，采用novaseprp-hplc系統(tǒng)，波長220nm，色譜柱為反相c18柱，常規(guī)0.1％tfa/乙腈為流動(dòng)相純化，除鹽，收集目的峰餾分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，凍干得到白色精肽固體0.78g，收率為53.06％，質(zhì)譜信號(hào)為1048.4。hplc純度98.50％，總收率52.0％。
實(shí)施例18：粗肽的純化
取實(shí)施例15制備得到的etelcalcetide粗肽1.50g，采用novaseprp-hplc系統(tǒng)，波長220nm，色譜柱為反相c18柱，常規(guī)0.1％tfa/乙腈為流動(dòng)相純化，除鹽，收集目的峰餾分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，凍干得到白色精肽固體0.80g，收率為53.33％，質(zhì)譜信號(hào)為1048.5。hplc純度98.50％，總收率49.48％。
實(shí)施例19：常規(guī)方法合成etelcalcetide
1、n-ac-d-cys(trt)-d-ala-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-ala-d-arg(pbf)-rink-amideresin的合成
稱取替代度為0.20mmol/g的rink-amide樹脂25.00克，加入到固相反應(yīng)柱中，用dmf洗滌2次，用dmf溶脹樹脂30分鐘，加入20％哌啶/dmf(v/v)溶液5+10分鐘脫除fmoc，脫除完畢用dmf洗滌樹脂6次，茚三酮檢測(cè)樹脂有顏色。稱取16.30克(25mmol)fmoc-d-arg(pbf)-oh，4.05克(30mmol)hobt，9.51克(25mmol)hbtu，用75mldmf和75mldcm溶解，冰水浴下加入6.5ml(37.5mmol)dipea活化5分鐘，將混合液加入到反應(yīng)柱中，室溫反應(yīng)2小時(shí)，以茚三酮檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)(如樹脂無色透明則終止反應(yīng)；如樹脂顯色則延長反應(yīng)1小時(shí)，下同)。
反應(yīng)結(jié)束，用dmf洗滌樹脂3次，加入20％哌啶/dmf(v/v)溶液5+10分鐘脫除fmoc，脫除完畢用dmf洗滌樹脂6次，茚三酮檢測(cè)樹脂有顏色。稱取7.80克(25mmol)fmoc-d-ala-oh，4.05克(30mmol)hobt，9.51克(25mmol)hbtu，用75mldmf和75mldcm溶解，冰水浴下加入6.5ml(37.5mmol)dipea活化5分鐘，將混合液加入到反應(yīng)柱中，室溫反應(yīng)2小時(shí)，以茚三酮檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)。
按照同樣的方法依次偶聯(lián)后續(xù)的氨基酸，偶聯(lián)結(jié)束，樹脂收縮抽干，得到34.80克肽樹脂片段a：n-ac-d-cys(trt)-d-ala-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-ala-d-arg(pbf)-rink-amideresin。
2、主鏈粗肽裂解
將得到的肽樹脂10g加入到圓底燒瓶中，用三氟乙酸：h2o(95:5)102ml，室溫振蕩2小時(shí)，過濾，裂解液加入無水乙醚中，得到黃色固體1.40g，粗肽收率為95.24％，粗肽純度85.2％。
3、主鏈粗肽純化
主鏈粗肽采用novaseprp-hplc系統(tǒng)，波長220nm，色譜柱為反相c18柱，常規(guī)0.1％tfa/乙腈為流動(dòng)相純化，除鹽，收集目的峰餾分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，凍干得到白色精肽固體0.82g。
4、主鏈cys側(cè)鏈巰基活化
稱取7.7g2,2'-二硫二吡啶，溶于50ml甲醇/水(3/1)中，將0.82g主鏈精肽溶于10ml水中，緩慢滴加到2,2'-二硫二吡啶溶液中，攪拌反應(yīng)30分鐘，用hplc監(jiān)控反應(yīng)情況。反應(yīng)完全后，活化中間體采用novaseprp-hplc系統(tǒng)，波長220nm，色譜柱為反相c18柱，常規(guī)0.1％tfa/乙腈為流動(dòng)相純化，除鹽，收集目的峰餾分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。
5、側(cè)鏈cys修飾
稱取0.242gh-cys-oh，溶于20ml水中，緩慢滴加到上述已活化的主鏈精肽溶液中，攪拌反應(yīng)1小時(shí)，用hplc監(jiān)控反應(yīng)情況。
6、粗肽的純化
將上述制備得到的etelcalcetide粗肽，采用novaseprp-hplc系統(tǒng)，波長220nm，色譜柱為反相c18柱，常規(guī)0.1％tfa/乙腈為流動(dòng)相純化，除鹽， 收集目的峰餾分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，凍干得到白色精肽固體0.46g，hplc純度98.50％，質(zhì)譜信號(hào)為1048.3?？偸章蕿?0.53％。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。