本發(fā)明涉及一種取代的氨基磷酸酯類衍生物、其制備方法及其應(yīng)用，具體的說，本發(fā)明涉及一種通式(I)所示的取代的氨基磷酸酯類衍生物、其立體異構(gòu)體或藥學(xué)上可以接受的鹽、其制備方法以及含有它們的藥物組合物以及在制備治療病毒感染性疾病中的藥物中的用途。

背景技術(shù)：
乙肝是世界性的疾病之一，它由乙肝病毒引起。世界上有三分之一的人口均在某種程度上感染了乙肝病毒，其中包括3億5千萬慢性攜帶者。在一些亞洲和非洲國家，乙肝已經(jīng)變成流行性疾病，尤其是在中國。乙肝病毒能引起急性和慢性感染，急性感染通常伴隨著肝臟發(fā)炎，嘔吐，黃疸，極個別的還會引起死亡，而慢性感染有可能誘發(fā)肝硬化及肝癌。目前雖然可以通過疫苗預(yù)防乙肝病毒感染，但仍無有效的方法治療慢性乙肝疾病。乙肝病毒是一種嗜肝性的脫氧核糖核酸(DNA)病毒，具有環(huán)狀的部分雙鏈DNA基因組。較短的一條鏈有1700到2800個核苷酸，較長的一條鏈有3020到3320個核苷酸，而這條長鏈則編碼病毒的DNA聚合酶。乙肝病毒的基因組編碼了四個已知基因——C、X、P和S?；駽編碼核蛋白(HBcAg)，基因S編碼表面抗原(HBsAg)，基因P則編碼DNA聚合酶，而基因X編碼的蛋白功能尚不清楚，但是它被認(rèn)為與肝癌的發(fā)生有關(guān)，因為它激活了誘導(dǎo)細(xì)胞增值的基因，并且讓生長調(diào)節(jié)因子失活。乙肝病毒的生命周期復(fù)雜，是通過未知受體和內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，其基因組被宿主蛋白chaperones轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核。在細(xì)胞核里，乙肝病毒通過宿主細(xì)胞的DNA聚合酶將部分雙鏈DNA轉(zhuǎn)化為完整的雙鏈DNA，并且將形態(tài)改變?yōu)橥ㄟ^共價鍵結(jié)合的環(huán)狀DNA(cccDNA)。cccDNA作為模板，轉(zhuǎn)錄四個病毒mRNA。這四個轉(zhuǎn)錄子作為模板，被轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì)胞質(zhì)，被翻譯成病毒的膜蛋白，核蛋白及DNA聚合酶。最長的mRNA(3.5kb，長于病毒基因組)作為模板復(fù)制新的基因組拷貝，轉(zhuǎn)錄核衣殼蛋白及病毒DNA聚合酶。同時，這個3.5kb長的RNA將逆轉(zhuǎn)錄出乙肝病毒DNA的反義鏈，隨后完成病毒正義鏈。雙鏈DNA會作為新的子病毒輸出或者重新回到細(xì)胞核形成新的cccDNA。乙肝病毒RNA和DNA的合成依賴于乙肝病毒DNA聚合酶，乙肝病毒DNA聚合酶對于病毒的復(fù)制是必須的。該聚合酶有四個結(jié)構(gòu)域：對于乙肝病毒復(fù)制的開始及核衣殼的裝配很重要的末端蛋白、間隔蛋白、逆轉(zhuǎn)錄酶及用于降解前基因組RNA模板的RNaseH結(jié)構(gòu)域。盡管如此，缺乏校對功能導(dǎo)致了乙肝病毒DNA聚合酶的高突變率。利用DNA聚合酶抑制劑來做為抗乙肝病毒藥物已經(jīng)稱為一個頗具吸引力的選擇。特殊的病毒聚合酶抑制劑屬于核苷類似物家族。對于慢性乙肝病人的治療由于口服抗乙肝病毒核苷類似物藥物而得到了改善。在血清中，核苷類似物能迅速將乙肝病毒DNA降至不可測的水平，并且起效機(jī)制明確：核苷類似物競爭性抑制了病毒DNA聚合酶的活性。同時，與干擾素IFN-α相比，核苷類似物表現(xiàn)出良好的耐受性及更小的不良反應(yīng)。到目前為止，有五種核苷類似物乙肝病毒DNA聚合酶抑制劑作為治療慢性乙肝的藥物，在美國及歐洲上市，包括：拉米夫定(lamivudine)、替諾福韋酯(adefovirdipivoxil)、恩替卡韋(entecavir)、替比夫定(telbivudine)和替諾福韋酯富馬酸鹽(tenofovirdisoproxilfumarate)，還有其他幾個藥物處于在研階段。同時，因為病毒在肝臟中殘留以及病毒聚合酶引起的突變(包括病毒聚合酶氨基酸的替換突變)，長期抗病毒治療可能會引起病毒的抗藥性和選擇性。這對于開發(fā)新型抗病毒藥物提出了要求。替諾福韋(tenofovir)，化學(xué)名稱為[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基-乙氧基]甲基磷酸(PMPA)，是一種核苷酸類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，具有抗HBV和HIV；但是由于其含有磷酸基團(tuán)，具有較大極性，生物膜穿透能力差，在生物體內(nèi)生物利用度差等缺點。為了克服這一缺點，可制成膦酸酯或者膦酰胺前藥形式。2002年由吉利德公司研發(fā)上市的藥物Viread(富馬酸替諾福韋二吡呋酯)為PMPA的一種前藥方式，制備成膦酸酯的前藥形式大大提高了生物利用度。Viread在治療HIV和HBV方面發(fā)揮了重要的作用。關(guān)于替諾福韋前藥形式的改造成為了研究的熱點。依澤替米貝(ezetimibe)是由先靈葆雅(Schering-Plough)公司研制的新型膽固醇吸收抑制劑，于2002年10月被FDA批準(zhǔn)上市，商品名為艾澤庭(Zetia)?；瘜W(xué)名稱為(1-(4-氟苯基)-(3R)-[3-(4-氟苯基)-(3S)-羥丙基]-(4S)-(4-羥苯基)-2-氮雜環(huán)丁酮)，是一種選擇性膽固醇吸收抑制劑，主要阻斷膽固醇的外源性吸收途徑。它通過與小腸刷狀緣膜小囊泡上膜蛋白NPC1L1結(jié)合，抑制小腸對飲食中和經(jīng)膽汁輸送到腸道中的膽固醇的吸收，降低血清和肝臟中的膽固醇含量。UlrikeProtzer等人(AntiviralResearch，2013(97)，195197.)于2013年報道了其在抑制HBV感染方面的活性。李文輝教授等人(eLife，2012；1：e00049.)于2012年報道了一種乙肝病毒受體-Sodiumtaurocholatecotransportingpolypeptide(NTCP，鈉離子-?；悄懰?協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)。JamesE.Polli等人(Mol.Pharmaceutics，2013(10)，1008-1019.)于2013年報道了依澤替米貝能夠抑制NTCP蛋白。