本發(fā)明涉及醫(yī)藥合成領(lǐng)域，具體涉及一種合成etelcalcetide的方法。
背景技術(shù)：
：繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)(shpt，簡稱繼發(fā)性甲旁亢)，是指在慢性腎功能不全、腸吸收不良綜合征、fanconi綜合征和腎小管酸中毒、維生素d缺乏或抵抗以及妊娠、哺乳等情況下，甲狀旁腺長期受到低血鈣、低血鎂或高血磷的刺激而分泌過量的甲狀旁腺激素(pth)，以提高血鈣、血鎂和降低血磷的一種慢性代償性臨床表現(xiàn)，長期的甲狀旁腺增生最終導(dǎo)致形成功能自主的腺瘤。etelcalcetide是由kaipharmaceuticals,inc.開發(fā)的一種新穎的擬鈣劑(calcimimeticagent)，能夠抑制甲狀旁腺激素(pth)的分泌。繼發(fā)性甲旁亢(shpt)是接受透析治療的慢性腎臟病(ckd)患者中一種常見且嚴(yán)重的代償失調(diào)疾病。目前已知，持續(xù)升高的甲狀旁腺激素(pth)與ckd患者的關(guān)鍵臨床結(jié)局相關(guān)。etelcalcetide可結(jié)合并激活甲狀旁腺上的鈣敏感受體，實(shí)現(xiàn)甲狀旁腺激素(pth)水平的降低。etelcalcetide有3個(gè)d構(gòu)型的精氨酸、2個(gè)d構(gòu)型的丙氨酸、1個(gè)d構(gòu)型的精氨酰胺、1個(gè)l構(gòu)型半胱氨酸與1個(gè)d構(gòu)型半胱氨酸(n段被乙?；忾])構(gòu)成，其中d構(gòu)型半胱氨酸與l構(gòu)型半胱氨酸以二硫鍵連接在一起(n-acetyl-d-cysteinyl-d-alanyl-d-arginyl-d-arginyl-d-arginyl-d-alanyl-d-argininamide,disulfidewithl-cysteine)，其結(jié)構(gòu)如下所示：專利cn201080045024.9首度報(bào)道了該化合物，但是未見該化合物的合成工藝報(bào)道。該化合物合成的關(guān)鍵在于二硫鍵的構(gòu)建，常規(guī)的肽合成中使用的構(gòu)建二硫鍵的方法包括空氣氧化法，碘/醋酸體系氧化法，雙氧水氧化法等，這類方法僅適合于環(huán)肽的二硫鍵的構(gòu)建，環(huán)肽的二硫鍵往往是分子內(nèi)的兩個(gè)巰基通過氧化的方法進(jìn)行連接，需要通過使用極稀溶液來進(jìn)行反應(yīng)，減少分子間反應(yīng)的發(fā)生。但是etelcalcetide需要進(jìn)行分子間巰基的氧化反應(yīng)，若按照常規(guī)的二硫鍵構(gòu)建方法進(jìn)行反應(yīng)，將無法得到理想收率和純度的最終產(chǎn)物。此外，如果以普通的固相合成方法合成該化合物合成，其中的胍基較為容易脫除而形成降解雜質(zhì)，純化難度極大。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種合成etelcalcetide的方法，使得本發(fā)明所述方法能夠提高etelcalcetide及中間產(chǎn)物的收率，提高etelcalcetide純度和降低雜質(zhì)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種合成etelcalcetide的方法，包括以下步驟：步驟1、液相合成在seqidno:1所示氨基酸序列上n末端乙酰化、c末端酰胺化的直鏈七肽；步驟2、l-cys進(jìn)行ncs氯化，使巰基上的氫被氯取代，生成l-cys(scl)；步驟3、將步驟1合成的直鏈七肽和l-cys(scl)偶聯(lián)反應(yīng)生成二硫化物，獲得etelcalcetide；步驟1和步驟2不分先后。本發(fā)明以液相合成方法合成etelcalcetide主鏈7肽，并以ncs氯化的方法制備活性中間體l-cys(scl)，使用該活性中間體構(gòu)建二硫鍵合成etelcalcetide，保證反應(yīng)的專一選擇性，收率高，雜質(zhì)少。其中，作為優(yōu)選，所述步驟1為：以保護(hù)氨基酸為原料，在偶聯(lián)體系作用下，液相合成在seqidno:1所示氨基酸序列上n末端乙酰化、c末端酰胺化的全保護(hù)直鏈七肽，然后裂解脫除各氨基酸的保護(hù)基，獲得直鏈七肽。