本發(fā)明涉及一種通過抑制固醇代謝的方式使微藻內(nèi)三酰基甘油累積的方法。本發(fā)明還涉及一種用于生產(chǎn)脂肪酸、生物燃料、藥物組合物或化妝品組合物，和食品補充劑的方法，所述方法包括根據(jù)本發(fā)明的使微藻內(nèi)三酰基甘油累積的步驟。最后，本發(fā)明關(guān)注于固醇代謝的抑制劑在微生物，并且優(yōu)選微藻內(nèi)使甘油三酯累積的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：已知的是，用于營養(yǎng)目的的作物不能轉(zhuǎn)變成用于生產(chǎn)油籽的作物(Durrettetal.,ThePlantJournal(2008)54,593-607)。因此，努力在其它生物(如藻類)中進行油的生產(chǎn)(Chisti,BiotechnologyAdvances25(2007)294-306；Chisti,TrendsinBiotechnology,2008,Vol26,No.3；Dismukesetal.,CurrentOpinioninBiotechnology2008,19:235-240；Scottetal.,CurrentOpinioninBiotechnology2010,21:277-286；Singhetal.,BioresourceTechnology102(2011)26-34)。對藻類(下表1)中產(chǎn)生三酰基甘油(TAG，也被稱為油)所進行的研究聚焦于細胞內(nèi)液滴中TAG的增加。表1：一些藻類中的油含量(來自Chisti,BiotechnologyAdvances25(2007)294-306)在EPOBIO報告(Micro-andmacro-algae:utilityforindustrialapplication,September2007,Editor:DiannaBowles)中總結(jié)了微藻相對于陸地植物的優(yōu)點。在陸地上可耕種的植物(作物)和在開放池或密閉反應(yīng)器中生長的微藻均為生物燃料以及用于工業(yè)目的的TAG和脂肪酸的潛在來源(Dismukesetal.,CurrentOpinioninBiotechnology2008,19:235-240)。然而，密集農(nóng)業(yè)引起了密切的關(guān)注：作物應(yīng)用暗示了作物由食物鏈到非食物鏈的轉(zhuǎn)移。因此，需要努力開發(fā)新一代的基于光合微生物的生物燃料。在用于生產(chǎn)TAG的植物中，微藻具有如下的主要優(yōu)點：-該生物資源不與用于動物或人類營養(yǎng)的農(nóng)業(yè)資源競爭。-能夠在受控密閉的條件下，利用回收的人類其它活動產(chǎn)生的無機廢棄物和有機廢棄物，以環(huán)境友好的過程監(jiān)控海藻的生長；并且微藻能夠用于捕獲工業(yè)副產(chǎn)氣體(例如CO2)并將其轉(zhuǎn)化成有價值的有機分子(Chisti,BiotechnologyAdvances25(2007)294-306；Chisti,TrendsinBiotechnology,2008,Vol26,No.3；Chisti,JournalofBiotechnology167(2013)201-214)。-海藻生物質(zhì)產(chǎn)率高，當與陸地植物相比時，微藻顯示出在成本節(jié)約下，極高的產(chǎn)率趨勢(參見表2)。該產(chǎn)量是可變的并且取決于所采用的培養(yǎng)方法：其在開放池系統(tǒng)中是相對較低的；而在封閉光生物反應(yīng)器(能夠控制培養(yǎng)參數(shù))中，該產(chǎn)量顯著地提高。-該生物資源并不依賴于地理位置或季節(jié)。表2：主要作物(“C3”或“C4”型光合作用)和微藻(“EPOBIO計劃”報告的摘錄，紐約大學(09/2007)，表4)的生物質(zhì)產(chǎn)率的比較該生物工業(yè)部分的經(jīng)濟可行性受到如下挑戰(zhàn)：對總體生物質(zhì)產(chǎn)量(即，每升產(chǎn)生的海藻有機物質(zhì)的干重量)以及有價值分子的比例(即，每干重中TAG的足夠高的比例用于工業(yè)提取和處理)的組合的當下制約(Chisti,BiotechnologyAdvances25(2007)294-306；Chisti,TrendsinBiotechnology,2008,Vol26,No.3；Chisti,JournalofBiotechnology167(2013)201-214)。具體地，微藻的油脂組成適用于生物柴油的生產(chǎn)(Dismukesetal.,CurrentOpinioninBiotechnology2008,19:235-240；Scottetal.,CurrentOpinioninBiotechnology2010,21:277-286)。由微藻生產(chǎn)生物柴油的基本原理是利用陽光將水和二氧化碳轉(zhuǎn)化成生物質(zhì)。隨后通過施加外部刺激(如營養(yǎng)應(yīng)力)，和/或通過代謝的基因工程使該生物質(zhì)特異性地定向用于產(chǎn)生生物燃料的油的合成(DorvalCourchesneetal.,JournalofBiotechnology141(2009)31-41)。