技術領域：
本發(fā)明屬于較小的糖聚合物的酶水解領域。具體地，本發(fā)明涉及用α-葡糖苷酶水解包含一個或多個α-1，5葡糖基-果糖鍵的二糖和低聚糖。以電子方式遞交的序列表的引用通過EFS-Web以電子方式將序列表的正式文本作為ASCII格式的序列表遞交，該文件名稱為CL6115USNP_SequenceListing_ST25.txt，創(chuàng)建日期為2015年2月10日，文件大小為266千字節(jié)，并且該文件與本說明書同時提交。在這一ASCII格式的文件中包含的序列表為所述說明書的部分并且全文以引用方式并入本文。
背景技術：
：葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3，α-1，4-葡聚糖葡糖水解酶)是催化水解含有葡萄糖的二糖、低聚糖和多糖的非還原端的α-1，4和α-1，6糖苷鍵兩者，每次釋放一個葡萄糖單元的外作用酶(1960，Pazur和Ando，J.Biol.Chem.235：297-302)。裂解發(fā)生于連接異頭碳與氧的糖苷鍵(1962，F(xiàn)leetwood和Weigel，Nature196：984)。α-1，4、α-1，6和α-1，3鍵是僅被葡糖淀粉酶以顯著速率水解的鍵(1957，Barker等人，J.Chem.Soc.4865-4871)。葡糖淀粉酶還能夠水解由α-1，2(例如曲二糖)或α-1，1(海藻糖)連接的兩個葡糖基單元之間的糖苷鍵。然而，與對具有α-1，4(麥芽糖)或α-1，6(異麥芽糖)鍵的二糖的葡糖淀粉酶活性相比，此種酶活性發(fā)生于更低的速率和更加稀釋的底物濃度。葡糖淀粉酶已被廣泛用于由淀粉產生高葡萄糖漿。高葡萄糖漿可用作用于產生各種增值化合物例如燃料乙醇、高果糖玉米糖漿、有機酸、氨基酸和維生素的原料。已從多種微生物、動物核植物中分離出葡糖淀粉酶，并且在微生物中，許多真菌是該酶的良好來源。在真菌生物體例如黑曲霉(Aspergillusniger)中產生的葡糖淀粉酶常用于商業(yè)應用，例如高葡萄糖漿生產。轉葡糖苷酶(EC.2.4.1.24，1，4-α-葡聚糖6-α-葡糖基轉移酶)是與α-D-葡糖-低聚糖一起溫育時催化水解和轉移反應兩者的D-葡糖基轉移酶(1951，Pazur和French，J.Amer.Chem.Soc.73：3536)。麥芽糖是用該酶進行轉葡糖基化反應的最優(yōu)選的底物。轉移最常發(fā)生于HO-6，從而由D-葡萄糖產生異麥芽糖，或由麥芽糖產生潘糖(6-O-α-葡糖基麥芽糖)。轉葡糖苷酶也可使葡糖基殘基轉移至另一個D-葡糖基單元的HO-2或HO-3，以形成曲二糖或黑曲霉糖。該酶可進一步使D-葡糖基單元轉移回HO-4，從而改良麥芽糖。由于轉葡糖基化反應采用轉葡糖苷酶，所以麥芽-低聚糖殘基轉化為包含較高比例的由非還原端的α-D-1，6糖苷鍵連接的葡糖基殘基的異麥芽-低聚糖(IMO)。IMO糖在亞洲用于多種食品和飲料配方。Brier等人(美國專利申請公開2003/0167929)公開了采用轉葡糖苷酶由大麥麥芽汁產生IMO。Poulose等人(美國專利申請公開2008/0229514)公開了用轉葡糖苷酶降解多糖例如黃原膠和瓜爾膠。黃原膠包括纖維素主鏈，其中另選葡萄糖1，3-連接至包含甘露糖和葡糖醛酸的支鏈上。瓜爾膠的主鏈包括每隔一個甘露糖使半乳糖殘基α-1，6-連接到其上的β-1，4-連接的甘露糖殘基。Lantero等人(美國專利5770437)公開了用轉葡糖苷酶降解蔗糖、松三糖和海藻酮糖。這些糖包括經由1，2-(蔗糖)、1，3-(松三糖)或1，1-(海藻酮糖)鍵連接至果糖的葡萄糖。雖然已公開了葡糖淀粉酶和轉葡糖苷酶的各種水解活性，但是這些酶通常被視為α-葡糖苷酶，給予了它們水解兩個葡糖基殘基之間α-鍵的能力。例如，葡糖淀粉酶和轉葡糖苷酶兩者均與具有麥芽糖酶活性(水解麥芽糖的兩個葡糖基殘基之間的α-1，4糖苷鍵)相關聯(lián)，其為α-葡糖苷酶活性的一種類型。盡管有前述公開，但現(xiàn)已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)α-葡糖苷酶例如轉葡糖苷酶(EC2.4.1.24)、葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3)及其它α-葡糖苷酶可水解葡糖基-果糖的α-1，5糖苷鍵。本文公開了α-葡糖苷酶用于降解包含葡糖基-α-1，5-果糖的二糖和低聚糖。技術實現(xiàn)要素：在一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種使包含至少一個α-1，5葡糖基-果糖鍵的糖中的α-1，5葡糖基-果糖鍵水解的方法，其中所述糖為二糖或低聚糖，并且其中該方法包括：使糖與α-葡糖苷酶在合適的條件下接觸，其中α-葡糖苷酶水解糖的至少一個α-1，5葡糖基-果糖鍵，并且其中糖的量相較于接觸步驟之前存在的糖的量減少。在另一個實施方案中，水解方法的α-葡糖苷酶是固定的。在另一個實施方案中，水解方法的糖為明串珠菌二糖。在另一個實施方案中，在接觸步驟之后明串珠菌二糖的濃度少于在接觸步驟之前存在的明串珠菌二糖的濃度的50％。在另一個實施方案中，水解方法的合適的條件包括：(i)葡聚糖合成反應，或(ii)從葡聚糖合成反應獲得的級分；其中糖為葡聚糖合成反應的副產物。在另一個實施方案中，葡聚糖合成反應產生至少一種不溶性α-葡聚糖產物。在另一個實施方案中，級分為葡聚糖合成反應的濾液。在另一個實施方案中，葡聚糖合成反應產生至少一種可溶性α-葡聚糖產物，其為：(i)葡糖基轉移酶的產物，或(ii)葡糖基轉移酶和α-葡聚糖水解酶兩者協(xié)同作用的產物，該α-葡聚糖水解酶能夠水解具有一個或多個α-1，3-糖苷鍵或一個或多個α-1，6-糖苷鍵的葡聚糖聚合物。在另一個實施方案中，級分為葡聚糖合成反應的色譜級分，其中葡聚糖合成反應產生至少一種可溶性α-葡聚糖產物。在另一個實施方案中，α-葡糖苷酶為轉葡糖苷酶或葡糖淀粉酶。在另一個實施方案中，(i)轉葡糖苷酶包含與SEQIDNO：1至少90％相同的氨基酸序列；或者(ii)葡糖淀粉酶包含與SEQIDNO：2至少90％相同的氨基酸序列。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種通過使糖與α-葡糖苷酶接觸而產生的組合物，其中糖為二糖或低聚糖并且包含至少一個α-1，5葡糖基-果糖鍵，其中α-葡糖苷酶水解糖的至少一個α-1，5葡糖基-果糖鍵，并且其中組合物包含的糖量相較于接觸步驟前存在的糖量減少。在另一個實施方案中，組合物的糖為明串珠菌二糖。例如，組合物中明串珠菌二糖的濃度少于接觸之前存在的明串珠菌二糖的濃度的50％。在另一個實施方案中，組合物的糖在(i)葡聚糖合成反應，或(ii)從葡聚糖合成反應獲得的級分中；其中糖為葡聚糖合成反應的副產物。在另一個實施方案中，級分為葡聚糖合成反應的濾液或葡聚糖合成反應的色譜級分。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種富集存在于葡聚糖合成反應的級分中果糖的方法，該方法包括：(a)使從葡聚糖合成反應獲得的級分與α-葡糖苷酶在合適的條件下接觸，其中α-葡糖苷酶水解級分內所含的二糖或低聚糖的至少一個α-1，5葡糖基-果糖鍵；以及(b)從步驟(a)的經水解級分中分離果糖，以獲得果糖濃度比步驟(a)的級分的果糖濃度更高的組合物。在另一第十三實施方案中，本發(fā)明涉及一種發(fā)酵方法，該方法包括：(a)使從葡聚糖合成反應獲得的級分與α-葡糖苷酶在合適的條件下接觸，其中α-葡糖苷酶水解級分內所含的二糖或低聚糖的至少一個α-1，5葡糖基-果糖鍵；(b)用微生物發(fā)酵步驟(a)的級分以獲得產物，其中發(fā)酵可在步驟(a)之后或與步驟(a)同時進行；以及(c)任選地，分離(b)的產物；其中相較于對未與α-葡糖苷酶接觸的葡聚糖合成反應的級分進行發(fā)酵的產物收率，(b)的產物收率增加。附圖和序列簡述圖1：在用NOVO188酶水解處理之前(起始材料)和之后(經處理材料)葡聚糖反應濾液材料的1HNMR光譜(參見實施例2-3)。圖2：在用TGL-2000轉葡糖苷酶水解處理之前(起始材料)和之后(經處理材料)葡聚糖反應濾液材料的1HNMR光譜(參見實施例2-3)。表1核酸和蛋白質序列標識號概述具體實施方式所有引用的專利和非專利文獻的公開全文以引用方式并入本文。如本文所用，術語“發(fā)明”或“本發(fā)明所公開的”不旨在限制但一般適用于權利要求中所限定的或本文所述的任何發(fā)明。這些術語在本文中可互換使用。除非另外指明，術語“糖”、“糖分子”和“碳水化合物”在本文可互換使用，并且是指二糖或低聚糖。本文“二糖”是指具有通過糖苷鍵連接的兩個單糖的碳水化合物。本文“低聚糖”是指由例如通過糖苷鍵連接的2至9個單糖組成的碳水化合物。在本文中，低聚糖也可稱為“低聚物”。在二糖或低聚糖內所含的單糖可稱為例如“單糖單元”或“單體單元”。本文優(yōu)選的單糖為果糖和葡萄糖。術語“糖苷鍵合”和“糖苷鍵”在本文可互換使用，并且是指使一個碳水化合物分子與另一個碳水化合物分子連接的一類共價鍵。本文術語“α-1，3葡糖基-葡萄糖鍵”、“α-1，3葡萄糖-葡萄糖鍵”和“葡萄糖-α-1，3-葡萄糖”是指兩個α-D-葡萄糖分子之間的α-1，3-糖苷鍵。本文術語“α-1，6葡糖基-葡萄糖鍵”、“α-1，6葡萄糖-葡萄糖鍵”和“葡萄糖-α-1，6-葡萄糖”是指兩個α-D-葡萄糖分子之間的α-1，6-糖苷鍵。在某些實施方案中，本文一個或多個α-1，3葡糖基-葡萄糖鍵和/或α-1，6葡糖基-葡萄糖鍵包含在二糖或低聚糖之內。本文術語“α-1，5葡糖基-果糖鍵”、“α-1，5葡萄糖-果糖鍵”和“葡萄糖-α-1，5-果糖”是指α-D-葡萄糖分子與果糖分子之間的α-1，5-糖苷鍵。在某些實施方案中，本文α-1，5葡糖基-果糖鍵包含在二糖或低聚糖之內。本文的“α-D-葡萄糖”也可稱為“葡萄糖”。包含α-1，5葡糖基-果糖鍵的二糖在本文稱為明串珠菌二糖。術語“明串珠菌二糖”和“D-吡喃葡糖基-α(1-5)-D-吡喃果糖”在本文中互換使用。明串珠菌二糖具有以下結構：術語“α-葡糖苷酶”、“α-1，4-葡糖苷酶”和“α-D-葡糖苷葡糖水解酶”在本文中互換使用。α-葡糖苷酶(EC3.2.1.20)(“EC”是指酶識別號)先前已被鑒定為催化水解釋放低聚糖(例如二糖)和多糖底物的末端非還原的(1，4)-連接的α-D-葡萄糖殘基的酶。本文現(xiàn)在公開的α-葡糖苷酶還對α-1，5葡糖基-果糖鍵具有水解活性，并且對α-1，3和α-1，6葡糖基-果糖鍵具有水解活性。轉葡糖苷酶和葡糖淀粉酶為具有此類活性的α-葡糖苷酶的示例。術語“轉葡萄糖苷酶”(TG)、“轉葡糖苷酶”和“1，4-α-葡聚糖6-α-葡糖基轉移酶”在本文中互換使用。轉葡糖苷酶(EC2.4.1.24)先前已被鑒定為與某些α-D-葡糖-低聚糖一起溫育時催化水解和轉移反應兩者的D-葡糖基轉移酶。本文現(xiàn)在公開的轉葡糖苷酶還對α-1，5葡糖基-果糖鍵具有水解活性，并且對α-1，3和α-1，6葡糖基-果糖鍵具有水解活性。術語“葡糖淀粉酶”(GA)、“葡萄糖淀粉酶”和“α-1，4-葡聚糖葡糖水解酶”在本文中互換使用。葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3)先前已被鑒定為催化水解含葡萄糖的二糖、低聚糖和多糖非還原端的α-1，4和α-1，6糖苷鍵兩者的外作用酶。本文現(xiàn)在公開的葡糖淀粉酶還對α-1，5葡糖基-果糖鍵具有水解活性。酶水解為其中在添加要素水的情況下酶促進分子中的鍵斷裂的過程。本文“水解”、“水解的”或“對其水解活性”α-1，5葡糖基-果糖鍵是指通過α-葡糖苷酶例如葡糖淀粉酶或轉葡糖苷酶來酶水解葡萄糖和果糖之間的α-1，5糖苷鍵。此類水解在包含α-1，5葡糖基-果糖鍵的二糖或低聚糖與本文的α-葡糖苷酶在合適的條件下接觸時發(fā)生。因此，本文“水解反應”至少包括：(i)包含α-1，5葡糖基-果糖鍵的二糖或低聚糖，和(ii)α-葡糖苷酶。本文“糖化”是指將糖(二糖或低聚糖)分解成其單糖組分的過程。可在本文水解反應中使糖發(fā)生糖化。用于使包含至少一個α-1，5葡糖基-果糖鍵的糖(二糖或低聚糖)與本文的α-葡糖苷酶接觸的“合適的條件”是指支持α-葡糖苷酶水解糖的一個或多個α-1，5葡糖基-果糖鍵的那些條件(例如溫度、pH、時間)。合適的條件可包括“水性條件”，例如包括至少20重量％水。水性條件可表現(xiàn)為溶液或混合物。其中使包含至少一個α-1，5葡糖基-果糖鍵的糖與α-葡糖苷酶接觸的溶液或混合物可稱為α-葡糖苷酶反應(例如，轉葡糖苷酶或葡糖淀粉酶反應)。本文“固定的”酶是指結合至惰性不可溶材料的酶。例如美國專利公開5541097公開了用于制備固定酶的方法，其公開內容以引用方式并入本文。術語“葡聚糖”和“葡聚糖聚合物”在本文互換使用，并且是指經糖苷鍵連接的葡萄糖單體的多糖。本文“α-葡聚糖”是指葡聚糖聚合物，其包含至少約80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％α-糖苷鍵。本文“不溶性葡聚糖”是指不溶于水性條件的葡聚糖聚合物。本文不溶性葡聚糖的一個示例是DP為至少8或9的聚α-1，3-葡聚糖。在某些實施方案中，如當前所公開的葡糖基轉移酶反應產生至少一種不溶性葡聚糖產物。術語“可溶性葡聚糖”、“可溶性α-葡聚糖”、“可溶性纖維”、“可溶性葡聚糖纖維”、“可溶性膳食纖維”等在本文互換使用，以指可溶于水性條件的葡聚糖聚合物。本文可溶性葡聚糖的示例為特定低聚糖，例如DP小于8的聚α-1，3-葡聚糖，以及在以下提供示例中公開的特定低聚糖。在某些實施方案中，如當前所公開的葡糖基轉移酶反應產生至少一種可溶性葡聚糖產物。在某些實施方案中，表征本文可溶性α-葡聚糖化合物的另一組特征在于：其是(i)水溶性葡萄糖低聚物，具有3或更大的聚合度，(ii)消化抗的(即表現(xiàn)出極慢消化性或沒有消化性)，在人小腸中吸收極少或不吸收，以及(iii)在下胃腸道中至少部分可發(fā)酵的?？扇苄云暇厶抢w維組合物的消化性可例如用AOAC方法2009.01測定。術語“聚α-1，3-葡聚糖”和“α-1，3-葡聚糖聚合物”在本文中互換使用。聚α-1，3-葡聚糖是包含經糖苷鍵連接在一起的葡萄糖單體單元的聚合物，其中至少約50％的糖苷鍵為α-1，3-糖苷鍵。如本文所用，術語“α-1，3-糖苷鍵”是指通過相鄰α-D-葡萄糖環(huán)上的碳1和3將α-D-葡萄糖分子彼此接合的一類共價鍵。本文葡聚糖的“分子量”可表示為數均分子量(Mn)或重均分子量(Mw)。另選地，分子量可表示為道爾頓、克/摩爾、DPw(重均聚合度)或DPn(數均聚合度)。