本發(fā)明涉及用于下一代測序測定的對照。這些對照可以分別充當陽性和陰性對照以及提取對照。本申請描述了相應(yīng)的質(zhì)粒、試劑盒、它們的用途以及涉及本發(fā)明的對照的使用的方法。

背景技術(shù)：

核酸測序的使用已成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的很多診斷領(lǐng)域中的必需工具。具體地，基于下一代測序(NGS)的基因測試很快在臨床診斷學(xué)中獲得認可。該領(lǐng)域的實例為腫瘤學(xué)，其中使用核酸序列以鑒定(例如)致癌突變是否存在于基因中或者引起和/或指示癌癥的移位是否存在于基因組中。此外，使用核酸測序來檢測病原微生物(如(例如)細菌或病毒)是否存在于臨床樣品，例如，來自人患者的組織樣品或血液樣品中，在后一種方法中，檢測不存在于人受試者中，而僅存在于微生物中的核酸序列。

通常，在實際測序步驟之前是擴增反應(yīng)，以擴增待測序的核酸。這種擴增反應(yīng)通常通過PCR反應(yīng)進行；因此，在PCR反應(yīng)中使用特異性引物，其雜交至待擴增序列的上游和下游的序列(即引物與待擴增序列側(cè)接)。

由于近年來的發(fā)展，診斷方法過程中的很多步驟，包括NGS工藝流程已自動化。例如，從臨床樣品提取核酸，擴增反應(yīng)以及實際測序反應(yīng)已自動進行。

NGS方法可以導(dǎo)致靶標序列的鑒定和序列確定，其可以表明致癌突變的存在或不存在或者病原體-來源的核酸的存在或不存在。

然而，在如上所述的測定中不能排除不正確地進行了所述測定的某些步驟。而依賴于PCR的常規(guī)測定(例如，qPCR)通常涉及陽性和陰性對照的使用以確保結(jié)果的質(zhì)量，基于NGS的測定通常不包含這些對照。這可以在測序結(jié)果的正確解釋中產(chǎn)生問題。

不正確地進行的測定的典型實例是由于未正確進行提取步驟而未檢測到靶標序列。因此，致癌基因或感染性微生物可能的確存在于樣品中，盡管結(jié)果(即測序反應(yīng)的結(jié)果)將是測序反應(yīng)失敗或者測序反應(yīng)后的分析將該事件歸類為“無效”結(jié)果。當樣品被DNA污染時，測序反應(yīng)分析的結(jié)果會是結(jié)果是假陽性或假陰性結(jié)果。本文所提供的對照(包括陰性對照)允許高通量測序方法(也稱為下一代測序)的使用者識別可能的假陽性和假陰性結(jié)果。本文所提供的系統(tǒng)對照(SC)將幫助排除測序失敗的故障。盡管測序失敗對患者無風(fēng)險，但是由于NGS過程涉及的高成本，它仍是重要的。此外，包括如本文所提供的適當?shù)南到y(tǒng)對照的NGS中獲得的測序數(shù)據(jù)的分析更可靠、更快速并且更準確。

為了排除不正確的提取步驟，可以使用提取對照。提取對照可以包括加入包含對照核酸序列的完整的所謂的參比細胞，其通常不同于待檢測的序列。通常，在開始自動提取步驟之前將這些細胞添加(“加標”)到樣品中(通常，通過在提取期間將細胞以特定濃度加入到所使用的裂解緩沖液中)。測定完成后，提取對照序列的檢測表明提取步驟確實已正確進行。

還要確保在所應(yīng)用的條件下擴增和實際測序步驟起作用，并且相對于結(jié)果的質(zhì)量和數(shù)量，靶標核酸的檢測限足以清楚說明，即以特定準確度水平說明特定序列是否存在于樣品中。

此外，必需小心排除污染核酸導(dǎo)致的假陽性或假陰性結(jié)果。如上所述，在NGS數(shù)據(jù)分析中，污染核酸的存在可能提供了某些靶標序列(或目的核酸序列)存在于來自患者的樣品中的印象。另一方面，當NGS測序反應(yīng)旨在確定野生型靶標序列和變體序列(例如，在致癌基因中)是否存在時，污染可能導(dǎo)致整體測序結(jié)果轉(zhuǎn)變到野生型或變體過度或未充分表示的一側(cè)。這還可以改變基于NGS的診斷的整體結(jié)果，例如，當固定預(yù)定期望水平時。

綜上所述，涉及NGS的診斷測試需要本文所公開的對照(其還可以稱為“系統(tǒng)對照”(SC))，具體地，當測定必需滿足各個法規(guī)機構(gòu)(如FDA)的某些監(jiān)管要求時。同時，這些對照應(yīng)易于獲得，即無需使用復(fù)雜的分子生物技術(shù)可獲得，它們應(yīng)以低成本可生產(chǎn)，不會對環(huán)境或處理它們的人員構(gòu)成危害。此外，對照的存在不應(yīng)不利地影響診斷測定的靈敏度。本發(fā)明滿足了這些及其它目標。

本發(fā)明的發(fā)明人在提供用于下一代測序(NGS)反應(yīng)的系統(tǒng)對照中獲得了特別的成功，所述系統(tǒng)對照可以在NGS反應(yīng)中用作陽性和陰性以及提取對照。

在更詳細地描述本發(fā)明的一些實施方式之前，引入以下定義。

定義

除非上下文中明確規(guī)定，否則如本說明書和權(quán)利要求中所使用的，單數(shù)形式的“一個”也包括相應(yīng)的復(fù)數(shù)形式。

需要理解術(shù)語“包括”不是限制性的。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語“由…組成”應(yīng)認為是術(shù)語“包括”的優(yōu)選實施方式。如果在下文中將組定義為包括至少某些實施方式，則這還意味著涵蓋了優(yōu)選地僅由這些實施方式組成的組。當核酸對照或靶標核酸序列包含核酸(序列)時，這意味著在包含其它序列的序列中存在額外的殘基是可能的，例如，在包含對照核酸序列的質(zhì)粒中。

“靶標核酸序列特異性基于NGS的診斷方法”或“基于NGS的靶標核酸檢測方法”的表述是指這些方法包括下一代測序，但是額外的步驟也是可能的，例如，從給定樣品提取和/或純化核酸，NGS-方案的任何修飾(只要根據(jù)該領(lǐng)域已知的方法進行測序反應(yīng))，以及測序后步驟，例如，測序和分析期間獲得的數(shù)據(jù)的分析、表示或在分析結(jié)束時提供的結(jié)果分析和表示。