就豐度而言，三類最重要的微藻為硅藻(硅藻綱，Bacillariophyceae)，綠藻(綠藻綱，Chlorophyceae)以及金藻(金藻綱，Chrysophyceae)(EPOBIO定義)。硅藻為海洋、淡水和各種土壤生境中浮游植物多樣性的重要門類。它們占高達25％的地球初級生產(chǎn)力。對該群組的真核生物的研究受益于對殼縫羽紋硅藻(pennatediatom)的模型，三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)的研究。像其他微藻一樣，硅藻被認為是用于替代化石燃料的烴類或來自石油化學的化學品的合理替代來源，基于如下的假定，其具有中性CO2平衡的優(yōu)點：通過光合作用，CO2和水能夠有效地轉(zhuǎn)化成生物質(zhì)并且能夠控制碳代謝，從而它們使TAG累積極力豐富(energetically-rich)。已經(jīng)對囊泡藻界(Chromalevolata)總門(包括三角褐指藻Phaeodactylumtricornutum)的不同浮游生物進行關(guān)注，關(guān)注于它們累積TAG的能力，有希望在工業(yè)化工藝中實現(xiàn)其初始產(chǎn)率、合適的穩(wěn)定性以及物理性質(zhì)。三角褐指藻Phaeodactylumtricornutum目前用于工業(yè)生產(chǎn)ω-3多元不飽和脂肪酸，但是當利用常規(guī)營養(yǎng)物不足的方法(諸如氮缺乏)來引起TAG累積時，該應(yīng)用以及其他應(yīng)用(諸如生物燃料)的工業(yè)實施仍然受限于生物質(zhì)的生長遲緩和低產(chǎn)率(Chisti,JournalofBiotechnology167(2013)201-214)。這些方法具有一重要的缺陷：氮缺乏導(dǎo)致了對生長的限制。三角褐指藻Phaeodactylumtricornutum顯示出用于工業(yè)實施的感興趣的性質(zhì)，如在沒有硅的存在下的生長能力或可用于收獲技術(shù)的細胞的沉降能力。可依賴于多種策略的組合對促進TAG累積進行嘗試，這些策略包括：刺激脂肪酸和TAG的生物合成，阻斷碳向替代代謝途徑轉(zhuǎn)移的路徑以及最終阻止TAG的分解代謝。小分子能夠在TAG代謝的三個方面中發(fā)揮作用。通過抑制或阻斷碳通量向替代代謝的代謝路徑，能夠促進微生物內(nèi)油的累積。例如，眾所周知的是，阻斷碳水化合物以存儲糖(諸如淀粉)形式的累積促進油的累積(Siautetal.,BMCBiotechnology2011,11:7)。然而，仍然需要一種替代方法，該替代方法在藻類生長于富含氮的介質(zhì)中時，通過試圖避免阻斷碳水化合物儲存代謝來引起油的累積。事實上，在CO2光合轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生的碳水化合物用作細胞內(nèi)所有其他有機分子的碳源，從而阻斷它們的儲存對細胞生長具有非常嚴重的負面影響。也可阻斷利用碳的其它代謝路徑，并且能夠?qū)ο騎AG代謝的碳代謝進行重新導(dǎo)向。為此目的，本發(fā)明人現(xiàn)已確定固醇的代謝為碳的替代下降(sink)，在微藻內(nèi)對其進行抑制引起油的累積。技術(shù)實現(xiàn)要素：因此，本發(fā)明的第一主題是一種通過抑制固醇代謝，優(yōu)選通過抑制固醇的合成引起微藻內(nèi)TAG累積的方法，所述方法通過用固醇代謝的抑制劑孵育微藻克服了上文列出的缺點。在本發(fā)明的框架內(nèi)，術(shù)語“微藻”是指真核生物的微藻。此外，在本發(fā)明的語境下，TAG通過脂肪酸與甘油骨架上1位、2位和3位上3個碳的酯化反應(yīng)來得到。以下，通過3個脂肪酸(R1、R2、R3)與甘油骨架的酯化反應(yīng)來合成TAG。在本發(fā)明的語境下：烷基選自(C1-C26)烷基，優(yōu)選(C1-C18)烷基，并且更優(yōu)選(C1-C6)烷基，諸如，甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基和異丁基；烯基選自具有至少一個碳碳雙鍵且具有2至26個、優(yōu)選2至18個，并且更優(yōu)選1至6個碳原子的烴鏈。烯基的實例包括乙烯基、丙烯基、異丙烯基、2,4-戊二烯基；炔基選自具有至少一個碳碳三鍵且具有2至26個、優(yōu)選2至18個，并且更優(yōu)選1至6個碳原子的烴鏈；烷基烯基是指由如上所限定的烯基中，氫原子被烷基取代所衍生的任何基團；炔基烯基是指由如上所限定的炔基中，氫原子被烷基取代所衍生的任何基團；環(huán)烷基是指優(yōu)選3至7個環(huán)碳的單價環(huán)烴基。所述環(huán)烷基可具有一個或多個雙鍵，并且可任選地被取代。術(shù)語“環(huán)烷基”包括例如，環(huán)丙基、環(huán)己基、環(huán)己烯基等；雜烷基是指如上所限定的烷基中，該烷基的任意碳中的一個或多個氫原子被選自由N、O、P、B、S、Si、Sb、Al、Sn、As、Se和Ge所組成的組中的雜原子所替代。碳原子和雜原子之間的鍵可為單鍵或雙鍵。合適的雜烷基包括氰基、苯甲?；⒓籽趸?