上述研究表明依澤替米貝能夠發(fā)揮抗HBV。歐洲專利EP206459描述了包含替諾福韋結(jié)構(gòu)的9-(磷酸甲氧基烷基)腺嘌呤衍生物，及其用于抗病毒藥的用途，其中R1選擇氫、甲基、羥甲基，R2選自取代或未取代的亞乙基、亞甲基、亞丙基等。不認(rèn)為此專利中具體描述是本發(fā)明的一部分，其結(jié)構(gòu)式如下：EP481214描述了包含阿德福韋酯的新的口服磷酸酯核苷類似物前藥，及其抗病毒的醫(yī)藥用途，特別是抗RNA、DNA病毒，也可以用于治療腫瘤等，其中B選自嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、鳥嘧啶等，R3選自取代或未取代的C1-C20烷基，R1、R2獨立的選自取代或未取代的氨基、OR4，R4選自CH2C(O)N(R5)2，CH2C(O)OR5、CH2OC(O)R5、CH(R5)OC(O)R5、CH2C(R5)2CH2OH或CH2OR5，R5選自未取代或被羥基、氧、硝基、鹵素取代的C4-C20烷基、芳基或芳基-烷基，R1、R2可以成環(huán)。不認(rèn)為此專利中具體描述是本發(fā)明的一部分，其結(jié)構(gòu)如下：WO0208241描述了包含替諾福韋酯結(jié)構(gòu)的腺嘌呤衍生物，其中R1選擇氫、甲基。不認(rèn)為此專利中具體描述是本發(fā)明的一部分，其結(jié)構(gòu)式如下：WO02057288描述了取代的氨基磷酸酯類衍生物及其用于抗病毒藥的用途，其中Q選自嘌呤或嘧啶，R4、R5獨立的選自氫、烷基、芳基等，R1、R2、R3、R7、R8獨立的選自羥基、鹵素、氫、氨基、烷基、烷氧基、烷基氨基等。不認(rèn)為此專利中具體描述是本發(fā)明的一部分，其結(jié)構(gòu)式如下：CN200410024276.X描述了9-((磷酸酯)甲氧基烷基)腺嘌呤衍生物及其用于抗病毒藥的用途，其中R1、R2獨立的選自氫或取代的聯(lián)苯甲基。不認(rèn)為此專利中具體描述是本發(fā)明的一部分，其結(jié)構(gòu)式如下：CN200710041280.0描述了取代的氨基磷酸酯類衍生物及其用于抗病毒藥的用途，其中R1選自氫、鹵素、氨基、環(huán)丙基氨基、甲氧基、乙氧基等，R2選自氫或氨基，R5選自甲基或氫，R3、R4獨立的選自(取代的氨基羰基氧基)烷基。不認(rèn)為此專利中具體描述是本發(fā)明的一部分，其結(jié)構(gòu)式如下；CN200410088840.4描述了取代的氨基磷酸酯類衍生物及其用于抗病毒藥的用途，其中R為氫或甲基，R2選自氫或樟腦?；琑1選自含3-8個碳的環(huán)烷基、3-8個碳的非飽和鏈烴基、3-8個碳的非飽和環(huán)烷基或6-10個碳的芳烴。不認(rèn)為此專利中具體描述是本發(fā)明的一部分，其結(jié)構(gòu)式如下WO2011069322描述了取代的氨基磷酸酯類衍生物及其用于治療和預(yù)防與病毒感染相關(guān)疾病的醫(yī)藥用途，其中R1選自氫或甲基，R2選自-R3或-OR3，R3選自C1-8烷基、C3-8環(huán)烷基。不認(rèn)為此專利中具體描述是本發(fā)明的一部分，其結(jié)構(gòu)式如下：本發(fā)明是在替諾福韋酯基礎(chǔ)上設(shè)計具有通式(I)所示的化合物，以提供一種結(jié)構(gòu)新穎、藥效更好、更安全、毒副作用小、溶解性好或生物利用度高取代的氨基磷酸酯類衍生物、其立體異構(gòu)體或藥學(xué)上可以接受的鹽，可用于治療病毒感染性疾病，其中病毒感染性疾病包括乙型肝炎病毒和HIV病毒引起的感染性疾病。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供一種通式(I)所示的取代的氨基磷酸酯類衍生物、其立體異構(gòu)體或藥學(xué)上可以接受的鹽，其中：A選自苯基或萘基，所述的苯基或萘基任選進(jìn)一步被0至5個選自H、F、Cl、Br、I、氨基、羥基、羧基、C1-4烷基或C1-4烷氧基的取代基所取代；B為E選自-CH(CH2F)CH2-、-CH2CH(CH3)OCH2-或-CH2CH2OCH2-；R1選自H或C1-4烷基；R2是一種天然或可藥用氨基酸的側(cè)鏈，如果側(cè)鏈含有羧基，該羧基可以選擇被烷基或芳基酯化；R3為R4選自H、甲?；1-4烷基、-(CH2)n-C3-6碳環(huán)、-(C＝O)-C1-4烷基或-(C＝O)-C3-6碳環(huán)；n選自0、1或2。本發(fā)明優(yōu)選方案，一種通式(I)所示取代的氨基磷酸酯類衍生物、其立體異構(gòu)體或藥學(xué)上可以接受的鹽，其中A選自苯基或萘基，優(yōu)選苯基；所述的苯基或萘基任選進(jìn)一步被0至5個選自H、F、Cl、Br、I、氨基、羥基、羧基、甲基、乙基、甲氧基或乙氧基的取代基所取代，進(jìn)一步優(yōu)選被0至5個選自H、F、Cl、Br、氨基或甲氧基的取代基所取代。本發(fā)明有選方案，一種通式(I)所示取代的氨基磷酸酯類衍生物、其立體異構(gòu)體或藥學(xué)上可以接受的鹽，其中R2是一種天然或可藥用氨基酸的側(cè)鏈，其中的氨基酸優(yōu)選甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、結(jié)氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、絲氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸、半胱氨酸、組氨酸、天冬酰胺、絡(luò)氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、萘胺酸或精氨酸，進(jìn)一步優(yōu)選甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺或精氨酸，更優(yōu)選甘氨酸、丙氨酸或苯丙氨酸。本發(fā)明有選方案，一種通式(I)所示取代的氨基磷酸酯類衍生物、其立體異構(gòu)體或藥學(xué)上可以接受的鹽，其中R4選自H、甲?；1-4烷基、-(CH2)n-C5碳環(huán)、-(CH2)n-C6碳環(huán)、-(C＝O)-C1-4烷基、-(C＝O)-C5碳環(huán)或-(C＝O)-C6碳環(huán)，優(yōu)選H、甲基、苯基、芐基、甲?；⒁阴；虮郊柞；?