進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟1為：以fmoc-d-arg(pbf)-oh、fmoc-d-ala-oh、n-ac-d-cys(trt)-oh保護(hù)氨基酸為原料，在氯甲酸異丙酯/dipea偶聯(lián)體系作用下液相合成在seqidno:1所示氨基酸序列上n末端乙?；?、c末端酰胺化的全保護(hù)直鏈七肽n-ac-d-cys(trt)-d-ala-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-ala-d-arg(pbf)-nh2，然后裂解脫除各氨基酸的保護(hù)基，獲得直鏈七肽n-ac-d-cys-d-ala-d-arg-d-arg-d-arg-d-ala-d-arg-nh2；所述n-ac-d-cys(trt)-oh為n端乙?；谋Ｗo(hù)的半胱氨酸。更優(yōu)選地，步驟1為：步驟1.1、將fmoc-d-arg(pbf)-oh的c端酰胺化，獲得fmoc-d-arg(pbf)-nh2，然后以fmoc-d-arg(pbf)-nh2為c端，用fmoc-d-arg(pbf)-oh、fmoc-d-ala-oh保護(hù)氨基酸在氯甲酸異丙酯/dipea偶聯(lián)體系作用下液相合成seqidno:1所示氨基酸序列n端到c端第4-7位的全保護(hù)多肽a，即fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-ala-d-arg(pbf)-nh2；以n-ac-d-cys(trt)-oh為n端，用fmoc-d-arg(pbf)-oh、fmoc-d-ala-oh保護(hù)氨基酸在dic/hosu/dipea三試劑偶聯(lián)體系或hatu/dipea雙試劑偶聯(lián)體系作用下液相合成seqidno:1所示氨基酸序列n端到c端第1-3位的全保護(hù)多肽b，即n-ac-d-cys(trt)-d-ala-d-arg(pbf)-oh；步驟1.2、將全保護(hù)多肽a和全保護(hù)多肽b用hatu/dipea雙試劑偶聯(lián)體系偶聯(lián)，獲得全保護(hù)直鏈七肽n-ac-d-cys(trt)-d-ala-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-ala-d-arg(pbf)-nh2；步驟1.3、全保護(hù)直鏈七肽裂解脫除各保護(hù)氨基酸保護(hù)基獲得直鏈七肽n-ac-d-cys-d-ala-d-arg-d-arg-d-arg-d-ala-d-arg-nh2。在本發(fā)明優(yōu)選的液相合成etelcalcetide主鏈7肽方案中，首先按照etelcalcetide主鏈肽序(本發(fā)明seqidno:1所示氨基酸序列)合成1-3和4-7片段，分別對(duì)應(yīng)全保護(hù)多肽b和a，然后再將這2個(gè)多肽片段偶聯(lián)得到全保護(hù)直連七肽，以etelcalcetide主鏈n端到c端的氨基酸順序編號(hào)，如下式：h-d-cys1-d-ala2-d-arg3-d-arg4-d-arg5-d-ala6-d-arg7-nh2在seqidno:1所示氨基酸序列中，xaa表示d型氨基酸，其中xaa(1)＝d-cys；xaa(2，6)＝d-ala；xaa(3，4，5)＝d-arg，括號(hào)中的數(shù)字表示seqidno:1所示氨基酸序列中氨基酸編號(hào)。本發(fā)明所述保護(hù)基是在多肽合成領(lǐng)域中用以保護(hù)氨基酸主鏈以及側(cè)鏈上氨基、羧基、巰基等干擾合成的基團(tuán)的保護(hù)基團(tuán)，防止氨基、羧基等在制備目標(biāo)產(chǎn)物過程中發(fā)生反應(yīng)，生成雜質(zhì)，而被保護(hù)基保護(hù)的氨基酸稱為保護(hù)氨基酸。在本
技術(shù)領(lǐng)域：