當對照序列和靶標核酸序列不同時，這表示核酸至少在一個核酸殘基中是不同的。經(jīng)常地，這些序列來自于不同的基因，極經(jīng)常地，它們來源于不同的基因和生物。優(yōu)選地，對照核酸來源于來源或者已通過這樣的方式修飾，所述方式使得所述對照對環(huán)境不呈現(xiàn)任何風(fēng)險，特別是對實驗室中處理它們的人員。

如本文所使用的術(shù)語“檢測存在”應(yīng)理解為“檢測存在或不存在”。

如在本發(fā)明申請所主張的方法中提及的，高通量測序或下一代測序，即基于NGS的診斷方法中分析的樣品可能包含含有靶標序列的核酸。優(yōu)選地，高通量測序方法是離子半導(dǎo)體測序方法。

在本發(fā)明的背景中，術(shù)語“核酸”是指處于單鏈或雙鏈形式的天然存在的脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸聚合物。所述核酸可以具體地為雙鏈DNA和單鏈RNA。

如本文所使用的術(shù)語“序列”是指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物中堿基的順序出現(xiàn)，其中脫氧核糖核苷酸聚合物中存在的堿基選自A、T、G和C，核糖核苷酸聚合物中存在的堿基選自A、U、G和C。因此，脫氧核糖核苷酸聚合物中堿基序列可以是(例如)GGAAGCAAGCCT，而核糖核苷酸聚合物中堿基序列可以是(例如)GGAAUCGAU。

如本文所使用的，術(shù)語“樣品”是指來自任何人或獸醫(yī)受試者的可以測試包含靶標序列的核酸的存在的任何生物樣品。所述樣品可以包括得自任何器官的組織，如(例如)肺組織；和得自任何器官的液體，如(例如)血液、血漿、血清、淋巴液、關(guān)節(jié)液、腦脊髓液、羊膜水、羊膜臍血、淚、唾液和鼻咽清洗液。如上所列，樣品還可以來源于身體的特定區(qū)域，例如，呼吸道；來自呼吸道的樣品包括喉拭子、喉清洗液、鼻拭子和來自下呼吸道的樣品。

所述樣品可以來源于人或獸醫(yī)受試者。因此，“患者”可以是人或獸醫(yī)受試者。如果提及“臨床樣品”，則這表示該樣品來自于懷疑帶有包含靶標序列的核酸的患者。

通過將對照核酸加入到樣品中來制備根據(jù)本發(fā)明的對照樣品，例如，當樣品為來自人器官的FFPE材料時，所述對照樣品包含來自相同來源的FFPE材料，但是另外它還包含加入樣品的對照核酸。根據(jù)應(yīng)作對照的步驟，例如，提取和/或測序等，可以在提取之前或之后將對照核酸加入對照樣品中。

如本文所使用的，術(shù)語“擴增”是指酶介導(dǎo)的程序，其能夠產(chǎn)生數(shù)十億的核酸靶標的拷貝。本領(lǐng)域中已知的酶介導(dǎo)的靶標擴增程序的實例包括PCR。

“提取核酸”是指從任何細胞背景中分離存在于小瓶中的任何核酸，具體地，從完整細胞或組織分離。優(yōu)選地，在所述方法過程中清洗核酸并任選地濃縮。提取后，除去與核酸無關(guān)的所有細胞或組織碎片。典型的提取方法可以包括低滲裂解緩沖液、熱和/或去污劑的使用，并且所述提取方法是技術(shù)人員已知的。

在本文中以分子生物學(xué)中的常規(guī)含義使用術(shù)語“測序”。因此，確定了核酸序列中準確的堿基順序出現(xiàn)。

如本文所使用的術(shù)語“微生物”以其最廣泛的含義使用。因此，微生物可以是任何類型的細菌、古菌、原生動物(protozoum)、真菌和病毒。明確提出病毒在如本文所使用的“微生物”的定義內(nèi)。

在本文中分別以分子生物學(xué)和腫瘤學(xué)中的常規(guī)含義使用術(shù)語“致癌基因”。因此，存在(例如)在基因中已知的突變，其使得“正?；蛞吧汀被蚓哂兄掳┬?，即引起癌癥；這方面的實例為使激酶具有組成型活性從而持續(xù)發(fā)出特定信號(例如，誘導(dǎo)生長信號)并起始相應(yīng)過程的突變。如本文所使用的“致癌基因”還可以涉及也會導(dǎo)致引起癌癥情況的染色體內(nèi)或染色體間易位。

如本文所提及的“靶標序列”是核酸中的序列，在根據(jù)本發(fā)明所述的方法中檢測其存在；“靶標序列”特征在于檢測其存在的特定核酸。

如本文所使用的，將正在測序的核酸稱為靶標核酸(或“靶標”)。靶標核酸包括但不限于DNA，如(但不限于)基因組DNA、線粒體DNA、cDNA等，和RNA，如(但不限于)mRNA、miRNA等。靶標核酸可以來源于任何來源，包括天然存在的來源或合成來源。所述核酸可以是PCR產(chǎn)物、粘粒、質(zhì)粒、天然存在或合成的文庫成員或物質(zhì)等。本發(fā)明不意欲限制于該方面。所述核酸可以來自動物或病原體來源，包括但不限于哺乳動物如人，和微生物如細菌、病毒、真菌、寄生蟲和分枝桿菌。在一些實施方式中，所述核酸不是病毒核酸。靶標核酸可以得自任何體液或組織，其包括但不限于血液、唾液、腦脊髓液(“CSF”)、皮膚、毛發(fā)、尿液、大便和粘液。靶標核酸還可以來源于但不限于環(huán)境樣品(如水樣)、食品樣品、森林樣品，所述樣品可以是新鮮樣品(例如，直接進行核酸提取的活組織檢查材料)，或已處理以允許儲存的樣品，例如，福爾馬林-固定和/或石蠟包埋的樣品(FFPE樣品)。根據(jù)本發(fā)明所述的方法特別適合于臨床樣品，例如，F(xiàn)FPE樣品。

一般地，將靶標核酸在5'和3'端之一或兩者處連接到序列。這些銜接頭序列包括在本發(fā)明所述的測序方法中使用的測序引物位點(即，測序引物將雜交的位點)。

在一些實施方式中，如以下所討論的，將進行擴增的靶標具有相同或類似長度(例如，靶標間5-10％的變化)。在一些實施方式中，可以保持盡可能小的這種變化，以確保均勻使用所有模板。