，進(jìn)一步優(yōu)選H、芐基、甲酰基、乙?；虮郊柞；?。本發(fā)明優(yōu)選方案，一種通式(I)所示取代的氨基磷酸酯類衍生物，其立體異構(gòu)體或藥學(xué)上可以接受的鹽，其中該取代的氨基磷酸酯類衍生物選自通式(II)所示的化合物，其中：E選自-CH2CH(CH3)OCH2-或-CH2CH2OCH2-，優(yōu)選-CH2CH(CH3)OCH2-；R2選自甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺或精氨酸的側(cè)鏈，優(yōu)選甘氨酸、丙氨酸或苯丙氨酸的側(cè)鏈；R4選自H、甲基、苯基、芐基、甲?；?、乙?；虮郊柞；?，優(yōu)選H、芐基、甲?；⒁阴；虮郊柞；１景l(fā)明優(yōu)選方案，一種通式(II)所示取代的氨基磷酸酯類衍生物，其立體異構(gòu)體或藥學(xué)上可以接受的鹽，其中E選自-CH2CH(CH3)OCH2-；R2選自甘氨酸、丙氨酸或苯丙氨酸的側(cè)鏈；R4選自H、芐基、甲?；?、乙?；虮郊柞；?。本發(fā)明優(yōu)選方案，一種通式(I)所示取代的氨基磷酸酯類衍生物，其立體異構(gòu)體或藥學(xué)上可以接受的鹽，其中該取代的氨基磷酸酯類衍生物選自通式(III)所示的化合物，其中：本發(fā)明優(yōu)選方案，一種通式(III)所示取代的氨基磷酸酯類衍生物，其立體異構(gòu)體或藥學(xué)上可以接受的鹽，其中R2選自甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺或精氨酸的側(cè)鏈，優(yōu)選甘氨酸、丙氨酸或苯丙氨酸的側(cè)鏈；R4選自H、甲基、苯基、芐基、甲?；⒁阴；虮郊柞；?，優(yōu)選H、芐基、甲酰基、乙酰基或苯甲?；M(jìn)一步優(yōu)選H。根據(jù)權(quán)利要求1所述取代的氨基磷酸酯類衍生物，其立體異構(gòu)體或藥學(xué)上可以接受的鹽，其中該取代的氨基磷酸酯類衍生物為：本發(fā)明還提供一種藥物組合物，所述藥物組合物含有治療有效劑量的本發(fā)明所述的取代的氨基磷酸酯類衍生物，及其立體異構(gòu)體或藥學(xué)上可以接受的鹽，以及藥學(xué)上可接受的載體或者賦形劑。進(jìn)一步，本發(fā)明還提供了本發(fā)明的取代的氨基磷酸酯類衍生物，其立體異構(gòu)體或其藥學(xué)上可以接受的鹽在制備治療病毒感染性疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)選方案，其中所述病毒感染性疾病包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和HIV病毒引起的感染性疾病。進(jìn)一步，本發(fā)明還提供了一種治療病毒感染性疾病的方法，其中所述方法包括給藥本發(fā)明所述的取代的氨基磷酸酯類衍生物、其立體異構(gòu)體或其藥學(xué)上可以接受的鹽或本發(fā)明所述的藥物組合物。本發(fā)明的優(yōu)選方案，其中所述病毒感染性疾病包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和HIV病毒引起的感染性疾病。除非有相反的陳述，在說明書和權(quán)利要求書中使用的術(shù)語具有下述含義。本發(fā)明涉及到被多個取代基取代時，各取代基可以相同或不相同。本發(fā)明涉及到含有多個雜原子時，各雜原子可以相同或不相同。本發(fā)明所述基團(tuán)和化合物中所涉及的元素碳、氫、氧、硫、氮或鹵素均包括它們的同位素情況，及本發(fā)明所述基團(tuán)和化合物中所涉及的元素碳、氫、氧、硫或氮任選進(jìn)一步被一個或多個它們對應(yīng)的同位素所替代，其中碳的同位素包括12C、13C和14C，氫的同位素包括氕(H)、氘(D，又叫重氫)、氚(T，又叫超重氫)，氧的同位素包括16O、17O和18O，硫的同位素包括32S、33S、34S和36S，氮的同位素包括14N和15N，氟的同位素19F，氯的同位素包括35Cl和37Cl，溴的同位素包括79Br和81Br。術(shù)語“烷基”是指飽和的脂肪族烴基團(tuán)，包括1至20個碳原子的直鏈和支鏈基團(tuán)。優(yōu)選含有1至10個碳原子的烷基，非限制性實施例包括，甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、正戊基、正壬基，及其各種支鏈異構(gòu)體等；更優(yōu)選的是含有1至4個碳原子的低級烷基，非限制性實施例包括甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、異丁基或叔丁基等。烷基可以是取代的或未取代的，當(dāng)被取代時，取代基優(yōu)選為1至5個，獨立地選自H、F、Cl、Br、I、＝O、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、巰基、羥基、硝基、氰基、氨基、烷基酰基氨基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、環(huán)烷氧基、雜環(huán)烷氧基、環(huán)烷基巰基、羥基烷基、羧酸、羧酸酯或雜環(huán)烷巰基?！巴檠趸笔侵?O-烷基，其中烷基如本文上面所定義。烷氧基可以是取代的或未取代的，其非限制性實施例包括，甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、戊氧基或己氧基，優(yōu)選具有1至12元烷氧基。當(dāng)被取代時，取代基優(yōu)選為1至5個，獨立地選自H、F、Cl、Br、I、＝O、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、巰基、羥基、硝基、氰基、氨基、烷基酰基氨基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、環(huán)烷氧基、雜環(huán)烷氧基、環(huán)烷基巰基、羥基烷基、羧酸、羧酸酯或雜環(huán)烷基巰基?！