，對(duì)于氨基酸側(cè)鏈需要保護(hù)的基團(tuán)、側(cè)鏈結(jié)構(gòu)以及如何偶聯(lián)保護(hù)基為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。本發(fā)明中對(duì)偶聯(lián)有保護(hù)基的氨基酸表示形式也是本領(lǐng)域常用表示形式，為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，如fmoc-d-arg(pbf)-oh，fmoc為氨基酸n端保護(hù)基，括號(hào)里的pbf為arg側(cè)鏈保護(hù)基，本發(fā)明其他保護(hù)氨基酸合成原料除非特殊說明均可參照此解釋。特別說明的是對(duì)于boc-l-cys-otbu保護(hù)氨基酸，boc為其n端保護(hù)基，otbu為其羧酸保護(hù)基。本發(fā)明在液相合成中優(yōu)選通過逐一偶聯(lián)方式合成目的多肽片段，逐一偶聯(lián)是指以第一個(gè)氨基酸為起始，剩余氨基酸按照seqidno:1所示氨基酸序列的順序逐個(gè)和前一個(gè)偶聯(lián)的氨基酸發(fā)生縮合反應(yīng)(主鏈氨基和羧基的縮合反應(yīng))進(jìn)行偶聯(lián)。在偶聯(lián)中，由于每個(gè)氨基酸n端都有保護(hù)基，因此需要先脫除n端fmoc保護(hù)基再偶聯(lián)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知常識(shí)，本發(fā)明優(yōu)選加入哌啶脫除n端fmoc保護(hù)基，用三氟醋酸脫除boc-l-cys-otbu羧酸保護(hù)基otbu。由于不斷有氨基酸偶聯(lián)，所合成的多肽片段是不斷變化的，作為優(yōu)選，每個(gè)待偶聯(lián)的氨基酸原料與之前已經(jīng)合成的多肽片段的摩爾比、每兩個(gè)待偶聯(lián)的氨基酸原料之間的摩爾比以及每兩個(gè)多肽片段之間的摩爾比接近于1:1，其他適用摩爾比可根據(jù)實(shí)際反應(yīng)進(jìn)行調(diào)整。此外，所述直鏈七肽c末端的酰胺化可通過對(duì)精氨酸的c端進(jìn)行酰胺化(如和氨水反應(yīng))，使其作為c端進(jìn)行液相合成；而n末端的乙?；赏ㄟ^對(duì)半胱氨酸的n端進(jìn)行乙?；?，使其作為n端進(jìn)行液相合成，也可采用市售的乙?；腚装彼徇M(jìn)行合成。作為優(yōu)選，本發(fā)明步驟2為：boc-l-cys-otbu進(jìn)行ncs氯化，使巰基上的氫被氯取代，生成boc-l-cys(scl)-otbu。針對(duì)etelcalcetide合成中，其胍基較為容易脫除而形成降解雜質(zhì)的技術(shù)問題，本發(fā)明通過降低反應(yīng)溫度來最大程度解決胍基脫除導(dǎo)致收率和純度降低的問題，故本發(fā)明步驟1所述液相合成、步驟2所述ncs氯化、步驟3所述偶聯(lián)反應(yīng)均優(yōu)選在0-10℃中進(jìn)行，更優(yōu)先為0℃≤反應(yīng)溫度＜10℃之間。作為優(yōu)選，步驟1所述液相合成、步驟2所述ncs氯化、步驟3所述偶聯(lián)反應(yīng)均以dmf、dcm或兩者的混合物(混合物中兩者體積比優(yōu)選1:1)為溶劑。作為優(yōu)選，所述裂解通過加入二氯甲烷和三氟醋酸的混合溶液進(jìn)行裂解，進(jìn)一步優(yōu)選地，二氯甲烷和三氟醋酸的體積比為15:85。以本發(fā)明所述方法合成的etelcalcetide經(jīng)hplc純化后純度達(dá)到98％以上，收率在62％以上。由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明采用全液相方法合成etelcalcetide，在液相合成過程中，可使用結(jié)晶、打漿等簡單易行的純化手段，大大提高了中間體質(zhì)量。與固相方法比較使用更少的試劑及溶劑，綠色環(huán)保，并且不使用價(jià)格高昂的樹脂，降低了成本。同時(shí)以價(jià)廉易得的ncs與半胱氨酸形成活性中間體構(gòu)建二硫鍵，避免了傳統(tǒng)方法轉(zhuǎn)化率低，純度低的缺點(diǎn)，利于etelcalcetide的大規(guī)模生產(chǎn)。具體實(shí)施方式本發(fā)明公開了一種合成etelcalcetide的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的的化合物和制備方法進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。