用于計算這些分子量測定的各種方法在本領域中是已知的，例如采用高壓液相色譜法(HPLC)、尺寸排阻色譜法(SEC)、或凝膠滲透色譜法(GPC)。術語“葡糖基轉移酶”、“gtf酶”、“gtf酶催化劑”、“gtf”、“葡聚糖蔗糖酶”等在本文互換使用。本文活性的gtf酶催化蔗糖底物反應以制得產物葡聚糖和果糖。gtf反應的其它產物(副產物)可包括葡萄糖(在從葡糖基-gtf酶中間復合物水解葡萄糖時得到)、各種可溶性低聚糖(例如DP2-DP7)和明串珠菌二糖(在葡糖基-gtf酶中間復合物的葡萄糖與果糖連接時得到)。野生形式的葡糖基轉移酶通常包含(N-末端方向至C-末端方向)信號肽、可變域、催化域和葡聚糖結合域。根據CAZy(碳水化合物-活性酶)數據庫，本文葡糖基轉移酶歸類為糖苷水解酶家族70(GH70)(Cantarel等人，NucleicAcidsRes.37：D233-238，2009)。本文術語“蔗糖”是指經α-1，2-糖苷鍵連接的α-D-葡萄糖分子與β-D-果糖分子組成的非還原二糖。蔗糖通常稱為食糖。術語“葡聚糖合成反應”、“葡聚糖反應”、“gtf反應”等在本文互換使用，并且是指通過葡糖基轉移酶進行的反應。如本文所用，葡聚糖合成反應通常涉及這樣一種溶液：在包含蔗糖和水、以及任選的其它組分的溶液中包含至少一種活性葡糖基轉移酶。可在本文葡聚糖合成反應中的其它組分包括例如果糖、葡萄糖、明串珠菌二糖、可溶性低聚糖(例如DP2-DP7)、以及一種或多種可溶性葡聚糖產物。另外，在一些方面，葡聚糖合成反應可包括一種或多種α-葡聚糖水解酶。應當理解，某些葡聚糖產物例如聚合度(DP)為至少8或9的聚α-1，3-葡聚糖是水不溶性的并因此在葡聚糖合成反應中不溶解，而是可以析出溶液。術語“α-葡聚糖水解酶”和“葡聚糖水解酶”在本文互換使用，并且是指能夠水解α-葡聚糖低聚物的酶。α-葡聚糖水解酶可通過其對特定α-D-糖苷鍵的內切水解活性來定義。本文α-葡聚糖水解酶的示例包括葡聚糖酶(EC3.2.1.11；能夠內切水解α-1，6-連接的糖苷鍵)、突變酶(EC3.2.1.59；能夠內切水解α-1，3-連接的糖苷鍵)和交替聚糖酶(alternanases)(EC3.2.1.-；能夠內切水解裂解交替聚糖(alternan))。各種因素包括但不限于某些α-葡聚糖內的支化程度、支化類型和相對分支長度，可不利地影響α-葡聚糖水解酶內切水解一些糖苷鍵的能力。葡聚糖合成反應的“干固體百分比”是指葡聚糖合成反應中所有糖的重量％?？衫缁谟糜谥苽浞磻a物的蔗糖量來計算gtf反應的干固體百分比。本文的葡聚糖合成反應的“級分”是指葡聚糖合成反應的液體溶液部分。級分可為得自葡聚糖合成反應的部分或全部液體溶液，并且分離自反應中合成的可溶性或不溶性葡聚糖產物。在一些實施方案中，級分可任選的稱為“母液”，其中產物為不溶性(固體)葡聚糖產物。級分的一個示例為葡聚糖合成反應的濾液。因為級分可包含溶解的糖例如蔗糖、果糖、葡萄糖、明串珠菌二糖、可溶性低聚糖(例如DP2-DP7)，所以級分可也稱為源于葡聚糖合成反應的“混合的糖溶液”。本文“經水解的級分”是指已經過本文的α-葡糖苷酶處理以水解存在于級分中的明串珠菌二糖和/或低聚糖的級分。術語“濾液”、“葡聚糖反應濾液”、“葡聚糖濾液”等在本文互換使用，并且是指從葡聚糖合成反應中合成的固體葡聚糖產物中過濾出來的級分。本文“經水解的濾液”是指已經過本文α-葡糖苷酶處理以水解存在于濾液中的明串珠菌二糖和/或低聚糖的濾液。術語“按體積計百分比”、“體積百分比”、“體積％”、“v/v％”等在本文互換使用。溶液中溶質的體積百分比可用下式進行測定：[(溶質體積)/(v溶液體積)]×100％。術語“重量％”、“重量百分比(重量％)”、“重量-重量百分比(重量/重量％)”等在本文互換使用。重量％是指物質在其被包含在組合物、混合物或溶液中時以質量計的百分比。除非另外指明，本文的所有百分比均為重量百分比。如本文所用，“多分散指數”、“PDI”、“非均勻性指數”、“分散性”等是指測量的給定聚合物(例如葡萄糖低聚物，例如可溶性α-葡聚糖)樣品中分子量分布，并且可通過將重均分子量除以數均分子量來計算(PDI＝Mw/Mn)。術語“增加的”、“增強的”和“改善的”在本文互換使用。這些術語是指更大的量或活性，例如稍大于初始量或活性的量或活性、或相較于初始量或活性大大過量的量或活性，并且包括介于其間的所有量或活性。另選地，這些術語可指例如該數量或活性與和它相比較的數量或活性相比，高至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。如本文所用，對于多核苷酸或多肽序列，術語“序列同一性”或“同一性”是指在指定的比較窗范圍為獲得最大對應而比對時兩條序列中相同的核酸堿基或氨基酸殘基。因此，“序列同一性百分比”或“同一性百分比”指通過在比較窗口上比較兩個最佳對齊的序列而測得的值，其中在與參考序列(其不包含添加或缺失)進行比較時，比較窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分可包含添加或缺失(即缺口)以實現(xiàn)兩個序列的最佳比對。通過以下方式計算這種百分比：確定在兩個序列中出現(xiàn)相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數目以得到匹配的位置的數目，將匹配的位置的數目除以比較窗口中位置的總數目，然后將結果乘以100以得到序列同一性百分比。在NationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)網站在線可用的BasicLocalAlignmentSearchTool(BLAST)算法可例如用于計算本文所公開的兩個或更多個多核苷酸序列(BLASTN算法)或多肽序列(BLASTP算法)之間的百分比同一性。另選地，序列間的百分比同一性可使用Clustal算法(例如ClustalW或ClustalV)進行計算。對于使用Clustal比對方法的多重比對，默認值可相當于GAPPENALTY＝10、以及GAPLENGTHPENALTY＝10。用Clustal方法進行成對比對和蛋白質序列的百分比同一性計算的默認參數可為KTUPLE＝1、GAPPENALTY＝3、WINDOW＝5、以及DIAGONALSSAVED＝5。對于核酸，這些參數可為KTUPLE＝2，GAPPENALTY＝5，WINDOW＝4、以及DIAGONALSSAVED＝4。仍另選地，序列之間的同一性百分比可采用EMBOSS算法(例如針(needle))進行，參數為例如GAPOPEN＝10，GAPEXTEND＝0.5，ENDGAPPENALTY＝false，ENDGAPOPEN＝10，ENDGAPEXTEND＝0.5，采用BLOSUM矩陣(例如BLOSUM62)。本文公開了多種多肽氨基酸序列作為某些實施方案的特征?？墒褂门c本文公開的序列至少約70-85％、85-90％、或90％-95％相同的這些序列的變體。另選地，變體氨基酸序列與本文公開的序列可具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。本文變體氨基酸序列與公開序列具有相同的功能/活性，或者具有公開序列至少約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的功能/活性。如在某些實施方案中所用的術語“分離的”是指與其天然來源完全分離的任何細胞組分(例如分離的多核苷酸或多肽分子)。在一些情況下，分離的多核苷酸或多肽分子是較大組合物、緩沖體系或試劑混合物的一部分。例如，分離的多核苷酸或多肽分子可以異源方式包含在細胞或生物內。另一個示例為分離的α-葡糖苷酶(例如葡糖淀粉酶、轉葡糖苷酶)、或葡糖基轉移酶。本文所公開的酶反應(例如α-葡糖苷酶反應、葡糖基轉移酶反應)是合成的、非天然存在的過程。本發(fā)明所公開的一些實施方案涉及一種使包含至少一個α-1，5葡糖基-果糖鍵的糖的α-1，5葡糖基-果糖鍵水解的方法。糖為二糖或低聚糖。該方法包括使糖與α-葡糖苷酶在合適的條件下接觸。在接觸步驟中，α-葡糖苷酶水解糖的至少一個α-1，5葡糖基-果糖鍵。由于此種水解，糖量相較于接觸步驟之前存在的糖量減少。因此，該水解方法或者可替換地稱為降低組合物中糖量的方法。顯著地，據信α-葡糖苷酶可水解α-1，5葡糖基-果糖鍵先前是未知的。根據該水解方法的α-葡糖苷酶反應可因此用于從葡聚糖合成反應和/或從其獲得的級分中除去包含α-1，5葡糖基-果糖鍵的明串珠菌二糖及其它低聚糖副產物。此類去除示出相對于可導致葡聚糖產物降解的副產物去除化學過程(例如酸水解)有所改進。最終，根據以上水解方法處理的葡聚糖反應級分更適于例如下游應用如發(fā)酵，因為葡萄糖和果糖單糖的含量在級分中增加。對于下游過程，單糖相較于明串珠菌二糖和低聚糖副產物通常更易處理。在本文的實施方案中使用的α-葡糖苷酶(EC3.2.1.20)水解包含至少一個α-1，5葡糖基-果糖鍵的糖的α-1，5葡糖基-果糖鍵。α-葡糖苷酶先前已被鑒定用于催化水解釋放低聚糖(例如二糖)和多糖底物的末端非還原的(1，4)-連接的α-D-葡萄糖殘基。本文現(xiàn)在公開的這些酶還對例如α-1，5葡糖基-果糖鍵具有水解活性。α-葡糖苷酶可得自例如任何來源(例如植物、動物、微生物，如細菌或真菌/酵母)，例如下文公開的轉葡糖苷酶和/或葡糖淀粉酶可源于其的那些來源。例如，α-葡糖苷酶可為真菌的α-葡糖苷酶。本文適宜的α-葡糖苷酶的其它示例包括在美國專利6355467、5922580、5795766、5763252和8633006中公開的那些，上述文獻均以引用方式并入本文。在某些實施方案中，α-葡糖苷酶可以包括SEQIDNO：5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38的氨基酸序列，或DIAZYMERDFULTRA(DuPontIndustrialBiosciences)的氨基酸序列。另選地，α-葡糖苷酶可包括與SEQIDNO：5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或DIAZYMERDFULTRA的氨基酸序列至少約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，并且對糖的α-1，5葡糖基-果糖鍵具有水解活性。例如幾種前述序列為缺少N-末端信號肽的成熟α-葡糖苷酶。對于此類序列，應當理解，如果對其進行表達而并不使用信號肽(例如采用其中酶在細胞內表達并獲自細胞裂解物的表達系統(tǒng))，則通常加入N-末端起始甲硫氨酸(如果必要的話)(直接地或經由插入異源氨基酸序列例如表位)。轉葡糖苷酶(EC2.4.1.24；1，4-α-葡聚糖6-α-葡糖基轉移酶)可在本文的某些實施方案中用作α-葡糖苷酶，以水解包含至少一個α-1，5葡糖基-果糖鍵的糖的α-1，5葡糖基-果糖鍵。此類酶先前已被鑒定為在與特定α-D-葡糖-低聚糖一起溫育時催化水解和轉移反應兩者的D-葡糖基轉移酶。如本文現(xiàn)在公開的轉葡糖苷酶還對α-1，5葡糖基-果糖鍵具有水解活性。本文的轉葡糖苷酶可來源于任何微生物源，例如細菌或真菌。真菌的轉葡糖苷酶的示例包括但不限于木霉屬(Trichoderma)菌種(例如里氏木霉(T.reesei))、曲霉屬(Aspergillus)菌種和新縫匠菌屬(Neosartorya)菌種(例如N.fischeri)的那些。轉葡糖苷酶可源于其的曲霉屬菌種的示例包括但不限于黑曲霉(A.niger)、泡盛曲霉(A.awamori)、米曲霉(A.oryzae)、土曲霉(A.terreus)、棒曲霉(A.clavatus)、煙曲霉(A.fumigatus)和構巢曲霉(A.nidulans)?？捎糜诒疚牡霓D葡糖苷酶的其它示例在Barker等人(1953，J.Chem.Soc.3588-3593)；Pazur等人(1986，Carbohydr.Res.149：137-147)，Nakamura等人(1997，J.Biotechnol.53：75-84)和美國專利申請公開2008/0229514中有所描述，這些專利均以引用方式并入本文?？捎糜诒疚牡霓D葡糖苷酶的其它示例是熱穩(wěn)定的那些；美國專利4689296公開了用于制備熱穩(wěn)定性轉葡糖苷酶的方法，其公開內容以引用方式并入本文?？捎糜诒疚牡霓D葡糖苷酶的更多示例可為在GENBANK數據庫(NCBI)中的任何那些，例如登陸號：D45356(GID：2645159，黑曲霉)、BAD06006.1(GID：4031328，泡盛曲霉)、BAA08125.1(GID：1054565，米曲霉)、XP_001210809.1(GID：115492363，土曲霉)、XP_001216899.1(GID：115433524，土曲霉)、XP_001271891.1(GID：121707620，棒曲霉)、XP_751811.1(GID：70993928，煙曲霉)、XP_659621.1(GID：67523121，構巢曲霉)、XP_001266999.1(GID：119500484，N.fischeri)和XP_001258585.1(GID：119473371，N.fischeri)，其均以引用方式并入本文。另選地，本文的轉葡糖苷酶可具有與任何前述公開的轉葡糖苷酶序列的氨基酸序列有至少90％或95％同一性的氨基酸序列，并且對糖的α-1，5葡糖基-果糖鍵具有水解活性。當所有前述轉葡糖苷酶用于本文的水解反應時，優(yōu)選為缺少N-末端信號肽的成熟形式。在本文的某些實施方案中，轉葡糖苷酶可包含SEQIDNO：1(轉葡糖苷酶L-2000)的氨基酸序列，其為黑曲霉轉葡糖苷酶(美國專利申請公開2008/0229514)。另選地，轉葡糖苷酶可包含與SEQIDNO：1至少約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，并且對糖的α-1，5葡糖基-果糖鍵具有水解活性。任何SEQIDNO：1或其變體可例如根據美國專利申請公開2008/0229514的公開內容制得，該申請以引用方式并入本文。SEQIDNO：1為缺少N-末端信號肽的成熟轉葡糖苷酶。因為SEQIDNO：1未以甲硫氨酸殘基開始，應當理解，如果對其進行表達而并不使用信號肽(例如采用其中酶在細胞內表達并獲自細胞裂解物的表達系統(tǒng))，則通常將N-末端起始甲硫氨酸加至SEQIDNO：1(直接地或經由插入異源氨基酸序列如表位)。葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3；α-1，4-葡聚糖葡糖水解酶)可在本文的某些實施方案中用作α-葡糖苷酶，以水解包含至少一個α-1，5葡糖基-果糖鍵的糖的α-1，5葡糖基-果糖鍵。