疤辑h(huán)”是指飽和或者不飽和的芳香環(huán)或者非芳香環(huán)，芳香環(huán)或者非芳香可以是3至8元的單環(huán)，4至12元雙環(huán)或者10至15元三環(huán)系統(tǒng)，碳環(huán)可以連接有橋環(huán)或者螺環(huán)，非限制性實施例包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)己烯基、環(huán)庚基、環(huán)戊烯、環(huán)己二烯、環(huán)庚三烯、苯基、萘基、苯并環(huán)戊基、二環(huán)[3.2.1]辛烷基、二環(huán)[5.2.0]壬烷基、三環(huán)[5.3.1.1]十二烷基、金剛烷基或螺[3.3]庚烷基等。碳環(huán)可以被取代，當(dāng)被取代時，取代基優(yōu)選為1至5個，獨立地選自H、F、Cl、Br、I、＝O、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷巰基、烷基氨基、巰基、羥基、硝基、氰基、氨基、烷基酰基氨基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、環(huán)烷氧基、雜環(huán)烷氧基、環(huán)烷基巰基、羥基烷基、羧酸、羧酸酯或雜環(huán)烷基巰基。“雜環(huán)”是指取代的或未取代的飽和或者不飽和的芳香環(huán)或非芳香環(huán)，芳香環(huán)和非芳香環(huán)可以是3至8元的單環(huán)，4至12元雙環(huán)或者10至15元三環(huán)系統(tǒng)，且由至少一個選自N、O或S的雜原子組成，優(yōu)選3至10元雜環(huán)，雜環(huán)的環(huán)中選擇性取代的N、S可被氧化成各種氧化態(tài)。雜環(huán)可以連接在雜原子或者碳原子上。雜環(huán)可以連接有橋環(huán)或者螺環(huán)，非限制性實施例包括，環(huán)氧乙烷、氮雜環(huán)丙基、氧雜環(huán)丁基、氮雜環(huán)丁基、1，3-二氧戊環(huán)、1，4-二氧戊環(huán)、1，3-二氧六環(huán)、氮雜環(huán)庚基、吡啶基、呋喃基、噻吩基、吡喃基、N-烷基吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、噠嗪基、咪唑基、哌啶基、哌?；?、嗎啉基、硫代嗎啉基、1，3-二噻烷、二氫呋喃、二氫吡喃、二噻戊環(huán)、四氫呋喃、四氫吡咯基、四氫咪唑、四氫噻唑、四氫吡喃、苯并咪唑、苯并吡啶、吡咯并吡啶、苯并二氫呋喃、氮雜二環(huán)[3.2.1]辛烷基、氮雜二環(huán)[5.2.0]壬烷基、氧雜三環(huán)[5.3.1.1]十二烷基、氮雜金剛烷基、氧雜螺[3.3]庚烷基等；當(dāng)被取代時，取代基優(yōu)選為1至5個，取代基獨立地選自H、F、Cl、Br、I、＝O、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、巰基、羥基、硝基、氰基、氨基、烷基?；被?、雜環(huán)烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、環(huán)烷氧基、雜環(huán)烷氧基、環(huán)烷基巰基、羥基烷基、羧酸、羧酸酯、雜環(huán)烷基巰基、-(CH2)nS(＝O)pR6、-(CH2)n-烯基-R6或-(CH2)n-炔基-R6。“氨基”是指-NH2，可以是取代的或未取代的，當(dāng)被取代時，取代基優(yōu)選為1至3個，獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、羥基、氨基、烷基氨基、烷基?；被?、雜環(huán)烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、環(huán)烷氧基、雜環(huán)烷氧基、羥基烷基、羧酸或羧酸酯?！胺蓟笔侵溉〈幕蛭慈〈?至14元全碳單環(huán)或稠和多環(huán)基團(tuán)，具有共軛的π電子體系的多環(huán)基團(tuán)，優(yōu)選6至10元芳香環(huán)，其非限定性實例包括苯基或萘基；所述芳基可以稠和與雜芳基、雜環(huán)基或環(huán)烷基，且與母體結(jié)構(gòu)連接的部分為芳基，其非限定性實例包括苯并呋喃、苯并環(huán)戊烷基或苯并噻唑等。當(dāng)被取代時，取代基優(yōu)選為1至5個，取代基獨立地選自H、F、Cl、Br、I、＝O、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、巰基、羥基、硝基、氰基、氨基、烷基?；被?、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、環(huán)烷氧基、雜環(huán)烷氧基、環(huán)烷基巰基、羥基烷基、羧酸、羧酸酯或雜環(huán)烷基巰基?！半s芳基”是指取代或未取代的5至15元芳香環(huán)，且含有1至3個選自N、O或S雜原子，優(yōu)選5至10元芳香環(huán)，雜芳基的非限制性實施例包括吡啶基、呋喃基、噻吩基、N-烷基吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、噠嗪基、咪唑基、苯并呋喃、苯并咪唑、苯并吡啶或吡咯并吡啶等。當(dāng)被取代時，取代基優(yōu)選為1至5個，取代基獨立地選自H、F、Cl、Br、I、＝O、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、巰基、羥基、硝基、氰基、氨基、烷基酰基氨基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、環(huán)烷氧基、雜環(huán)烷氧基、環(huán)烷基巰基、羥基烷基、羧酸、羧酸酯或雜環(huán)烷基巰基?！疤烊换蚩伤幱冒被帷保旱鞍踪|(zhì)分子的基本骨架是氨基酸序列，組成蛋白質(zhì)的基本氨基酸有20種，這20種基本氨基酸是生物進(jìn)行蛋白后期修飾的基礎(chǔ)，此外，在這些基本氨基酸的基礎(chǔ)上，生物還會合成羥脯氨酸、羥賴氨酸等衍生出來的氨基酸類型，這些由生物合成的氨基酸統(tǒng)稱為“天然氨基酸”；用人工方法合成的就是“非天然氨基酸”?！翱伤幱冒被帷笔侵冈谒帉W(xué)上可接受的天然或非天然氨基酸。本發(fā)明的“＝O”為本領(lǐng)域通常習(xí)慣用法，是指以雙鍵相連的氧原子，譬如羰基中與碳原子相連的雙鍵氧原子?！八帉W(xué)上可接受的鹽”是指藥學(xué)上可接受的無毒酸或堿的鹽，包括無機(jī)酸和堿、有機(jī)酸和堿的鹽?！肮簿А笔侵富钚运幬锍煞?activepharmaceuticalingredient，API)和共晶形成物(cocrystalformer，CCF)在氫鍵或其他非共價鍵的作用下結(jié)合而成的晶體，其中API和CCF的純態(tài)在室溫下均為固體，并且各組分間存在固定的化學(xué)計量比。共晶是一種多組分晶體，既包含兩種中性固體之間形成的二元共晶，也包含中性固體與鹽或溶劑化物形成的多元共晶。所述“共晶形成物”包括但不限于各種藥學(xué)上可接受的酸、堿、非離子化合物，“立體異構(gòu)體”是指由分子中原子在空間上排列方式不同所產(chǎn)生的異構(gòu)體，包括順反異構(gòu)體、對映異構(gòu)體和構(gòu)象異構(gòu)體。“藥物組合物”表示一種或多種文本所述化合物或其生理學(xué)/藥學(xué)上可接受的鹽或前體藥物與其它化學(xué)組分的混合物，其它組分例如生理學(xué)/藥學(xué)上可接受的載體和賦形劑。藥物組合物的目的是促進(jìn)化合物對生物體的給藥?！扒八帯笔侵缚梢栽谏項l件下或者通過溶劑解轉(zhuǎn)化為具有生物活性的本發(fā)明化合物。本發(fā)明的前藥通過修飾在該化合物中的功能基團(tuán)來制備，該修飾可以按常規(guī)的操作或者在體內(nèi)被除去，而得到母體化合物。前藥包括本發(fā)明化合物中的一個羥基、氨基或者巰基連接到任何基團(tuán)上所形成的化合物，當(dāng)本發(fā)明化合物的前藥被施予哺乳動物個體時，前藥被割裂而分別形成游離的羥基、游離的氨基或者游離的疏基。前藥的例子包括但不限于，本發(fā)明化合物中的羥基或氨基功能基團(tuán)與甲酸、乙酸或苯甲酸所形成的化合物?！迦芜x″、″任選的″或″任選地″意味著隨后所描述地事件或環(huán)境可以但不必發(fā)生，包括該事件或環(huán)境發(fā)生或不發(fā)生的場合。例如，“芳基任選被烷基取代”意味著烷基可以但不必須存在，該說明包括芳基被烷基取代的情形和芳基不被烷基取代的情形?！叭〈蛭慈〈摹笔侵富鶊F(tuán)可以被取代或不被取代的情形，若在本發(fā)明中沒有指出基團(tuán)可以被取代，則表示該基團(tuán)為未取代的情形?！白鳛檫x擇”是指“作為選擇”之后的方案與“作為選擇”之前的方案為并列關(guān)系，而不是在前方案中的進(jìn)一步選擇情形。“取代”是指基團(tuán)中一個或多個氫原子被其它基團(tuán)取代的情形，如果所述的基團(tuán)被氫原子取代，形成的基團(tuán)與被氫原子取代的基團(tuán)相同?；鶊F(tuán)被取代的情形，例如氨基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、C3-6碳環(huán)、3至6元雜環(huán)任選進(jìn)一步被0至4個選自H、F、Cl、Br、I、羥基、氰基、氨基、C1-4烷基或C1-4烷氧基的取代基所取代，形成的基團(tuán)包括但不限于甲基、氯甲基、三氯甲基、羥基甲基、-CH2OCH3、-CH2SH、-CH2CH2CN、-CH2NH2、-NHOH、-NHCH3、-OCH2Cl、-OCH2OCH2CH3、-OCH2CH2NH2、-OCH2CH2SH、-OCH2CH2OH、1-羥基環(huán)丙基、2-羥基環(huán)丙基、2-氨基環(huán)丙基、4-甲基呋喃基、2-羥基苯基、4-氨基苯基或苯基。本發(fā)明具體合成方法當(dāng)R4不為H時：堿性條件下，化合物I-A和化合物I-B反應(yīng)后，再加入化合物I-C，反應(yīng)完畢后得到化合物I；當(dāng)R4為H時：堿性條件下，化合物I-A和化合物I-B反應(yīng)后，再加入化合物I-C，反應(yīng)完畢后，再通過常用脫除保護(hù)基的方法脫除R5基團(tuán)得到化合物I。其中R1、R2、R4的定義與通式I所述的定義一致；R5選自C1-4烷基、-(CH2)n-C3-6碳環(huán)、-(C＝O)-C1-4烷基或-(C＝O)-C3-6碳環(huán)；n選自0、1或2。具體實施方式以下結(jié)合附圖及實施例詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明的保護(hù)范圍包括但是不限于此。化合物的結(jié)構(gòu)是通過核磁共振(NMR)或(和)質(zhì)譜(MS)來確定的。NMR位移(δ)以10-6(ppm)的單位給出。NMR的測定是用(BrukerAvanceIII400和BrukerAvance300)核磁儀，測定溶劑為氘代二甲基亞砜(DMSO-d6)，氘代氯仿(CDCl3)，氘代甲醇(CD3OD)，內(nèi)標(biāo)為四甲基硅烷(TMS)。MS的測定用(Agilent6120B(ESI)和Agilent6120B(APCI))。HPLC的測定使用安捷倫1260DAD高壓液相色譜儀(ZorbaxSB-C18100×4.6mm)。薄層層析硅膠板使用煙臺黃海HSGF254或青島GF254硅膠板，薄層色譜法(TLC)使用的硅膠板采用的規(guī)格是0.15mm～0.20mm，薄層層析分離純化產(chǎn)品采用的規(guī)格是0.4mm～0.5mm。柱層析一般使用煙臺黃海硅膠200～300目硅膠為載體。本發(fā)明的己知的起始原料可以采用或按照本領(lǐng)域已知的方法來合成，或可購買于泰坦科技、安耐吉化學(xué)、上海德默、成都科龍化工、韶遠(yuǎn)化學(xué)科技、百靈威科技等公司。氮氣氛是指反應(yīng)瓶連接一個約1L容積的氮氣氣球。氫氣氛是指反應(yīng)瓶連接一個約1L容積的氫氣氣球。氫化反應(yīng)通常抽真空，充入氫氣，反復(fù)操作3次。實施例中無特殊說明，反應(yīng)在氮氣氛下進(jìn)行。實施例中無特殊說明，溶液是指水溶液。實施例中無特殊說明，反應(yīng)的溫度為室溫。室溫為最適宜的反應(yīng)溫度，為20℃～30℃。中間體16-氨基-9-[(2R)-2-(二氯磷酰基甲氧基)丙基]嘌呤(中間體1)9-[(2R)-2-(dichlorophosphorylmethoxy)propyl]purin-6-amine第一步：6-氨基-9-[(2R)-2-(二氯磷?；籽趸?丙基]嘌呤(中間體1)9-[(2R)-2-(dichlorophosphorylmethoxy)propyl]purin-6-amine將[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基乙氧基]甲基]磷酸(20g，0.07mmol)溶于乙腈(300mL)中，加入氯化亞砜(50g，0.42mmol)，升溫至回流反應(yīng)3小時。