、乙酰胺、硼酸鹽/酯、砜、硫酸鹽/酯、硫化環(huán)戊烷(thiane)、磷酸鹽/酯、膦酸鹽/酯等；烷氧基選自(C1-C20)烷氧基，并且優(yōu)選(C1-C4)烷氧基，諸如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基和異丁氧基；芳基是指自至少一個簡單芳香環(huán)衍生的任何官能團或取代基；芳香環(huán)對應(yīng)于具有離域π體系的任何平面環(huán)狀化合物，其中，該環(huán)的每個原子包括p-軌道，所述p-軌道自身重疊。更具體地，術(shù)語“芳基”包括但并不限于，苯基、聯(lián)苯基、1-萘基、2-萘基、蒽基、芘基以及它們的被取代的形式；雜芳基是指自如上所限定的至少一個芳香環(huán)衍生的并且含有至少一個選自P、S、O和N的雜原子的任何官能團或取代基。術(shù)語“雜芳基”包括但不限于，呋喃、吡啶、吡咯、噻吩、咪唑、吡唑、噁唑、異噁唑、噻唑、異噻唑、四唑、吡唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、噠嗪、苯并呋喃、異苯并呋喃、吲哚、異吲哚、苯并噻吩、苯并[c]噻吩、苯并咪唑、吲唑、苯并噁唑、苯并異噁唑、苯并噻唑、喹啉、異喹啉、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、嘌呤和吖啶。本發(fā)明的芳基和雜芳基優(yōu)選包括1至12個碳原子，并且更優(yōu)選5或6個碳原子；芳基烷基是指由如上所限定的烷基中，氫原子被芳基或雜芳基所取代而衍生的任何基團；芳基烯基是指由如上所限定的烯基中，氫原子被芳基或雜芳基所取代而衍生的任何基團；芳基炔基是指由如上所限定的炔基中，氫原子被芳基或雜芳基所取代而衍生的任何基團；烷基芳基是指由如上所限定的烷基芳基中，氫原子被烷基所取代而衍生的任何基團。根據(jù)本發(fā)明，鹵原子選自溴、氯、氟和碘，并且優(yōu)選溴、氯和氟。根據(jù)本發(fā)明的固醇代謝抑制劑的酸加成鹽可例如選自鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽或硫酸氫鹽、磷酸鹽或磷酸氫鹽、乙酸鹽、苯甲酸鹽、琥珀酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、乳酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、葡糖酸鹽、甲磺酸鹽、苯磺酸鹽和對甲苯磺酸鹽。根據(jù)優(yōu)選的實施方式，在本發(fā)明的方法中，固醇代謝的抑制通過在含氮介質(zhì)中，利用固醇代謝的抑制劑孵育微藻來實現(xiàn)。上述固醇代謝的抑制劑的濃度可為1μM至1M，優(yōu)選5μM至20μM。孵育步驟持續(xù)優(yōu)選24小時至72小時。本發(fā)明的微藻有利地選自硅藻門、囊泡藻界門(Chromalveolataphylum)以及原始色素體生物門(Archaeplastidaephylum)的微藻，并且更有利地選自硅藻門和囊泡藻界門的微藻。優(yōu)選地，上述微藻選自硅藻微藻種的三角褐指藻Phaeodactylumtricornutum和假微型海鏈藻Thalassiosirapseudonana；囊泡藻界微藻種的微擬球藻Nannochloropsis，并且更優(yōu)選海洋富油微擬球藻Nannochloropsisgaditana、海洋微擬球藻Nannochloropsisoceanica、鹽生微擬球藻Nannochloropsissalina；以及原始色素體生物微藻種的衣藻Chlamydomonas，綠藻Ostreococcus，小球藻Chlorella。更優(yōu)選地，上述微藻選自硅藻微藻種的三角褐指藻Phaeodactylumtricornutum和假微型海鏈藻Thalassiosirapseudonana，以及囊泡藻界微藻種的微擬球藻Nannochloropsis，并且更優(yōu)選海洋富油微擬球藻Nannochloropsisgaditana、海洋微擬球藻Nannochloropsisoceanica、鹽生微擬球藻Nannochloropsissalina。固醇抑制劑由這樣的分子組成：該分子在固醇的生物合成中對任何的蛋白活性，對從生物合成HMG-CoA還原酶開始，隨后合成甲羥戊酸、環(huán)氧鯊烯以及衍生自環(huán)氧鯊烯的所有類固醇結(jié)構(gòu)的路徑(參見圖1)具有影響。基于已證明利用對檢測植物固醇是有效的膽固醇氧化酶/酯酶的處理(D.KritchevskyandS.A.Tepper,ClinicalChemistry,Vol.25,No.8,1464-1465(1979))，通過諸如CellBioLabs商業(yè)化的比色法和熒光劑量法(總固醇檢測分析試劑盒，比色法，參比STA-384或熒光方法，參照STA-390)能簡單地實現(xiàn)抑制固醇代謝(優(yōu)選使每細胞的總固醇含量降低20％)的化合物的鑒定；或者也可根據(jù)諸如在申請WO2010/046385和WO97/03202中所示例出的那些方法。