該類酶先前已被鑒定為催化水解含葡萄糖的二糖、低聚糖和多糖非還原端的α-1，4和α-1，6糖苷鍵兩者的外作用酶。如本文現(xiàn)在公開的葡糖淀粉酶還對α-1，5葡糖基-果糖鍵具有水解活性。在某些實施方案中，α-葡糖苷酶不為葡糖淀粉酶。本文的葡糖淀粉酶可來源于任何微生物源，例如細菌或真菌。細菌的葡糖淀粉酶的示例包括但不限于芽孢桿菌屬(Bacillus)菌種(例如嗜堿芽孢桿菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、遲緩芽孢桿菌(B.lentus)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis))和鏈霉菌屬(Streptomyces)菌種(例如(S.lividans))的那些。真菌的葡糖淀粉酶的示例包括但不限于木霉屬菌種(例如里氏木霉、長枝木霉(T.longibrachiatum)、T.strictipilis、棘孢木霉(T.asperellum)、康長木霉(T.konilangbra)、哈茨木霉(T.hazianum))、曲霉屬菌種(例如黑曲霉、米曲霉、土曲霉、棒曲霉、構巢曲霉、白曲霉、泡盛曲霉)、根霉菌屬(Rhizopus)菌種(例如米根霉(R.oryzae)、雪根霉(R.niveus))、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)菌種(例如埃默森藍狀菌(T.emersonii)、嗜熱放線菌(T.thermophilus)、T.duponti)、毛霉菌屬(Mucor)菌種、肉座菌屬(Hypocrea)菌種(例如H.gelatinosa、H.orientalis、H.vinosa、H.citrina)、鐮孢屬(Fusarium)菌種(例如尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、玫瑰色鐮孢(F.roseum)、F.venenatum)、鏈孢霉屬(Neurospora)菌種(例如粗糙鏈孢霉(N.crassa))、腐質霉屬(Humicola)菌種(例如灰腐質霉(H.grisea)、H.insolens、柔毛腐質霉(H.lanuginose))、青霉屬(Penicillium)菌種(例如特異青霉(P.notatum)、產黃青霉(P.chrysogenum))和活性酵母屬(Saccharomycopsis)菌種(例如扣囊復膜酵母(S.fibuligera))的那些。用于本文的這些細菌和真菌葡糖淀粉酶的示例公開于美國專利申請公開2013/0102035中，該文獻以引用的方式并入本文?？捎糜诒疚牡钠咸堑矸勖傅钠渌纠赟vensson等人(1983，CarlsbergRes.Commun.48：529-544)、Boel等人(1984，EMBOJ.3：1097-1102)、Havashida等人(1989，Agric.Biol.Chem.53：923-929)；美國專利5024941、美國專利4794175、美國專利4247637、美國專利6255084、美國專利6620924，Ashikari等人(1986，Agric.Biol.Chem.50：957-964)、Ashikari等人(1989，Appl.Microbiol.Biotechnol.32：129-133)、美國專利4863864；美國專利4618579、Houghton-Larsen等人(2003，Appl.Microbiol.Biotechnol.62：210-217)和美國專利7413887中有所描述，這些專利均以引用方式并入本文。另選地，本文的葡糖淀粉酶可具有與任何前述公開的葡糖淀粉酶序列的氨基酸序列有至少90％或95％同一性的氨基酸序列，并且對糖的α-1，5葡糖基-果糖鍵具有水解活性。當所有前述葡糖淀粉酶用于本文的水解反應時，優(yōu)選為缺少N-末端信號肽的成熟形式?？捎糜诒疚牡目缮藤彨@得的葡糖淀粉酶包括例如OPTIDEXL-400、GC147、GC321、GZYMEG9904X、OPTIMAX7525、DEXTROZYME、DISTILLASE和GLUCZYME。在本文的某些實施方案中，葡糖淀粉酶可包含SEQIDNO：2(GC321)的氨基酸序列，其為里氏木霉葡糖淀粉酶。另選地，葡糖淀粉酶可包含與SEQIDNO：2至少約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，并且對糖的α-1，5葡糖基-果糖鍵具有水解活性。任何SEQIDNO：2或其變體可例如根據美國專利7413887或美國專利申請公開2013/0102035的公開內容制得，這些申請以引用方式并入本文。SEQIDNO：2為缺少N-末端信號肽的成熟葡糖淀粉酶。因為SEQIDNO：2未以甲硫氨酸殘基開始，應當理解，如果對其進行表達而并不使用信號肽(例如采用其中酶在細胞內表達并獲自細胞裂解物的表達系統(tǒng))，則通常將N-末端起始甲硫氨酸加至SEQIDNO：2(直接地或經由插入異源氨基酸序列如表位)。本文的α-葡糖苷酶例如轉葡糖苷酶或葡糖淀粉酶可得自商業(yè)來源(例如DuPontIndustrialBiosciences/Genencor，USA；MegazymeInternational，Ireland；AmanoEnzymeInc.，Japan)。另選地，此類酶可通過本領域已知的任何方法制得，例如在美國專利申請公開2008/0229514、美國專利7413887或美國專利申請公開2013/0102035中所描述的，這些申請以引用的方式并入本文。例如，α-葡糖苷酶可在異源表達系統(tǒng)中重組產生，例如微生物或真菌異源表達系統(tǒng)。異源表達系統(tǒng)的示例包括細菌(例如大腸桿菌(E.coli)、芽孢桿菌屬(Bacillussp.))和真核系統(tǒng)。真核系統(tǒng)可采用例如酵母(例如，畢赤酵母屬(Pichiasp.)、酵母屬(Saccharomycessp.))或真菌(例如，木霉屬，例如里氏木霉；曲霉屬菌種，例如黑曲霉)表達系統(tǒng)。SEQIDNO：1的轉葡糖苷酶和SEQIDNO：2的葡糖淀粉酶以及它們的變體可例如在里氏木霉宿主中表達。當α-葡糖苷酶用于本文的水解反應時，優(yōu)選為缺少N-末端信號肽的成熟形式。用于產生本文的成熟α-葡糖苷酶的表達系統(tǒng)可采用編碼酶的多核苷酸，該編碼酶的多核苷酸還包含編碼N-末端信號肽的序列來指導胞外分泌。在此類實施方案中，在分泌過程期間信號肽從酶上切割下來。信號肽對轉葡糖苷酶或葡糖淀粉酶而言可以是天然的或異源的。另選地，成熟形式的α-葡糖苷酶可通過例如采用其中酶在細胞內表達并獲自細胞裂解液的表達系統(tǒng)對其進行表達(不使用信號肽)來提供。在任一種情況下(分泌或細胞內表達)，異源氨基酸序列例如表位可任選地包含在α-葡糖苷酶的N-末端。在某些實施方案中，可在本文水解反應中通過直接使用表達一種或多種酶的細胞來提供α-葡糖苷酶。換句話講，與糖接觸的α-葡糖苷酶可因其由置于用于水解的合適條件中的細胞表達而存在。此類細胞因此可用于代替添加至水解反應的分離的α-葡糖苷酶制劑。用于該目的的細胞可為例如細菌、酵母或真菌細胞。酵母的示例包括得自以下的那些：酵母屬(例如釀酒酵母(S.cerevisiae))、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、假絲酵母(Candida)、畢赤酵母屬(Pichia)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、漢遜酵母屬(Hansenula)、克勒克酵母屬(Kloeckera)、許旺酵母屬(Schwanniomyces)?？捎糜诒疚牡牡钠渌磉_系統(tǒng)公開于美國專利申請公開2013/0323822中，該申請以引用的方式并入本文。本文的糖包含至少一個α-1，5葡糖基-果糖鍵。因此，根據糖的長度，其可包含例如1、2、3、4、5、6、7或8個α-1，5葡糖基-果糖鍵。糖優(yōu)選包含1、2或3個此類鍵。因為本文的糖包含至少一個α-1，5葡糖基-果糖鍵，所以糖包含至少一個葡萄糖單元和至少一個果糖單元。在某些實施方案中，本文的糖僅包含葡萄糖和果糖單元。此類組合物可表現(xiàn)為葡聚糖合成反應的二糖和低聚糖副產物。另選地，除了葡萄糖和果糖之外，本文的糖還可包含其它單糖，例如半乳糖、核糖和木糖。本發(fā)明公開的在某些實施方案中水解的糖可為低聚糖。本文的低聚糖可具有例如2、3、4、5、6、7、8或9個單糖單元。如在本領域中所理解的，本文的低聚糖可參照其聚合度(DP)數目——這指定了低聚糖中單體單元的數目。例如，DP3低聚糖具有3個單體單元。因此，低聚糖可例如為DP3、DP4、DP5、DP6、DP7、DP8或DP9低聚糖。在某些實施方案中，糖的DP為3至7(即，DP3-7)。除了至少一個α-1，5葡糖基-果糖鍵之外(需注意，具有2個單糖單元的低聚糖——即二糖——為明串珠菌二糖，給出在本文的水解方法中的糖具有至少一個α-1，5葡糖基-果糖鍵)，本文的具有3個或更多個單糖單元的低聚糖還可包含其它鍵。例如，在低聚糖中也可存在α-1，3、α-1，6和/或α-1，4鍵，其也易于被如本文所示的α-葡糖苷酶水解。在某些實施方案中，糖僅包含經α-1，3和/或α-1，6糖苷鍵連接的葡萄糖單體。因此，此類低聚糖僅包含α-1，3葡糖基-葡萄糖鍵和/或α-1，6葡糖基-葡萄糖鍵。此類低聚糖的示例僅包含α-1，3鍵或α-1，6鍵。在某些實施方案中，低聚糖可包含至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％葡糖基-葡萄糖鍵。在其它實施方案中，在本文的低聚糖中可存在約75-85％的α-1，3葡糖基-葡萄糖鍵和約15-25％的α-1，6葡糖基-葡萄糖鍵。另選地，本文的低聚糖可包含任意百分比(介于1％至99％之間的任意整數值)的α-1，3葡糖基-葡萄糖鍵和任意百分比(介于1％至99％之間的任意整數值)的α-1，6葡糖基-葡萄糖鍵，只要這些百分比不大于100％即可。任何這些低聚糖可在得自葡聚糖合成反應的級分之中，該葡聚糖合成反應產生例如(i)不溶性α-葡聚糖(例如聚α-1，3-葡聚糖)，或(ii)可溶性α-葡聚糖產物。該鍵含量可表征：(i)單獨的各個低聚糖，或(ii)一組低聚糖(即平均鍵含量)。僅包含經由α-1，3和/或α-1，6糖苷鍵連接的葡萄糖單體的低聚糖可例如為DP2-DP7或DP3-DP7。應當理解，鍵在低聚糖中的具體分布可根據產生低聚糖副產物的葡聚糖合成反應的條件(例如gtf酶)而變化。還應當理解，鍵的具體分布對于當前公開的方法并非至關重要的。本文的示例展示了α-葡糖苷酶(例如轉葡糖苷酶和葡糖淀粉酶)可水解(i)包含α-1，5葡糖基-果糖鍵的明串珠菌二糖，和(ii)僅包含α-1，3葡糖基-葡萄糖和/或α-1，6葡糖基-葡萄糖鍵的低聚糖兩者。因此，可例如在用于水解α-1，5葡糖基-果糖鍵、α-1，3葡糖基-葡萄糖鍵和/或α-1，6葡糖基-葡萄糖鍵的反應中使用α-葡糖苷酶。本文的糖的至少一個α-1，5葡糖基-果糖鍵可被本文的α-葡糖苷酶水解。另選地，據信糖的2、3、4、5或更多個α-1，5葡糖基-果糖鍵可例如被α-葡糖苷酶水解。在某些實施方案中，至少一個α-1，5葡糖基-果糖鍵的水解可在糖的非還原端發(fā)生。例如，其中糖為二糖即明串珠菌二糖，非還原端葡萄糖從果糖上裂解下來，獲得游離的葡萄糖和果糖。又如，其中糖為具有α-1，5連接至果糖的非還原端葡萄糖的低聚糖，據信該葡萄糖可被裂解掉，在低聚糖的非還原端處留下果糖殘基。公開的水解方法中糖的量相較于接觸步驟之前存在的糖的量減少。該減少起因于糖的至少一個α-1，5葡糖基-果糖鍵的水解斷裂。在本文水解方法中，接觸步驟之后的糖量(例如濃度)可小于接觸步驟之前(在使本文α-葡糖苷酶與糖在合適的條件下接觸之前)所存在糖量的約1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(或介于1％至90％之間的任意整數值)。本發(fā)明公開的在某些實施方案中水解的糖為明串珠菌二糖，其為具有α-1，5葡糖基-果糖鍵的二糖。在本文水解方法中，接觸步驟之后的明串珠菌二糖的濃度可小于接觸步驟之前(在使本文α-葡糖苷酶與明串珠菌二糖在合適的條件下接觸之前)存在的明串珠菌二糖的濃度的約1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(或介于1％至90％之間的任意整數值)。在本文的某些方面，水解方法可替換地稱為降低組合物中明串珠菌二糖的量的方法。在本文的水解方法中，可例如使明串珠菌二糖與轉葡糖苷酶例如包含SEQIDNO：1的轉葡糖苷酶(轉葡糖苷酶L-2000)接觸。在某些實施方案中，完成該方法之后的明串珠菌二糖的濃度可小于初始明串珠菌二糖濃度約1-3％。公開的水解方法中糖的量相較于接觸步驟之前存在的糖的量減少。應當理解該比較可按照任何方式進行。例如，可在進行水解方法之前和之后兩者測定糖濃度。另選地，除了未將如當前公開的α-葡糖苷酶添加到對照反應之外，可相對于具有相同條件的對照反應進行比較。在某些實施方案中，α-葡糖苷酶可以是固定的?？墒褂帽绢I域已知的任何方法和/或方式來固定酶，例如在美國專利5541097和4713333中公開的那些，這兩個專利均以引用方式并入本文。例如，可通過使一種或多種酶與胺反應性材料(例如戊二醛)接觸以形成加合物(例如酶-戊二醛加合物)，其后將該加合物結合到經聚胺(例如聚乙烯亞胺，如EPOMINP-1050)處理的固體載體上來固定一種或多種酶。在某些實施方案中，可使α-葡糖苷酶固定到其上的固體載體(固體支持體)可為無機或有機材料。此類材料包括例如γ-氧化鋁、二氧化鈦、粒狀活性炭、粒狀硅藻土、玻璃珠、多孔玻璃、浮巖、硅膠、金屬氧化物和氧化鋁。聚胺可用于處理固體載體，由此使得固體載體隨后暴露于包括酶和胺反應性材料的加合物，導致酶結合至固體載體。可用于本文的聚胺的示例包括：聚乙烯二胺、聚乙烯亞胺(例如聚二亞乙基三胺、聚三亞乙基四胺、聚五亞乙基六胺、聚六亞甲基二胺)、聚亞甲基二環(huán)己基胺、聚亞甲基二苯胺、聚四亞乙基五胺、聚亞苯基二胺以及兩種或更多種這些聚胺化合物的共混物。優(yōu)選的聚胺是水溶性的并且/或者具有約500至100,000道爾頓的分子量?？稍谀承嵤┓桨钢惺褂镁垡蚁﹣啺防鏓POMINP-1050。用于制備包含本文的酶的加合物的胺反應性材料可例如為醛、有機鹵化物、酸酐、偶氮化合物、異硫氰酸酯和/或異氰酸酯。