在本發(fā)明具體實(shí)施方式中，所有保護(hù)氨基酸均可通過市售獲得，本發(fā)明中的保護(hù)氨基酸購自于吉爾生化有限公司，申請(qǐng)文件中所用英文縮寫對(duì)應(yīng)的中文含義見表1。表1英文縮寫釋義縮寫及英文含義ncsn-氯代丁二酰亞胺boc叔丁氧羰基etelcalcetide一種凱伊藥品公司開發(fā)的新型多肽藥物cys半胱氨酸-otbu叔丁酯ms質(zhì)譜argininamide精氨酰胺fmoc芴甲氧羰基ac乙?；鵧ipea二異丙基乙基胺mmol毫摩爾pbf2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰氯hplc高效液相equ.當(dāng)量kaipharmaceuticals,inc.凱伊藥品公司在本發(fā)明液相合成中，各中間產(chǎn)物可通過結(jié)晶、柱層析等手段純化，如乙酸乙酯加熱回流溶解后加正己烷冷卻析晶、加乙酸乙酯加熱回流溶解后冷卻析晶(乙酸乙酯打漿)、柱層析(二氯甲烷/甲醇梯度洗脫)；而全保護(hù)直鏈七肽可通過乙醇重結(jié)晶純化，直鏈七肽和終產(chǎn)物可采用乙醚沉淀法。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。實(shí)施例1：fmoc-d-arg(pbf)-nh2的合成1、本發(fā)明方法fmoc-d-arg(pbf)-oh(130g,200mmol)加入到1000毫升二氯甲烷中，冰水浴冷卻至低于10℃，加入氯甲酸異丙酯(27g,220mmol,1.1equ.),攪拌5分鐘后，緩慢滴加dipea(31g,242mmol,1.21equ.)，所得混合物保持體系溫度低于10℃，攪拌，tlc監(jiān)控反應(yīng)，直到原料點(diǎn)消失。200毫升氨水緩慢加入到上述反應(yīng)液中，保持反應(yīng)溫度低于20℃，繼續(xù)攪拌2小時(shí)，分液，dcm層水洗兩遍，無水硫酸鈉干燥，移除溶劑后得到白色固體115g(收率88.5％)，hplc純度為95.2％。2、對(duì)照方法fmoc-d-arg(pbf)-oh(130g,200mmol)加入到1000毫升二氯甲烷中，反應(yīng)體系溫度控制在30-40℃，加入氯甲酸異丙酯(27g,220mmol,1.1equ.),攪拌5分鐘后，緩慢滴加dipea(31g,242mmol,1.21equ.)，所得混合物保持體系溫度30-40℃，攪拌，tlc監(jiān)控反應(yīng)，直到原料點(diǎn)消失。200毫升氨水緩慢加入到上述反應(yīng)液中，保持反應(yīng)溫度低于20℃，繼續(xù)攪拌2小時(shí)，分液，dcm層水洗兩遍，無水硫酸鈉干燥，移除溶劑后得到白色固體112.3g(收率86.4％)，hplc純度89.6％。所得白色固體加入到乙酸乙酯(200ml),室溫?cái)嚢?小時(shí)，過濾，得白色固體104.8g，hplc純度94.8％。實(shí)施例2：fmoc-d-ala-d-arg(pbf)-nh2的合成fmoc-d-ala-oh(4.67g,15mmol)加入到100毫升二氯甲烷中，攪拌10分鐘后，冰水浴冷卻至低于10℃，加入氯甲酸異丙酯(2.0g,16.5mmol,1.1equ.),攪拌5分鐘后，緩慢滴加dipea(2.33g,18.1mmol,1.21equ.)，所得混合物保持體系溫度低于10℃，攪拌，tlc監(jiān)控反應(yīng)，直到原料點(diǎn)消失。fmoc-d-arg(pbf)-nh2脫除fmoc保護(hù)基,h-d-arg(pbf)-nh2(7.0g,16.5mmol)加入二氯甲烷(50毫升)溶解，然后將其加入上述反應(yīng)液中，保持體系溫度低于10℃繼續(xù)攪拌10小時(shí)，直到原料點(diǎn)消失(tlc)。反應(yīng)混合溶液用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌一次，水洗兩遍，無水硫酸鈉干燥，移除溶劑后得到白色固體11.1g。將所得白色固體加入到乙酸乙酯(100毫升)中，加熱至回流，全部固體溶解，50毫升正己烷緩慢加入到乙酸乙酯溶液中，所得溶液繼續(xù)回流0.5小時(shí)，然后緩慢冷卻至室溫，大量固體析出，過濾得白色固體8.9g，收率81.0％。純度95.7％。