根據(jù)本發(fā)明的實施方式，上述固醇代謝的抑制劑為式(I)的化合物或其鹽：其中：R41和R42相同或不同，表示氫原子、烷基、烯基、炔基、或羥基、-COR4a或-COOR4a基團，其中，R4a表示氫原子，可選地被獨立選自烷基或環(huán)烷基(優(yōu)選C4至C6環(huán)烷基)的一個或多個基團取代的直鏈或支鏈的烷基，可選地被獨立選自烷基或環(huán)烷基(優(yōu)選C4至C6環(huán)烷基)的一個或多個基團取代的芳基，可選地被獨立選自烷基或環(huán)烷基(優(yōu)選C4至C6環(huán)烷基)的一個或多個基團取代的雜芳基；或者R41和R42一起形成通過雙鍵連接的氧原子；R43表示氫原子或烷基，優(yōu)選C1至C3烷基；以及R44、R45和R46，相同或不同，表示氫原子、烷基、烷氧基、羥基或通過雙鍵連接的氧原子，所述烷基可選地被一個或多個鹵原子取代，并且在所述烷基的鏈中可選地包括一個或多個亞砜官能團。有利地，R41和R42，相同或不同，表示氫原子、腈基、羥基、C1-C2烷基或-COOR4a基團，其中，R4a為C1-C7且可選地被C4-C6環(huán)烷基取代；或者R41和R42一起形成通過雙鍵連接的氧原子。根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式，上述固醇代謝的抑制劑為式(II)的化合物或其鹽：其中：W3、X3、Y3和Z3表示碳原子、硫原子、氮原子或氧原子，并且優(yōu)選地，W3、X3、Y3和Z3表示碳原子；n3和n3'獨立地為等于0或1的整數(shù)，并且優(yōu)選地，n3和n3'等于1；R31和R32相同或不同，表示氫原子，直鏈或支鏈的烷基、烯基、炔基、烷基烯基、炔基烯基、環(huán)烷基、烷基芳基、芳基烷基(優(yōu)選芐基)、芳基烯基、芳基炔基、雜烷基、雜芳基；或者R31和R32一起形成包括5至6個碳原子的環(huán)烷基，所述環(huán)烷基的一個或兩個碳原子能夠被一個或兩個雜原子，優(yōu)選氮原子替代；或者R31或R32中的一個與R39一起形成5至6個碳原子的環(huán)烷基，所述環(huán)烷基的一個或兩個碳原子能夠被一個或兩個雜原子，優(yōu)選氧原子替代，所述R31或R32可選地被獨立選自以下基團的一個或多個基團取代：直鏈或支鏈的烷基，環(huán)烷基、諸如炔基(所述炔基優(yōu)選地為C5至C12的支鏈炔基)，芳基烷基，芳基，雜芳基，羥基，鹵素，硝基，-COR3a基團或-NR3aR3b基團，其中，R3a和R3b相同或不同，表示氫原子或直鏈或支鏈的烷基鏈；R33表示氫原子；直鏈或支鏈的烷基鏈，諸如C1至C3烷基，或者腈基，并且，優(yōu)選地R33表示氫原子；R34、R35、R36、R37、R38和R39，相同或不同，表示，氫原子或鹵原子，或者羥基，并且優(yōu)選地，R34、R35、R36、R37、R38和R39為氫原子。式(II)的虛線表示單鍵或雙鍵。具體地，當W3-X3鍵中的W3或X3中之一或者Y3-Z3鍵中的Y3或Z3中之一為硫或氧時，所述W3-X3鍵或Y3-Z3鍵分別為單鍵。當W3和X3，或Y3和Z3為碳或氮時，所述W3-X3鍵或Y3-Z3鍵分別為雙鍵。根據(jù)優(yōu)選的實施方式，R31和R32相同或不同，表示氫原子、直鏈或支鏈的烷基、烯基、炔基、炔基烯基、環(huán)烷基、烷基芳基、芳基烷基(并且優(yōu)選芐基)、芳基烯基、芳基炔基、雜烷基、雜芳基；或者R31和R32一起形成包括5至6個碳原子的環(huán)烷基，所述環(huán)烷基的一個或兩個碳原子可能被一個或兩個雜原子(優(yōu)選氮原子)替代；或者R31和R32中的一個與R39一起形成5至6個碳原子的環(huán)烷基，所述環(huán)烷基的一個或兩個碳原子可能被一個或兩個雜原子(優(yōu)選氧原子)替代，所述R31或R32可選地被獨立選自以下基團的一個或多個基團取代：直鏈或支鏈的烷基，環(huán)烷基、諸如炔基(所述炔基優(yōu)選為C5至C12的支鏈炔基)，芳基烷基，芳基，雜芳基，羥基，鹵素，硝基，-COR3a基團或-NR3aR3b基團，其中，R3a和R3b相同或不同，表示氫原子或直鏈或支鏈的烷基鏈。根據(jù)更優(yōu)選的實施方式，R31和R32相同或不同，表示可選地被獨立選自直鏈或支鏈的烷基的一個或多個基團取代的，C1-C6直鏈或支鏈的烷基鏈或芳基烷基。有利地，R31表示C1-C6直鏈或支鏈的烷基鏈，并且R32為被C1-C6直鏈或支鏈的烷基鏈取代的芐基，或被直鏈或支鏈的炔基取代的烯基，諸如，-(CH2)n3”-CH＝CH-C≡C-C(CH3)3，其中，n3”為1至6。根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式，上述固醇代謝的抑制劑為式(III)的化合物或其鹽：其中：n1的范圍為1至12，并且優(yōu)選n1＝2，R11表示氫原子；-COR1a基團，其中，R1a為選自直鏈或支鏈的烷基鏈，可選的取代的芐基，或可選的取代的芳基(諸如苯基)，所述直鏈或支鏈的烷基鏈可選地被獨立選自羥基、鹵素、硝基的一個或多個基團取代，所述芳基最終被獨立選自氫原子和甲基的一個或多個基團取代；R12、R13和R14，相同或不同，表示氫原子；直鏈或支鏈的烷基鏈；羥基；-CH2OH基團；-COOR1b基團，其中，R1b表示氫原子，或直鏈或支鏈的烷基鏈；-OSiR1cR1dR1e基團，其中，R1c、R1d和R1e，相同或不同，表示氫原子，或直鏈或支鏈的烷基鏈；或者R12和R13一起稠合形成環(huán)外亞甲基(exomethylenegroup)；R15表示羥基；如上所限定的-OSiR1cR1dR1e基團；-COOR1f基團，其中R1f表示氫原子，或直鏈或支鏈的烷基鏈；-OCOR1g基團，其中R1g表示直鏈或支鏈的烷基鏈，優(yōu)選C1-C3烷基鏈，并且更優(yōu)選C1烷基鏈；或R15為與四氫吡喃酮環(huán)形成烯屬不飽和的碳。