可以通過多種方式將擴增產(chǎn)物固定在支持物表面(例如，玻璃表面)上。例如，可以在溶液中進行擴增過程，然后將最終產(chǎn)物連接到支持物表面?？梢詫U增產(chǎn)物在其5'端或其3'端連接到固體支持物。連接可以通過與固定在支持物表面上的核酸的雜交或者它可以通過擴增產(chǎn)物末端上的部分與支持物表面上的部分之間的相互作用。實例包括使用生物素或雙重生物素標記的DNA(Margulies等人,Nature 437:376(2005))與鏈霉親和素/親和素/中性親和素包被的支持物表面、DIG(洋地黃毒苷)和抗DIG抗體或抗體片段、熒光素和抗熒光素抗體或抗體片段(Gore等人,Nature 442,836-9(2006))，或通過使用雜官能化的交聯(lián)劑，如生物素化的琥珀酰亞胺基丙酸酯-PEG，其可以偶聯(lián)(例如)至胺-官能化的玻璃并通過鏈霉親和素夾心(即核酸生物素-鏈霉親和素/親和素/中性親和素-生物素固體支持物相互作用)用于固定生物素-標記的DNA。

模板可以是指隨機固定至表面上。這表示基于序列，模板未放置到固體支持物表面上。然而，以在聚合酶-介導(dǎo)的摻入反應(yīng)期間和/或在模板延伸期間確保每個模板被未被另一模板占據(jù)的區(qū)域(并因此，體積)所圍繞的方式將它們置于固體支持物上。也就是說，在一些情況下，將模板以彼此之間足夠的距離布置在表面上以防止模板之間的任何相互作用。

固體支持物是指模板所結(jié)合或固定的部件，其可以由任何材料構(gòu)成，所述材料包括但不限于玻璃或其它二氧化硅基材料、塑料或其它聚合物基材料，然而只要所述材料對測序反應(yīng)和清洗中使用的模板、引物、聚合酶、dNTP和其它成分是相對惰性的。固體載體可以或可以不是剛性的。它可以是多孔的。它可以或可以不是連續(xù)的。在一些實施方式中，固體支持物是玻璃載玻片。在一些實施方式中，所述支持物是本身固定在固體支持物上的多個珠或顆粒(如微粒)。這些珠可以是多孔的。所述支持物可以是篩網(wǎng)，在一些實施方式中，所述固體支持物本身是檢測器或傳感器，如接觸成像儀。

應(yīng)理解可以將多個模板(無論是否相同)連接至固體支持物，只要所述多個模板的每個部件與其它部件之間的間隔足夠遠，從而在模板之間不會發(fā)生重疊。

通常，模板必需連接到其游離端上的可觀察(或可檢測)部分。該部分旨在表示模板的游離端，并因此其位置和在作用力方向上的移動表明了模板的長度。所述可觀察部分可以是任何數(shù)目的部分，并且本發(fā)明不受限于其性質(zhì)。可觀察部分的性質(zhì)將決定適于觀察(或檢測或監(jiān)測)模板長度變化的傳感器或檢測器的類型。在一些重要的實施方式中，所述可觀察部分為珠，如微珠，并且更具體地，如磁珠。

所述部分可以通過多種方法并且使用多種相互作用連接到模板，其包括但不限于非共價相互作用，如生物素/鏈霉親和素、DIG/抗-DIG和熒光物質(zhì)/抗熒光物質(zhì)結(jié)合對，以及共價相互作用，如本文中所討論的關(guān)于模板(或引物)與支持物表面共價固定化的那些。

所述固體支持物是流通池的一部分或鄰近于流通池。如本文所使用的，流通池是具有至少入口和出口的室，其中液體通過入口和出口移動。根據(jù)用于觀察模板的檢測系統(tǒng)的位置，模板所連接的固體支持物可以在流通池的下方、上方或旁邊。所述固體支持物可以是流通池的壁，包括下壁、側(cè)壁或上壁。

如將理解的，模板準確且快速的測序取決于未摻入的核苷酸從系統(tǒng)移除的程度和速率。因此，未摻入的核苷酸的快速且完全(或接近完全)的移除是重要的。還必須設(shè)計微流體系統(tǒng)以使清洗最大化，從而可能導(dǎo)致較小的清洗體積和清洗時間。

還可以通過腺苷三磷酸雙磷酸酶的使用部分或完全促進未摻入的核苷酸的清除，所述腺苷三磷酸雙磷酸酶將未摻入的dNTP降解并使他們不適于進一步摻入。一旦任何給定核苷酸三磷酸鹽類型的摻入停止(如通過模板末端可檢測部分的任何上述背景移動的停止所指示的)，則腺苷三磷酸雙磷酸酶可以自由流動，加入到清洗緩沖液中并引入到流通池中?？蛇x地或者另外，腺苷三磷酸雙磷酸酶可以固定或固定化到流通池內(nèi)，如(例如)，固體支持物表面(模板也固定或固定化的表面)。這可以通過接頭的使用進行，以使所述酶更可接近并移除與表面密切鄰近有關(guān)的任何空間阻礙。腺苷三磷酸雙磷酸酶可以連接到長度不同的多個接頭上。以這種方式，腺苷三磷酸雙磷酸酶可以存在于流通池內(nèi)的多種氣流中，包括與壁更接近的那些和與中央氣流更接近或位于中央氣流的那些。如以上所討論的，接近壁的氣流以低速移動，并且這些氣流中存在的未摻入的dNTP不易清除。這些氣流中具有的腺苷三磷酸雙磷酸酶應(yīng)改善這些dNTP的去除。這將提高以下可能性：模板長度的變化是新引入到流通池的dNTP的摻入的結(jié)果，而不是清洗后流通池中保留的殘余和未摻入的dNTP的結(jié)果。