這些胺反應性材料的示例包括：戊二醛、琥珀醛、對苯二甲醛、二-重氮聯(lián)苯胺-2，2’-二磺酸、4，4’-二氟-3，3’-二硝基二苯砜、二苯基-4，4’-二硫氰酸酯-2，2’-二磺酸、3-甲氧基二苯基甲烷-4，4’-二異氰酸酯、甲苯-2-異氰酸酯-4-異硫氰酸酯、甲苯-2，-4-二異氰酸脂、重氮聯(lián)苯胺、重氮聯(lián)苯胺-3，3’-鄰聯(lián)茴香胺、N，N’-六亞甲基二碘乙酰胺、六亞甲基二異氰酸酯、三聚氯氰、和/或1，5-二氟-2，4-二硝基苯。優(yōu)選地，胺反應性材料為醛，例如戊二醛?？墒古c胺反應性化合物加合的α-葡糖苷酶與經聚胺處理的固體載體接觸，從而使酶固定在固體載體上。本文固定的酶可用于各種反應器系統(tǒng)中，例如柱(例如填充柱)或攪拌槽反應器，以進行如本文公開的水解反應。用于使本文的糖與本文的α-葡糖苷酶(例如轉葡糖苷酶或葡糖淀粉酶)接觸的合適的條件是支持糖的一個或多個α-1，5葡糖基-果糖鍵被α-葡糖苷酶水解的那些條件。合適的條件的示例公開于以下實施例中。用于使本文的α-葡糖苷酶與糖底物接觸的條件(例如溫度、pH、時間)也公開于美國專利申請公開2008/0229514、美國專利7413887和美國專利申請公開2013/0102035中(這些專利均以引用方式并入本文)，并且也可適用于所公開的水解方法。在公開的水解方法中，二糖和低聚糖通常能夠溶于水或水性溶液。因此，使本文的糖與α-葡糖苷酶接觸優(yōu)選在其中溶解糖的合適的水性條件下進行。水性條件可表現(xiàn)為包含至少約20重量％水的溶液或混合物。另選地，本文的水性條件例如為至少約20、30、40、50、60、70、80、85、90或95重量％水(或介于20至95重量％之間的任意整數值)。水性條件還可包括例如合適濃度的緩沖液，例如酸性、中性或堿性緩沖液，并且基于由緩沖液提供的pH范圍來選擇。緩沖液/緩沖劑的示例包括檸檬酸鹽、乙酸鹽(例如乙酸鈉)、KH2PO4、MOPS、CHES、硼酸鹽、碳酸鈉和碳酸氫鈉。本文的水解反應的pH例如可為約3.0至9.0。水解反應pH例如可為約3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5或9.0。另選地，pH可為約4-5。用于設定pH的技術包括使用例如緩沖液、堿、和/或酸，并且在本領域中是公知的。本文的水解反應的溫度例如可為約20℃至約80℃。水解反應溫度例如可為約20、30、40、50、60、70或80℃(或介于20至80℃之間的任意整數值)。在某些實施方案中，約60℃、65℃或60-65℃的水解溫度是優(yōu)選的。本文的水解反應可進行例如至少約10分鐘至約90小時的時段。水解反應的時間例如可為至少約0.5、1、2、3、4、8、12、16、20、24、30、36、42，48、54、60、66、72、78、84或90小時(或介于0.5至72小時之間的任意整數值)。在例如對明串珠菌二糖進行水解的某些實施方案中，水解反應的可例如進行小于4小時(例如0.5-4小時)。實現(xiàn)期望的水解水平所需的時間段將根據所用具體條件來變化，并且本領域技術人員可以理解。例如，使添加至反應或固定到用于反應的固體載體上的酶量增加將減少接觸時間。在某些實施方案中，本文的一種或多種α-葡糖苷酶可用于水解反應。例如，轉葡糖苷酶和葡糖淀粉酶兩者可用于反應。在本文的水解反應中，α-葡糖苷酶的量可例如比任何用于以下實施例(例如實施例2)的量增/減10％至20％(或5％至10％)。另選地，約0.1-0.5體積％或0.1-1.0體積％的α-葡糖苷酶可用于水解反應。仍另選地，本文的α-葡糖苷酶以約、或至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15ppm用于水解反應。轉葡糖苷酶單位(TGU)可例如定義為在以下測定的條件下每分鐘產生一微摩爾潘糖的轉葡糖苷酶的量。轉葡糖苷酶活性可例如如下測定：將轉葡糖苷酶引入包含4mM對-硝基苯基-α-葡糖苷和1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)的100mM乙酸鈉緩沖液(pH4.5)中。在30℃下溫育30分鐘之后，通過添加等體積的1M碳酸鈉終止反應，并記錄OD405。葡糖淀粉酶單位(XU)可例如定義為將產生1g還原糖的葡糖淀粉酶的量，計算為在pH4.2和60℃下每小時來自可溶性淀粉底物(4％DS[取代度])的葡萄糖。在本發(fā)明公開的某些實施方案中，水解反應中糖的初始濃度可例如為約1重量％至50重量％。例如，明串珠菌二糖的濃度可為約5、10、15、20、25、30、35或40重量％(或介于5至40重量％之間的任意整數值)。又如，在本文的水解反應中，一種或多種低聚糖(例如DP2、DP3、DP4、DP2-DP7、DP3-DP7)的濃度可為約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15重量％。本領域的技術人員認識到，總糖(包括二糖和低聚糖)的濃度可對α-葡糖苷酶的活性有影響；在一些方面，在水解反應中使酶活性最大化的優(yōu)選的總糖濃度可小于50重量％干固體(DS)，最優(yōu)選的濃度為20-35重量％DS。在某些實施方案中，用于使糖與本文的α-葡糖苷酶接觸的合適的條件可包括：(i)葡聚糖合成反應，或(ii)從葡聚糖合成反應獲得的級分；其中糖為葡聚糖合成反應的副產物。換句話講，本文的水解反應可在葡聚糖合成反應的范圍中或葡聚糖合成反應的一部分中進行，雖然其通常在后者之中進行。本文的葡聚糖合成反應可例如產生一種或多種不溶性和/或可溶性α-葡聚糖產物。因此，在本文的一些實施方案中，葡聚糖合成反應可特征化為“α-葡聚糖合成反應”。葡聚糖合成反應通常涉及這樣一種溶液：其包含至少一種蔗糖、水和一種活性葡糖基轉移酶、以及任選的其它組分。可在葡聚糖合成反應中的其它組分包括果糖、葡萄糖、明串珠菌二糖、可溶性低聚糖(例如DP2-DP7)、以及一種或多種可溶性葡聚糖產物。另外，在一些方面，葡聚糖合成反應可包括一種或多種α-葡聚糖水解酶。應當理解，某些葡聚糖產物例如DP為至少8或9的聚α-1，3-葡聚糖可以是水不溶性的并因此在葡聚糖合成反應中不溶解，而是可以析出溶液。因此，由本文的葡聚糖合成反應產生的葡聚糖可以是不溶性的?？蓪⒈疚牡摩?葡糖苷酶在葡聚糖合成反應的任何階段添加至其中，例如在反應初始制備期間或當反應接近完成(例如，完成80至90％)或完成時，其中后兩個時間點是優(yōu)選的。本文的葡聚糖合成反應除了產生葡聚糖產物之外，還可產生副產物例如明串珠菌二糖和/或可溶性低聚糖。在一些方面，葡聚糖為聚α-葡聚糖。因此，本文的葡聚糖合成反應可例如用于產生聚α-1，3-葡聚糖或齒斑葡聚糖，其通常在葡聚糖合成反應中與至少一種明串珠菌二糖和/或低聚糖副產物共同產生。在某些實施方案中，葡聚糖合成反應包括產生聚α-葡聚糖例如α-1，3-葡聚糖的葡糖基轉移酶?？捎糜诒疚牡拇祟惼咸腔D移酶的示例公開于美國專利7000000和美國專利申請公開2013/0244288、2013/0244287和2014/0087431，這些專利均以引用方式并入本文。本文的葡糖基轉移酶可來源于任何微生物源，例如細菌或真菌。細菌葡糖基轉移酶的示例為來源于鏈球菌屬(Streptococcus)菌種、明串珠菌屬(Leuconostoc)菌種或乳桿菌屬(Lactobacillus)菌種的那些。鏈球菌屬菌種的示例包括唾液乳桿菌(S.salivarius)、表兄鏈球菌(S.sobrinus)、S.dentirousetti、汗毛鏈球菌(S.downei)、變異鏈球菌(S.mutans)、口腔鏈球菌(S.oralis)、解沒食子酸鏈球菌(S.gallolyticus)和血鏈球菌(S.sanguinis)。明串珠菌屬菌種的示例包括(L.mesenteroides)、腸膜明串珠菌(L.amelibiosum)、阿根廷明串珠菌(L.argentinum)、肉明串珠菌(L.carnosum)、嗜檸檬酸明串珠菌(L.citreum)、乳脂鏈球菌(L.cremoris)、葡聚糖明串珠菌(L.dextranicum)和L.fructosum。乳桿菌屬菌種的示例包括嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)、德氏乳桿菌(L.delbrueckii)、(L.helveticus)、瑞士乳桿菌(L.salivarius)、干酪乳酸桿菌(L.casei)、彎曲乳桿菌(L.curvatus)、植物乳桿菌(L.plantarum)、清酒乳桿菌(L.sakei)、短乳桿菌(L.brevis)、(L.buchneri)、布氏乳桿菌(L.fermentum)和羅伊氏乳桿菌(L.reuteri)。本文的葡糖基轉移酶可不依賴引物或依賴引物。不依賴引物的葡糖基轉移酶不需要存在進行葡聚糖合成的引物。在聚合物合成期間，依賴引物的葡糖基轉移酶需要反應溶液中存在充當酶引物的起始分子。如本文所用，術語“引物”是指任何能夠用作葡糖基轉移酶的引發(fā)劑的分子?？捎糜谀承嵤┓桨傅囊锇ɡ缙暇厶羌捌渌妓衔锘?，例如水解的葡聚糖。美國專利申請公開2013/0244287(其以引用方式并入本文)公開了將聚α-1，3-葡聚糖用作起始材料來制備水解的葡聚糖。用作引物的葡聚糖可為例如葡聚糖T10(即具有10kD分子量的葡聚糖)。用于本文的葡聚糖合成反應的葡糖基轉移酶可通過在本領域已知的任何方法產生。例如，葡糖基轉移酶可在異源表達系統(tǒng)，例如微生物異源表達系統(tǒng)中重組產生。異源表達系統(tǒng)的示例包括細菌(例如大腸桿菌，如TOP10或MG1655；芽孢桿菌屬)和真核(例如酵母，如畢赤酵母屬和酵母屬)表達系統(tǒng)。本文所述葡糖基轉移酶可以以任何純化態(tài)(例如純或不純的)使用。例如，葡糖基轉移酶在其臨用前可以是純化和/或分離的。不純的葡糖基轉移酶的示例包括細胞裂解液形式的那些。細胞裂解液或提取物可從用于異源表達酶的細菌(例如大腸桿菌)得到。例如，可使用French壓碎器對細菌進行破壞。在另選的實施方案中，可用勻漿器(例如APV，Rannie，Gaulin)使細菌勻漿化。葡糖基轉移酶通常能夠溶于這些類型的制劑中。本文的細菌細胞裂解液、提取物、或均漿例如可以以約0.15-0.3％(v/v)用于反應溶液，從而由蔗糖產生聚α-葡聚糖，例如聚α-1，3-葡聚糖。如果期望，可對本文的葡聚糖合成反應的溫度進行控制。在某些實施方案中，反應的溫度為約5℃至約50℃。在某些其它實施方案中，溫度為約20℃至約40℃。在本文的葡聚糖合成反應中，蔗糖的初始濃度可為例如約20g/L至約400g/L。另選地，蔗糖的初始濃度可為約75g/L至約175g/L、或約50g/L至約150g/L。仍另選地，蔗糖的初始濃度可為例如約40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150或160g/L(或介于40至160g/L之間的任意整數值)?！罢崽堑某跏紳舛取笔侵竷H在添加所有反應溶液組分(至少水、蔗糖、gtf酶)之后gtf反應溶液中的蔗糖濃度。用于本文的葡聚糖合成反應的蔗糖可以是高純度的(≥99.5％)或為任何其它純度或等級。例如，蔗糖可具有至少99.0％的純度或者可為試劑級蔗糖。又如，可使用未完全精制的蔗糖。本文的未完全精制的蔗糖是指未加工為精制白蔗糖的蔗糖。因此，未完全精制的蔗糖可為完全未精制的或部分精制的。未精制的蔗糖的示例為“粗蔗糖”(“粗糖”)及其溶液。部分精制的蔗糖的示例未經歷一個、兩個、三個或更多個結晶步驟。本文的未完全精制的蔗糖的ICUMSA(InternationalCommissionforUniformMethodsofSugarAnalysis)可例如大于150。本文蔗糖可來源于任何可再生糖源，例如甘蔗、糖用甜菜、木薯、甜高粱或玉米?？捎糜诒疚牡倪m宜形式的蔗糖例如為結晶形式或非結晶形式(例如糖漿、蔗汁、甜菜汁)。未完全精制的蔗糖的另外適宜形式公開于美國申請61/969,958。測定蔗糖ICUMSA值的方法在本領域中是公知的，并且例如由InternationalCommissionforUniformMethodsofSugarAnalysis公開為ICUMSAMethodsofSugarAnalysis：OfficialandTentativeMethodsRecommendedbytheInternationalCommissionforUniformMethodsofSugarAnalysis(ICUMSA)(H.C.S.deWhalley編輯，ElsevierPub.Co.，1964)，該文獻引用方式并入本文。ICUMSA可例如如由R.J.McCowage，R.M.Urquhart知M.L.Burge(DeterminationoftheSolutionColourofRawSugars，BrownSugarsandColouredSyrupsatpH7.0-Official，VerlagDrAlbertBartens，2011修訂版)所述的ICUMSA方法GS1/3-7測定，該文獻以引用方式并入本文。在某些實施方案中，葡聚糖合成反應的pH可為約4.0至約8.0。另選地，pH可為約4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5或8.0。可以通過添加或摻入合適的緩沖液來調節(jié)或控制pH，該緩沖液包括但不限于：磷酸鹽、tris、檸檬酸鹽、或它們的組合。葡聚糖合成反應的緩沖液濃度可例如為0mM至約100mM、或約10、20、或50mM。在本文的葡聚糖合成反應中產生的聚α-1，3-葡聚糖可具有至少約50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或介于50％至100％之間的任意整數值)α-1，3糖苷鍵。在此類實施方案中，聚α-1，3-葡聚糖具有少于約50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％或0％(或介于0％至50％之間的任意整數值)的非α-1，3糖苷鍵。本文的聚α-1，3-葡聚糖優(yōu)選具有直鏈的/非支鏈的主鏈。在某些實施方案中，聚α-1，3-葡聚糖不具有分枝點或具有小于約10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％分枝點(作為聚合物中糖苷鍵的百分比)。分枝點的示例包括α-1，6分枝點。本文的葡聚糖合成反應中產生的聚α-1，3-葡聚糖的分子量可測定為數均分子量(Mn)或重均分子量(Mw)。另選地，分子量可按道爾頓或克/摩爾計測定。其也可用來指聚α-1，3-葡聚糖聚合物的DPw(重均聚合度)或DPn(數均聚合度)。本文的聚α-1，3-葡聚糖的Mn或Mw可為至少約1000。另選地，Mn或Mw可例如為至少約1000至約600000(或介于1000至600000之間的任意整數值)。