根據(jù)優(yōu)選的實施方式，R11為-COR1a基團，其中，R1a為直鏈或支鏈的烷基鏈，并且優(yōu)選R11為-COCH(CH3)C2H5基團或-COC(CH3)2C2H5基團。有利地，R14表示C1-C6烷基鏈，優(yōu)選-CH3基團；并且R12和R13表示氫原子?？商娲?，R12和R14可表示C1-C6烷基鏈，優(yōu)選-CH3基團，并且R13為氫原子。根據(jù)另一優(yōu)選的實施方式，n1＝2，并且R15表示羥基。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，上述固醇代謝的抑制劑選自乙炔雌二醇、美伐他汀、辛伐他汀、布替萘芬、特比萘芬、雌素酮。最優(yōu)選的式(I)的固醇代謝抑制劑為乙炔雌二醇和雌素酮。最優(yōu)選的式(II)的固醇代謝抑制劑為布替萘芬。最優(yōu)選的式(III)的固醇代謝抑制劑為美伐他汀和辛伐他汀。根據(jù)本發(fā)明的固醇代謝的抑制劑均對“甲羥戊酸酯(mevalonate)”路徑發(fā)揮作用，而不對固醇合成的“非甲羥戊酸酯”路徑(參見圖1)發(fā)揮作用。更具體地，式(I)的固醇代謝的抑制劑用作類固醇結(jié)構(gòu)類似物，與參與固醇代謝的蛋白相互作用，包括雌素酮(MerolaandArnold,Science,Vol.144,301-302(1964))和乙炔雌二醇(Koopenetal.,JournalofLipidResearch,Vol.40,1999)，式(II)的固醇代謝的抑制劑用作鯊烯環(huán)氧酶抑制劑(Belteretal.,Biol.Chem.,Vol.392,1053-1075(2011))，以及式(III)的固醇代謝的抑制劑用作HMG-CoA還原酶抑制劑(Liuetal.,Mol.Biol.Rep.(2010)37:1391-1395)。本發(fā)明的另一主題為一種用于生產(chǎn)脂肪酸的方法，所述方法包括：根據(jù)本發(fā)明所限定的引起微藻內(nèi)三?；视屠鄯e的步驟；隨后對在微藻內(nèi)累積的三酰基甘油進行提取的步驟。本發(fā)明還涉及一種用于生產(chǎn)生物燃料的方法，所述方法包括以下步驟：(i)根據(jù)本發(fā)明所限定的引起微藻內(nèi)三?；视屠鄯e的步驟；隨后(ii)對步驟(i)中在微藻內(nèi)累積的三?；视瓦M行提取的步驟；以及(iii)對步驟(ii)中回收的三?；视瓦M行酯交換的步驟，例如如Zhangetal.,BioresourceTechnology147(2013)59-64中所述。本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)藥物組合物或化妝品組合物的方法，所述方法包括以下步驟：(i’)根據(jù)本發(fā)明所限定的引起微藻內(nèi)三?；视屠鄯e的步驟；隨后(ii’)對步驟(i’)中在微藻內(nèi)累積的三?；视瓦M行提取的步驟；以及(iii’)將至少一種藥學上可接受的賦形劑或化妝品上可接受的賦形劑加入到步驟(ii’)中回收的三酰基甘油的步驟。本發(fā)明還涉及一種用于生產(chǎn)人類食品補充劑和動物飼料補充劑的方法，所述方法包括以下步驟：(i”)根據(jù)本發(fā)明所限定的引起微藻內(nèi)三酰基甘油累積的步驟；隨后(ii”)對步驟(i”)中在微藻內(nèi)累積的三?；视瓦M行提取的步驟；以及(iii”)將至少一種食品添加劑加入到步驟(ii”)中回收的三酰基甘油中的步驟。本發(fā)明的方法在引起微藻內(nèi)三酰基甘油累積的步驟之后，可包括一個或多個提取步驟。上述提取步驟可利用溶劑或其它本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它提取方法來進行。本發(fā)明的另一主題涉及固醇代謝的抑制劑在微生物，尤其是微藻，更優(yōu)選硅藻門的微藻，并且進一步優(yōu)選硅藻微藻種的三角褐指藻Phaeodactylumtricornutum中使甘油三酯累積的應(yīng)用。有利地，本發(fā)明涉及選自式(I)、式(II)和式(III)的化合物，諸如乙炔雌二醇、雌素酮、布替萘芬、美伐他汀、辛伐他汀、特比萘芬的固醇代謝的抑制劑在微生物，尤其是微藻內(nèi)，更優(yōu)選硅藻門的微藻，并且進一步優(yōu)選硅藻微藻種的三角褐指藻Phaeodactylumtricornutum內(nèi)使甘油三酯累積的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及選自式(I)、式(II)和式(III)的化合物，諸如乙炔雌二醇、雌素酮、布替萘芬、美伐他汀、辛伐他汀、特比萘芬的固醇代謝的抑制劑的組合以及它們與已知能增強微藻中TAG累積的其它方法(尤其是營養(yǎng)不足，優(yōu)選氮不足)的組合的應(yīng)用。