在本發(fā)明的一些方面中，所述測序方法被稱為通過合成反應(yīng)的測序。這表示確定第一核酸的序列需要使用第一核酸作為模板的第二核酸的合成。以這種方式，根據(jù)摻入的dNTP的順序和數(shù)目確定第二核酸的序列，并且將第一核酸的序列確定為第一核酸序列的互補物。本發(fā)明所述的方法通過模板長度的變化并且不是通過直接觀察dNTP向正在合成的核酸中的添加來檢測dNTP的摻入。因此，dNTP可以是天然的dNTP(即，缺少任何修飾的dNTP，包括任何外源可檢測標記物，如熒光團)。如根據(jù)本發(fā)明公開應(yīng)清楚的，本發(fā)明的測序方法還需要模板保持完整。本發(fā)明的一些方面包括描述為在不存在熒光的情況下發(fā)生或以非熒光方式發(fā)生的測序方法。這些鑒定表示可以在不檢測熒光(特別是不檢測來自每個摻入的dNTP的熒光)的情況下進行所述方法。因此，這些方法的實施方式可以使用未通過添加外源熒光團修飾的天然dNTP。然而，這些鑒定不排除以下可能性：綴合至模板游離端的可觀察部分本身是發(fā)熒光的。在該后一種情況下，可以通過可觀察部分的熒光而不是來自單個摻入的dNTP的任何熒光來使模板長度變化可視化。

類似地，還將理解本文所提供的測序方法能夠通過檢測可觀察部分本身來檢測核苷酸摻入(例如，如通過CMOS接觸成像儀所可能的)。因此，在一些實施方式中，直接檢測可觀察部分，并且無需酶-介導(dǎo)的事件。酶促檢測核苷酸摻入的實例是結(jié)合釋放的無機焦磷酸的硫酸化酶和熒光素酶介導(dǎo)的檢測的焦磷酸測序。(參見Leamon and Rothberg,Chemical Reviews,"Cramming More Sequencing Reactions onto Microreactor Chips".2006)。因此，本發(fā)明的方面被認為是非酶促法(或者作為非酶促檢測核苷酸摻入)，這是因為可以在不存在酶產(chǎn)生的信號的情況下檢測核苷酸摻入。

在多個實施方式中，特別感興趣的分析物是氫離子，并且具體地配置了根據(jù)本發(fā)明公開的大規(guī)模ISFET陣列來測量pH。在其它實施方式中，正在監(jiān)控的化學(xué)反應(yīng)可以涉及DNA合成過程，或者其它化學(xué)和/或生物過程，并且可以具體地配置chemFET陣列以測量pH或提供與目的具體化學(xué)過程有關(guān)的相關(guān)信息的一個或多個其它分析物。在多個方面，使用常規(guī)CMOS處理技術(shù)制造chemFET陣列，并且具體地配置chemFET陣列以有利于從整個陣列快速采集數(shù)據(jù)(掃描所有像素以獲得相應(yīng)的像素輸出信號)。優(yōu)選的測序系統(tǒng)是離子PGM系統(tǒng)，然而，還考慮了其它基于質(zhì)子檢測的測序系統(tǒng)。例如，焦磷酸測序系統(tǒng)和Illumina通過合成測序是選項。相對于分析物的檢測和測量，應(yīng)理解在以下更詳細地討論的多個實施方式中，通過根據(jù)本發(fā)明公開的chemFET陣列測量的一個或多個分析物可以包括提供目的化學(xué)過程(例如，多個核酸鏈的結(jié)合，抗體與抗原的結(jié)合等)的相關(guān)信息的任何多種化學(xué)物質(zhì)。在一些方面，除了僅檢測分析物的存在之外，測量一種或多種分析物的水平或濃度的能力提供了與化學(xué)過程有關(guān)的有價值的信息。在其它方面，僅檢測目的分析物的存在可以提供有價值的信息。最優(yōu)選的測序方法包括Ion Torrent's PGM系統(tǒng)的使用，即包括離子半導(dǎo)體測序的NGS測序方法。

在另一個方面，本發(fā)明涉及用于測序核酸的方法，其包括將模板核酸片段化以產(chǎn)生多個片段化核酸，將來自多個片段化核酸的每一個的一條鏈單獨連接至珠以產(chǎn)生分別具有連接其上的單鏈片段化核酸的多個珠，將具有連接其上的單鏈片段化核酸的多個珠遞送到對該區(qū)域中每個傳感器具有單獨的反應(yīng)室的chemFET陣列，并且其中僅一個珠位于每個反應(yīng)室中，并且在多個室中同時進行測序反應(yīng)。

本發(fā)明考慮在相同流通池或在相同固體支持物內(nèi)同時進行多個不同的測序反應(yīng)。每個測序反應(yīng)獲得了固定在固體支持物上的一個模板的相關(guān)信息。單次試驗中可以測序的模板數(shù)目將取決于模板的預(yù)期長度以及固體支持物的面積。因此，根據(jù)實施方式，可以將至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900或至少1000個模板固定在固體支持物上并因此同時測序。在其它實施方式中，可以同時測序100-500、100-750、100-1000、500-1000、600-1000、700-1000、800-1000、900-1000、1000-2000、2000-3000、3000-4000、4000-5000、5000-10000個或更多個模板。

通過將dNTP摻入到雜交至模板的新合成的核酸鏈來進行測序反應(yīng)。新合成的鏈可以衍生自結(jié)合至模板的引物或衍生自可以進行聚合酶-介導(dǎo)的延伸的其它分子。

在一個非限制性實例中，可以通過在允許雜交的情況下將模板與引物接觸，并將模板/引物的雜交物與聚合酶接觸來開始測序反應(yīng)。這種接觸可以在固定化至固體支持物之前、期間和/或之后發(fā)生。在一個重要的實施方式中，在固定化至固體支持物之后發(fā)生。

一旦將引物和聚合酶結(jié)合到模板，則重復(fù)循環(huán)的試劑流入并通過流通池。當試劑流含有與直接在引物3'端的下游的模板上的核苷酸互補的核苷酸時，聚合酶將摻入dNTP。如果模板上鄰接的下游位置未被相同的核苷酸(本文中稱為均聚物)占據(jù)，則聚合酶將摻入相同數(shù)目的互補dNTP。當流中的dNTP與模板上下一個可用的核苷酸不互補時，這種摻入將停止。流動的dNTP的量和這種流動的時間將分別超過模板上互補堿基的數(shù)目和摻入所有可能的dNTP所需的時間。

重要地，互補dNTP的摻入在超過一種結(jié)合引物上發(fā)生。更優(yōu)選地，摻入在至少10％、至少25％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或在全部結(jié)合的引物上發(fā)生。引物的百分比可以基于模板中靶標拷貝的數(shù)目。對于一些實施方式，每個單個模板中，摻入在至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100個或更多個引物上發(fā)生。將理解本發(fā)明考慮在給定模板上的多個雜交引物上摻入dNTP以通過提高所發(fā)生的長度變化的幅度(無論長度增加或減少)來提高信噪比。