2、對(duì)照方法fmoc-d-ala-oh(4.67g,15mmol)加入到100毫升二氯甲烷中，攪拌10分鐘后，冰水浴冷卻至低于10℃，加入氯甲酸異丙酯(2.0g,16.5mmol,1.1equ.),攪拌5分鐘后，緩慢滴加dipea(2.33g,18.1mmol,1.21equ.)，所得混合物保持體系溫度30-40℃，攪拌，tlc監(jiān)控反應(yīng)，直到原料點(diǎn)消失。fmoc-d-arg(pbf)-nh2脫除fmoc保護(hù)基,h-d-arg(pbf)-nh2(7.0g,16.5mmol)加入二氯甲烷(50毫升)溶解，然后將其加入上述反應(yīng)液中，保持體系溫度30-40℃繼續(xù)攪拌，直到原料點(diǎn)消失(tlc)。反應(yīng)混合溶液用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌一次，水洗兩遍，無水硫酸鈉干燥，移除溶劑后得到白色固體10.4g。將所得白色固體加入到乙酸乙酯(100毫升)中，加熱至回流，全部固體溶解，50毫升正己烷緩慢加入到乙酸乙酯溶液中，所得溶液繼續(xù)回流0.5小時(shí)，然后緩慢冷卻至室溫，大量固體析出，過濾得白色固體7.2g，收率65.5％。純度93.8％。實(shí)施例3：fmoc-d-arg(pbf)-d-ala-d-arg(pbf)-nh2的合成fmoc-d-ala-r-arg(pbf)-nh2(8.9g12mmol)加入到二氯甲烷(200毫升)中，攪拌5分鐘后，滴加哌啶(5.1g，60mmol)，反應(yīng)液繼續(xù)攪拌直到fmoc-d-ala-r-arg(pbf)-nh2完全消失(tlc)。使用稀鹽酸洗滌至二氯甲烷溶液呈中性，分液，二氯甲烷液干燥，移除溶劑得油狀物h-d-ala-d-arg(pbf)-nh2(5.3g,收率85.8％)，將油狀物用乙酸乙酯/正己烷處理得到純品。fmoc-d-arg(pbf)-oh(6.5g,10mmol)加入到100毫升n,n-二甲基甲酰胺中，冰水浴冷卻至低于10℃，加入氯甲酸異丙酯(1.34g,11mmol,1.1equ.),攪拌5分鐘后，緩慢滴加dipea(1.56g,12.1mmol,1.21equ.)，所得混合物保持體系溫度低于10℃，攪拌，tlc監(jiān)控反應(yīng)，直到原料消失。油狀物(h-d-ala-d-arg(pbf)-nh2,5.3g,10.3mmol)加入n,n-二甲基甲酰胺(50毫升)溶解，然后將其加入上述反應(yīng)液中，保持體系溫度低于10℃繼續(xù)攪拌10小時(shí)，直到原料消失(tlc)。將所得反應(yīng)液加入到5倍體積的水中，靜置過夜。過濾，將所得白色固體加入到乙酸乙酯(150毫升)中，加熱至回流0.5小時(shí)，然后緩慢冷卻至室溫，過濾得白色固體10.2g，收率87.7％。純度93.7％。2、對(duì)照方法fmoc-d-ala-d-arg(pbf)-nh2(8.9g12mmol)加入到二氯甲烷(200毫升)中，攪拌5分鐘后，滴加哌啶(5.1g，60mmol)，反應(yīng)液繼續(xù)攪拌直到fmoc-d-ala-d-arg(pbf)-nh2完全消失(tlc)。使用稀鹽酸洗滌至二氯甲烷溶液呈中性，分液，二氯甲烷液干燥，移除溶劑得油狀物h-d-ala-d-arg(pbf)-nh2(5.4g,收率89.0％)。將油狀物用乙酸乙酯/正己烷處理得到純品。fmoc-d-arg(pbf)-oh(6.5g,10mmol)加入到100毫升n,n-二甲基甲酰胺中，冰水浴冷卻至低于10℃，加入氯甲酸異丙酯(1.34g,11mmol,1.1equ.),攪拌5分鐘后，緩慢滴加dipea(1.56g,12.1mmol,1.21equ.)，所得混合物冰水浴冷卻至低于10℃，攪拌，tlc監(jiān)控反應(yīng)，直到原料消失。h-d-ala-d-arg(pbf)-nh2,5.3g,10.3mmol加入n,n-二甲基甲酰胺(50毫升)溶解，然后將其加入上述反應(yīng)液中，保持體系溫度30-40℃繼續(xù)攪拌10小時(shí)以上，直到原料消失(tlc)。將所得反應(yīng)液加入到5倍體積的水中，靜置過夜。過濾，將所得白色固體加入到乙酸乙酯(150毫升)中，加熱至回流0.5小時(shí)，然后緩慢冷卻至室溫，過濾得白色固體9.1g，收率78.2％。純度92.6％。