附圖說明除了上述設(shè)定外，本發(fā)明還包括在以下說明書的剩余部分以及所附附圖中進行的其他設(shè)定，其中：圖1示出了經(jīng)由甲羥戊酸的固醇生物合成路徑的示意圖，并且示出了美伐他汀和辛伐他汀(Liuetal.,Mol.Biol.Rep.(2010)37:1391-1395)、雌素酮(MerolaandArnold,Science,Vol.144,301-302(1964)、布替萘芬和特比萘芬(Belteretal.,Biol.Chem.,Vol.392,1053-1075(2011))的作用；圖2示出了在富氮N(+)介質(zhì)或氮缺乏N(-)介質(zhì)中培養(yǎng)72h后，經(jīng)共聚焦顯微鏡直觀化的褐指藻細胞的圖片，在左側(cè)(A和C)細胞以相襯(“相”)的方式示出；在右側(cè)(B和D)，示出在488nm處激發(fā)尼羅紅且在519nm處發(fā)光后的細胞；圖3a至圖3h示出了乙炔雌二醇、美伐他汀、辛伐他汀和雌素酮的劑量響應(yīng)；以及圖4示出了通過尼羅紅染色估算TAG含量，以及利用馬拉瑟細胞(Malassezcell)以等份(aliquotefraction)的方式計數(shù)來估算細胞，乙炔雌二醇、美伐他汀和辛伐他汀的劑量響應(yīng)；圖5示出了布替萘芬對分別在ESAW1N1P介質(zhì)和ESAW10N10P介質(zhì)中生長的海洋富油微擬球藻Nannochloropsisgaditana中尼羅紅累積的影響。通過計算每百萬細胞中的相對熒光單位來對尼羅紅熒光性進行標準化；圖6示出了乙炔雌二酮對分別在ESAW1N1P介質(zhì)和ESAW10N10P介質(zhì)中生長的海洋富油微擬球藻Nannochloropsisgaditana中尼羅紅累積的影響。通過計算每百萬細胞中的相對熒光單位來對尼羅紅熒光性進行標準化。具體實施方式實施例1)材料和方法1)1-三角褐指藻Phaeodactylumtricornutum菌株和生長條件在各實驗中使用三角褐指藻Phaeodactylumtricornutum(Pt1)Bohlin菌株8.6CCMP2561(海洋生物的菌種保藏，現(xiàn)被稱為NCMA：海洋藻類和微生物群國家中心)。使Pt1在20℃下，250mL燒瓶中，于根據(jù)加拿大微生物培養(yǎng)中心(CanadianCenterfortheCultureofMicroorganisms)的規(guī)定制備的“富集的人工海水”(enrichedartificialseawater，ESAW)介質(zhì)中生長。為了制備ESAW介質(zhì)，制備四種單獨的溶液：兩種鹽溶液(溶液1和溶液2)，一種營養(yǎng)溶液以及一種維生素溶液。將鹽加入到蒸餾的去離子水(DDW)中。當溶液1和溶液2中的鹽完全溶解后，將溶液1和溶液2混合在一起。用DDW來稀釋總體積。表3：ESAW鹽溶液1和ESAW鹽溶液2的組成表4：營養(yǎng)物富集原液*甘油磷酸酯二鈉可用Na2HPO4的等摩爾原液替換。**Na2EDTA.2H2O在痕量金屬Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O和FeCl3.6H2O之前加入。***Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O可用FeCl3的等摩爾原液替換。利用2g的Na2CO3將溶液5調(diào)節(jié)至pH＝6?？蓪θ芤?進行加熱以使鐵溶解。表5：維生素原液維生素原液原液溶度(g.L-1)終濃度(mM)硫胺素0.12.97×10-1維生素B120.0021.47×10-3生物素0.0014.09×10-3為了制備ESAW介質(zhì)，利用玻璃纖維預(yù)過濾器，使溶液過濾通過0.45μm膜過濾器。在第一使用前用10％HCl的對燒瓶進行酸洗，并且用蒸餾水進行沖洗。將1mL的營養(yǎng)物富集原液1、營養(yǎng)物富集原液2、營養(yǎng)物富集原液4、營養(yǎng)物富集原液5、營養(yǎng)物富集原液6和營養(yǎng)物富集原液7，2mL的營養(yǎng)物富集原液3，以及2mL的維生素原液(表4和表5)加入至1L的經(jīng)過濾的鹽溶液中。為了降低高壓滅菌過程中的沉淀，加入1.44mL的1NHCl以及0.12g的碳酸氫鈉。隨后通過高壓滅菌對所得到的ESAW介質(zhì)進行殺菌。使細胞在12:12光(450μEinstein-1sec-1)/黑暗周期(Einstein被限定為1摩爾(6.022×1023)光子的能量)下生長。利用1/5的前培養(yǎng)物在新鮮介質(zhì)上進行接種，來每周對細胞進行繼代培養(yǎng)。富氮N(+)介質(zhì)不含氮源。氮缺乏N(-)介質(zhì)含有0.05g/LNaNO3。為了監(jiān)控細胞生長，使用含有組蛋白H4蛋白的基因修飾的菌株，其中，所述組蛋白H4蛋白融合有黃色熒光蛋白(Siautetal.,Gene406(2007)23-35)。1)2-油滴的尼羅紅染色的原理如Ren等人所述(BiotechnologyforBiofuels2013,6:143)，通過尼羅紅(SigmaAldrich)熒光染色(激發(fā)波長485nm；發(fā)光波長525nm)能夠監(jiān)控油滴(oildroplet)的累積。對細胞進行稀釋，并將其調(diào)節(jié)至與尼羅紅熒光性線性相關(guān)的細胞濃度。