作為測序反應(yīng)的一部分，如果其互補核苷酸存在于模板核酸的相同位置，則dNTP將連接至(或如本文所使用的“摻入到”)新合成的鏈的3'端(或者就第一個摻入的dNTP來說，測序引物的3'端)。引入的dNTP的摻入將模板單鏈區(qū)轉(zhuǎn)化為雙鏈區(qū)，并且這種轉(zhuǎn)化反映在張力作用下的模板長度的變化。通過確定和監(jiān)控模板游離端的可觀察部分(例如，珠)的位置，檢測長度變化。因此，如果在任何給定流過后，珠位置未改變，則無dNTP摻入，并且可以推斷流過的dNTP與模板中下一個可用的核苷酸不互補。如果檢測了所述部分位置的變化，則流過的dNTP是互補的并且摻入到新合成的鏈中。dNTP可以以任何順序流動，只要所述順序是已知的并且優(yōu)選地在整個測序試驗中保持恒定。

對于本發(fā)明的一些方面，典型的測序循環(huán)可以包括用清洗緩沖液清洗流動室(和孔)，測量連接到模板核酸末端的可觀察部分的位置，在存在聚合酶的情況下將第一dNTP種類(例如，dATP)引入到流動室，測量可觀察部分的位置，腺苷三磷酸雙磷酸酶任選地在清洗緩沖液中流過，清洗緩沖液的流過，在存在聚合酶的情況下第二dNTP種類的引入等。該過程持續(xù)直至所有4種dNTP(即dATP、dCTP、dGTP和dTTP)已流過所述室并使其摻入到新合成的鏈中。這種4-核苷酸循環(huán)可以重復(fù)任何次數(shù)，包括(但不限于)10、25、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000次或更多次。循環(huán)次數(shù)將取決于正在測序的靶標長度和補充反應(yīng)試劑(具體地，dNTP儲備溶液和清洗緩沖液)的需要。因此，可以使用本發(fā)明所述的方法確定的序列長度可以為至少50個核苷酸、至少100個核苷酸、至少200個核苷酸、至少300個核苷酸、至少400個核苷酸、至少500個核苷酸、至少600個核苷酸、至少700個核苷酸、至少800個核苷酸、至少900個核苷酸、多至并且包括1000個核苷酸、1500個核苷酸、2000個核苷酸或更多個核苷酸。

適合的聚合酶可以是DNA聚合酶、RNA聚合酶或其亞基，只要這些亞基能夠基于模板合成新的核酸鏈并能夠從雜交引物開始。適合的聚合酶亞基的實例是缺少3'至5'外切核酸酶活性的大腸桿菌(E.coli)DNA聚合酶1的Klenow片段的外切形式。其它適合的聚合酶包括T4 exo-、Therminator和Bst聚合酶。聚合酶在溶液中可以是游離的(并且可以存在于清洗和/或dNTP溶液中)或者它可以固定在固體支持物、流通池的一個或多個壁、模板或引物上。

將理解本文所提供的測序方法具有一些應(yīng)用，其包括但不限于確定核酸(或者一系列核酸，如存在于基因組中的核酸，包括哺乳動物基因組并且更具體地人基因組)的部分或完全的核苷酸序列，確定樣品中是否存在核酸(如在(例如)診斷和法醫(yī)學(xué)方法中可以是有用的樣品)，確定核酸在序列中是否包括突變或變化(如(例如)等位變化，包括單核苷酸多態(tài)性)，確定已知核酸是否經(jīng)歷導(dǎo)致新物種產(chǎn)生的的突變(如可能是抗生素耐受性微生物的潛在原因)，確定基因修飾的微生物或基因工程核酸的存在，確定兩種樣品(如(例如)正常組織和患病組織)間是否存在遺傳學(xué)差異并且存在何種遺傳學(xué)差異，確定對于患有如可以通過受試者的遺傳構(gòu)成確定的特定病況的受試者的治療什么治療方案將最有效，和基因分型(例如，分析一個或多個基因位點以確定(例如)載體狀態(tài))。在這些實施方式的一些中，可以將使用本發(fā)明所述的方法確定的核苷酸序列與已知或參考序列相比較以定向所獲得的序列和/或鑒定兩條序列間的差異。這可以幫助鑒定遺傳變化和突變。所述已知或參考序列可以是先前確定的序列(例如，由物種完整的基因組測序所產(chǎn)生的)。

本文所述的方法也可以用于幫助鑒定和治療病況。例如，所述方法可以用于鑒定與特定病況有關(guān)的序列或用于鑒定用于診斷特定病況不存在的序列。所分析的樣品可以來自于任何受試者，包括人。所述病況可以是癌癥或感染。

所述方法也可以用于鑒定與對試劑的陽性反應(yīng)有關(guān)的序列。所述方法可以包括使用本文所提供的一種或多種測序方法對來自多位對試劑顯示出陽性反應(yīng)的受試者和來自多位對試劑顯示出陰性反應(yīng)的受試者的DNA測序，和鑒定多位顯示陽性反應(yīng)的受試者中的共有序列和來自顯示出陰性反應(yīng)的受試者中的共有序列，并且該共有序列不存在于其它多位受試者中。優(yōu)選地，所述受試者是哺乳動物，并且更優(yōu)選地，是人。

本文所述的方法可以自動化進行從而通過機器人進行測序反應(yīng)。另外，得自檢測器或傳感器的測序數(shù)據(jù)可以輸入到個人電腦、個人數(shù)字助理、移動電話、電視游戲系統(tǒng)或電視中，從而使用者可以遠程監(jiān)控測序反應(yīng)的進行。

本發(fā)明還考慮了包含進行擴增和/或測序反應(yīng)所必需的多種試劑的試劑盒，以及根據(jù)本文所述方法的使用說明書。本文所提供的方法依賴于檢測模板中每個靶標拷貝的單個核苷酸。分辨率極限依賴于所使用的檢測系統(tǒng)的分辨率。

盡管在本文中已描述和說明了一些發(fā)明性實施方式，但是本領(lǐng)域那些技術(shù)人員將容易地設(shè)想用于發(fā)揮功能和/或獲得結(jié)果和/或本文所述的一種或多種優(yōu)勢的多種其它方式和/或結(jié)構(gòu)，并且這些變化和/或改變中的每一個被認為在本文所述的本發(fā)明的實施方式的范圍內(nèi)。更一般地，本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地理解本文所述的所有參數(shù)、尺寸、材料和配置意在為示例性的，并且實際參數(shù)、尺寸、材料和/或配置將基于本發(fā)明教導(dǎo)內(nèi)容所使用的特定用途。僅使用常規(guī)實驗方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識或能夠確定與本文所述的具體的本發(fā)明的實施方式等價的多種實施方式。因此，應(yīng)理解僅通過舉例的方式提供了上述實施方式，并且上述實施方式在所附權(quán)利要求及其等價形式的范圍內(nèi)；可以以其它方式實施除了如所具體描述和主張的之外的本發(fā)明的實施方式。本公開的發(fā)明實施方式涉及每個單獨的本文所述的特征、系統(tǒng)、制品、材料、試劑盒和/或方法。另外，如果這些特征、系統(tǒng)、制品、材料、試劑盒和/或方法彼此不一致，則這些特征、系統(tǒng)、制品、材料、試劑盒和/或方法中的兩種或更多種的任意組合包含在本發(fā)明公開的發(fā)明范圍內(nèi)。

應(yīng)理解如本文所定義和使用的所有定義優(yōu)先于詞典定義、通過引用并入的文檔中的定義和/或所定義術(shù)語的常規(guī)含義。

本發(fā)明的方面

本發(fā)明提供了檢測樣品中包含靶標序列的核酸的存在的新方法，所述方法包括下一代測序，其中使用了系統(tǒng)對照，即陽性和/或陰性對照，其優(yōu)選地不影響核酸檢測方法的靈敏度。

本發(fā)明基于對照核酸，也稱為系統(tǒng)對照(SC)的使用，在診斷(以及在研究)測定中，可以將其加入(“加標”)到含有待分析樣品材料的反應(yīng)容器中。在所附權(quán)利要求中更詳細地定義了對照。

令人驚奇地認識到可以在基于NGS的診斷方法中使用本發(fā)明的對照核酸并且使得能夠確定提取和后續(xù)NGS方法步驟，例如，核酸擴增、文庫制備和測序是否能夠滿足可靠的質(zhì)量標準，并且認識到NGS工藝流程是完全有功能的。同時，本發(fā)明的對照核酸允許監(jiān)控是否發(fā)生DNA污染。作為滿足強制性調(diào)控要求所需的質(zhì)量控制，這些對照是理想適合的。還令人驚奇地注意到僅需要極低量的對照核酸來實現(xiàn)以上所列的目標。注意到這些較低量的對照核酸不會負面地影響來源于待研究樣品的核酸的提取、擴增和測序反應(yīng)(或NGS中的其它步驟)。

陰性對照反應(yīng)通常在單獨的反應(yīng)容器中進行，其中僅向該特定小瓶中加入緩沖液而不是樣品。陰性對照中靶標序列的存在表明樣品被污染。

在第一個方面，本發(fā)明提供了用于靶標核酸序列-特異性基于下一代測序的診斷方法的核酸對照，其中所述核酸對照包括至少一種不同于所述靶標核酸序列的核酸對照序列。然而，有可能的是對照包括更多的核酸對照序列，其可以存在于單獨的或相同的核酸分子。

所述核酸對照序列可以來源于任何生物、微生物或其部分，例如，器官，只要所述對照序列不同于所述靶標序列所來源的生物、微生物或器官的靶標序列。例如，當分析人患者樣品時，對照序列可以來源于非人來源以確保特異性鑒定并同時避免所使用的材料的任何交叉反應(yīng)。

在另一個方面，核酸對照可以選自病毒、細菌、真菌和病原體-來源的核酸，或來源于動物、植物的核酸，或來源于不同于分析是否存在所述靶標核酸序列的器官或身體部分的器官或身體部分的核酸。

在本發(fā)明的一個方面，核酸對照選自病毒核酸，例如，來源于動物或植物病毒的核酸。核酸序列通常以排除了感染可能的方式使用，從而對于處理對照的人員或環(huán)境無風(fēng)險。

在另一個方面，所述核酸對照序列選自來源于煙草花葉病毒(TMV)的核酸。這些序列可以是野生型序列，即存在于自然界的那些，或者可以是修飾的序列，即所述序列可以含有核酸殘基的突變、添加、缺失、倒位。有可能突變序列用作對照核酸，例如，當與野生型序列相比時，已修飾從而它們帶有可示蹤變化的TMV來源的核酸。有可能通過核酸殘基的突變、添加、缺失或倒位使TMV突變。用作核酸對照的TMV核酸是適合的非人序列的實例。這些非人序列(例如，TMV核酸)的一個優(yōu)勢在于當靶標核酸序列來源于人時，這些序列可以用作陰性對照。

本發(fā)明另外的方面中，所述核酸對照包括至少兩種不同的核酸對照序列。這些序列可以在至少一個核酸殘基中是不同的，但是還有可能修飾更多殘基。

在另一個方面，所述對照包含至少一種野生型核酸序列和所述野生型核酸序列的至少一種突變體，例如，野生型和突變型非人序列，如TMV序列。使用野生型和突變型核酸序列的混合物的一個優(yōu)勢在于這些混合物可以用作變體調(diào)用的參考材料并提供限定的突變率。這大大提高了根據(jù)本發(fā)明所述的方法的靈敏度。不使用參考材料時，突變率調(diào)用(靶標核酸中，例如，致癌基因中)將較不可靠。

修飾的對照序列可以或可以不人工突變，即突變可以或可以不自然發(fā)生，只要可以在基于NGS的方法中通過測序追蹤所述修飾。期望地，NGS測定結(jié)果使得能夠決定核酸對照已加樣到懷疑包含靶標核酸的樣品中，或者在沒有樣品的情況下使用對照核酸，例如，在基于NGS的核酸分析中用作陰性內(nèi)部對照。在后一種情況下，如在給定基于NGS的測序反應(yīng)中確定的，對照序列的存在和靶標序列的不存在指示不存在來源于樣品的材料或來源于任何其它來源的材料的污染，例如，從先前分析、環(huán)境等所攜帶的核酸。

在本發(fā)明的一些方面，核酸對照具有單個核苷酸突變、大于1個核苷酸的突變、核酸殘基的倒位、缺失或添加。

在本發(fā)明的其它方面，提供了對照核酸的混合物。可以在靶標核酸序列-特異性基于下一代測序的診斷方法中使用所述混合物，并且所述混合物以預(yù)先確定的比例包括至少兩種核酸對照。例如，如果基于NGS的診斷方法或測定針對以特定變體頻率水平(例如，25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、1％或小于1％)檢測變體，則混合不同的對照序列以反映這些變體頻率水平。例如，當應(yīng)檢測5％的變體頻率水平時，將1個對照核酸(例如，TMV野生型)與5％的另一種對照核酸(例如，具有1個修飾的TMV，例如，單個點突變、三個突變、倒位、缺失等)混合。95％的野生型對照核酸序列和5％的突變對照核酸的所得混合物可以用于驗證基于NGS的方法能夠正確檢測變體頻率水平。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何準確確定變體核酸的量，即應(yīng)與在本發(fā)明方法或本發(fā)明的混合物中用作對照的野生型核酸混合的變體(或突變/修飾)核酸的量。

還提供了適合在序列-特異性基于下一代測序的診斷方法中用于檢測靶標核酸的試劑盒。這些試劑盒包括如上定義的至少一種核酸對照或以上詳細說明的核酸對照混合物。此外，任選地所述試劑盒可以包括用于基于下一代測序的診斷方法的其它試劑，例如，化學(xué)試劑、說明活頁等。

本文還提供了基于下一代測序的診斷方法，包括從樣品和對照樣品提取核酸材料。在提取之前，制備了對照樣品。這些方法還包括將所提取的核酸材料進行下一代測序方法，例如，離子半導(dǎo)體測序。在一些方面，本文所提供的基于下一代測序的診斷方法包括對照樣品，其含有添加有任何上述核酸對照或核酸對照混合物的樣品材料。

在本發(fā)明的其它方面，基于下一代測序的診斷方法旨在檢測來源于感染劑或致癌基因的靶標序列的存在與否。當然，在一次NGS運行中，有可能分析不止一個靶標。此外，NGS方法可以使用得自一個或多個來源的樣品，例如，一位人患者或多位人患者。還有可能使用來自一個來源的樣品材料和靶標不同的核酸序列。對用作對照樣品的來自一個來源的樣品進行至少一次NGS-分析，即向樣品中加標至少一種上述核酸對照或本發(fā)明的混合物。當使用來自不止一個來源的樣品時或者如果相對于不同靶標分析來自一個來源的樣品，則對于每個來源，可以存在對照，或者對于每個靶標，可以存在對照。

因此，根據(jù)本發(fā)明所述的基于下一代測序的診斷方法使得能夠檢測和分析來源于感染劑或致癌基因的靶標序列的存在與否。測序反應(yīng)后，核酸對照序列的存在指示了從樣品中成功實現(xiàn)的核酸提取。

如以上所指出的，本發(fā)明所述的基于下一代測序的診斷方法還可以包括污染對照，即陰性對照。出于該目的，對未加入到樣品材料中的對照核酸進行NGS工藝流程。污染對照包括如上定義的至少一種核酸對照或如上定義的核酸對照混合物。基于下一代測序的診斷方法包括對污染對照進行靶標核酸特異性測序反應(yīng)，其中污染對照中靶標核酸特異性序列檢測的不存在和對照核酸特異性序列存在的檢測指示不存在污染。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述樣品是臨床樣品，其中所述臨床樣品優(yōu)選地來自人受試者。優(yōu)選地，所述臨床樣品是組織樣品或體液樣品。所述樣品可以(例如)是從呼吸道、胃腸道或移植后的移植物獲得的組織樣品。此外，所述樣品可以具體地為體液樣品，其選自血液、血漿、血清、淋巴液和唾液。

在另一個優(yōu)選的實施方式中，所述靶標核酸可以是來自微生物的核酸。優(yōu)選地，所述微生物選自細菌、古細菌、原生動物、真菌和病毒。在特別優(yōu)選的實施方式中，所述微生物為細菌，其選自A群鏈球菌，包括結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、非洲分枝桿菌(Mycobacterium africanum)、牛型結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium bovis)、卡氏分枝桿菌(Mycobacterium canetti)和田鼠分枝桿菌(Mycobacterium microti)的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群成員，腸沙門氏菌種(Salmonella enterica spp.)，艱難梭菌(Clostridium difficile)，萬古霉素耐受性腸球菌(Vancomycin-resistant enterococcus)和二甲氧苯青霉素耐受性金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)。在另一個特別優(yōu)選的實施方式中，所述微生物是病毒，其選自腺病毒、流感病毒、家禽流行性感冒A(H7N9)病毒、中東呼吸綜合征冠狀病毒、諾瓦克病毒、BK病毒、巨細胞病毒、埃-巴二氏病毒、單純皰疹病毒1、單純皰疹病毒2、水痘-帶狀皰疹病毒、腸道病毒、HIV-1、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、登革熱病毒和基孔肯亞病毒。

在一些實施方式中，所述靶標核酸可以是致癌基因，優(yōu)選地人致癌基因，例如，選自下列的致癌基因：主要BCR-ABL、次要BCR-ABL、BCR-AML1ETO、PML-RARA、BRAF V600突變體、KRAS突變體、NRAS突變體、EGFR、KIT或PIK3CA。在本發(fā)明的實施方式中，因此本發(fā)明所述的方法可以用于檢測樣品中一種或多種致癌基因的存在。

本發(fā)明的對照核酸可以在基于NGS的診斷方法中以允許特異性檢測和/或預(yù)期檢測水平的量使用。樣品反應(yīng)中對照的存在不應(yīng)負面影響結(jié)果的結(jié)局。這意味著就足夠質(zhì)量和/或足夠數(shù)量的靶標核酸而言，不應(yīng)存在可以導(dǎo)致對結(jié)果的錯誤理解的對照核酸對提取、擴增和測序或任何其它NGS方法步驟的干擾。

根據(jù)就變體頻率(vf)而言的特異性靶標序列所需的靈敏度，選擇本發(fā)明的對照的量。例如，當期望檢測5％的變體頻率(vf)時，可以使用5fg的本發(fā)明的系統(tǒng)對照(用5％的變體頻率構(gòu)建)來提供對靶標大于1000倍的覆蓋度。如果所需的靈敏度改變?yōu)?％vf，則有可能使用20fg的本發(fā)明的對照(用1％變體頻率構(gòu)建)來提供靶標序列的10000倍的覆蓋度。0.1-1000fg，優(yōu)選地，0.1-100fg，更優(yōu)選地，1.0-50.0fg、1.0-25fg，更優(yōu)選地，1.0-10.0fg，例如，5fg的對照核酸存在于NGS反應(yīng)中可以是足夠的。例如，可以將約100fg至1000fg加入到樣品中。然而，根據(jù)靶標材料的來源，可以調(diào)整正確的量。出于此目的，可以對來自不同來源的參考材料或已物理處理以類似于所需來源材料的材料進行對照核酸的量的滴定分析以確定每個具體測定中所需的適合的量。例如，從植物材料或動物組織提取核酸可能需要不同的預(yù)處理。根據(jù)來自不同來源的核酸的預(yù)期得率或損失，對照材料的定量輸入可以是不同的。

附圖

圖1提供了根據(jù)本發(fā)明的發(fā)明性NGS方法的總覽。A，在該示意圖中進行的八個反應(yīng)。在第一反應(yīng)孔(1)中，僅加入陽性系統(tǒng)對照(SC)，即該反應(yīng)不含任何樣品材料。反應(yīng)孔(2至8)含有FFPE樣品材料和加標SC。還顯示了在自動化工藝流程中使用的裝置。在B和C中，顯示了測序反應(yīng)的結(jié)果。盡管根據(jù)需要檢測了孔(1)和(2至8)中的陽性對照和加標對照SC序列，但是孔(1)中不存在靶標序列。另一方面，成功完成了孔(2)至(8)中的FFPE樣品中存在的致癌基因的測序反應(yīng)?？?1)中使用的系統(tǒng)對照是包含野生型非人核酸序列的質(zhì)粒和包含所述非人核酸序列中的突變的質(zhì)粒的混合物?；旌腺|(zhì)粒，以便突變以5％的變體頻率存在，并且其余的由包含野生型非人核酸序列的質(zhì)粒組成。作為FFPE參考材料，細胞系得自Horizon Discovery Ltd.,UK。對這些細胞系進行工程設(shè)計以具有以限定的變體頻率(2-33％)存在的已知突變。

圖2顯示了帶條碼的NGS運行的結(jié)果，所述運行包含每個PCR(AmpliSeq)反應(yīng)中加入10、5、1、0.5、0.25和0.1fg SC的FFPE-DNA，以及在自動化工藝流程開始時以100fg SC加標到樣品中的類似的DNA樣品。A，SC覆蓋度相對于在AmpliSeq(Life technologies)之前(手動)加入到每個測序反應(yīng)中的SC的已知量的柱狀圖。在工藝流程開始時，用于該測試部分的FFPE DNA不可用SC加標。所得的SC覆蓋度與加入到每個AmpliSeq反應(yīng)中的SC的水平成正比。B，SC覆蓋度相對于SC水平的圖顯示了SC覆蓋度和SC水平之間的線性關(guān)系。在本發(fā)明中，用樣品中所有擴增子的平均覆蓋度歸一化SC覆蓋度。通過內(nèi)插法(紅色虛線)，在提取步驟開始時以100fg的SC加標的FFPE樣品將產(chǎn)生與AmpliSeq反應(yīng)中加入5fg的SC的樣品相當?shù)腟C覆蓋度。該測試表明在自動化工藝流程之后可以回收SC，并且可以估計它在測序反應(yīng)中的水平。因此，SC可以用作加標對照。(注意除SC外，用于該測序運行的所有樣品具有相匹配的DNA輸入)。

圖3顯示了如以上圖2中所述的相同加條型碼的運行。本文所示的柱狀圖是靶標擴增子的平均覆蓋度相對于加入每個樣品的不同SC水平的圖。本發(fā)明中，SC從0.1提高至10fg不抑制樣品中的平均覆蓋度，其顯示在這些水平(0.1至10fg)，SC不會不利地影響靶標擴增子的擴增。

圖4顯示了具有固定的SC(每個AmpliSeq反應(yīng)加入5fg)和不同的DNA輸入(0.1-5ng)的實驗。本發(fā)明中，SC覆蓋度與平均靶標覆蓋度成反比。將未歸一化和歸一化的SC覆蓋度對DNA輸入作圖(分別為A和B)。數(shù)據(jù)顯示SC水平根據(jù)樣品中DNA輸入而改變，并因此作為低DNA輸入的檢查點可以是有用的。

圖5顯示了僅含SC的陰性對照孔(孔#1)。該數(shù)據(jù)表明SC作為陽性對照和陰性對照(NTC)的有用性。A.檢測了SC的序列，但是未檢測人靶標序列的序列。B，在下一代測序后，回收了SC中的所有三個突變。SC的擴增子表示為EC_pUC97。

圖6包括表1，其顯示了作為NGS的質(zhì)量(QC)概念參與系統(tǒng)對照(SC)的使用的邏輯表。成功的測序運行需要每個樣品中加標的SC的序列回收，以及孔(1)中SC(獨立的SC)的序列回收。另外，不應(yīng)對孔(1)中的人靶標進行序列譜圖繪制。以這種方法，孔(1)用作運行的外部、整體陽性對照以及非模板對照(NTC)兩者。加標SC用作每個樣品的提取和樣品中陽性對照。對于成功的樣品，預(yù)期能夠成功檢測預(yù)期的靶標擴增子。無法回收孔(1)中的SC表明了工藝流程的嚴重失敗，并且將認為運行是無效的。即使成功測序，靶標擴增子也可能不可靠。對于不能產(chǎn)生靶標擴增子但是通過了孔(1)中獨立SC的標準的樣品，加標SC的存在表明工藝流程運行，但是樣品具有不足量的可擴增的DNA。加標的不存在表明樣品中抑制劑的存在。

應(yīng)理解盡管已結(jié)合本文所述的實施方式描述了本發(fā)明，但是上述描述以及隨后的實施例旨在說明而不是限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的范圍內(nèi)的其它方面、優(yōu)勢和改變對于本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將是顯而易見的。本文提及的所有專利和出版物以其全部內(nèi)容通過引用并入。

提供以下實施例，從而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員提供如何制備和使用本發(fā)明的組合物的完整公開和描述。所述實施例旨在作為本發(fā)明的非限制性實施例。盡管已盡力確保變量，如量、溫度等的準確度，但是應(yīng)考慮實驗誤差和偏差。除非另外說明，否則分數(shù)是重量份數(shù)，溫度是攝氏度，并且壓力為或接近大氣壓。除非另外說明，否則所有組分是可商業(yè)獲得的。