實(shí)施例4：fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-ala-d-arg(pbf)-nh2(全保護(hù)多肽a)的合成fmoc-d-arg(pbf)-d-ala-d-arg(pbf)-nh2(10.2g8.77mmol)加入到二氯甲烷(250毫升)中，攪拌5分鐘后，滴加哌啶(4.25g，50mmol)，反應(yīng)液繼續(xù)攪拌直到fmoc-d-ala-d-arg(pbf)-nh2完全消失(tlc)。柱層析純化(二氯甲烷/甲醇梯度洗脫)，移除溶劑得白色固體h-d-arg(pbf)-d-ala-d-arg(pbf)-nh2(5.31g,收率64.3％)。fmoc-d-arg(pbf)-oh(3.6g,5.5mmol)加入到80毫升n,n-二甲基甲酰胺中，冰水浴冷卻至低于10℃，加入氯甲酸異丙酯(0.81g,6.6mmol,1.2equ.),攪拌5分鐘后，緩慢滴加dipea(1.1g,8.3mmol,1.5equ.)，所得混合物保持體系溫度低于10℃，攪拌，tlc監(jiān)控反應(yīng)，直到原料消失。h-d-arg(pbf)-d-ala-d-arg(pbf)-nh2(5.31g,5.64mmol)加入n,n-二甲基甲酰胺(50毫升)溶解，然后將其加入上述反應(yīng)液中，保持體系溫度低于10℃繼續(xù)攪拌10小時(shí)，直到原料消失(tlc)。500毫升水緩慢加入到上述反應(yīng)體系中，繼續(xù)攪拌0.5小時(shí)，過濾，將所得白色固體加入到乙酸乙酯(150毫升)中，加熱至回流2.0小時(shí)，然后冷卻至室溫，過濾得白色固體6.14g，收率70.3％。純度96.7％。2、對(duì)照方法fmoc-d-arg(pbf)-d-ala-d-arg(pbf)-nh2(10.2g,8.77mmol)加入到二氯甲烷(250毫升)中，攪拌5分鐘后，滴加哌啶(4.25g，50mmol)，反應(yīng)液繼續(xù)攪拌直到fmoc-d-ala-d-arg(pbf)-nh2完全消失(tlc)。柱層析純化(二氯甲烷/甲醇梯度洗脫)，移除溶劑得h-d-arg(pbf)-d-ala-d-arg(pbf)-nh2(5.28g,收率64.0％)。fmoc-d-arg(pbf)-oh(3.6g,5.5mmol)加入到80毫升n,n-二甲基甲酰胺中，冰水浴冷卻至低于10℃，加入氯甲酸異丙酯(0.81g,6.6mmol,1.2equ.),攪拌5分鐘后，緩慢滴加dipea(1.1g,8.3mmol,1.5equ.)，所得混合物保持體系溫度低于10℃，攪拌，tlc監(jiān)控反應(yīng)，直到原料消失。h-d-arg(pbf)-d-ala-d-arg(pbf)-nh2(5.31g,5.64mmol)加入n,n-二甲基甲酰胺(50毫升)溶解，然后將其加入上述反應(yīng)液中，保持體系溫度30-40℃繼續(xù)攪拌10小時(shí)以上，直到原料消失(tlc)。500毫升水緩慢加入到上述反應(yīng)體系中，繼續(xù)攪拌0.5小時(shí)，過濾，將所得白色固體加入到乙酸乙酯(150毫升)中，加熱至回流2.0小時(shí)，然后冷卻至室溫，過濾得白色固體5.80g，收率66.4％。純度95.1％。實(shí)施例5：n-ac-d-cys(trt)-d-ala-oh的合成n-ac-d-cys(trt)-oh(4.06g10mmol)加入到二氯甲烷(100毫升)中，冰水浴冷卻至低于10℃，加入dic(1.52g,12mmol,1.2equ.)、hosu(1.80g,12mmol,1.2equ.),攪拌5分鐘后，緩慢滴加dipea(1.94g,15mmol,1.5equ.)，所得混合物保持體系溫度低于10℃，攪拌，tlc監(jiān)控反應(yīng)，直到原料消失。過濾，減壓移除溶劑，得油狀物。取對(duì)照樣品，油狀物中加入乙腈(150ml)、dipea(1.94g,15mmol,1.5equ.)，攪拌溶解后，h-d-ala-oh(0.98g,11mmol) 加入上述溶液中，另加入80ml水，混合均勻后，保持體系溫度低于10℃繼續(xù)攪拌，與對(duì)照樣品對(duì)照直到原料消失(tlc)。反應(yīng)液水洗兩次，干燥，移除溶劑后，所得油狀物加入到100毫升乙酸乙酯中，加熱溶解，正己烷緩慢加入，直到體系有固體析出。冷卻至室溫后，過濾得到白色固體4.05g,收率84.9％，純度97.2％。