將尼羅紅溶液(40μL的2.5μg.mL-1原液濃度，在100％DMSO中)加入到160μL細胞懸浮液中。通過用尼羅紅熒光強度除以細胞數(shù)來確定熒光比度。隨后，利用ZeissAxioScope.A1顯微鏡(FITC濾光器；激發(fā)波長488nm；發(fā)光波長519nm)使尼羅紅染色過的油滴直觀化。油脂滴能夠被直觀化。在圖2中，在富氮N(+)介質(zhì)或氮缺乏N(-)介質(zhì)中培養(yǎng)72h后，通過共聚焦顯微鏡使指藻Phaeodactylum細胞直觀化。在左側(cè)，細胞以相襯(“相”)的方式示出。在右側(cè)，示出在488nm處尼羅紅激發(fā)且在519nm處發(fā)光后的細胞。油脂滴可被清楚地直觀化。該原理是簡單地通過利用分光熒光計測量三角褐指藻Phaeodactylumtricornutum中油的存在(在這些條件下，對細胞內(nèi)其它熒光素，諸如在530nm處激發(fā)且在580nm處發(fā)光的葉綠素的檢測降低)。1)3-用于油水平檢測的替代方法可替代地，利用溶劑或其它提取方法對油進行提取，通過薄層色譜法對油進行分離和純化，并且使其進行甲醇化以產(chǎn)生脂肪酸甲酯，通過與電離火焰檢測器或質(zhì)譜儀聯(lián)用的氣相色譜法對其進行量化。從200mg的冷凍干燥的三角褐指藻Phaeodactylumtricornutum細胞中提取TAG以防止油脂降解。簡單地說，在收獲之后，將細胞立即冷凍在液氮中。使經(jīng)冷凍干燥的細胞團重新懸浮在4mL的煮沸的乙醇中5分鐘，隨后在室溫下加入2mL的甲醇和8mL的氯仿。隨后，用氬氣飽和該混合物，并且在室溫下攪拌1h。在通過玻璃絲過濾后，用3mL的氯仿/甲醇(2:1，v/v)沖洗細胞剩余物。為了促進兩相的形成，隨后將5mL的1％NaCl加入到濾液中。在氬氣下對氯仿相進行干燥，隨后將油脂提取物重新溶解在純氯仿中。為了分離TAG，利用己烷/乙醚/乙酸(70:30:1,v/v)，油脂在硅膠薄層色譜(TLC)板(Merck)上移動。隨后，在8-苯胺基-1-萘磺酸以2％粉碎在甲醇中后，利用UV燈使油脂直觀化。隨后，將它們從TLC板上刮落以進行進一步的分析。為了TAG的?；饰龊土炕?00℃下，1小時內(nèi)，利用3mL的2.5％的H2SO4甲醇溶液來使脂肪酸甲基化(涵蓋21:0的標準量)。通過加入3mL的水和3mL的己烷來使反應(yīng)停止。在BPX70(SEG)柱上，利用氣液色譜法(PerkinElmer)對己烷相進行分析。通過比較甲基化的脂肪酸的保留時間和標準物的保留時間來鑒定該甲基化的脂肪酸，并且利用用于校準的21:0，通過表面峰值方法來量化該甲基化的脂肪酸。上述提取和量化至少進行3次。1)4-細胞標準化的原理利用熒光標記物(reporter)，如Siaut等人(Gene406(2007)23-35)所述的含有與黃色熒光蛋白(YFP)融合的組氨酸H4蛋白的基因構(gòu)造的菌株，能夠估算樣品中的細胞數(shù)(Siautetal.,Gene406(2007)23-35的圖5A)。為了細胞計數(shù)，我們可使用該被稱為“ptYFP”的菌株，并且測量在515nm處激發(fā)后，YFP在530nm處發(fā)射的熒光；或者使用任何的菌株，并且通過用Malassez網(wǎng)格(grid)(供應(yīng)商：Mareinfeld)計數(shù)來估算細胞數(shù)。1)5-利用固醇代謝的抑制劑孵育三角褐指藻Phaeodactylumtricornutum，并且檢測由該處理引起的油累積在第一天，我們通過在每個孔上加入經(jīng)紫外光照射消毒的4mm玻璃珠，來制備48孔板。我們制備處于指數(shù)生長期的微藻的新鮮懸浮液。對于基于YFP熒光使細胞標準化，使在N(+)ESAW介質(zhì)中培養(yǎng)的含有YFP標記物(ptYFP)的三角褐指藻Phaeodactylumtricornutum的細胞以3,500rpm離心5分鐘。對于基于利用Malassez網(wǎng)格的計數(shù)使細胞標準化，使在N(+)ESAW介質(zhì)中培養(yǎng)的三角褐指藻Phaeodactylumtricornutum的Pt1細胞以3,500rpm離心5分鐘。棄去上清，并且使團塊(pellet)懸浮在N(-)ESAW中。隨后，使微藻以3,500rpm離心5分鐘。棄去上清，并且使團塊懸浮在N(-)ESAW中。隨后，將細胞在N(-)ESAW中稀釋至1×106個細胞/mL。隨后，將樣品分為兩批。使一批補充有1μL/mL的46.7g/LNaNO3原液以得到細胞在N(+)ESAW介質(zhì)中的懸浮液。另一批保持沒有NaNO3以得到N(-)ESAW培養(yǎng)物，來作為用于高油脂累積的對照。在48孔透明板中，布置有1×106細胞/mL的450μL/孔。對于劑量響應(yīng)分析，隨后利用50μL的下列物質(zhì)，通過0μM、1μM、10μM或100μM的固醇代謝的抑制劑使48孔板的每個孔進行恰當?shù)姆跤?0μL的固醇代謝的抑制劑的10倍濃縮液(5％DMSO:95％N(+)ESAW)；或50μL的富氮介質(zhì)，沒有任何的固醇代謝的抑制劑(5％DMSO:95％N(+)ESAW)；或者氮缺乏介質(zhì)，沒有任何的固醇代謝的抑制劑(5％DMSO:95％N(-)ESAW)，作為陽性對照。對于單劑量效果的分析，利用0以及選定濃度的固醇代謝的抑制劑(50μM)進行孵育。