仍另選地，聚α-1，3-葡聚糖可具有這樣的分子量：至少約100、或至少約100至1000(或介于100至1000之間的任意整數值)的Mn或Mw。葡聚糖合成反應的級分可構成用于使糖與如當前公開的α-葡糖苷酶接觸的合適的條件。級分可為得自葡聚糖合成反應的部分或全部液體溶液。通常，使級分與反應中合成的一種或多種可溶性或不溶性葡聚糖產物分離。例如，可使級分與一種或多種在其合成期間從溶液析出的不溶于水的葡聚糖產物(例如聚α-1，3葡聚糖)分離。在本公開的某些優(yōu)選的實施方案中的級分得自聚α-1，3-葡聚糖合成反應。在某些實施方案中，級分的體積(在任選地稀釋或濃縮級分之前，參見下文)可為從中獲取該級分的葡聚糖合成反應的體積的至少約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(或介于10％至90％之間的任意整數值)。通常，在產生不溶性葡聚糖(例如聚α-1，3葡聚糖)的葡聚糖合成反應中，級分將為反應的液體溶液組分的一部分(并非全部)?？稍谄暇厶呛铣煞磻娜魏坞A段獲得級分，但是優(yōu)選在反應接近完成(例如大于完成的80％或90％)或完成之后獲得。在某些實施方案中，葡聚糖合成反應的級分的示例包括濾液和上清液。因此，在其中合成不溶性葡聚糖產物的那些實施方案中，可使用漏斗、過濾器(例如壓濾器)、離心機、或本領域已知的允許從固體中移除一些或全部液體的任何其它方法或設備來從葡聚糖合成反應獲得(分離)本文的級分。過濾可例如通過重力、真空、或壓濾進行。過濾優(yōu)選地除去全部或大部分不溶性葡聚糖；可使用平均孔尺寸(例如約40-50微米)足以從液體中移除固體的任何過濾材料(例如濾紙)。級分通常保留全部或大部分其溶解的組分，例如葡聚糖合成反應的副產物。在本文的濾液中，明串珠菌二糖是優(yōu)選的糖。如果期望，可對本文的級分進行任選地稀釋或濃縮。級分的濃縮可采用適于濃縮溶液的本領域已知的任何其它方法或設備進行。例如，可通過蒸發(fā)，例如用旋轉蒸發(fā)儀(例如，設定為約40-50℃的溫度)來濃縮級分。在本文的一些方面，可使級分濃縮至這樣的體積：約初始級分體積的75％、80％、85％、90％或95％。經濃縮的級分(例如經濃縮濾液)可任選地稱為糖漿。級分在一些方面可包含水，該水替代從中獲得級分的組合物中存在的水。例如，可在其中初始溶劑被另一種溶劑替代的某些色譜方法中從葡聚糖合成反應分離一種或多種糖副產物(例如結合至柱的糖副產物[由此從初始溶劑中移除]可洗脫到新溶劑中)。在一些方面，可以以這樣的方式處理級分：具有以上公開的用于使糖與α-葡糖苷酶接觸的任何合適條件(例如，溫度、pH和試劑)。例如，在α-葡糖苷酶添加至級分之前，可使級分改變?yōu)榫哂屑s4至5的pH。又如，關于級分的水解反應的溫度可為約55-65℃(例如約60℃)。又如，已濃縮為糖漿的級分可用于水解反應。級分在本文的某些優(yōu)選的實施方案中得自聚α-1，3-葡聚糖合成反應；例如級分優(yōu)選地為濾液。本文的聚α-1，3-葡聚糖合成反應的級分至少包括水、果糖、以及一種或多種類型的糖(明串珠菌二糖和/或低聚糖，例如DP2-DP7)?？稍谠擃惣壏种械钠渌M分例如包括蔗糖(即在gtf反應中未消耗的殘余的蔗糖)、一種或多種gtf酶、葡萄糖、緩沖液、鹽、硼酸鹽、氫氧化鈉、鹽酸、細胞裂解液組分、蛋白質和/或核酸。最低限度地，得自聚α-1，3-葡聚糖合成反應的級分的組分包括例如水、果糖、葡萄糖、一種或多種類型的糖(明串珠菌二糖和/或低聚糖，例如DP2-DP7)、以及任選的蔗糖。應當理解，級分的組成部分取決于從中獲得級分的葡聚糖合成反應的條件。在包含一種或多種gtf酶的那些級分中，優(yōu)選地，在本文的水解反應中使用級分之前，此類一種或多種gtf酶失活(例如熱失活)。應當理解，在葡聚糖合成反應中經由聚合蔗糖產生的糖副產物的具體分布可基于所用反應條件和gtf酶，尤其是溫度和蔗糖濃度而變化。還應當理解，糖在葡聚糖合成反應的級分中的具體組成對于公開的水解方法并非至關重要的。一般來講，隨著蔗糖的量增大，反應對明串珠菌二糖和低聚糖兩者的選擇性將增大。相反地，隨著溫度增大，反應對明串珠菌二糖的選擇性趨于降低，而對于低聚糖的選擇性大體上未受到影響。應當理解，通過將糖的質量除以總溶液重量計算的糖與水的比率即重量％干固體(DS)可通過使水蒸發(fā)(優(yōu)選地在真空下和低于50℃的溫度下)或添加水來調節(jié)，而大體上不會影響糖在葡聚糖合成反應的級分中的相對分布。還可以通過在實現(xiàn)完全轉化(轉化為葡聚糖)之前終止gtf反應來增大級分中蔗糖的百分比，該終止通過將pH降到低于gtf酶的活性范圍或通過使gtf酶熱失活實現(xiàn)。在某些實施方案中，本文的葡聚糖合成反應可產生一種或多種可溶性α-葡聚糖產物?？扇苄驭?葡聚糖產物(或者“可溶性纖維”)可為：(i)葡糖基轉移酶的直接產物，或(ii)葡糖基轉移酶和α-葡聚糖水解酶兩者協(xié)同作用的產物，所述α-葡聚糖水解酶能夠水解具有一個或多個α-1，3-糖苷鍵或一個或多個α-1，6-糖苷鍵的葡聚糖聚合物。本文的可溶性α-葡聚糖可包括，例如：a)至少75％α-1，3-糖苷鍵；b)少于25％α-1，6-糖苷鍵；c)少于10％α-1，3，6-糖苷鍵；d)小于5000道爾頓的Mw；e)在20℃下，在水中12重量％下，小于0.25帕斯卡秒(Pa·s)的粘度；f)范圍為4至40的右旋糖當量(DE)；g)小于10％的消化性，如分析化學師協(xié)會(AssociationofAnalyticalCommunities，AOAC)方法2009.01所測；h)在25℃下，pH7水中至少20％(w/w)的溶解度；和i)小于5的多分散指數(PDI)?？扇缑绹暾?2/004,290所公開來制備此類可溶性α-葡聚糖。例如，可溶性α-葡聚糖纖維組合物可包含至少75％、優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少85％、甚至更優(yōu)選至少90％、并且最優(yōu)選至少95％α-(1，3)糖苷鍵。又如，除了上述α-(1，3)糖苷鍵實施方案之外，可溶性α-葡聚糖纖維組合物還可包含少于25％、優(yōu)選少于10％、更優(yōu)選5％或更少、并甚至更優(yōu)選少于1％α-(1，6)糖苷鍵。又如，除了上述α-(1，3)和α-(1，6)糖苷鍵含量實施方案之外，可溶性α-葡聚糖纖維組合物還可包含少于10％、優(yōu)選少于5％、并最優(yōu)選少于2.5％的α-(1，3，6)糖苷鍵。又如，可溶性α-葡聚糖纖維組合物可包含93至97％α-(1，3)糖苷鍵和少于3％α-(1，6)糖苷鍵，并且具有對應于3至7混合DP的重均分子量。在另一個實施方案中，可溶性α-葡聚糖纖維組合物可包含約95％α-(1，3)糖苷鍵和約1％α-(1，6)糖苷鍵，并且具有對應于3至7混合DP的重均分子量。在以上實施方案的另一方面，可溶性α-葡聚糖纖維組合物可包含約1至3％α-(1，3，6)鍵或優(yōu)選約2％α-(1，3，6)鍵。又如，除了以上提及的糖苷鍵含量實施方案之外，可溶性α-葡聚糖纖維組合物還可包含少于5％、優(yōu)選少于1％、并且最優(yōu)選少于0.5％α-(1，4)糖苷鍵。又如，除了以上提及的糖苷鍵含量實施方案之外，可溶性α-葡聚糖纖維組合物還可包括小于5000道爾頓、優(yōu)選小于2500道爾頓、更優(yōu)選500至2500道爾頓、并且最優(yōu)選約500至約2000道爾頓的重均分子量(Mw)。又如，除了任何以上特征之外，在20℃下和水中12重量％下，可溶性α-葡聚糖纖維組合物還可包括小于250厘泊(0.25Pa·s)、優(yōu)選小于10cP(0.01Pa·s)、優(yōu)選小于7cP(0.007Pa·s)、更優(yōu)選小于5cP(0.005Pa·s)、更優(yōu)選小于4cP(0.004Pa·s)、并且最優(yōu)選小于3cP(0.003Pa·s)的粘度。在某些實施方案中，如分析化學師協(xié)會(AssociationofAnalyticalCommunities，AOAC)方法2009.01所測，可溶性α-葡聚糖纖維組合物可具有小于10％、優(yōu)選小于9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％消化性的消化性。在另一方面，消化性的相對水平或者也可采用AOAC2011.25(綜合總膳食纖維檢測定，IntegratedTotalDietaryFiberAssay)(McCleary等人，2012，J.AOACInt.，95(3)，824-844)測定。除了任何以上實施方案之外，可溶性α-葡聚糖纖維組合物可25℃下pH7水中具有至少20％(w/w)、優(yōu)選至少30％、40％、50％、60％或70％的溶解度。在一個實施方案中，可溶性α-葡聚糖纖維組合物可包含的還原糖的含量小于10重量％、優(yōu)選小于5重量％、并且最優(yōu)選小于重量1％或更少。在一個實施方案中，可溶性α-葡聚糖纖維組合物可包括少于4千卡/g、優(yōu)選少于3千卡/g、更優(yōu)選少于2.5千卡/g、并且最優(yōu)選約2千卡/g或更少的含熱量。又如，本文的可溶性α-葡聚糖可包括：a)10％至30％α-1，3-糖苷鍵；b)65％至87％α-1，6-糖苷鍵；c)少于5％α-1，3，6-糖苷鍵；d)小于5000道爾頓的重均分子量(Mw)；e)在20℃下，在水中12重量％下，小于0.25帕斯卡秒(Pa·s)的粘度；f)范圍為4至40、優(yōu)選10至40的右旋糖當量(DE)；g)小于10％的消化性，如分析化學師協(xié)會(AssociationofAnalyticalCommunities，AOAC)方法2009.01所測；h)在25℃下，pH7水中至少20％(w/w)的溶解度；和i)小于5的多分散指數(PDI)。可如美國申請62/004,308所公開來制備此類可溶性α-葡聚糖。又如，本文的可溶性α-葡聚糖可包括：a)25-35α-1，3-糖苷鍵；b)55-75％α-1，6-糖苷鍵；c)5-15％α-1，3，6-糖苷鍵；d)小于5000道爾頓的重均分子量；e)在20℃下，在水中12重量％下，小于0.25帕斯卡秒(Pa·s)的粘度；f)范圍為4至40的右旋糖當量(DE)；g)小于10％的消化性，如分析化學師協(xié)會(AssociationofAnalyticalCommunities，AOAC)方法2009.01所測；h)在25℃下，水中至少20％(w/w)的溶解度；和i)小于5的多分散指數?？扇缑绹暾?2/004,312所公開來制備此類可溶性α-葡聚糖。又如，本文的可溶性α-葡聚糖可包括：a)至少95％α-1，6-糖苷鍵；b)1％或更少的α-1，3-糖苷鍵；c)少于2％α-1，3，6-糖苷鍵；d)少于1.5％α-1，4-糖苷鍵；e)小于20000道爾頓的重均分子量；f)20℃下，在水中12重量％下，小于0.25帕斯卡秒(Pa·s)的粘度：g)范圍為1至30的右旋糖當量(DE)；h)小于10％的消化性，如分析化學師協(xié)會(AssociationofAnalyticalCommunities，AOAC)方法2009.01所測；i)在25℃下，pH7水中至少20％(w/w)的溶解度；和j)小于5的多分散指數?？扇缑绹暾?2/004,314所公開來制備此類可溶性α-葡聚糖。又如，本文的可溶性α-葡聚糖可包括：a)范圍為：i)1％至50％的α-1，3-糖苷鍵；或ii)大于10％單但少于40％的α-1，4-糖苷鍵；或iii)i)和ii)的任何組合；b)1至50％α-1，2-糖苷鍵；c)0-25％α-1，3，6-糖苷鍵；d)小于98％α-1，6-糖苷鍵；e)小于300kDa的重均分子量；f)20℃下，在水中12重量％下，小于0.25帕斯卡秒(Pa·s)的粘度；g)小于20％的消化性，如分析化學師協(xié)會(AssociationofAnalyticalCommunities，AOAC)方法2009.01所測；h)在25℃下，pH7水中至少20％(w/w)的溶解度；和i)小于26，優(yōu)選小于5的多分散指數。可如美國申請62/004,305所公開來制備此類可溶性α-葡聚糖。在某些實施方案中，可溶性α-葡聚糖為葡糖基轉移酶的直接產物。在合適的葡聚糖合成反應中，此類葡糖基轉移酶和用于其的條件可如本文所公開的，或如在任何美國專利申請例如62/004,290、62/004,308、62/004,312、62/004,314和/或62/004,305中公開的?？扇苄驭?葡聚糖或者也可為例如葡糖基轉移酶和α-葡聚糖水解酶兩者協(xié)同作用的產物，所述α-葡聚糖水解酶能夠水解具有一個或多個α-1，3-糖苷鍵或一個或多個α-1，6-糖苷鍵的葡聚糖聚合物。在一些方面，用于產生可溶性α-葡聚糖產物的葡聚糖合成反應可包括至少一種葡糖基轉移酶和至少一種α-葡聚糖水解酶兩者。在其它方面，葡聚糖合成反應可初始包含一種或多種葡糖基轉移酶作為唯一的酶組分。此類反應產生尚未通過α-葡聚糖水解酶進行修飾的第一α-葡聚糖。然后，將至少一種α-葡聚糖水解酶添加至反應合適的時間段，以允許將第一產物修飾為可溶性α-葡聚糖產物。因此，存在通過其經由葡糖基轉移酶和α-葡聚糖水解酶兩者協(xié)同作用合成可溶性α-葡聚糖產物的不同方式。在葡聚糖合成反應期間和/或葡聚糖合成之后，用于進行葡聚糖合成反應(其中包含一種或多種α-葡聚糖水解酶)的條件可如本文所公開，或如在任何美國專利申請例如62/004,290、62/004,308、62/004,312、62/004,314和/或62/004,305中公開的。本文的α-葡聚糖水解酶可為例如葡聚糖酶(能夠水解α-1，6-連接的糖苷鍵；E.C.3.2.1.11)、突變酶(能夠水解α-1，3-連接的糖苷鍵；E.C.3.2.1.59)、霉菌葡聚糖酶(能夠內切水解包含(1-3)-和(1-4)-鍵兩者的α-D-葡聚糖的(1-4)-α-D-糖苷鍵；EC3.2.1.61)、葡聚糖1，6-a-葡糖苷酶(EC3.2.1.70)和交替聚糖酶(EC3.2.1.-；能夠內切水解裂解交替聚糖；E.C.3.2.1.-；參見美國專利5786196)?？稍谀承┓矫嬷惺褂冒⊿EQIDNO：47的突變酶。另選地，突變酶可例如包含與SEQIDNO：47至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列，并且具有突變酶活性。如當前所公開的用于產生一種或多種可溶性α-葡聚糖產物的葡聚糖合成反應可直接用作其中進行本文的水解反應的合適的條件，其中α-葡糖苷酶用于水解α-1，5葡糖基-果糖鍵?？筛鶕P于產生例如聚α-1，3-葡聚糖的葡聚糖合成反應的水解處理的任何以上公開的條件進行此類水解。