將反應(yīng)液冷卻至常溫，濃縮得到標(biāo)題化合物6-氨基-9-[(2R)-2-(二氯磷?；籽趸?丙基]嘌呤(中間體1)，黃色固體(22.7g，產(chǎn)率100％)。實施例1[(1S)-1-(4-氟苯基)-3-((2S，3R)-1-(4-氟苯基)-2-(4-羥基苯基)-4-氧代-氮雜環(huán)丁烷-3-基)]丙酯-(2S)-2-[[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基乙氧基]甲基苯氧基]磷酰基]氨基]丙酸[(1S)-1-(4-fluorophenyl)-3-((2S，3R)-1-(4-fluorophenyl)-2-(4-hydroxyphenyl)-4-oxo-azetidin-3-yl)]propyl-(2S)-2-[[[(1R)-2-(6-aminopurin-9-yl)-1-methylethoxy]methylphenoxy]phosphory]amino]propanoate第一步：(1S)-1-(4-氟苯基)-3-((2S，3R)-1-(4-氟苯基)-2-(4-芐氧基苯基)-4-氧代-氮雜環(huán)丁烷-3-基)正丙醇(1B)(1S)-1-(4-fluorophenyl)-3-((2S，3R)-1-(4-fluorophenyl)-2-(4-Benzyloxyphenyl)-4-oxo-azetidin-3-yl)propan-1-ol將(1S)-1-(4-氟苯基)-3-((2S，3R)-1-(4-氟苯基)-2-(4-羥基苯基)-4-氧代-氮雜環(huán)丁烷-3-基)正丙醇(1A)(20g，0.0488mmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(20mL)中，加入芐溴(41.7g，0.2442mmol)和碳酸銫(27g，0.0823mmol)，維持常溫反應(yīng)3小時。向反應(yīng)液中加入水(500mL)，用乙酸乙酯(300mL)萃取，合并有機(jī)相，有機(jī)相用飽和食鹽水(300mL×2)洗滌，無水硫酸鈉干燥，濃縮，殘留物用石油醚洗滌后得到標(biāo)題化合物(1S)-1-(4-氟苯基)-3-((2S，3R)-1-(4-氟苯基)-2-(4-芐氧基苯基)-4-氧代-氮雜環(huán)丁烷-3-基)正丙醇(1B)，白色固體(24g，產(chǎn)率99％)。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ7.43-7.21(m，11H)，7.04-6.89(m，6H)，5.05(s，2H)，4.71(t，1H)，4.57(d，1H)，3.09-3.06(m，1H)，2.04-1.83(m，4H)。第二步：[(1S)-1-(4-氟苯基)-3-((2S，3R)-1-(4-氟苯基)-2-(4-芐氧基苯基)-4-氧代-氮雜環(huán)丁烷-3-基))丙酯-(2S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)丙酸-(1C)[(1S)-1-(4-fluorophenyl)-3-((2S，3R)-1-(4-fluorophenyl)-2-(4-Benzyloxyphenyl)-4-oxo-azetidin-3-yl)]propyl-(2S)-2-(tert-butoxycarboxylamino)propanoate將(1S)-1-(4-氟苯基)-3-((2S，3R)-1-(4-氟苯基)-2-(4-芐氧基苯基)-4-氧代-氮雜環(huán)丁烷-3-基)正丙醇(1B)(12g，24mmol)溶于二氯甲烷(200mL)中，加入(2S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)丙酸(4.5g，24mmol)，在氮氣氛圍下，滴加二環(huán)己基碳二亞胺(4.9g，24mmol)的二氯甲烷(50mL)溶液和4-二甲氨基吡啶(2g，24mmol)的二氯甲烷(50mL)溶液，反應(yīng)過夜。將反應(yīng)液墊硅藻土過濾，濾液用飽和食鹽水洗滌(200mL)，無水硫酸鈉干燥，濃縮，殘留物用硅膠柱色譜分離提純(乙酸乙酯∶石油醚(v/v)＝0∶1～1∶9)得到標(biāo)題化合物[(1S)-1-(4-氟苯基)-3-((2S，3R)-1-(4-氟苯基)-2-(4-芐氧基苯基)-4-氧代-氮雜環(huán)丁烷-3-基))丙酯-(2S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)丙酸(1C)，白色固體(11g，69％)。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ7.45-7.31(m，5H)，7.29-7.19(m，6H)，7.04-6.95(m，4H)，6.95-6.89(m，2H)，5.73(t，1H)，5.05(s，2H)，4.95(d，1H)，4.55(d，1H)，4.32(m，1H)，3.03(m，1H)，2.11-2.00(m，2H)，1.98-1.77(m，2H)，1.42(s，9H)，1.29(d，3H)。第三步：[(1S)-1-(4-氟苯基)-3-((2S，3R)-1-(4-氟苯基)-2-(4-芐氧基苯基)-4-氧代-氮雜環(huán)丁烷-3-基)]丙酯-(2S)-2-氨基丙酸-(1D)[(1S)-1-(4-fluorophenyl)-3-((2S，3R)-1-(4-fluorophenyl)-2-(4-Benzyloxyphenyl)-4-oxo-azetidin-3-yl)]propyl-(2S)-2-aminopropanoate將[(1S)-1-(4-氟苯基)-3-((2S，3R)-1-(4-氟苯基)-2-(4-芐氧基苯基)-4-氧代-氮雜環(huán)丁烷-3-基))丙酯-(2S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)丙酸(1C)(11g，16.4mmol)溶于二氯甲烷(50mL)中，冷卻至0℃，加入三氟乙酸(18.7g，164mmol)，升溫至常溫反應(yīng)1小時。將反應(yīng)液冷卻至0℃，加入水(100mL)和二氯甲烷(100mL)，用氨水調(diào)節(jié)溶液pH＞8，分液，有機(jī)層用飽和食鹽水(100mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥，濃縮得到標(biāo)題化合物[(1S)-1-(4-氟苯基)-3-((2S，3R)-1-(4-氟苯基)-2-(4-芐氧基苯基)-4-氧代-氮雜環(huán)丁烷-3-基)]丙酯-(2S)-2-氨基丙酸(1D)，淺黃色油狀物(9g，產(chǎn)率91％)。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ7.45-7.31(m，5H)，7.30-7.17(m，6H)，7.05-6.95(m，4H)，6.95-6.88(m，2H)，5.71(t，1H)，5.05(s，2H)，4.54(d，1H)，3.59(q，1H)，3.06(m，1H)，2.09-2.02(m，2H)，1.89-1.79(m，2H)，1.29(d，3H)。第四步：[(1S)-1-(4-氟苯基)-3-((2S，3R)-1-(4-氟苯基)-2-(4-芐氧基苯基)-4-氧代-氮雜環(huán)丁烷-3-基)]丙酯-(2S)-2-[[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基乙氧基]甲基苯氧基]磷?；鵠氨基]丙酸-(1E)[(1S)-1-(4-fluorophenyl)-3-((2S，3R)-1-(4-fluorophenyl)-2-(4-Benzyloxyphenyl)-4-oxo-azetidin-3-yl)]propyl-(2S)-2-[[[(1R)-2-(6-aminopurin-9-yl)-1-methylethoxy]methylphenoxy]phosphory]amino]propanoate將6-氨基-9-[(2R)-2-(二氯磷酰基甲氧基)丙基]嘌呤(中間體1)(15.3g，0.0474mmol)溶于二氯甲烷中，冷卻至-40～-30℃，滴加[(1S)-1-(4-氟苯基)-3-((2S，3R)-1-(4-氟苯基)-2-(4-芐氧基苯基)-4-氧代-氮雜環(huán)丁烷-3-基)]丙酯-(2S)-2-氨基丙酸(1D)(9g，0.0158mmol)的三乙胺(12.8g，0.126mmol)/二氯甲烷(80mL)溶液，薄板層析檢測至[(1S)-1-(4-氟苯基)-3-((2S，3R)-1-(4-氟苯基)-2-(4-芐氧基苯基)-4-氧代-氮雜環(huán)丁烷-3-基)]丙酯-(2S)-2-氨基丙酸反應(yīng)完畢，滴加苯酚(8.9g，0.094mmol)的二氯甲烷(50mL)溶液，升溫至常溫反應(yīng)1小時。向反應(yīng)液中加入水(20mL)，分液，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，濃縮，殘留物用硅膠柱色譜分離提純(甲醇∶二氯甲烷(v/v)＝0∶1～1∶19)得到標(biāo)題化合物[(1S)-1-(4-氟苯基)-3-((2S，3R)-1-(4-氟苯基)-2-(4-芐氧基苯基)-4-氧代-氮雜環(huán)丁烷-3-基)]丙酯-(2S)-2-[[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基乙氧基]甲基苯氧基]磷酰基]氨基]丙酸(1E)，淺黃色固體(9g，產(chǎn)率62％)。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ8.30(d，1H)，7.94(d，1H)，7.46-7.30(m，5H)，7.29-7.17(m，8H)，7.10(m，2H)，7.02-6.88(m，7H)，5.88(s，2H)，5.74-5.63(m，1H)，5.06(s，2H)，4.52(dd，1H)，4.42-4.27(m，1H)，4.20-4.05(m，2H)，3.97-3.80(m，2H)，3.71-3.55(m，2H)，3.02(td，1H)，2.08-2.00(m，2H)，1.93-1.75(m，2H)，1.26(d，3H)，1.15(m，3H)。MSM/Z(ESI)：915.5(M+1)。Ms：915.5(M+1)。第五步：[(1S)-1-(4-氟苯基)-3-((2S，3R)-1-(4-氟苯基)-2-(4-羥基苯基)-4-氧代-氮雜環(huán)丁烷-3-基)]丙酯-(2S)-2-[[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基乙氧基]甲基苯氧基]磷?；鵠氨基]丙酸-(化合物1)[(1S)-1-(4-fluorophenyl)-3-((2S，3R)-1-(4-fluorophenyl)-2-(4-hydroxyphenyl)-4-oxo-azetidin-3-yl)]propyl-(2S)-2-[[[(1R)-2-(6-aminopurin-9-yl)-1-methylethoxy]methylphenoxy]phosphory]amino]propanoate將[(1S)-1-(4-氟苯基)-3-((2S，3R)-1-(4-氟苯基)-2-(4-芐氧基苯基)-4-氧代-氮雜環(huán)丁烷-3-基)]丙酯-(2S)-2-[[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基乙氧基]甲基苯氧基]磷?；鵠氨基]丙酸(1E)(4g，4.36mmol)溶于甲醇(50mL)中，加入乙酸(5mL)，和鈀碳(0.8g)，在氫氣氛圍下，常壓反應(yīng)2天。將反應(yīng)液用硅藻土過濾，濾餅用二氯甲烷洗滌，合并濾液，濃縮，殘留物用硅膠柱色譜分離提純(甲醇∶二氯甲烷(v/v)＝0∶1～1∶19)得到標(biāo)題化合物[(1S)-1-(4-氟苯基)-3-((2S，3R)-1-(4-氟苯基)-2-(4-羥基苯基)-4-氧代-氮雜環(huán)丁烷-3-基)]丙酯-(2S)-2-[[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基乙氧基]甲基苯氧基]磷?；鵠氨基]丙酸(化合物1)，白色固體(2g，產(chǎn)率55.5％)。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ8.30(d，1H)，7.99(d，1H)，7.25-7.13(m，6H)，7.07(m，4H)，6.97(m，3H)，6.87(m，4H)，6.06(s，2H)，5.65(q，1H)，4.49(m，1H)，4.44-4.27(m，1H)，4.18-3.99(m，2H)，3.90-3.65(m，3H)，3.65-3.56(m，1H)，3.03-2.90(m，1H)，1.98(m，2H)，1.83-1.69(m，2H)，1.22(m，3H)，1.15(m，3H)。