2、對(duì)照方法n-ac-d-cys(trt)-oh(4.06g10mmol)加入到二氯甲烷(100毫升)中，冰水浴冷卻至低于10℃，加入dic(1.52g,12mmol,1.2equ.)、hosu(1.80g,12mmol,1.2equ.),攪拌5分鐘后，緩慢滴加dipea(1.94g,15mmol,1.5equ.)，所得混合物保持體系溫度30-40℃，攪拌，tlc監(jiān)控反應(yīng)，直到原料消失。過濾，減壓移除溶劑，得油狀物。取對(duì)照樣品，油狀物中加入乙腈(150ml)、dipea(1.94g,15mmol,1.5equ.)，攪拌溶解后，h-d-ala-oh(0.98g,11mmol)加入上述溶液中，另加入80ml水，混合均勻后，保持體系溫度30-40℃繼續(xù)攪拌，與對(duì)照樣品對(duì)照直到原料消失(tlc)。反應(yīng)液水洗兩次，干燥，移除溶劑后，所得油狀物加入到100毫升乙酸乙酯中，加熱溶解，正己烷緩慢加入，直到體系有固體析出。冷卻至室溫后，過濾得到白色固體3.82g,收率80.1％，純度95.4％。實(shí)施例6：n-ac-d-cys(trt)-d-ala-d-arg(pbf)-oh(全保護(hù)多肽b)的合成1、本發(fā)明方法n-ac-d-cys(trt)-d-ala-oh(4.06g8.5mmol)、h-d-arg(pbf)-oh(4.26g,10mmol)加入到n,n-二甲基甲酰胺(80毫升)中，冰水浴冷卻至低于10℃，加入hatu(3.81g,10mmol,1.2equ.),攪拌5分鐘后，緩慢滴加dipea(1.64g,12.8mmol,1.5equ.)，所得混合物保持體系溫度低于10℃，攪拌，tlc監(jiān)控反應(yīng)，直到原料消失。反應(yīng)液加到5倍體積水中，靜置過夜，過濾得到白色固體，白色固體加入到乙酸乙酯(200ml)中，加熱回流，使用分水器移除殘余水分，冷卻，靜置析晶，過濾得到白色固體5.58g,收率74.2％，純度98.9％。2、對(duì)照方法n-ac-d-cys(trt)-d-ala-oh(4.06g8.5mmol)、h-d-arg(pbf)-oh(4.26g,10mmol)加入到n,n-二甲基甲酰胺(80毫升)中，保持反應(yīng)溫度30-40℃，加入hatu(3.81g,10mmol,1.2equ.),攪拌5分鐘后，緩慢滴加dipea(1.64g,12.8mmol,1.5equ.)，所得混合物保持反應(yīng)溫度30-40℃，攪拌，tlc監(jiān)控反應(yīng)，直到原料消失。反應(yīng)液加到5倍體積水中，靜置過夜，過濾得到白色固體，白色固體加入到乙酸乙酯(200ml)中，加熱回流，使用分水器移除殘余水分，冷卻，靜置析晶，過濾得到白色固體5.41g,收率71.9％，純度98.8％。實(shí)施例7：n-ac-d-cys(trt)-d-ala-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-ala-d-arg(pbf)-nh2(全保護(hù)直鏈七肽)的合成1、本發(fā)明方法fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-ala-d-arg(pbf)-nh2(6.14g3.86mmol)加入到dmf(80毫升)中，攪拌5分鐘后，滴加哌啶(1.62g，19mmol)，反應(yīng)液繼續(xù)攪拌直到fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-ala-d-arg(pbf)-nh2完全消失(tlc)。150毫升水緩慢加入到混合液中，過濾，所得固體用100毫升乙酸乙酯打漿，過濾的白色固體h-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-ala-d-arg(pbf)-nh2(4.23g,收率80.3％)。n-ac-d-cys(trt)-d-ala-d-arg(pbf)-oh(2.74g,3.1mmol)、h-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-ala-d-arg(pbf)-nh2(4.23g,3.1mmol)加入到n,n-二甲基甲酰胺(100毫升)，冰水浴冷卻至低于10℃，加入hatu(1.42g,3.72mmol,1.2equ.),攪拌5分鐘后，緩慢滴加dipea(0.6g,4.65mmol,1.5equ.)