另選地，用于產生一種或多種可溶性α-葡聚糖產物的葡聚糖合成反應的級分(例如色譜級分)可用作其中對α-1，5葡糖基-果糖鍵進行α-葡糖苷酶介導的水解的合適的條件。在本文的某些實施方案中，級分可為葡聚糖合成反應的色譜級分。例如，級分可為產生一種或多種如本文公開的可溶性α-葡聚糖產物的葡聚糖合成反應的色譜級分。此類反應可在葡聚糖合成期間和/或葡聚糖合成完成之后任選地包括一種或多種α-葡聚糖水解酶。通常在任何這些類型的實施方案中獲得級分，以便使全部或大部分(例如，至少約60％、70％、80％、90％、95％)可溶性α-葡聚糖產物與產生其的反應組合物分離。一旦與全部或大部分可溶性α-葡聚糖產物分離，就可使用一種或多種α-葡聚糖酶使級分經受本文所公開的任何α-1，5葡糖基-果糖水解過程。本文的色譜級分可通常使用適宜類型的液相色譜法獲得。液相色譜可例如使用尺寸排阻色譜法(SEC)、柱層析、高效液相色譜法(HPLC)、離子交換色譜法、親和色譜法、超濾、微濾、或滲析進行。本公開還涉及一種通過使糖與α-葡糖苷酶(例如轉葡糖苷酶或葡糖苷酶)接觸而產生的組合物，其中(i)糖為包含至少一個α-1，5葡糖基-果糖鍵的二糖或低聚糖，并且(ii)α-葡糖苷酶水解糖的至少一個α-1，5葡糖基-果糖鍵。以該方式產生的組合物包含的糖量相較于接觸之前存在的糖量更少。組合物的示例包括本文公開的那些，例如得自葡聚糖合成反應的經水解的濾液、或用于產生可溶性α-葡聚糖的葡聚糖合成反應的經水解的級分。以上公開的以及實施例中關于水解方法及其產物的任何特征可表征組合物。組合物的以下特征為示例。在組合物的某些實施方案中，α-葡糖苷酶可包含與SEQIDNO：5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38，或DIAZYMERDFULTRA(DuPontIndustrialBiosciences)至少90％，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在組合物的某些實施方案中，轉葡糖苷酶可包含與SEQIDNO：1至少90％相同的氨基酸序列。在組合物的某些實施方案中，葡糖淀粉酶可包含與SEQIDNO：2至少90％相同的氨基酸序列。另選地，本文公開的任何α-葡糖苷酶可用于產生公開的組合物。由本文的水解方法產生的組合物的糖例如明串珠菌二糖的濃度可例如少于糖與α-葡糖苷酶接觸之前存在的明串珠菌二糖的濃度的50％。在本文的某些實施方案中，由水解方法產生的組合物可為葡聚糖合成反應物、或其級分，其中葡聚糖合成反應的副產物與α-葡糖苷酶接觸接觸。在該實施方案中，級分可例如為葡聚糖合成反應的濾液、或用于產生可溶性α-葡聚糖的葡聚糖的合成反應的級分。在該實施方案中，糖可例如為明串珠菌二糖。技術人員應當理解，當前公開的實施方案部分用于糖化以其它方式可能難以分解的二糖和低聚糖。例如，可以利用該特征來實施增強的方法：(i)果糖富集和(ii)發(fā)酵。以下實施例6顯示，相較于使用未水解的濾液，當使用被α-葡糖苷酶(轉葡糖苷酶)水解的葡聚糖濾液時通過色譜法增強了果糖富集。因此，公開的發(fā)明還涉及一種富集存在于葡聚糖合成反應的級分中果糖的方法。該方法包括：(a)使從葡聚糖合成反應獲得的級分與α-葡糖苷酶(例如轉葡糖苷酶或葡糖淀粉酶)在合適的條件下接觸，其中酶水解級分內所含的二糖或低聚糖的至少一個α-1，5葡糖基-果糖鍵；以及(b)從步驟(a)的經水解級分中分離果糖，以獲得果糖濃度比步驟(a)的級分的果糖濃度更高的組合物。公開的例如關于α-葡糖苷酶(例如轉葡糖苷酶或葡糖淀粉酶)和葡聚糖合成反應的級分的果糖富集方法的特征可根據本文提供的涉及每種這些特征的任何公開內容。分離果糖的步驟(b)可通過本領域的技術人員已知的任何方法進行。例如，可如以下實施例中所公開，或根據歐洲專利公開EP2292803B1來使用色譜法，該專利以引用方式并入本文。得自公開的富集方法的具有更高濃度果糖的組合物(例如果糖溶液或果糖糖漿)可具有至少約90、91、92、93、94、95、96、97、98或99重量％果糖。本文的果糖富集方法可比利用未經如當前公開的α-葡糖苷酶水解的濾液的方法表現(xiàn)地更好。此類增大的性能可根據至少40％、45％或50％的果糖回收百分比來測定。本公開還涉及一種發(fā)酵方法，該方法包括：(a)使從葡聚糖合成反應獲得的級分與α-葡糖苷酶(例如，轉葡糖苷酶或葡糖淀粉酶)在合適的條件下接觸，其中α-葡糖苷酶水解級分內所含的二糖或低聚糖的至少一個α-1，5葡糖基-果糖鍵；(b)用微生物發(fā)酵步驟(a)的級分以獲得產物；以及(c)任選地分離(b)的產物。步驟(b)的發(fā)酵步驟可在步驟(a)之后或與步驟(a)同時進行。顯著地，可例如通過發(fā)酵葡聚糖合成反應的經水解的濾液，使用該方法產生乙醇。得自該過程的乙醇收率高于發(fā)酵尚未水解的葡聚糖濾液時獲得的乙醇收率。關于α-葡糖苷酶(例如，轉葡糖苷酶或葡糖淀粉酶)、二糖和低聚糖、葡聚糖合成反應的級分、以及合適的接觸條件的公開的發(fā)酵方法的特征例如可根據本文提供的涉及每種這些特征的任何公開內容。用于本文的發(fā)酵方法的微生物可為例如細菌、酵母或真菌?？捎糜诒疚牡募毦氖纠ㄈ闂U菌屬菌種、鏈球菌屬菌種、雙歧桿菌屬菌種、明串珠菌屬菌種、埃希氏菌屬(Escherichia)菌種(例如大腸桿菌)和芽孢桿菌屬菌種。可用于本文的酵母的示例包括酵母屬菌種，例如釀酒酵母(S.cerevisiae)和貝酵母(S.bayanus)。本文的發(fā)酵方法可獲得產物例如乙醇或酸(例如乳酸)。然而，據信如果期望，可產生其它產物。本領域技術人員應當理解，使用如公開的發(fā)酵方法產生特定產物將依賴于各種條件，例如用于發(fā)酵的一種或多種微生物。例如，本文的用于發(fā)酵的條件可如以下實施例所公開，或者如E1-Mansi等人(2006，F(xiàn)ermentationMicrobiologyandBiotechnology，第二版，CRCPress)和Stanbury等人(1999，PrinciplesofFermentationTechnology，第二版，Butterworth-Heinemann)所公開，二者均以引用方式并入本文。在本文的發(fā)酵方法的某些實施方案中，產物收率高于發(fā)酵未經本文的α-葡糖苷酶水解的葡聚糖濾液時獲得的產物收率。該比較可參照例如使用葡聚糖合成反應的未水解級分的對照發(fā)酵。本文發(fā)酵的產物收率可例如增加至少約10％、20％、40％、60％、80％或100％(或介于10％至100％之間的任意整數值)。此外，由本文的發(fā)酵形成產物的速率可增大。以下實施例7顯示出，明串珠菌二糖可被提供有包含未水解的葡聚糖濾液的進料的酵母發(fā)酵為乙醇。因此，本文進一步公開了一種用微生物將明串珠菌二糖發(fā)酵為產物(例如乙醇)的方法。該方法可包括發(fā)酵(i)已經或(ii)未經如本文公開的α-葡糖苷酶水解的葡聚糖濾液。無論明串珠菌二糖是否提供于葡聚糖濾液中或以另一種形式提供(例如半純化或富集形式)，用于發(fā)酵串珠菌二糖的方法可包括使微生物(例如酵母，如釀酒酵母)適于利用明串珠菌二糖。此類適應可包括使微生物在明串珠菌二糖和任選的其它糖存在下生長至少2或3個生長周期，其后微生物利用更多明串珠菌二糖來發(fā)酵產物。在某些實施方案中，微生物可(i)在包含明串珠菌二糖的第一進料中生長(1個完整周期)，(ii)從第一進料中移除，(iii)在包含明串珠菌二糖的第二進料中生長(兩個完整周期，(iv)從第二進料任選地移除，以及(v)在第三進料中任選地生長(三個完整周期)。在某些實施方案中，以該方式適應的微生物可增大發(fā)酵明串珠菌二糖的能力。以下實施例9顯示出，當葡聚糖濾液在被轉葡糖苷酶水解的同時被酵母發(fā)酵時，存在于葡聚糖濾液中的幾乎所有(例如＞98％或＞99％)明串珠菌二糖可用于被酵母發(fā)酵。因此，本文增強的串珠菌二糖發(fā)酵方法可包括用α-葡糖苷酶(例如，轉葡糖苷酶或葡糖淀粉酶)水解串珠菌二糖，同時用微生物發(fā)酵串珠菌二糖。本文所公開的組合物和方法的非限制性示例包括：1.一種使包含至少一個α-1，5葡糖基-果糖鍵的糖中的α-1，5葡糖基-果糖鍵水解的方法，其中糖為二糖或低聚糖，并且其中所述方法包括：使糖與α-葡糖苷酶在合適的條件下接觸，其中α-葡糖苷酶水解糖的至少一個α-1，5葡糖基-果糖鍵，并且其中糖量相較于接觸之前存在的糖量減少。2.根據實施方案1所述的方法，其中α-葡糖苷酶是固定的。3.根據實施方案1或2所述的方法，其中糖為明串珠菌二糖。4.根據實施方案3所述的方法，其中在接觸步驟之后的明串珠菌二糖的濃度少于在接觸之前存在的明串珠菌二糖的濃度的50％。5.根據實施方案1、2、3或4所述的方法，其中合適的條件包括：(i)葡聚糖合成反應，或(ii)從葡聚糖合成反應獲得的級分；其中糖為葡聚糖合成反應的副產物。6.根據實施方案5所述的方法，其中葡聚糖合成反應產生至少一種不溶性α-葡聚糖產物。7.根據實施方案6所述的方法，其中級分為葡聚糖合成反應的濾液。8.根據實施方案5所述的方法，其中葡聚糖合成反應產生至少一種可溶性α-葡聚糖產物，其為：(i)葡糖基轉移酶的產物，或(ii)葡糖基轉移酶和α-葡聚糖水解酶兩者協(xié)同作用的產物，所述α-葡聚糖水解酶能夠水解具有一個或多個α-1，3-糖苷鍵或一個或多個α-1，6-糖苷鍵的葡聚糖聚合物。9.根據實施方案8所述的方法，其中級分為葡聚糖合成反應的色譜級分。10.根據實施方案1-9中任一項所述的方法，其中α-葡糖苷酶為轉葡糖苷酶或葡糖淀粉酶。11.一種通過使糖與α-葡糖苷酶接觸而產生的組合物，其中糖為二糖或低聚糖并且包含至少一個α-1，5葡糖基-果糖鍵，其中酶水解糖的至少一個α-1，5葡糖基-果糖鍵，并且其中組合物包含的糖量相較于接觸之前存在的糖量減少。12.根據實施方案11所述的組合物，其中糖為明串珠菌二糖。13.根據實施方案11或12所述的組合物，其中糖在(i)葡聚糖合成反應，或(ii)從葡聚糖合成反應獲得的級分中；其中糖為葡聚糖合成反應的副產物。14.一種富集存在于葡聚糖合成反應的級分中果糖的方法，該方法包括：(a)使從葡聚糖合成反應獲得的級分與α-葡糖苷酶在合適的條件下接觸，其中α-葡糖苷酶水解級分內所含的二糖或低聚糖的至少一個α-1，5葡糖基-果糖鍵；以及(b)從步驟(a)的經水解級分中分離果糖，以獲得果糖濃度比步驟(a)的級分的果糖濃度更高的組合物。15.一種發(fā)酵方法，該方法包括：(a)使從葡聚糖合成反應獲得的級分與α-葡糖苷酶在合適的條件下接觸，其中α-葡糖苷酶水解級分內所含的二糖或低聚糖的至少一個α-1，5葡糖基-果糖鍵；(b)用微生物發(fā)酵步驟(a)的級分以獲得產物，其中發(fā)酵在步驟(a)之后或與步驟(a)同時進行；以及(c)任選地，分離(b)的產物；其中相較于對未與α-葡糖苷酶接觸的葡聚糖合成反應的級分進行發(fā)酵的產物收率，(b)的產物收率增加。實施例所公開的發(fā)明將在以下的實施例中進一步闡述。應該理解，盡管這些實施例說明了本發(fā)明的某些優(yōu)選方面，但僅是以例證的方式給出的。通過上述論述和這些實施例，本領域的技術人員可確定本發(fā)明的必要特征，并且在不脫離本發(fā)明的實質和范圍內的前提下，可對本發(fā)明進行各種變化和修改以適應多種用途和條件?？s寫本文所用一些縮寫的的含義如下：“g”是指克，“h”是指小時，“mL”是指毫升，“psi”是指磅每平方英寸，“wt％”是指重量百分比，“μm”是指微米，“％”是指百分比，“℃”是指攝氏度，“mg”毫克，“mm”是指毫米，“mL/min”是指毫米每分鐘，“m”是指米，“uL”是指微升，“mmol”是指毫摩爾，“min”是指分鐘，“mol％”是指摩爾％，“M”是指摩爾，“mg/g”是指毫克每克，“rpm”是指轉每分鐘，“MPa”是指兆帕。一般方法除非另行指出，所有試劑均可購自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。蔗糖可購自VWR(Radnor，PA)。葡糖基轉移酶(gtf)的粗提取物的制備采用異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)-誘導的表達系統(tǒng)在大腸桿菌菌株DH10B中表達唾液鏈球菌gtfJ酶(SEQIDNO：3)。相較于唾液鏈球菌gtfJ氨基酸序列(GENBANK識別號47527)，SEQIDNO：3具有N-末端42個殘基缺失，但是包括起始甲硫氨酸。簡而言之，大腸桿菌DH10B細胞被轉化以由經密碼子優(yōu)化的DNA序列表達SEQIDNO：3，從而在大腸桿菌中表達gtfJ酶。該DNA序列包括在表達載體(DNA2.0，MenloParkCA)中。將轉化的細胞接種于初始光密度(OD，在600nm處)為0.025的LB培養(yǎng)基(10g/L胰蛋白胨；5g/L酵母提取物，10g/LNaCl)中，并使其在37℃下于培養(yǎng)箱中生長，同時在250rpm下進行攪拌。當其達到0.8-1.0的OD600時，添加1mMIPTG來誘導培養(yǎng)物。將誘導的培養(yǎng)物置于搖動器上并在誘導3小時后收獲。通過使培養(yǎng)的細胞在離心機中離心(25℃，16000rpm)收獲得到酶GtfJ(SEQIDNO：3)，使細胞重懸于5.0mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中并在冰上冷卻至4℃。采用0.1-mm二氧化硅粒珠使用粒打漿機使細胞破碎，然后在4℃和16000rpm下離心以使未破碎細胞和細胞碎片沉淀。使粗提物(包含可溶性GtfJ酶，SEQIDNO：3)與沉淀分離，并通過Bradford蛋白質測定法分析來測定蛋白質濃度(mg/mL)。如下制備鏈球菌屬C150gtf-S酶(SEQIDNO：40)。SG1184是枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)表達菌株，其表達截短型式的鏈球菌屬C150(GI：321278321)的糖基轉移酶Gtf-S(“GTF0459”)。在aprE啟動子作用下將來自大腸桿菌表達質粒pMP79(SEQIDNO：41)的編碼N-末端截短的蛋白質GTF0459(SEQIDNO：42)的基因克隆到枯草芽孢桿菌整合型表達質粒p4JH的NheI和HindIII位點中并在載體上與枯草芽孢桿菌AprE信號肽融合。首先將構建體轉化到大腸桿菌DH10B中并在含氨芐青霉素(100μg/mL)的LB平板上進行選擇。