在所有的情況下，利用封口膜對板的邊緣進行密封。在20℃、100rpm,12h/12h光/暗下，通過頂部照明在孵育器中使板孵育48小時。在孵育48小時之后，在以下激發(fā)/發(fā)光波長處測量熒光：530/580nm(用于在尼羅紅加入之前，估算基線熒光)和515/530nm(用于估算YFP熒光)。在該第一次測量之后，加入40μL的尼羅紅(2.5μg/mL原液濃度，在100％DMSO中)。將這些板混合，并且在室溫下在免受光下孵育20分鐘。隨后利用分光熒光計測量尼羅紅熒光(激發(fā)530nm/發(fā)光580nm)。1)6-利用固醇代謝的抑制劑孵育海洋富油微擬球藻Nannochloropsisgaditana，并且檢測由該處理引起的油累積在兩個不同條件的海洋富油微擬球藻Nannochloropsisgaditana中進行該實驗：細胞在含47mg.L-1NaNO3和3mg.L-1NaH2PO4的ESAW(介質(zhì)1N1P)中孵育，或細胞在含470mg/LNaNO3和30mg.L-1NaH2PO4的ESAW(介質(zhì)10N10P)中孵育。通過以3500rpm離心10分鐘來收集處于指數(shù)生長期的細胞。棄去上清，并且使細胞重新懸浮在相同體積的ESAW介質(zhì)(1N1P或10N10P)中。再一次，使培養(yǎng)物以3500rpm離心10分鐘，并且棄去上清。使團塊重新懸浮在ESAW(1N1P或10N10P)中以得到2×106個細胞/mL的濃度。利用Malassez計數(shù)池對細胞進行計數(shù)，在計數(shù)前，停留10分鐘以用于細胞沉降。將20毫升的在ESAW(10N10P)和ESAW(1N1P)中的2×106個細胞/mL的海洋富油微擬球藻Nannochloropsisgaditana分配到無菌玻璃錐形瓶中。制備在DMSO中的固醇代謝的抑制劑的原液。將固醇代謝的抑制劑以終濃度為10μM、30μM或100μM加入到20mL的海洋富油微擬球藻Nannochloropsisgaditana樣品中。樣品中DMSO的最大終濃度為1％(v/v)。將所有的培養(yǎng)物在100rpm、12h/12h光/暗周期、50μE.m-2.s-1、20℃下孵育7天。每一天，從每個燒瓶中取出一等份，以進行尼羅紅染色和細胞計數(shù)。將160μL/每樣品加入到黑色96孔板中，并且使其沉降10分鐘。為了檢測任何的背景噪聲，在530nm激發(fā)處和580nm發(fā)光處分別測量熒光。將40μL的DMSO中的2.5μg.mL-1尼羅紅加入到各個孔中，并且徹底混合。在孵育20分鐘后，在530nm激發(fā)處和580nm發(fā)光處分別測量尼羅紅熒光。通過計算每百萬細胞的相對熒光單位來使尼羅紅熒光標準化。結(jié)果被表示為在完全介質(zhì)(ESAW(10N10P)或ESAW(1N1P))中培養(yǎng)的海洋富油微擬球藻Nannochloropsisgaditana的尼羅紅熒光的百分比。1)7-固醇代謝的抑制劑從Prestwick實驗室中獲知固醇代謝的抑制劑引起三角褐指藻Phaeodactylumtricornutum的細胞內(nèi)油脂滴累積的能力，隨后，從Sigma-Aldrich.購買該固醇代謝的抑制劑。表6：選自Prestwick實驗室的固醇代謝的抑制劑2)結(jié)果在10μM的美伐他汀、布替萘芬、辛伐他汀、雌素酮、乙炔雌二醇和特比萘芬的存在下，孵育三角褐指藻Phaeodactylumtricornutum48h。在所有的情況下，基于尼羅紅染色，每個細胞中存在的油增加至少1.5倍。圖3a至圖3h示出了通過用尼羅紅染色對TAG含量進行估算，以及通過監(jiān)控表達的組蛋白H4標記物基因的YFP熒光對細胞進行估算，對于乙炔雌二醇、美伐他汀和雌素酮的劑量響應(yīng)。在左側(cè)，圖3a至圖3h示出了以未處理細胞的百分率表示的尼羅紅水平以及以未處理細胞的百分率表示的通過YFP熒光估算的細胞數(shù)。右側(cè)示出了每個細胞的油含量的增加，以用未處理細胞的百分率表示的尼羅紅熒光/YFP熒光的比表示。與未處理的細胞相比時，每個細胞油含量隨著藥物濃度和固醇代謝抑制的水平而增加，并且范圍在120％至400％。圖4示出了通過用尼羅紅染色對TAG含量進行估算，以及通過利用Malassez細胞以等份計算來對細胞進行估算，對于乙炔雌二醇(A)、美伐他汀(B)和辛伐他汀(C)的劑量響應(yīng)。在圖4的直方圖中，白色柱表示以未處理細胞的百分率表示的估算的細胞數(shù)，并且黑色柱表示以未處理細胞的百分率表示的每106個細胞的尼羅紅。當與未處理的細胞相比時，每個細胞的油含量以及因此固醇代謝抑制的水平由于在50μM抑制劑下孵育而增加，并且范圍在120％至350％。在布替萘芬和乙炔雌二醇的存在下，孵育海洋富油微擬球藻Nannochloropsisgaditana。圖5和圖6示出了布替萘芬和乙炔雌二醇對分別在ESAW1N1P介質(zhì)和ESAW10N10P介質(zhì)中生長的海洋富油微擬球藻Nannochloropsisgaditana中尼羅紅累積的影響。通過計算每百萬細胞中相對熒光單位來對尼羅紅熒光性進行標準化。在不同介質(zhì)中以及能夠觀察的時段(至少7天)中，布替萘芬和乙炔雌二醇均能夠引起海洋富油微擬球藻Nannochloropsisgaditana中油的累積。當前第1頁1 2 3