MSM/Z(ESI)：825.6(M+1)。實施例2化合物1的拆分取[(1S)-1-(4-氟苯基)-3-((2S，3R)-1-(4-氟苯基)-2-(4-羥基苯基)-4-氧代-氮雜環(huán)丁烷-3-基)]丙酯-(2S)-2-[[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基乙氧基]甲基苯氧基]磷?；鵠氨基]丙酸(化合物1)(800mg)用于拆分。制備條件：儀器：Thar80preparativeSFC；柱：ChiralPakAS-20u，250×50mmI.D.；流動相：A：CO2，B：甲醇；梯度：B35％；流量：70mL/min；背壓：100bar；柱溫：38℃；波長：220nm；周期：12min；樣品制備：化合物1溶解于甲醇中制得15mg/ml；注射：1.5ml/針。分離后，將餾分，在40℃下，經(jīng)由旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮、干燥，得到兩個光學(xué)異構(gòu)體化合物2-1(360mg)，化合物2-2(300mg)。化合物2-11HNMR(400MHz，CDCl3)δ8.33(s，1H)，8.05(s，1H)，7.22(m，4H)，7.14(m，4H)，7.07(m，1H)，7.04-6.96(m，4H)，6.94-6.85(m，4H)，6.23(s，2H)，5.65(t，1H)，4.52(d，1H)，4.36(dd，1H)，4.16-3.97(m，2H)，3.90(dd，2H)，3.67(t，1H)，3.60(dd，1H)，2.99-2.90(m，1H)，1.97-1.83(m，2H)，1.82-1.69(m，2H)，1.24(d，3H)，1.18(d，3H)。MSM/Z(ESI)：826.2(M+1)。31PNMR(CDCl3)δ22.75?；衔?-21HNMR(400MHz，CDCl3)δ8.29(s，1H)，8.02(s，1H)，7.30-7.22(m，3H)，7.19(m，4H)，7.10(m，4H)，6.97(t，2H)，6.87(dd，4H)，6.11(s，2H)，5.64(t，1H)，4.48(d，1H)，4.41(dd，1H)，4.17-4.03(m，2H)，3.95-3.88(m，2H)，3.68-3.56(m，2H)，2.98(m，1H)，2.02-1.93(m，2H)，1.80-1.74(m，2H)，1.19(d，3H)，1.13(d，3H)。MSM/Z(ESI)：826.2(M+1)。31PNMR(CDCl3)δ23.77。測試?yán)郎y試?yán)?、抗乙型肝炎病毒活性篩選用HepG2.2.15細(xì)胞測定化合物的抗乙肝病毒活性。使用的材料與儀器如下：HepG2.2.15細(xì)胞，RPMI1640培養(yǎng)液，胎牛血清，96孔板，DMSO，QIAamp96DNABloodKit，Cell-titerblue，酶標(biāo)儀，AppliedBiosystems7900real-timePCRsystem。用DMSO將各化合物溶解至20mM，-20℃貯存，將各化合物的20mM貯存液用DMSO3倍梯度稀釋，共9個濃度。再用含2.0％FBS的RPMI1640培養(yǎng)液稀釋200倍。化合物的最高測試終濃度為100μM。實驗步驟參照QIAamp96DNABloodKit(QIAGEN51161)說明書，qPCR法測定化合物抗乙肝病毒活性并計算EC50(半數(shù)有效抑制濃度)。分析數(shù)據(jù)和計算抑制百分比：應(yīng)用如下公式計算抑制百分比：抑制率(％)＝(DMSO對照組的HBV總量-受試樣品組的HBV總量)/DMSO對照組的HBV總量×100。最后使用GraphPadPrism軟件計算化合物的EC50值。Cell-titerblue法測定化合物的細(xì)胞毒性并計算CC50(致50％細(xì)胞毒性濃度)。分析數(shù)據(jù)和計算相對細(xì)胞活力：應(yīng)用如下公式計算細(xì)胞活性百分比：細(xì)胞生存率(％)＝(受試樣品的熒光數(shù)值-背景熒光數(shù)值)/(DMSO對照組的熒光數(shù)值-背景熒光數(shù)值)×100。最后使用GraphPadPrism軟件計算化合物的CC50值。結(jié)果如下表所示：表1：各化合物EC50值及CC50值序號化合物編號EC50(nM)CC50(μM)1化合物2-185.95＞11.12化合物2-248.31＞11.1結(jié)論：測試化合物均表現(xiàn)出了較好的抗乙肝病毒活性，在測試的濃度范圍內(nèi)(0.0152-100μM)沒有表現(xiàn)出細(xì)胞毒性。測試?yán)?、藥代動力學(xué)評價比格犬(購自成都達(dá)碩生物科技有限公司，許可證編號SCXK(川)2013-24)8-12kg，禁食過夜。實驗當(dāng)天，3只比格犬靜脈給予2-1(2-2不溶無法靜脈給藥)，于給藥前及給藥后5，15，30min，1，2，4，8，12和24h，由前肢頭靜脈采血1.0mL(肝素抗凝)，收集血漿。洗脫一周后，6只比格犬分別灌胃給予受試化合物2-1和2-2，于給藥前及給藥后5，15，30min，1，2，4，8，12和24h，由前肢頭靜脈采血1.0mL(肝素抗凝)，收集血漿。在30μL血漿中加入150μL乙腈(內(nèi)含維拉帕米，5.0ng·mL-1and格列本脲，50.0ng·mL-1)，漩渦混合10min，3700rpm離心18min。取上清70μL，加入70μL水，漩渦混合10min后，取10μL進(jìn)行LC-MS/MS檢測。采用PharsightPhoenix6.3中的非房室模型計算藥代動力學(xué)參數(shù)。實驗結(jié)果如表2所示。表2：犬藥代動力學(xué)評價結(jié)果結(jié)論：實驗結(jié)果顯示本發(fā)明化合物2-1在犬血漿中有較高的暴露量，而較低的PMPA的暴露量，因此本發(fā)明化合物2-1具有良好的血漿穩(wěn)定性；結(jié)合上述測試?yán)?的測試結(jié)果可以預(yù)測，本發(fā)明化合物具有良好的抗乙肝病毒潛力的同時，也具有顯著的降低血漿中代謝產(chǎn)生PMPA所產(chǎn)生的毒副作用效果。