然后將經證實的表達GTF0459的構建體pDCQ984轉化到包含九個蛋白酶缺失的枯草芽孢桿菌BG6006中(amyE：：xylRPxylAcomK-ermC，degUHy32，oppA，ΔspoIIE3501，ΔaprE，ΔnprE，Δepr，ΔispA，Δbpr，Δvpr，ΔwprA，Δmpr-ybfJ，ΔnprB)并在含氯霉素(5μg/mL)的LB平板上選擇。使在含有5μg/mL氯霉素的LB平板上生長的菌落在含25μg/mL氯霉素的LB平板上劃線接種幾次。使所得的枯草芽孢桿菌表達菌株SG1184首先在含25μg/mL氯霉素的LB培養(yǎng)基上生長并然后在含25μg/mL氯霉素的GrantsII培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，在30℃下生長2-3天。在15,000g和4℃下使培養(yǎng)物離心30分鐘并使上清液過濾通過0.22-μm濾波器。將過濾后的上清液分成等份并在-80℃冷凍。通過常規(guī)的分批補料發(fā)酵使表達GTF0459(SEQIDNO：42)的枯草芽孢桿菌SG1184菌株在深水有氧條件下生長。使用含有0-0.25％固體玉米漿(Roquette)、5-25g/L磷酸鈉和磷酸鉀、0.3-0.6M硫酸亞鐵、氯化錳和氯化鈣的溶液、0.5-4g/L硫酸鎂和0.01-3.7g/L硫酸鋅、硫酸亞銅、硼酸和檸檬酸的溶液的營養(yǎng)培養(yǎng)基。以2-4mL/L添加消泡劑FOAMBLAST882來控制發(fā)泡。當檢測不到批量中的初始葡糖糖時，用50％(w/w)葡萄糖進料補加10-L發(fā)酵。葡萄糖進料速率在幾小時內上升。使發(fā)酵控制于30℃和20％DO，并且初始攪拌為750rpm。用50％(v/v)氫氧化銨將pH控制于7.2。在貫穿2-天的發(fā)酵運行中，監(jiān)測發(fā)酵參數例如pH、溫度、空氣流量和DO％。在運行結束時收獲得到培養(yǎng)物發(fā)酵液并對其進行離心以獲得上清液。然后使包含GTF0459(SEQIDNO：42)的上清液在-80℃下冷凍儲存。如下制備變異鏈球菌MT-4239gtf-C酶(SEQIDNO：43)。使用經最優(yōu)化以在枯草芽孢桿菌中表達的密碼子合成編碼截短型式的葡糖基轉移酶(gtf)(在識別為GI：3130088，SEQIDNO：43；得自變異鏈球菌MT-4239的gtf-C)的基因并且其由GenScript合成。由GENSCRIPT質粒擴增編碼具有N-末端截短和C-末端T1截短的GTF0088BsT1(SEQIDNO：45)的基因(SEQIDNO：44)，并且在aprE啟動子作用下克隆到枯草芽孢桿菌整合型表達質粒p4JH的NheI和HindIII位點中并在載體上與枯草芽孢桿菌AprE信號肽融合。首先將構建體轉化到大腸桿菌DH10B中并在含氨芐青霉素(100μg/mL)的LB平板上進行選擇。然后將經證實的表達GTF0088BsT1的構建體pDCQ1021轉化到包含九個蛋白酶缺失的枯草芽孢桿菌BG6006中(amyE：：xylRPxylAcomK-ermC，degUHy32，oppA，ΔspoIIE3501，ΔaprE，ΔnprE，Δepr，ΔispA，Δbpr，Δvpr，ΔwprA，Δmpr-ybfJ，ΔnprB)并在含氯霉素(5μg/mL)的LB平板上選擇。使在含有5μg/mL氯霉素的LB平板上生長的菌落在含25μg/mL氯霉素的LB平板上劃線接種幾次。使所得的枯草芽孢桿菌表達菌株SG1221首先在含25μg/mL氯霉素的LB培養(yǎng)基上生長并然后在含25μg/mL氯霉素的GrantsII培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，在30℃下生長2-3天。在15,000g和4℃下使培養(yǎng)物離心30分鐘并使上清液過濾通過0.22-μm濾波器。將過濾后的上清液分成等份并在-80℃冷凍。通過常規(guī)的分批補料發(fā)酵使表達GTF0088BsT1(SEQIDNO：45)的枯草芽孢桿菌SG1221菌株在深水有氧條件下生長。使用含有0-0.25％固體玉米漿(Roquette)、5-25g/L磷酸鈉和磷酸鉀、0.3-0.6M硫酸亞鐵、氯化錳和氯化鈣的溶液、0.5-4g/L硫酸鎂和0.01-3.7g/L硫酸鋅、硫酸亞銅、硼酸和檸檬酸的溶液的營養(yǎng)培養(yǎng)基。以2-4mL/L添加消泡劑FOAMBLAST882來控制發(fā)泡。當檢測不到批量中的初始葡糖糖時，用50％(w/w)葡萄糖進料補加2-L發(fā)酵。葡萄糖進料速率在幾小時內上升。使發(fā)酵控制于30℃和20％DO，并且初始攪拌為400rpm。用50％(v/v)氫氧化銨將pH控制于7.2。在貫穿2-天的發(fā)酵運行中，監(jiān)測發(fā)酵參數例如pH、溫度、空氣流量和DO％。在運行結束時收獲得到培養(yǎng)物發(fā)酵液并對其進行離心以獲得上清液。然后使包含GTF088BsT1(SEQIDNO：45)的上清液在-80℃下冷凍儲存。葡糖基轉移酶GTF0459和GTF0088BsT1活性的測定葡糖基轉移酶活性測定通過以下過程進行：在存在或不存在25g/L葡聚糖(MW～1500，Sigma-Aldrich，Cat.#31394)的情況下，在37℃和125rpm軌道搖動下，用含200g/L蔗糖的25mM或50mM乙酸鈉緩沖液(pH5.5下)溫育包含GTF酶的1-10％(v/v)粗蛋白提取物。在1h、2h和3h時取出一份反應混合物的等分試樣并在90℃加熱5min以使GTF失活。通過在13,000xg下離心5分鐘來移除不溶性材料，之后使其過濾通過0.2umRC(再生纖維素)膜。在85℃下采用兩個串聯(lián)AMINEXHPX-87C柱通過HPLC分析所得濾液(Bio-Rad，Hercules，CA)來定量蔗糖濃度。相對于反應時間繪出各個時間點的蔗糖濃度并由線性曲線的斜率確定初始反應速率。一個GTF活性單位定義為在測定條件下每分鐘消耗一微摩爾的蔗糖所需的酶量。α-(1，3)-葡聚糖水解酶(突變酶)的粗提取物的制備編碼馬爾內菲青霉(Penicilliummarneffei)18224TM突變酶(識別為GI：212533325)的基因由GenScript(Piscataway，NJ)合成。在CBHI啟動子和終止子的控制下，將編碼蛋白質序列(MUT3325；SEQIDNO：47)的核苷酸序列(SEQIDNO：46)亞克隆到質粒pTrex3的SacII和AscI限制性位點中，該質粒即設計用于表達里氏木霉(Trichodermareesei)中的目標基因的載體，采用黑曲霉乙酰胺酶用于選擇。通過基因槍注入將所得的質粒轉化到里氏木霉中?；驑屴D化的具體方法描述于國際PCT專利申請公開WO2009/126773A1，其公開內容以引用方式并入本文。使用具有來自穩(wěn)定克隆的孢子的1-cm2瓊脂棒TRM05-3來接種制備培養(yǎng)基(以下所述)。在28℃和220rpm下，使培養(yǎng)物在搖瓶中生長4-5天。為了收獲得到分泌的蛋白質，首先通過在4000g下離心10分鐘移除細胞群，并使上清液過濾通過0.2-μm無菌過濾器。突變酶MUT3325(SEQIDNO：47)的表達通過SDS-PAGE加以證實。以下列出了制備培養(yǎng)基組分。NREL-TrichLactoseDefined里氏木霉痕量元素通過在2-L帶擋板的燒瓶中用1.0mL的MUT3325表達菌株TRM05-3的冷凍孢子懸液接種0.5L的基本培養(yǎng)基來制備發(fā)酵種子培養(yǎng)物(基本培養(yǎng)基由5g/L硫酸銨、4.5g/L磷酸二氫鉀、1.0g/L七水硫酸鎂、14.4g/L無水檸檬酸、1g/L二水氯化鈣、25g/L葡萄糖，以及痕量元素包括0.4375g/L檸檬酸、0.5g/L七水硫酸亞鐵、0.04g/L七水硫酸鋅、0.008g/L五水硫酸銅、0.0035g/L一水合硫酸錳和0.002g/L硼酸組成，pH為5.5)。在轉化到14-L發(fā)酵罐中的8L制備培養(yǎng)基之前，使培養(yǎng)物在32℃和170rpm下生長48小時。制備培養(yǎng)基由75g/L葡萄糖、4.5g/L磷酸二氫鉀、0.6g/L二水合氯化鈣、1.0g/L七水硫酸鎂、7.0g/L硫酸銨、0.5g/L無水檸檬酸、0.5g/L七水硫酸亞鐵、0.04g/L七水硫酸鋅、0.00175g/L五水硫酸銅、0.0035g/L一水合硫酸錳、0.002g/L硼酸和0.3mL/LFOAMBLAST882組成。對于在34℃和500rpm下于葡萄糖上生長24h的批次，首先運行發(fā)酵。在24h結束時，使溫度降低至28℃并使攪拌速度增大至1000rpm。然后在0.030g葡萄糖-槐糖固體/g生物質/小時的特定進料速率下，用葡萄糖和槐糖混合物(62％w/w)進料發(fā)酵罐。在運行結束時，通過離心移除生物質，并且使用10-kD分子量截留超濾芯(UFP-10-E-35；GEHealthcare，LittleChalfont，Buckinghamshire，UK)通過過濾將含有MUT3325突變酶(SEQIDNO：47)的上清液濃縮約10倍。使?jié)饪s蛋白質于-80℃儲存。α-葡聚糖水解酶(突變酶)活性的測定使用由遠緣鏈球菌(Streptococcussobrinus)33478TM產生的分泌的酶來制備測定突變酶活性所需的不溶性齒斑葡聚糖聚合物。具體地，在BHI瓊脂板上(BrainHeartInfusionagar，Teknova，Hollister，CA)劃線接種一環(huán)遠緣鏈球菌33478TM的甘油原種，并使平板在37℃下孵育2天。用環(huán)挑出數個菌落以在初始培養(yǎng)基瓶(得自Teknova)中接種2X100mLBHI液體培養(yǎng)基，并在37℃下孵育培養(yǎng)物，靜態(tài)保持24h。通過離心移除所得細胞并使所得上清液過濾通過0.2-μm無菌過濾器；收集2X101mL的濾液。向濾液中添加2X11.2mL的200g/L蔗糖(最終蔗糖20g/L)。在未攪拌情況下，使反應于37℃溫育67h。通過在5000xg下離心10min來收集所得多糖聚合物。小心地潷出上清液。用40mL的無菌水將不溶性聚合物洗滌4次。使所得的齒斑葡聚糖聚合物凍干48h。使齒斑葡聚糖聚合物(390mg)懸浮于39mL的無菌水中以制備10mg/mL懸液。通過超聲處理(40％幅值直至較大團塊消失，總計～10min)均質化齒斑葡聚糖懸液。將勻化的懸液分成等份并在4℃儲存。通過在pH5.5和37℃下用含有0.5mg/mL齒斑葡聚糖聚合物(如上所述制備的)的25mMKOAc緩沖液溫育合適量的酶，開始突變酶測定。在各個時間點，取出等分試樣的反應混合物并用等體積的100mM甘氨酸緩沖液(pH10)淬滅。通過在14,000xg下離心5min移除各個經淬滅樣品中的不溶性材料。通過對羥基苯甲酸酰肼溶液(PAHBAH)(LeverM.，Anal.Biochem.，(1972)47：273-279)測定對各個時間點產生的低聚糖和多糖聚合物的還原端進行定量，并且初始速率由時間過程中最初三個或四個時間點的線性曲線圖的斜率來確定。通過將10μL的反應樣品上清液添加至100μL的PAHBAH工作溶液中進行PAHBAH測定并在95℃加熱5min。通過混合一份試劑A(0.05g/mL對羥基苯甲酸酰肼和5體積％的濃鹽酸)與四份試劑B(0.05g/mLNaOH、0.2g/mL酒石酸鉀鈉)來制備工作溶液。記錄410nm處的吸光度，并且通過減去適當的背景吸收并使用各種濃度的葡萄糖(作為標準物)產生的標準曲線來計算還原端的濃度。通過HPLC進行反應特征分析從反應中周期性取樣并使用配備有折射率檢測器的1260HPLC進行分析。在0.6mL/min的流速和85℃下，使用具有去離子水的HP-87C柱(BioRad，Hercules，CA)來測定gtf反應中蔗糖、葡萄糖、明串珠菌二糖和果糖的含量。在0.6mL/min的流速和85℃下，使用具有具有去離子水的HP-42A柱(BioRad)來定量測定gtf反應中可溶性低聚糖副產物(DP2-DP7)。配備有折射率檢測器的UltiMateTM3000HPLC(ThermoScientific)用于包括固定化的酶的樣品(實施例4)。在0.3mL/min的流速和85℃下，使用具有去離子水的RezexTMcalciummonosaccharide柱來分析糖。通過NMR分析低聚糖在使用5-mm低溫三聯(lián)共振脈沖場梯度(PFG)探頭的于500MHz(對于1H)下工作的AgilentDD2光譜儀上采集NMR數據。通過將觀測發(fā)射器頻率小心地置于“普氏(presat)”實驗的殘余水信號的共振處，并然后使用具有完整相位循環(huán)(32多次)和10ms的混合時間的NOESY實驗的第一數據片(slice)獲得水抑制。一維1H光譜采集于6410Hz的光譜寬度、5.1s的采集時間、65536個數據點、4s預飽和以及5.85μs的90-度脈沖。使樣品溫度維持于25℃。通過將50μL與450μL的D2O和60μL的含12.4mMDSS(4，4-二甲基-4-甲硅烷基戊烷-1-磺酸鈉鹽)內標的D2O一起添加至5-mmNMR管中來制備樣品，甲基共振設定為0ppm。不同異頭鍵的化學位移定位得自：Goffin等人(2009，BullKoreanChem.Soc.30：2535-2541。對于α(1，3)鍵而言峰分布為5.35ppm，明串珠菌二糖為5.1ppm，并且α(1，6)鍵為4.95。對于αRE還原端(RE)分配為5.2，對于βRE為4.65。實施例1通過聚合蔗糖制備糖漿該實施例公開了通過在葡聚糖合成反應中采用gtf酶使蔗糖聚合來產生可溶性糖的混合物的一般方式。具體地，制備了葡聚糖合成反應的濾液，然后將其濃縮為糖漿。將蔗糖(3000g)添加至清潔的5-加侖的聚乙稀桶中。將水(18.1L)和FermasureTM(10mL)添加至桶中，并且通過添加5體積％NaOH和5體積％H2SO4將pH調節(jié)至7.0。最終體積為約20L，并且如由HPLC所測，蔗糖的初始濃度為152.5g/L。通過添加如在一般方法部分中所述制備的0.3體積％的粗制gtf酶(SEQIDNO：3)提取物來引發(fā)葡聚糖聚合反應。該提取物包含約2.9mg/mL的蛋白質。使用配備有玻璃軸和PTFE刀片的高架機械馬達向反應溶液提供攪拌。在48小時之后，HPLC分析顯示，已消耗96％的蔗糖并且認為反應完成。采用325-目鋼絲網和40-微米濾紙使用布氏過濾器漏斗過濾移除反應的不溶性聚-α-1，3-葡聚糖產物。然后使用旋轉蒸發(fā)儀(40-50℃的浴溫)將母液(濾液)濃縮至約320g/L糖的總糖濃度。濃縮濾液的組成提供于表2中。表2葡聚糖合成反應的濃縮濾液的組成蔗糖明串珠菌二糖葡萄糖果糖DP2DP3+總量g/L13.5130.625.5103.818.328.3320.1wt％4.240.8832.45.78.9100表2指出葡聚糖合成反應的濃縮濾液包含蔗糖、果糖、葡萄糖、明串珠菌二糖和低聚糖DP2-DP7。