，所得混合物保持體系溫度低于10℃，攪拌，tlc監(jiān)控反應(yīng)，直到原料消失。200毫升水緩慢加入到反應(yīng)體系中，過濾，所得固體加入到乙醇中，加熱回流，攪拌2小時(shí)，過濾得白色固體4.63g，收率66.4％，純度95.1％。2、對(duì)照方法fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-ala-d-arg(pbf)-nh2(6.14g3.86mmol)加入到dmf(80毫升)中，攪拌5分鐘后，滴加哌啶(1.62g，19mmol)，反應(yīng)液繼續(xù)攪拌直到fmoc-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-ala-d-arg(pbf)-nh2完全消失(tlc)。150毫升水緩慢加入到混合液中，過濾，所得固體用100毫升 乙酸乙酯打漿，過濾的白色固體h-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-ala-d-arg(pbf)-nh2(4.23g,收率80.3％)。n-ac-d-cys(trt)-d-ala-d-arg(pbf)-oh(2.74g,3.1mmol)、h-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-ala-d-arg(pbf)-nh2(4.23g,3.1mmol)加入到n,n-二甲基甲酰胺(100毫升)，保持反應(yīng)溫度30-40℃，加入hatu(1.42g,3.72mmol,1.2equ.),攪拌5分鐘后，緩慢滴加dipea(0.6g,4.65mmol,1.5equ.)，攪拌，tlc監(jiān)控反應(yīng)，直到原料消失。200毫升水緩慢加入到反應(yīng)體系中，過濾，所得固體加入到乙醇中，加熱回流，攪拌2小時(shí)，過濾得白色固體4.41g，收率63.2％，純度94.9％。實(shí)施例8：boc-l-cys(scl)-otbu的合成boc-l-cys-otbu(0.56g，2.0mmol)加入到二氯甲烷(20毫升)中，攪拌溶解后，冰水浴冷卻，三乙胺(3.1g，3.0mmol有機(jī)堿催化反應(yīng)進(jìn)行)加入溶液中，然后將ncs(3.0g,2.2mmol)分批加入反應(yīng)體系中，所得混合液繼續(xù)保溫反應(yīng)4小時(shí)，tlc檢測無原料殘留，過濾，將濾液移除溶劑，另加n,n-二甲基甲酰胺(20毫升)溶解殘余物。實(shí)施例9：n-ac-d-cys-d-ala-d-arg-d-arg-d-arg-d-ala-d-arg-nh2(直鏈七肽)的合成實(shí)施例7所得全保護(hù)直鏈七肽n-ac-d-cys(trt)-d-ala-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-arg(pbf)-d-ala-d-arg(pbf)-nh2(4.63g,2.56mmol)加入到二氯甲烷/三氟醋酸(50毫升，15:85)混合溶液中，反應(yīng)液控溫不高于10℃，繼續(xù)攪拌4小時(shí)，將所得反應(yīng)混合液緩慢加入預(yù)冷至0℃的乙醚(500毫升)中，過濾得直鏈七肽粗品1.86g，hplc純度：79.5％收率78.3％。ms:[m+h]+:929。實(shí)施例10：etelcalcetide的合成上述實(shí)施例9所得直七肽粗品(1.86g，2.0mmol)加入到n,n-二甲基甲酰胺(50毫升)中，攪拌溶解，冰水浴冷卻，緩慢加入實(shí)施例8制得的樣品溶液，混合好的反應(yīng)液繼續(xù)保溫?cái)嚢?小時(shí)，反應(yīng)液中緩慢加入三氟醋酸(5毫升脫除otbu保護(hù)基)，混合液繼續(xù)攪拌4小時(shí)，然后緩慢加入到500毫升預(yù) 冷好的乙醚中，混合，靜置4小時(shí)，離心過濾，得粗肽固體2.03g,hplc純度77.2％。粗肽利用hplc制備純化，得純品1.32g，收率62.9％，純度98.2％，ms:[m+h]+:1049。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁12