本發(fā)明還涉及包含熒光標(biāo)記的SOMAmer，其中所述SOMAmer包含對(duì)金黃色葡萄球菌特異的核苷酸序列，其用于檢測(cè)樣品中的金黃色葡萄球菌細(xì)胞，并且涉及包括至少一種此類包含熒光標(biāo)記的SOMAmer的微陣列或生物傳感器以及試劑盒。對(duì)于食物、水、非無(wú)菌產(chǎn)品或環(huán)境的微生物污染的監(jiān)測(cè)通?；趥鹘y(tǒng)的微生物學(xué)方法，如培養(yǎng)方法。對(duì)于檢測(cè)特定的微生物，可以使用選擇性或鑒別性培養(yǎng)基，其分別允許僅選定的微生物生長(zhǎng)或?qū)⒁环N微生物類型與生長(zhǎng)在相同培養(yǎng)基上的另一種微生物區(qū)分開(kāi)來(lái)。這些方法需要若干天以得到結(jié)果，因?yàn)槠湟蕾囉谖⑸锷L(zhǎng)以產(chǎn)生可見(jiàn)菌落的能力。即使其耗時(shí)，但其一直是標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方法。在過(guò)去的二十多年里，在快速微生物學(xué)領(lǐng)域興起了許多技術(shù)和檢測(cè)系統(tǒng)，如基于核酸擴(kuò)增的技術(shù)（NAAT）和免疫測(cè)定法。相比傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)的方法，這些替代技術(shù)減少了檢測(cè)時(shí)間。已知NAAT可以在數(shù)小時(shí)內(nèi)得出污染結(jié)果。然而，此技術(shù)有若干缺點(diǎn)，如方案的復(fù)雜性（需要很高專業(yè)技術(shù)）或假陽(yáng)性問(wèn)題，并且依然受限于樣品的制備方法。免疫測(cè)定法依賴于使用特定的單克隆或多克隆抗體以捕獲和/或檢測(cè)靶微生物。免疫測(cè)定法的效率和成功依賴于測(cè)試中所使用的抗體的質(zhì)量。由于其生產(chǎn)方式（在動(dòng)物體內(nèi)或通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)），使用抗體的一個(gè)缺點(diǎn)是各批次間的再現(xiàn)性問(wèn)題。為了克服抗體的某些缺點(diǎn)并提高測(cè)定質(zhì)量，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了新的親和力結(jié)合劑，如適體。適體是合成的、短的DNA或RNA鏈，其可以折疊成多種結(jié)構(gòu)并可以（如抗體般）特異性結(jié)合至其靶標(biāo)。DNA適體已經(jīng)被用于檢測(cè)微生物（包括金黃色葡萄球菌）。此外，也已經(jīng)報(bào)道了經(jīng)熒光標(biāo)記的DNA適體用于使用基于熒光的方法檢測(cè)全細(xì)菌細(xì)胞：US2012/0071639A1公開(kāi)了用于結(jié)合多種食源性和水源性病原體及生物毒素的特定DNA序列。WO2013/064818A1公開(kāi)了用于檢測(cè)樣品中病原細(xì)菌的經(jīng)熒光標(biāo)記的適體。Cao等人(2009,NucleicAcidsRes37,4621-4628)公開(kāi)了通過(guò)全細(xì)菌SELEX程序獲得的對(duì)金黃色葡萄球菌特異的一組ssDNA適體。這些適體中的五種的組合在識(shí)別不同的金黃色葡萄球菌菌株中取得了良好的效果。Dwivedi等人(2013,ApplMicrobiolBiotechnol97,3677-3686)描述了對(duì)塞洛瓦鼠傷寒沙門氏菌（SalmonellaentericaserovaTyphimurium）特異的DNA適體及其在通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)沙門氏菌上的用途。Gold等人(2010,PLoSOne5,e15004)和Vaught等人(2010,JAmChemSoc132,4141-4151)描述了被稱為SOMAmer（經(jīng)修飾的慢解離率的適體）的新的基于適體的試劑的開(kāi)發(fā)。SOMAmer由單鏈DNA（ssDNA）制成，含有在其5’位置用氨基酸側(cè)鏈模擬物修飾過(guò)的嘧啶殘基并且具有相當(dāng)長(zhǎng)的（>30min）解離速率。這些特征導(dǎo)致了SOMAmer相比標(biāo)準(zhǔn)的RNA或DNA適體更好的親和力和更好的動(dòng)力學(xué)特性。US7947447B2公開(kāi)了用于生產(chǎn)SOMAmer的經(jīng)過(guò)改進(jìn)的SELEX方法，所述SOMAmer能夠以較使用以前的SELEX方法獲得的更慢的解離速率常數(shù)結(jié)合至靶分子。Ochsner等人(2013,DiagnMicrobiolInfectDis.76,278-285)描述了對(duì)艱難梭狀芽孢桿菌（Clostridiumdifficile）毒素（即，微生物蛋白質(zhì)）特異的SOMAmer的表征。在現(xiàn)有技術(shù)中尚未描述SOMAmer在檢測(cè)全細(xì)菌細(xì)胞上的用途。本發(fā)明的目的是為檢測(cè)復(fù)雜樣品中的微生物提供合適的試劑。令人驚奇的是，據(jù)發(fā)現(xiàn)，高度特異的經(jīng)熒光標(biāo)記的SOMAmer是用于通過(guò)基于熒光的方法檢測(cè)復(fù)雜樣品中微生物的非常有效的工具。因此，本發(fā)明涉及檢測(cè)樣品中微生物的方法，包括步驟：a)將所述樣品與包含熒光標(biāo)記的經(jīng)修飾的慢解離率的適體（SOMAmer）溫育；b)任選地洗滌所述樣品；c)通過(guò)基于熒光的檢測(cè)方法分析所述樣品。SOMAmer（經(jīng)修飾的慢解離率的適體）由單鏈DNA（ssDNA）制成，含有在其5’位置用氨基酸側(cè)鏈模擬物修飾過(guò)的嘧啶殘基并且具有相當(dāng)長(zhǎng)的（>30min）解離速率。這些特征導(dǎo)致了SOMAmer相比標(biāo)準(zhǔn)的RNA或DNA適體更好的親和力和更好的動(dòng)力學(xué)特性（Gold等人,2010,PLoSOne5,e15004;Vaught等人,2010,JAmChemSoc132,4141-4151）。如本文所用，“慢解離率”指代適體/靶標(biāo)復(fù)合物開(kāi)始解離所花費(fèi)的時(shí)間。這可以表示為半衰期或50%的適體/靶標(biāo)復(fù)合物已經(jīng)解離的（時(shí)間）點(diǎn)。SOMAmer的解離率或解離速率，表示為半衰期（t1/2）值，可以大于30min、大于60min、大于90min或大于120min。解離時(shí)間可以通過(guò)本領(lǐng)域熟知的監(jiān)測(cè)復(fù)合物的結(jié)合與解離的動(dòng)態(tài)系統(tǒng)（例如，表面等離子體共振）來(lái)測(cè)量?？梢允褂锰烊换蚪?jīng)純化的重組蛋白用多個(gè)經(jīng)修飾的DNA文庫(kù)通過(guò)SELEX方法對(duì)微生物的細(xì)胞表面結(jié)合蛋白質(zhì)生成SOMAmer試劑。用于生成此類SOMAmer的合適的SELEX方法公開(kāi)于US7947447B2中，其以引用方式并入本專利申請(qǐng)的公開(kāi)內(nèi)容中。實(shí)施本發(fā)明所需的常規(guī)的化學(xué)、微生物學(xué)和分子生物學(xué)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且也可見(jiàn)于標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)中。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)微生物涉及細(xì)菌、酵母或真菌。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，微生物為細(xì)菌，優(yōu)選病原細(xì)菌。其可以，例如，選自沙門氏菌屬（如鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌）、大腸桿菌（Escherichiacoli）、李斯特氏菌屬（Listeriaspp）、單核細(xì)胞增多性李斯特菌（Listeriamonocytogenes）、金黃色葡萄球菌、假單胞菌（Pseudomonas）、彎曲菌（Campylobacter）、志賀氏桿菌（Shigella）、鏈球菌（Streptococcus）、分枝桿菌（Mycobacterium）、伯克氏菌（Burkholderia）、軍團(tuán)菌（Legionella）、耶爾森氏菌（Yersinia）、梭狀芽孢桿菌（Clostridium）、棒狀桿菌（Corynebacterium）和弧菌（Vibrio）。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，微生物為金黃色葡萄球菌。金黃色葡萄球菌的表面結(jié)合蛋白質(zhì)（可以針對(duì)其制備例如SOMAmer）的實(shí)例包括：SpA、ClfA、ClfB、FnbA、FnbB、SasD、IsdA、IsdB、IsdC和IsdH。通過(guò)轉(zhuǎn)肽酶介導(dǎo)的LPXTG轉(zhuǎn)肽酶基序的蘇氨酸與甘氨酸之間的裂解，所有這些蛋白質(zhì)均連接到細(xì)胞壁上，并且變成酰胺連接至肽聚糖的五甘氨酸交聯(lián)橋(Marraffini等人,2006,MicrobiolMolBiolRev70:192-221)。金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)A（SpA）存在于細(xì)菌表面并且分泌到細(xì)胞外環(huán)境中。ClfA和ClfB是結(jié)構(gòu)上相關(guān)的纖維蛋白原結(jié)合蛋白(McDevitt等人,1997,EurJBiochem247:416-424;NiEidhin等人,1998,MolMicrobiol30:245-257)。ClfB是負(fù)責(zé)粘附至脫落的前鼻孔上皮細(xì)胞的關(guān)鍵因素之一，并且通常產(chǎn)生于早期指數(shù)生長(zhǎng)期(NiEidhin等人,1998,參見(jiàn)上文)。FnbA和FnbB附著到細(xì)胞外基質(zhì)的組分（既有纖粘蛋白又有彈性蛋白），并且對(duì)于感染期間宿主組織的定殖很重要(Roche等人,2004,JBiolChem279:38433-38440)。SasD是假定的具有未知生理作用的粘附蛋白(Roche等人,2003,Microbiology149:643-654;Ythier等人,2012,MolCellProteomics11:1123-1139)。這些蛋白質(zhì)中的四種屬于鐵響應(yīng)表面決定因子（Isd）系統(tǒng)，該系統(tǒng)在金黃色葡萄球菌中于限鐵條件下被誘導(dǎo)并且對(duì)于捕獲來(lái)自血紅蛋白（IsdB、IsdH）及其跨細(xì)胞壁轉(zhuǎn)運(yùn)子（IsdA、IsdC）的血紅素很重要(Grigg等人,2010,JInorgBiochem104:341-348;Mazmanian等人,2003,Science299:906-909)。通常，待分析的樣品是復(fù)雜樣品，如臨床樣品、食物或飼料樣品、飲料樣品、藥物樣品（包括注射用水）、個(gè)人護(hù)理和/或化妝品樣品。樣品可以是原料、成品，或者可以取自生產(chǎn)或儲(chǔ)存環(huán)境。優(yōu)選地，樣品為臨床樣品、食物樣品、藥物樣品和/或個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品。“復(fù)雜樣品”意指包含不止一種組分的樣品。例如，當(dāng)其為食物或飼料時(shí)-其可以是肉類或肉制品（例如，生或熟肉制品）、乳制品或用于乳制品生產(chǎn)的組合物（如奶酪或酸奶）、基于植物的食物產(chǎn)品、即食食物或食物成分、沙拉產(chǎn)品、嬰兒配方奶粉。在一個(gè)實(shí)施方案中，樣品可以是個(gè)人護(hù)理或化妝產(chǎn)品如眼部護(hù)理產(chǎn)品，如隱形眼鏡護(hù)理液。如果樣品為飲料，則其可以是例如啤酒或取自啤酒釀制期間的樣品、飲用水。藥物樣品涵蓋了人用以及動(dòng)物用（即獸醫(yī)應(yīng)用）藥品。臨床樣品可以例如是體液（特別是血液、血漿或血清）或組織樣品。示例性樣品包括但不限于：食物（例如牛奶、羊奶、山羊奶、馬奶、驢奶、駱駝奶、牦牛奶、水牛奶和馴鹿奶、奶制品、牛肉、山羊肉、羔羊肉、羊肉、豬肉、蛙腿肉、小牛肉、嚙齒類動(dòng)物肉、馬肉、袋鼠肉、禽類肉（包括雞肉、火雞肉、鴨肉、鵝肉、野鴿肉或鴿子肉、鴕鳥(niǎo)肉、鴯鹋肉）、海鮮（包括有鰭魚(yú)如鮭魚(yú)和羅非魚(yú)，以及貝類如軟體動(dòng)物和甲殼類以及蝸牛）、肉制品、植物制品、種子、來(lái)自草本植物的谷類（包括玉蜀黍、小麥、水稻、大麥、高粱和小米）、來(lái)自非草本植物的谷類（包括菜豆、花生、豌豆和小扁豆）、堅(jiān)果（包括杏仁、核桃和松子）、含油種子（包括葵花、油菜和芝麻）、蔬菜如食根類蔬菜（包括馬鈴薯、木薯和蕪青）、食葉類蔬菜（包括莧菜、菠菜和甘藍(lán)）、海生蔬菜（包括掌狀紅皮藻、昆布和翅菜）、食莖類蔬菜（包括竹筍、仙人掌和蘆筍）、食花類蔬菜（包括洋薊、花椰菜和黃花菜）以及食果實(shí)類蔬菜（包括南瓜、秋葵和茄子）、水果、香草和香料）、全血、尿液、痰液、唾液、羊水、血漿、血清、肺灌洗液和組織（包括但不限于肝、脾、腎、肺、腸、腦、心臟、肌肉、胰腺等）。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，得自任何以上示例性樣品或所述示例性樣品的混合物或包括一種或多種所述示例性樣品的組合物的細(xì)胞裂解物、提取物或（均質(zhì)化）材料也是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)的樣品。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，SOMAmer包含對(duì)金黃色葡萄球菌特異的核苷酸序列。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“核苷酸序列”指代寡核苷酸序列或多核苷酸序列及其變體、同系物、片段和衍生物（如其部分）。核苷酸序列可以源于合成或重組，其可以是單鏈的，代表有義或反義鏈。與本發(fā)明有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“核苷酸序列”包括合成的DNA和RNA。優(yōu)選地，可以使用本領(lǐng)域熟知的化學(xué)方法整體地或部分地合成根據(jù)本發(fā)明的SOMAmer的核苷酸序列。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“特異的”意指，相比其它微生物，SOMAmer選擇性地與金黃色葡萄球菌反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明的SOMAmer可以類似抗體的方式使用。與抗體類似，SOMAmer提供靶標(biāo)結(jié)合特異性。在本發(fā)明的一個(gè)方面，SOMAmer包含選自下列的核苷酸序列：SEQIDNO:15和SEQIDNO:16或其片段或與其具有至少80%同一性的序列，或在嚴(yán)格條件下與其雜交的序列。優(yōu)選地，SOMAmer包含選自下列的核苷酸序列：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12或其片段或與其具有至少80%同一性的序列，或在嚴(yán)格條件下與其雜交的序列。更優(yōu)選地，SOMAmer包含選自下列的核苷酸序列：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12。在本發(fā)明的非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，SOMAmer包含根據(jù)SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的核苷酸序列。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“片段”意指本文教導(dǎo)的適體序列的一部分，相比完整序列，其對(duì)目的靶標(biāo)具有相同或更好的親和力、特異性或功能活性。片段可以由約35個(gè)核苷酸（例如33-37個(gè)核苷酸）構(gòu)成。優(yōu)選地，片段具有與原始全長(zhǎng)適體在該片段所代表的區(qū)域上相似的二級(jí)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明也涵蓋了與本發(fā)明的核酸序列具有至少80%的序列同一性的序列的通途。在本上下文中，所采取的相似序列包括可能與目標(biāo)序列（subjectsequence）具有至少80%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95或98%的同一性的核苷酸序列。通常，相似序列將包含與目標(biāo)SOMAmer相同或相似的二級(jí)結(jié)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所采取的相似序列包括相比目標(biāo)序列具有一個(gè)或若干個(gè)添加、缺失和/或置換的核苷酸序列。序列同一性比較可以通過(guò)肉眼，或更常用地，借助容易得到的序列比較程序進(jìn)行。這些市售的計(jì)算機(jī)程序可以計(jì)算兩個(gè)或更多個(gè)序列之間的%同一性。本發(fā)明也涵蓋了與本發(fā)明的核酸序列互補(bǔ)的序列或能夠雜交至本發(fā)明的序列或與其互補(bǔ)的序列的序列。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“雜交”應(yīng)當(dāng)包括“核酸鏈與互補(bǔ)鏈通過(guò)堿基配對(duì)連接的方法”。雜交在嚴(yán)格條件下（例如，50℃和0.2xSSC{1xSSC=0.15MNaCl、0.015M檸檬酸鈉pH7.0}）進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明，SOMAmer包含熒光標(biāo)記。所述標(biāo)記可連接到SOMAmer的5’或3’端。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述標(biāo)記連接到SOMAmer的5’端。技術(shù)人員很清楚用于將熒光標(biāo)記連接到核酸鏈的技術(shù)。這些方法中的任一種均可用于本發(fā)明以將熒光標(biāo)記連接到SOMAmer，例如，如Schubert等人,1990,NucleicAcidsResearch18,3427所述。理論上，可以在寡核苷酸合成期間或之后連接熒光標(biāo)記。熒光標(biāo)記可以直接或間接連接到SOMAmer。對(duì)于間接連接而言，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何機(jī)制，如使用生物素和鏈霉親和素或地高辛（DIG）和抗地高辛。合適的熒光標(biāo)記由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)不同的參數(shù)選擇，如標(biāo)記的大小和/或光學(xué)特性（如顏色、熒光激發(fā)波長(zhǎng)、熒光發(fā)射波長(zhǎng)和強(qiáng)度）。大量各種各樣的熒光標(biāo)記在市場(chǎng)上有售。合適的熒光標(biāo)記的實(shí)例有：熒光素染料（如熒光素、6-FAM（6-羧基熒光素）、JOE、TET、HEX）、若丹明染料（如5’-四甲基若丹明、ROX、TRITC、X-若丹明、麗絲胺若丹明B）、花青染料（如Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、IRD700、IRD800、別藻藍(lán)蛋白（APC））、甲藻葉綠素（PerCP）、R-藻紅蛋白（R-PE）、香豆素染料（如羥基香豆素、氨基香豆素、甲氧基香豆素）和量子點(diǎn)。另外的實(shí)例有：AlexaFluor?350、AlexaFluor?405、AlexaFluor?430、AlexaFluor?488、AlexaFluor?500、AlexaFluor?514、AlexaFluor?532、AlexaFluor?546、AlexaFluor?555、AlexaFluor?568、AlexaFluor?594、AlexaFluor?610、AlexaFluor?633、AlexaFluor?647、AlexaFluor?660、AlexaFluor?680、AlexaFluor?700、AlexaFluor?750、AlexaFluor?790、DyLight350、DyLight408、DyLight488、DyLight549、DyLight594、DyLight633、DyLight649、DyLight680、DyLight759、DyLight800、eFluor?660、CascadeBlue、PacificBlue、PacificOrange、LuciferYellow、NBD、Red613、TruRed、FluorX、BODIPY-FL、TexasRed。優(yōu)選地，使用熒光素。根據(jù)本發(fā)明的方法涉及步驟a）將樣品與包含熒光標(biāo)記的經(jīng)修飾的慢解離率的適體（SOMAmer）溫育。這意味著將包含熒光標(biāo)記的SOMAmer與樣品混合并溫育一段時(shí)間。通常，在使用SOMAmer通過(guò)基于熒光的檢測(cè)方法進(jìn)一步分析之前，將樣品直接接種到緩沖液或生長(zhǎng)培養(yǎng)液中（任選溫育）。如果樣品是固體樣品，則可能有必要在加入緩沖液或生長(zhǎng)培養(yǎng)液之后或期間進(jìn)行均化（stomaching）。在另外的可選的實(shí)施方案中，用液體沖洗固體樣品，并隨后收集所述液體用于另外任選的在生長(zhǎng)培養(yǎng)液中溫育并用SOMAmer進(jìn)一步分析。可選地，將SOMAmer與合適的緩沖液或與生長(zhǎng)培養(yǎng)液混合，隨后與樣品混合。如果樣品是固體樣品，則可能有必要在加入包含SOMAmer的緩沖液/生長(zhǎng)培養(yǎng)液之后或期間進(jìn)行均質(zhì)化。合適的緩沖液可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇。其通常具有大于5而小于9的pH值，優(yōu)選大于6而小于8，更優(yōu)選在6.5到7.5之間。可用于本發(fā)明的方法中的緩沖液優(yōu)選自磷酸緩沖液、磷酸鹽緩沖生理鹽水緩沖液（PBS）、2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇（TRIS）緩沖液、TRIS緩沖生理鹽水緩沖液（TBS）和TRIS/EDTA（TE）。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述緩沖液還包含MgCl2。MgCl2–如果存在-通常以0.005至3M之間、優(yōu)選0.01至1M之間、更優(yōu)選0.01至0.5M之間，例如25mM，的濃度存在。通常，大約0.07μmol/L的SOMAmer將足以檢測(cè)樣品中107個(gè)靶微生物的細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用0.01至10μmol/l緩沖液的SOMAmer濃度。溫育通常在16℃至30℃的溫度、優(yōu)選18℃至28℃的溫度、更優(yōu)選室溫下進(jìn)行。通常，溫育時(shí)間周期在1至60分鐘、優(yōu)選5至30分鐘。根據(jù)本發(fā)明所用的SOMAmer的濃度可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。任選地，根據(jù)本發(fā)明的方法可涉及洗滌樣品的步驟。在此步驟期間，可以在檢測(cè)結(jié)合態(tài)SOMAmer的存在之前，洗脫任何未結(jié)合的SOMAmer。通常，洗滌意指將樣品離心并將團(tuán)塊重懸浮于緩沖液中。所述洗滌步驟可以進(jìn)行一次或重復(fù)若干次，例如兩次、3次或4次。在根據(jù)本發(fā)明的步驟c）中，通過(guò)基于熒光的檢測(cè)方法分析樣品?；跓晒獾臋z測(cè)方法優(yōu)選自：流式細(xì)胞術(shù)、固相式細(xì)胞術(shù)、基于熒光的分析方法和熒光成像系統(tǒng)（如熒光顯微術(shù)）。流式細(xì)胞術(shù)是一種分析方法，其允許測(cè)量由發(fā)光的單個(gè)細(xì)胞所散射的光和所產(chǎn)生的熒光發(fā)射。通常，將待分析的細(xì)胞或顆粒懸浮于液體中并單獨(dú)通過(guò)激光束。通過(guò)檢測(cè)器收集每個(gè)顆粒的散射光（與顆粒大小和復(fù)雜性有關(guān)）和熒光發(fā)射（由于對(duì)靶顆粒/細(xì)胞的熒光標(biāo)記）并發(fā)送至計(jì)算機(jī)。由于每個(gè)顆?；蚣?xì)胞是分別調(diào)查的，所以結(jié)果代表了累積的個(gè)體細(xì)胞特征（álvarez-Barrientos等人2000,ClinMicrobiolRev,13(2):167–195）。將可含有靶分析物的樣品與用合適的熒光分子標(biāo)記的對(duì)該靶分析物特異的試劑（例如，根據(jù)本發(fā)明的SOMAmer）混合。在施加恰當(dāng)?shù)慕Y(jié)合條件及任選的洗滌步驟之后，然后通過(guò)流式細(xì)胞儀處理經(jīng)標(biāo)記的樣品：細(xì)胞單獨(dú)地通過(guò)激光束并分析所得散射光和熒光信號(hào)以收集與該靶分析物（例如細(xì)胞）有關(guān)的信息。熒光成像系統(tǒng)提供了被觀察對(duì)象（例如單個(gè)細(xì)胞、微菌落）的圖像，所述圖像是使用由熒光現(xiàn)象發(fā)射的光所形成的（Barrett和Myers2003,FoundationsofImageScience.InWileySeriesinpureandAppliedOpticsed.SalehB.E.A.USA,NewJersey,Hoboken:JohnWiley&Sons,Inc）。熒光顯微術(shù)是熒光成像系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)例，其中被成像的特征很小并通過(guò)光學(xué)放大獲得。將可能含有靶分析物的樣品與用合適的熒光分子標(biāo)記的對(duì)該靶分析物特異的試劑（例如SOMAmer）混合。在施加恰當(dāng)?shù)慕Y(jié)合條件及任選的洗滌步驟之后，將經(jīng)標(biāo)記的樣品置于顯微鏡的物鏡下。設(shè)置顯微鏡的參數(shù)以匹配熒光標(biāo)記的特性。固相式細(xì)胞術(shù)是用于檢測(cè)固體表面上單個(gè)顆粒/細(xì)胞的方法。通常，固相式細(xì)胞術(shù)是在膜上實(shí)現(xiàn)的。基于圖像的定量系統(tǒng)將結(jié)合任何選定標(biāo)記在膜上的定位提供其數(shù)量、大小和形狀。將可能含有靶分析物的樣品通過(guò)具有適當(dāng)孔徑（即對(duì)于細(xì)菌而言，0.4μm）的黑膜過(guò)濾器（例如聚酯或聚碳酸酯）過(guò)濾。然后，將保留下來(lái)的細(xì)胞用經(jīng)合適的熒光分子標(biāo)記的對(duì)該靶分析物特異的試劑（例如SOMAmer）標(biāo)記。隨后用激光掃描所述過(guò)濾器，所述激光允許膜上的熒光事件（例如經(jīng)標(biāo)記的微生物）被一系列檢測(cè)單元所檢測(cè)到。這使得能夠?qū)δど系陌蟹治鑫镞M(jìn)行檢測(cè)和計(jì)數(shù)（Reynolds和Fricker1999,JApplMicrobiol86,785–795;Vanhee等人2009,NatProtoc4,224-231）?；跓晒獾姆治龇椒ㄊ菧y(cè)量熒光信號(hào)總量的方法，其用于檢測(cè)和/或測(cè)量已經(jīng)合適的熒光標(biāo)簽標(biāo)記的靶分析物的量（Skoog等人2007,PrinciplesofInstrumentalAnalysis,第六版,USA,California,Belmont:Brooks/Cole）。此類方法可以在各種載體（例如微板、管、微管、微流體裝置）上實(shí)施。將可能含有靶分析物的樣品與用合適的熒光分子標(biāo)記的對(duì)該靶分析物特異的試劑（例如SOMAmer）混合。在施加恰當(dāng)?shù)慕Y(jié)合條件及任選的洗滌步驟之后，將裝有經(jīng)標(biāo)記的樣品的容器（例如微孔板、小管）暴露于特定波長(zhǎng)以恰當(dāng)?shù)丶ぐl(fā)熒光染料。通過(guò)恰當(dāng)?shù)墓鈧鞲衅魇占ㄗ鳛榘蟹治鑫锱c熒光試劑結(jié)合的結(jié)果而發(fā)生的）熒光發(fā)射。通過(guò)傳感器對(duì)此熒光量進(jìn)行定量并就與參考數(shù)據(jù)的相關(guān)性進(jìn)行了處理以提供對(duì)分析物的量度。任何熒光分子均可以用于任何基于熒光的檢測(cè)方法。對(duì)于給定的檢測(cè)方法而言，關(guān)鍵的要求在于適合于所選熒光分子的激發(fā)源以及熒光檢測(cè)器的可用性。用于熒光檢測(cè)（合適的熒光標(biāo)記）的波長(zhǎng)組合的實(shí)例：-激發(fā)：488nm(藍(lán)色激光)+發(fā)射：530nm(熒光素、AlexaFluor?488)、585nm(R-藻紅蛋白–R-PE)以及>670nm(甲藻葉綠素-PerCP)-激發(fā)：532-561nm(綠色和黃/綠色激光)+發(fā)射：560(AlexaFluor?532)、585(R-PE-R-藻紅蛋白)-激發(fā)：635nm(紅色激光)+發(fā)射：660nm(別藻藍(lán)蛋白–APC/花青5–Cy5/eFluor?660/AlexaFluor?647)。根據(jù)本發(fā)明的方法相比使用抗體提供了若干優(yōu)點(diǎn)：-在溶液中優(yōu)越的熱穩(wěn)定性-更低的分子量-更高的多路復(fù)用能力-對(duì)熱、干燥和溶劑的化學(xué)穩(wěn)定性-可逆復(fù)性-易于試劑生產(chǎn)-一致的批次間表現(xiàn)-更低的成本。本發(fā)明還涉及包含熒光標(biāo)記的經(jīng)修飾的慢解離率的適體（SOMAmer），其中所述SOMAmer包含對(duì)金黃色葡萄球菌特異的核苷酸序列。如上所述定義了SOMAmer、熒光標(biāo)記及其優(yōu)選的實(shí)施方案。因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含熒光標(biāo)記的SOMAmer，其特征在于，所述SOMAmer包含選自下列的核苷酸序列：SEQIDNO:15和SEQIDNO:16或其片段或與其具有至少80%同一性的序列，或在嚴(yán)格條件下與其雜交的序列。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含熒光標(biāo)記的SOMAmer，其特征在于，所述SOMAmer包含選自下列的核苷酸序列：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12或其片段或與其具有至少80%同一性的序列，或在嚴(yán)格條件下與其雜交的序列。在另外的方面，本發(fā)明涉及包含熒光標(biāo)記的SOMAmer，其特征在于，所述SOMAmer包含根據(jù)SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的核苷酸序列。在另外的方面，本發(fā)明涉及如上文所定義的包含熒光標(biāo)記的SOMAmer在檢測(cè)樣品中金黃色葡萄球菌細(xì)胞上的用途。根據(jù)本發(fā)明的SOMAmer可以被固定在（例如結(jié)合或粘附于）基底或載體（例如微載體）上。本發(fā)明也涉及包含至少一種如上所述包含熒光標(biāo)記的SOMAmer的微陣列或生物傳感器。生物傳感器是用于檢測(cè)靶分析物的分析裝置，其將生物應(yīng)答轉(zhuǎn)化成電信號(hào)。生物傳感器的應(yīng)用使用生物識(shí)別元件（如酶、抗體和核酸）以檢測(cè)靶分子。通常的生物傳感器含有三個(gè)組件：可以識(shí)別或結(jié)合分析物的生物傳感元件、將檢測(cè)事件轉(zhuǎn)化成可測(cè)量信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)元件以及將信號(hào)轉(zhuǎn)化成數(shù)字格式的顯示器。傳感元件主要限定生物傳感器的選擇性和靈敏度。檢測(cè)分析物通常是基于用電子讀數(shù)或光學(xué)讀數(shù)傳感分析物。根據(jù)本發(fā)明的包含熒光標(biāo)記的SOMAmer可以用作生物傳感器應(yīng)用中的生物元件。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括至少一種如上文定義的包含熒光標(biāo)記的SOMAmer的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒可以是快速檢測(cè)試劑盒。所述試劑盒可以例如包括i）至少一種（如2、3或4種）根據(jù)本發(fā)明的包含熒光標(biāo)記的SOMAmer以及ii）如何使用所述SOMAmer的說(shuō)明書(shū)。附圖說(shuō)明圖1：在用不同濃度的經(jīng)熒光標(biāo)記的4520-8(SEQIDNO:3)和4531-56(SEQIDNO:1)SpASOMAmer染色107個(gè)細(xì)胞（15分鐘的結(jié)合反應(yīng)）后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)金黃色葡萄球菌。(a)于不同SOMAmer濃度（n=3）下獲得的平均熒光強(qiáng)度（柱）和經(jīng)染色細(xì)胞的百分比（線）的圖示?；疑菏褂?520-8(SEQIDNO:3)時(shí)的平均熒光強(qiáng)度，黑色柱：使用4531-56(SEQIDNO:1)時(shí)的平均熒光強(qiáng)度。黑線：使用4520-8(SEQIDNO:3)或4531-56(SEQIDNO:1)時(shí)的經(jīng)染色細(xì)胞的百分比（同一數(shù)據(jù)）。(b)使用4531-56(SEQIDNO:1)SpASOMAmer時(shí)獲得的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果的實(shí)例。黑色區(qū)域：未染色的細(xì)胞群體；用0.07μmoll-1（淺灰色）、0.7μmoll-1（深灰色）和7μmoll-1（黑色實(shí)線）染色的細(xì)胞群體。設(shè)置M1和M2區(qū)間以將對(duì)照未染色細(xì)胞的熒光信號(hào)（自體熒光）包括在M1中。因此，位于M2區(qū)間中的細(xì)胞群體被視為已染色的。圖2：在用7μmoll-1的經(jīng)熒光標(biāo)記的4531-56(SEQIDNO:1)SpASOMAmer染色107個(gè)細(xì)胞后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)金黃色葡萄球菌。比較不同的染色時(shí)間（n=3）。平均熒光強(qiáng)度以柱表示而經(jīng)染色細(xì)胞的百分比以線圖表示。圖3：在用0.7μM的經(jīng)熒光標(biāo)記的4531-56(SEQIDNO:1)SpASOMAmer染色107個(gè)細(xì)胞后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)金黃色葡萄球菌。比較不同的染色時(shí)間（n=3）。相比經(jīng)過(guò)5分鐘的染色溫育所獲得的強(qiáng)度，使用30分鐘的染色溫育，平均熒光強(qiáng)度提高了1.4倍。實(shí)施例：實(shí)施例1：純化金黃色葡萄球菌靶標(biāo)用表1中所示的引物從金黃色葡萄球菌NRS384(USA300)的基因組DNA中PCR擴(kuò)增編碼所需靶標(biāo)或靶域的基因的相關(guān)部分，并將其克隆到pCR-ScriptSK+(Stratgene)中。將clfA基因以BamHI-SacI盒的形式轉(zhuǎn)移到表達(dá)載體pET-51b(EMD-Novagen)中，所述載體內(nèi)含氨基末端Strep標(biāo)簽和羧基末端His10標(biāo)簽。對(duì)質(zhì)粒測(cè)序以驗(yàn)證基因的身份以及所克隆的DNA片段與載體編碼的His標(biāo)簽和Strep標(biāo)簽的序列的正確基因融合。表1：擴(kuò)增和克隆編碼金黃色葡萄球菌細(xì)胞表面蛋白的基因在大腸桿菌BL21(DE3)或BL21(DE3)/pLysE(EMD/Novagen)中過(guò)表達(dá)重組蛋白。相對(duì)于生長(zhǎng)溫度（25-37℃）和誘導(dǎo)時(shí)間（4-15h）優(yōu)化了可溶性蛋白的最佳表達(dá)條件。將來(lái)自0.1-0.8L培養(yǎng)物的細(xì)胞用10mLBugBuster/核酸酶試劑（EMDMillipore）裂解。依序通過(guò)Ni-NTA瓊脂糖和Strep?Tactin?Superflow?瓊脂糖（EMDMillipore）的親和力層析，將重組的、經(jīng)His10/Strep標(biāo)簽的蛋白質(zhì)從可溶性級(jí)分中純化出來(lái)。天然的葡萄球菌蛋白質(zhì)A購(gòu)自VWR并且用NHS-PEG4-生物素（PierceBiotechnology）進(jìn)行了生物素?；?。使用QuickStartBradford蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒（BioRad）測(cè)定了蛋白質(zhì)濃度。實(shí)施例2：選擇SOMAmer將分別使用5-芐基氨羰基-dU（BndU）、5-萘基甲基氨羰基-dU（NapdU）和5-色氨羰基-dU（TrpdU）的文庫(kù)用于使用金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)的SELEX。每次選擇均從1nmol（1014-1015）含有40個(gè)連續(xù)隨機(jī)化位置的序列（其側(cè)接PCR擴(kuò)增所需的固定序列）開(kāi)始。SELEX基本上如(Gold等人2010,PLoSOne5:e15004;Ochsner等人2013,DiagnMicrobiolInfectDis.;Vaught等人2010,JAmChemSoc132:4141-4151)所述進(jìn)行。在整個(gè)SELEX及隨后的結(jié)合測(cè)定中使用緩沖液SB18T，其由40mMHEPESpH7.5、0.1MNaCl、5mMKCl、5mMMgCl2和0.05%Tween-20組成。進(jìn)行了八輪選擇，并且從第2輪開(kāi)始，用10mM硫酸葡聚糖進(jìn)行動(dòng)力學(xué)挑戰(zhàn)以利于慢解離率。用順磁性TalonDynabeads?Talon?（Invitrogen）（其結(jié)合重組蛋白上的His10標(biāo)簽）或用MyOne鏈親和素C1微珠（LifeTechnologies）（針對(duì)經(jīng)生物素?；腟pA）實(shí)現(xiàn)SOMAmer–靶標(biāo)復(fù)合物的分配。將選定的序列從與微珠結(jié)合的靶標(biāo)上用80μl40mMNaOH洗脫，用20μl160mMHCl中和并用KODEXDNA聚合酶（Invitrogen-LifeTechnologies）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用KODEXDNA聚合酶通過(guò)從PCR產(chǎn)物的反義鏈引物延伸制備了用于下一輪的經(jīng)修飾的DNA并純化，如(Gold等人,2010)中所述。對(duì)從第3到8輪中選定的DNA的DNA再結(jié)合動(dòng)力學(xué)分析（C0t）被用于評(píng)估后幾輪期間的序列趨同性，指示出一些序列或序列家族的增加的豐度?？寺≡谌芤航Y(jié)合放射性測(cè)試（見(jiàn)下）中表現(xiàn)出良好親和力（Kd≤10nM）的SOMAmer池并確定48個(gè)克隆/池的序列。根據(jù)序列模式和多樣性選擇單個(gè)的SOMAmer并采用酶法制備以用于進(jìn)一步表征。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)法以1μmol的規(guī)模制備48-50聚體形式的合成SOMAmer并經(jīng)過(guò)HPLC純化。其含有5’生物素-dA或5’熒光素-生物素-dA以及在3’端倒置的dT核苷酸（3’idT)以增加針對(duì)3’至5’核酸外切酶的穩(wěn)定性。實(shí)施例3：SOMAmer平衡和全細(xì)胞放射性標(biāo)記結(jié)合測(cè)定在結(jié)合測(cè)定前，通過(guò)在95℃加熱5min使SOMAmer適當(dāng)?shù)卣郫B，接著經(jīng)過(guò)10－15min時(shí)間段冷卻至室溫。在經(jīng)放射性標(biāo)記的SOMAmer（10-20pM）與連續(xù)稀釋的蛋白質(zhì)（0.001－100nM）的平衡溶液結(jié)合測(cè)定中確定親和力（Kd）并將ZorbaxPSM-300A（AgilentTechnologies）樹(shù)脂用于分配至過(guò)濾平板上，如（Gold等人2010）中所述。在克隆前，也使用表皮葡萄球菌（S.epidermidis）、溶血性鏈球菌（S.hemolyticus）、化膿性鏈球菌（S.pyogenes）、糞腸球菌（E.faecalis）、大腸桿菌和銅綠假單胞菌作為對(duì)照，在2h的平衡結(jié)合測(cè)定中測(cè)試了SOMAmer池對(duì)金黃色葡萄球菌的特異性結(jié)合。細(xì)胞密度在105–108CFU/mL的范圍內(nèi)，并且向結(jié)合緩沖液中加入了0.1mM硫酸葡聚糖和0.35MNaCl以減少非特異性背景。另外，針對(duì)與八種不同金黃色葡萄球菌的結(jié)合對(duì)單個(gè)的核酸適體進(jìn)行篩選，所述金黃色葡萄球菌屬于不同的譜系，包括：NRS382、NRS383、NRS384、NRS123、NRS385、NRS386、NRS103（NARSA和ATCC29213（ATCC）。結(jié)果：池親和力測(cè)定確認(rèn)，針對(duì)用經(jīng)BndU、NapdU或TrpU修飾的ssDNA獲得的總共22個(gè)池，成功選擇了SOMAmer，而池親和力在0.13-8.90nM的范圍內(nèi)。觀察到了對(duì)金黃色葡萄球菌的特異性結(jié)合，但未觀察到對(duì)表皮葡萄球菌、溶血性鏈球菌、化膿性鏈球菌、糞腸球菌、大腸桿菌或銅綠假單胞菌的結(jié)合。針對(duì)來(lái)自每個(gè)池的各48個(gè)克隆所確定的序列的比對(duì)示出了共享相同序列模式的多拷貝克隆和家族。在親和力測(cè)定中篩選了代表性的克隆，而最佳SOMAmer的Kd在0.03-2.17nM的范圍內(nèi)（表2）。表2：用于金黃色葡萄球菌表面蛋白的SOMAmer試劑，顯示了針對(duì)在SELEX中獲得的原始全長(zhǎng)序列的親和力（Kd）SOMAmer對(duì)經(jīng)純化的金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)的結(jié)合親和力與所觀察到的對(duì)全細(xì)菌的結(jié)合有良好的相關(guān)性。一個(gè)SpA-NapdU克隆（4520-8;SEQIDNO:3）和一個(gè)tSpA-TrpdU克?。?531-56;SEQIDNO:1）能夠結(jié)合所有經(jīng)測(cè)試的金黃色葡萄球菌的全細(xì)胞，其在放射性標(biāo)記過(guò)濾結(jié)合測(cè)定中的檢測(cè)極限為~104個(gè)細(xì)胞/孔（105–106個(gè)細(xì)胞/mL）。未觀察到對(duì)表皮葡萄球菌或乙型鏈球菌的結(jié)合，指示出這些SOMAmer良好的特異性。對(duì)于ClfASOMAmer而言，觀察到了類似的結(jié)合特性。SOMAmer的序列列于表3中。表3：SOMAmer的序列：表3中所提供的序列的“T”核苷酸是經(jīng)C-5修飾的嘧啶。更具體地講，靶向SpA蛋白的SOMAmer的“T”核苷酸是NapdUTP（或NapdU）核苷酸，而靶向ClfA蛋白的SOMAmer的“T”核苷酸是BndUTP（或BndU）核苷酸。另外，結(jié)合SpA蛋白的適體序列基序（4520）由以下序列表示：GGCWWCGGGWACCWAWWAWNGGWWWAGCC(N)nGWC（SEQIDNO:15），其中所述序列中的“W”表示可能由經(jīng)C-5修飾的嘧啶所占據(jù)的位置，而其中所述序列中的“N”表示可能由任何未修飾或經(jīng)修飾的核苷酸所占據(jù)的位置，并且n為0到2（或0、1或2）。優(yōu)選地，所述經(jīng)C-5修飾的嘧啶為NapdU或BndU。更優(yōu)選地，所述經(jīng)C-5修飾的嘧啶為NapdU。結(jié)合ClfA蛋白的適體序列基序（4503）由以下序列表示：AWCWGGWC(N)nAWCWGGWWWWWAAG（SEQIDNO:16），其中所述序列中的“W”表示可能由經(jīng)C-5修飾的嘧啶所占據(jù)的位置，而其中所述序列中的“N”表示可能由任何未修飾或經(jīng)修飾的核苷酸所占據(jù)的位置。另外，n可以是從1到30（或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30）或從2到20（或2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20）或從5到18（或5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18）或從10到16（或10、11、12、13、14、15或16）的數(shù)。優(yōu)選地，n為16。優(yōu)選地，所述經(jīng)C-5修飾的嘧啶為NapdU或BndU。更優(yōu)選地，所述經(jīng)C-5修飾的嘧啶為BndU。實(shí)施例4：通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)金黃色葡萄球菌細(xì)胞如上所述以含有5’ABflT（生物素和熒光素）的48聚體的形式合成了針對(duì)蛋白質(zhì)A（SpA）的SOMAmer，用于流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)。確認(rèn)了以下的活性：4520-8(SEQIDNO:3)(Kd=0.17nM)和4531-56(SEQIDNO:1)(Kd=0.09nM)。在胰酶大豆肉湯（TrypcaseSoyBroth，TSB;bioMérieux,Craponne,France）中用冷凍保存的金黃色葡萄球菌DSM1104（或ATCC25923）培養(yǎng)物接種并在32.5℃搖動(dòng)溫育過(guò)夜。然后將過(guò)夜培養(yǎng)物在新鮮TSB中于32.5℃搖動(dòng)繼代培養(yǎng)直至工作培養(yǎng)物的OD600達(dá)到0.8（大約108細(xì)菌ml-1）并分成大約107個(gè)細(xì)胞/管的等分試樣。通過(guò)在10000g離心2min收獲細(xì)菌。將團(tuán)塊重懸浮于含有SOMAmer（濃度范圍0.07–7μmoll-1）的100μlPBS/25mmoll-1MgCl2中。在室溫下溫育5、15或30min之后，將細(xì)菌在10000g離心2min并將團(tuán)塊用PBS/25mmoll-1MgCl2重懸浮。將此洗滌步驟重復(fù)兩次。依照相同的程序（不加入SOMAmer）制備了未染色細(xì)菌作為對(duì)照。然后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析了未染色和已染色的細(xì)菌。所有實(shí)驗(yàn)均用配備了在488nm發(fā)射的風(fēng)冷15mW氬離子激光的FACSCalibur?流式細(xì)胞儀（BectonDickinsonBiosciences;LePontdeClaix,France）進(jìn)行。在FL1通道（530±30nm）中以對(duì)數(shù)信號(hào)的形式收集綠色熒光。在這些測(cè)定中確定了作為SOMAmer結(jié)合結(jié)果產(chǎn)生的平均熒光強(qiáng)度和熒光細(xì)胞（在限定的門中，n=10000）百分比。使用BDCellQuest?軟件（BectonDickinsonBiosciences）分析來(lái)自FACSCalibur?的數(shù)據(jù)。結(jié)果：經(jīng)熒光標(biāo)記的SpASOMAmer4520-8(SEQIDNO:3)和4531-56(SEQIDNO:1)被用于評(píng)估其通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)金黃色葡萄球菌的效率。兩種SOMAmer在對(duì)全金黃色葡萄球菌細(xì)胞染色上均表現(xiàn)良好。雖然100%的所述細(xì)胞在0.07μmoll-1的低SpASOMAmer濃度下均已經(jīng)被染色，但是在0.7μmoll-1和7μmoll-1的更高的試劑濃度下，平均熒光強(qiáng)度大幅增加（圖1a）。此數(shù)據(jù)與當(dāng)高度豐富的細(xì)胞表面組分被經(jīng)熒光標(biāo)記的SOMAmer飽和時(shí)所預(yù)期的增加是一致的。確保通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)精確區(qū)分陰性群體（未染色細(xì)胞）和陽(yáng)性群體（已染色細(xì)胞）的SpASOMAmer的最低濃度可以設(shè)為0.07μmoll-1（圖1b）。為了確定最佳結(jié)合時(shí)間，進(jìn)行了時(shí)程測(cè)定。在存在7μmoll-1SpASOMAmer的情況下，經(jīng)過(guò)僅5-min的結(jié)合反應(yīng)之后，100%的細(xì)胞均已經(jīng)被染色（圖2）。通過(guò)將結(jié)合時(shí)間增加至15和30分鐘，熒光強(qiáng)度分別提高了約2倍和3倍，導(dǎo)致更好地區(qū)分陰性群體和陽(yáng)性群體。當(dāng)用更低的SpASOMAmer濃度（0.7μmoll-1）標(biāo)記細(xì)胞時(shí)，熒光強(qiáng)度的這種增加不太明顯，可能是由于限制了SOMAmer濃度（圖3）。所開(kāi)發(fā)的SpASOMAmer經(jīng)證實(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌具有高染色效率。在實(shí)驗(yàn)條件中，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)金黃色葡萄球菌的最佳檢測(cè)是在使用低試劑濃度（0.7μmoll-1）和短結(jié)合時(shí)間（15min）的簡(jiǎn)單的一步程序中實(shí)現(xiàn)的。已經(jīng)報(bào)道了用于使用單個(gè)或組合適體的基于流式細(xì)胞術(shù)的金黃色葡萄球菌檢測(cè)的DNA適體（Cao等人2009)或用于使用由全細(xì)胞SELEX生成的適體檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌的DNA適體（Dwivedi等人2013）。然而，在這些研究中獲得的經(jīng)適體標(biāo)記的細(xì)胞的百分比未接近100%并且熒光強(qiáng)度相比用本發(fā)明的SOMAmer所獲得的熒光強(qiáng)度更弱。實(shí)施例5：比較根據(jù)本發(fā)明的SOMAmer與標(biāo)準(zhǔn)適體由于根據(jù)本發(fā)明的SOMAmer獨(dú)特的慢解離率特征，相比標(biāo)準(zhǔn)RNA或DNA適體，這些試劑應(yīng)當(dāng)具有更好的親和力和更好的動(dòng)力學(xué)特性。為了證明這一論斷，將根據(jù)本發(fā)明的SpASOMAmer與對(duì)金黃色葡萄球菌特異的DNA適體（未知靶抗原）進(jìn)行了比較。所述DNA適體由IntegratedDNATechnologies制備。本發(fā)明的適體和標(biāo)準(zhǔn)適體的方案均與實(shí)施例4中所述的相同（標(biāo)準(zhǔn)適體的不同之處：在測(cè)定前不加熱適體；PBS用作結(jié)合緩沖液）。由金黃色葡萄球菌DSM1104所獲得的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果：結(jié)合劑濃度結(jié)合時(shí)間已染色細(xì)胞的百分比平均熒光強(qiáng)度SOMAmer(4531-56;(SEQIDNO:1))0.7μmoll-15min100%331標(biāo)準(zhǔn)適體159μmoll-160min90%265在60-min的結(jié)合時(shí)間之后，由159μmoll-1的標(biāo)準(zhǔn)適體所獲得的已染色細(xì)胞的百分比沒(méi)有達(dá)到100%。而使用0.7μmoll-1的本發(fā)明的SOMAmer，在僅5分鐘后就使100%的細(xì)胞染色。此結(jié)果證明，根據(jù)本發(fā)明的SOMAmer即使在其濃度比標(biāo)準(zhǔn)DNA適體低200倍的情況下，其結(jié)合效率依然更好。此實(shí)驗(yàn)證明了根據(jù)本發(fā)明的SOMAmer的慢解離率特征在金黃色葡萄球菌的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)上的益處：可以用更低的試劑濃度在非常短的時(shí)限內(nèi)實(shí)現(xiàn)更高的結(jié)合/檢測(cè)效率。序列表<110>MerckPatentGmbH,SOMAlogicInc<120>通過(guò)基于熒光的檢測(cè)方法檢測(cè)樣品中微生物的方法<130>I14/041<160>16<170>PatentIn版本3.5<210>1<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>SOMAmer:靶標(biāo)SpA<220><221>t<222>(1)..(1)<223>經(jīng)C-5修飾的嘧啶<400>1gctcgagttaattcgggatcgggctccggcttttcgaat39<210>2<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>SOMAmer:靶標(biāo)SpA<220><221>t<222>(1)..(1)<223>經(jīng)C-5修飾的嘧啶<400>2ccggcttcgggtacctattatcggtttagcccagtcataa40<210>3<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>SOMAmer:靶標(biāo)SpA<220><221>t<222>(1)..(1)<223>經(jīng)C-5修飾的嘧啶<400>3tcggcttcgggtacctattatcggtttagcccagtcagaa40<210>4<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>SOMAmer:靶標(biāo)SpA<220><221>t<222>(1)..(1)<223>經(jīng)C-5修飾的嘧啶<400>4gcggcttcgggtacctattatcggtttagcccagtcaaaa40<210>5<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>SOMAmer:靶標(biāo)SpA<220><221>t<222>(1)..(1)<223>經(jīng)C-5修飾的嘧啶<400>5gtggcttcgggtacctattatcggtttagcccagtcagaa40<210>6<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>SOMAmer:靶標(biāo)SpA<220><221>t<222>(1)..(1)<223>經(jīng)C-5修飾的嘧啶<400>6gcggcttcgggtacctattatcggtttagccctgtcagga40<210>7<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>SOMAmer:靶標(biāo):SpA<220><221>t<222>(1)..(1)<223>經(jīng)C-5修飾的嘧啶<400>7gtgatcgagcggcttcgggtacctattattggtttagcccagtcagaa48<210>8<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>SOMAmer:靶標(biāo)SpA<220><221>t<222>(1)..(1)<223>經(jīng)C-5修飾的嘧啶<400>8tcggcttcgggtacctattatcggtttagcccagtctgaa40<210>9<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>SOMAmer:靶標(biāo)SpA<220><221>t<222>(1)..(1)<223>經(jīng)C-5修飾的嘧啶<400>9acggcttcgggtacctattatcggtttagccagtcagaa39<210>10<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>SOMAmer:靶標(biāo)ClfA<220><221>t<222>(1)..(1)<223>經(jīng)C-5修飾的嘧啶<400>10atctggttcaaagtgacgattgggcatctggtttttaagt40<210>11<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>SOMAmer:靶標(biāo)ClfA<220><221>t<222>(1)..(1)<223>經(jīng)C-5修飾的嘧啶<400>11atctggttctaagttacttggcgtaatctggtttttaaga40<210>12<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>SOMAmer:靶標(biāo)ClfA<220><221>t<222>(1)..(1)<223>經(jīng)C-5修飾的嘧啶<400>12atctggttcaaagtggcgattgggcatctggtttttaagt40<210>13<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物序列clfA-3<400>13cggatccagtagctgcagatgcacc25<210>14<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物序列clfA-4<400>14cgagctcgctcatcaggttgttcagg26<210>15<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>結(jié)合SpA的SOMAmer<220><221>n<222>(1)..(1)<223>沒(méi)有核苷酸或任何未修飾或經(jīng)修飾的核苷酸<220><221>W<222>(1)..(1)<223>經(jīng)C-5修飾的嘧啶<220><221>misc_feature<222>(20)..(20)<223>n為a、c、g或t<220><221>misc_feature<222>(30)..(31)<223>n為a、c、g或t<400>15ggcwwcgggwaccwawwawnggwwwagccnngwc34<210>16<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>結(jié)合ClfA的SOMAmer<220><221>W<222>(1)..(1)<223>經(jīng)C-5修飾的嘧啶<220><221>n<222>(1)..(1)<223>1到30個(gè)未修飾或經(jīng)修飾的核苷酸<220><221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>n為a、c、g或t<400>16awcwggwcnawcwggwwwwwaag23當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3