實施例2酶對葡聚糖合成反應的濾液中糖水解的影響該實施例測定了各種葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3)、轉葡糖苷酶(EC2.4.1.24)、β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)、α-淀粉酶(EC3.2.1.1)和葡糖苷酶(EC3.2.1)的活性，目的在于減小葡聚糖合成反應的濃縮濾液中明串珠菌二糖和/或低聚糖副產物的濃度。某些酶例如DIAZYMERDFULTRA、轉葡糖苷酶(EC2.4.1.24)和葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3)均為α-葡糖苷酶，被發(fā)現(xiàn)特別有效地降低這些副產物的量，導致經處理濾液中的單糖(葡萄糖和果糖)相應增加。根據實施例1的過程概要首先制得葡聚糖合成反應的濾液并將其濃縮為糖漿。該濃縮濾液的組成提供于表3中。NMR分析顯示，存在于糖漿中的α(1，3)與(1，6)鍵的比率為78：22。表3葡聚糖合成反應的濃縮濾液的組成表3的糖漿用于測試各種酶對葡聚糖合成反應的明串珠菌二糖和低聚糖副產物的水解活性。假定明串珠菌二糖包含特殊鍵[α(1，5)-葡糖基果糖]并且低聚糖主要包含α(1，3)和α(1，6)葡糖基-葡萄糖鍵，在這些實驗開始時何種酶可用于水解這兩種副產物這并不是顯而易見的。就該分析而言，選擇具有不同活性的酶(表4)。表4用于明串珠菌二糖和低聚糖水解的酶評估aDuPontIndustrialBiosciences用以上各酶來處理表3的糖漿的條件提供于表5(載酶量、時間、溫度、pH、糖濃度)中。用水稀釋糖漿以達到用于各個水解反應的糖濃度。表5還提供了被每種酶水解的明串珠菌二糖和DP3+(至少DP3-DP7)低聚糖的百分比。DP3+水解百分比計算為(1-(最終糖漿中DP3+低聚糖的重量％)/(初始糖漿中DP3+低聚糖的重量％))。相似地，明串珠菌二糖水解百分比計算為(1-(最終糖漿中明串珠菌二糖重量％)/(初始糖漿中明串珠菌二糖重量％))。表5通過各種酶水解濃縮濾液中明串珠菌二糖和低聚糖aHPLC測得的糖濃度(蔗糖、葡萄糖、果糖、明串珠菌二糖和低聚糖)；記錄的值被四舍五入到最接近10g/L增量。bDP3+包含DP3-DP7，但也可包含較大的可溶性低聚糖，其在用某些gtf酶產生時具有較高的α-1，6鍵與α-1，3鍵的比率。表5表明1，4-α-葡糖苷酶和1，6-α-葡糖苷酶顯示出部分(實施例2.1)或極少(實施例2.2)水解明串珠菌二糖，但是從低聚糖中釋放出一些葡萄糖。α-淀粉酶(實施例2.3和實施例2.4)的使用顯示出對目標化合物的活性極小。相似地，支鏈淀粉酶(實施例2.5)的使用示出極小的活性。纖維素酶(實施例2.14和2.15)在水解明串珠菌二糖時很大程度上無效，但是水解一些低聚糖。雖然低聚糖包含β鍵，但令人驚奇地，β-葡糖苷酶也顯示出極低(ACCELERASEBG，實施例2.9)至極高(NOVO188，實施例2.10和2.11)的水解轉化范圍。這些酶的相對功效大幅度變化。在一些情況下，水解的低聚糖的量大大超過(實施例2.11)或接近于(實施例2.12)水解的明串珠菌二糖的百分比。在其它情況下，明串珠菌二糖被β-葡糖苷酶高度水解，同時低聚糖被中度水解(實施例2.13)。所觀察到的β-葡糖苷酶的結果之間的較高差異表明，在受試β-葡糖苷酶制劑中存在的其它酶例如葡糖淀粉酶或另一類α-葡糖苷酶是造成觀察到的活性的原因。相反地，表5中的結果表明，轉葡糖苷酶(TGL-2000，實施例2.6)示出水解低聚糖和明串珠菌二糖兩者的極高活性。被轉葡糖苷酶水解的明串珠菌二糖在某些情況下看起來是定量的，并且在較高的載酶量下大于95％的DP3+材料水解為葡萄糖和DP2(實施例2.7)。使用經純化型式的轉葡糖苷酶顯示出類似的活性(實施例2.8)，表明所觀測的水解歸因于轉葡糖苷酶而非背景活性。葡糖淀粉酶(實施例2.16-2.18)示出對于明串珠菌二糖和低聚糖的一定范圍的活性。僅有一種受試葡糖淀粉酶(實施例2.18)給予明串珠菌二糖和低聚糖兩者小于30％的水解。表5中的結果表明，α-葡糖苷酶例如DIAZYMERDFULTRA、葡糖淀粉酶和轉葡糖苷酶可水解存在于葡聚糖反應濾液中的明串珠菌二糖副產物。α-葡糖苷酶水解明串珠菌二糖的能力表明這些酶可水解α-1，5葡糖基-果糖鍵。在將明串珠菌二糖用作底物而示出以上此種活性時，據信該活性也可擴展到包含α-1，5葡糖基-果糖鍵的低聚糖。表5的結果進一步表明，α-葡糖苷酶例如葡糖淀粉酶和轉葡糖苷酶可水解存在于葡聚糖反應濾液中的低聚糖副產物。因為這些低聚糖主要由經α-1，3和/或α-1，6鍵連接的葡萄糖單體單元組成(實施例3)，所以表5的數據表明α-葡糖苷酶可水解α-1，3葡糖基-葡萄糖和/或α-1，6葡糖基-果糖鍵。因為α-葡糖苷酶通常有效地水解葡聚糖合成反應的明串珠菌二糖和/或低聚糖副產物，所以可單獨或組合使用這些酶來降低從包含增加量的單糖和減小量的糖副產物的葡聚糖反應濾液產生高純度糖漿所需的加工時間。有效的酶組合的示例可為用于水解明串珠菌二糖的轉葡糖苷酶例如TGL-2000，和有效地水解低聚糖副產物的葡糖淀粉酶(例如GC321)。因此，α-葡糖淀粉酶可獨立地水解特定糖中的(i)α-1，5葡糖基-果糖鍵，和(ii)α-1，3和α-1，6葡糖基-葡萄糖鍵。實施例3酶水解之前和之后葡聚糖反應濾液組分的鍵分布的比較該實施例測定轉葡糖苷酶(EC2.4.1.24)和β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)對存在于葡聚糖合成反應的濃縮濾液中的明串珠菌二糖和低聚糖副產物的水解活性。發(fā)現(xiàn)轉葡糖苷酶減少了這些副產物的量，導致經處理濾液中的單糖(葡萄糖和果糖)相應增加。存在于以上葡聚糖合成反應的濾液中的低聚糖副產物包含＞90％的葡萄糖-葡萄糖鍵，如由NMR所測得的(一般方法)。在葡萄糖-葡萄糖鍵中，約78％代表α-1，3鍵并且約22％代表α-1，6鍵。NMR用于測定水解之后在以上實施例2.11產生的物質的鍵特征。如圖1所示，對應于α-1，3鍵的峰降低86％，對應于α-1，6鍵的峰僅降低2.3％，并且對應于明串珠菌二糖的峰的峰降低21％。雖然蔗糖幾乎定量地被該酶水解，但是Novo188似乎不能水解α-1，6鍵。NMR類似地用于測定用TGL-2000(SEQIDNO：1)轉葡糖苷酶產生的物質的鍵特征(圖2)。將210μL的濃縮濾液(得自表3的材料)、300μL的D2O和90μL含有12.4mMDSS(作為內標)的D2O在NMR管中混合，以給出300g/L的總糖濃度并加熱至60℃。在60℃熱平衡之后獲得時間零點光譜(圖2中的起始材料)，并然后添加0.5體積％的酶。在60℃下，使樣品在探頭中再平衡并加上墊片，并在分析的幾分鐘之內進行測量。在用TGL-2000酶(圖2中經處理材料)處理10小時之后，對應于α-1，3鍵的峰降低41％，對應于α-1，6鍵的峰降低36％，并且對應于明串珠菌二糖的峰降低＞95％(圖2)。觀測到α-還原端和β-還原端峰兩者均增加，這對應于果糖和葡萄糖的增加(圖2)。這些結果表明轉葡糖苷酶可將包含α-1，3和α-1，6鍵的低聚糖轉化為葡萄糖并且可將明串珠菌二糖轉化為果糖和葡萄糖。因此，轉葡糖苷酶可水解特定糖中的(i)α-1，5葡糖基-果糖鍵以及(ii)α-1，3和α-1，6葡糖基-葡萄糖鍵。實施例4使用固定化酶水解葡聚糖反應濾液中的明串珠菌二糖和低聚糖該實施例描述了使用固定的葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3)和轉葡糖苷酶(EC2.4.1.24)水解存在于獲自葡聚糖合成反應的濾液中的明串珠菌二糖及其它低聚糖。具體地，研究了固定的轉葡糖苷酶TGL-2000(SEQIDNO：1，獲自Genencor/DuPontIndustrialBiosciences)和固定的葡糖淀粉酶GC-147(獲自Genencor/DuPontIndustrialBiosciences)對葡聚糖合成反應的濾液中明串珠菌二糖和低聚糖DP2、DP3和HS(高糖，DP4+)水解的影響。根據美國專利5541097中描述的方法對葡糖淀粉酶和轉葡糖苷酶進行固定，其公開內容以引用方式并入本文。在用于固定葡糖淀粉酶和轉葡糖苷酶的典型方法中，使約8.0g/批的兩批多孔顆粒狀硅藻土(EPMinerals，Reno，NV)用蒸餾水水化并然后轉移至直徑1.5-cm、高度30-cm的玻璃柱反應器中。以約6-7mL/min向上流動泵送水，從而從全部三個柱中除去細粒。通常，在一小時內，水流出物不含細粒。將水從柱排至顆粒狀的硅藻土床的頂部并用0.1％w/v聚氮丙啶(PEI，EPOMINP-1050)水溶液替換。然后向上流動泵送3500mL的PEI溶液并使流出物循環(huán)通過床2小時。然后，在室溫下，用向上流動的蒸餾水洗滌顆粒狀硅藻土床2小時，以除去游離的PEI。這樣，獲得顆粒狀硅藻土-PEI。同時，將具有表4限定的活性的3.5mL葡糖淀粉酶GC-147添加至315ml的0.02M乙酸鹽緩沖液(pH4.5)中。然后，將1.575g的50％w/w戊二醛(GA-50)緩慢添加至葡糖淀粉酶水溶液中，輕輕混合，并在輕輕攪拌下使戊二醛與葡糖淀粉酶水溶液在20-25℃的溫度下反應4小時，其導致形成包含經處理葡糖淀粉酶的經處理酶-戊二醛加合物。使用具有表4限定活性的轉葡糖苷酶TGL-2000而非葡糖淀粉酶分別重復這些步驟，由此導致形成包含經處理轉葡糖苷酶的經處理酶-戊二醛加合物。然后，使每種經處理酶-戊二醛加合物在其包含顆粒狀硅藻土-PEI載體的自身柱(如上制備)中循環(huán)4小時(20-25℃)。用水將過量的經處理加合物從載體中洗出。由此制備具有固定的葡糖淀粉酶或轉葡糖苷酶的柱。將具有表3所限定組成的葡聚糖濾液稀釋至180g/L，調節(jié)至pH4.5，并使其通過包含固定化酶的柱。將柱溫控制于60℃。在柱平衡16小時之后，在不同流速下定時取樣。通過HPLC測定水解反應產物的糖組成(表6)。當每次改變流速設定時，使柱在取樣之前再平衡至少1-2個床體積。用實施例2所述的方法計算明串珠菌二糖和低聚糖的水解度。測試三種柱配置：1)固定的葡糖淀粉酶，2)固定的轉葡糖苷酶，以及3)在固定的轉葡糖苷酶之后固定的葡糖淀粉酶。表6固定的葡糖淀粉酶和轉葡糖苷酶水解低聚糖和明串珠菌二糖的應用表6表明，隨著平均接觸時間(定義為標稱柱體積除以平均流速)增大，明串珠菌二糖和低聚糖的水解度通常增大。用固定的轉葡糖苷酶水解明串珠菌二糖是特別優(yōu)選的，因為即使使用所測最快流速也未觀測到顯著差異。雖然各個柱分別示出適當的轉化，但是葡糖淀粉酶和轉葡糖苷酶的組合給予了低聚糖的最高水解。因此，固定的葡糖淀粉酶或轉葡糖苷酶、或這兩類固定的酶的使用顯示出了水解包含α-1，3和α-1，6葡糖基-葡萄糖鍵的低聚糖以及明串珠菌二糖的有效的技術。這些結果符合實施例2的那些。其它α-葡糖苷酶的固定應當給出類似的結果。實施例5用色譜法從葡聚糖反應濾液中富集果糖該實施例公開了可如何通過色譜法進一步富集葡聚糖反應濾液中的果糖。通常，當通過色譜法分離糖分子時，組分洗脫與分子尺寸負相關，因此首先洗脫出最大的分子。因此，對于葡聚糖合成反應的濾液，首先洗脫出低聚糖，之后是二糖，然后是單糖。采用鈉陽離子樹脂分離無法充分分離果糖和葡萄糖，并且所有的明串珠菌二糖、蔗糖和DP2被共同洗脫出來。優(yōu)選使用陽離子為鈣的離子交換樹脂分離葡萄糖和果糖。根據實施例1的過程概要首先制得葡聚糖合成反應的濾液并將其濃縮為糖漿。該濃縮濾液的組成提供于表7中。表7葡聚糖合成反應的濃縮濾液的組成將表7的糖漿過濾并用非離子交換水稀釋至25g干固體/100g溶液，并進料至包含交聯(lián)的強酸性離子交換樹脂(鈣形式)的柱中。該柱的物理參數顯示在表8中。將稀釋的糖漿(15.8L)送入維持于65℃的柱中，此后用流速為30L/小時的水洗脫柱。表8柱的物理參數樹脂類型FINEXCS11GC離子形式Ca2+交聯(lián)，二乙烯苯％5.5粒度(mm)0.34床長度(m)5.0柱直徑(m)0.225在該分離中，保留于柱中的明串珠菌二糖比蔗糖長，這可能是由于串珠菌二糖與鈣陽離子絡合，并且事實上與葡萄糖共同洗脫出來。使包含果糖的兩個級分分離。在47至120分鐘之間洗脫出級分5.1，并且在120至172分鐘之間洗脫出級分5.2。在供料于色譜分離的果糖中，95.7％的果糖以＞90％純度分離。如HPLC所測，各個級分(5.1和5.2)中的產物分布顯示于表9中。表9包含顯著量果糖的色譜級分的產物分布因為用于該分離的進料組合物包含36.0％果糖，所以總共34.5％的總料流以具有＞90重量％DS果糖的果糖糖漿回收。如果忽略進料中的蔗糖，則40.7％的糖以具有＞90重量％DS果糖的果糖糖漿回收。因此，葡聚糖反應濾液中的果糖可通過色譜法進一步富集。以下實施例6顯示出，可使用轉葡糖苷酶水解的葡聚糖濾液來增強該過程。實施例6通過色譜法從水解的葡聚糖反應濾液中富集果糖該實施例示出，與從未水解的葡聚糖濾液中分離果糖相比，從低聚糖和明串珠菌二糖已被水解的葡聚糖濾液中分離果糖導致高純度果糖糖漿的收率增加。通過在60℃和pH4.5下對已經1體積％轉葡糖苷酶TGL-2000(SEQIDNO：1)處理24小時的葡聚糖濾液進行濃縮(在50℃下真空)來制備糖漿。在濃縮過程期間觀察到一些低聚糖形成物，其可以是期望的，因為已知轉葡糖苷酶在高濃度的單糖下產生低聚糖。糖漿具有表A所述的最終產物分布。表A在濃縮之前水解的濃縮葡聚糖濾液的組成將表A所述的糖漿過濾并用非離子交換水稀釋至25.4gDS/100g溶液，并進料至包含交聯(lián)的強酸性陽離子交換樹脂(鈣形式)的柱中。柱的物理參數示于表B中。然后將稀釋的糖漿(169g)送入維持于65℃的柱中，此后用流速為50mL/min的水洗脫柱。表B柱的物理參數樹脂類型FINEXCS11GC離子形式Ca2+交聯(lián)，二乙烯苯％5.5粒度(mm)0.34床長度(m)1.69柱直徑(m)0.093使包含果糖的兩個級分分離。在73至103分鐘之間洗脫出級分6.1，并且在103至120分鐘之間洗脫出級分6.2。在供料于色譜分離的果糖中，進料至柱的93.0％的果糖在級分6.2中以＞90％純度分離。如HPLC所測，各個級分(6.1和6.2)中的產物分布顯示于表C中。表C包含得自水解葡聚糖濾液的果糖的色譜級分的產物分布該實施例的分離效率相較于實施例5的減小可歸因于柱規(guī)模的差異以及樣品中更高的葡萄糖級分。即使如此，相較于通過色譜法由未經轉葡糖苷酶水解的葡聚糖濾液制備糖漿的實施例5所獲得的，該材料的色譜純化導致高純度果糖糖漿的收率增加。因為用于該分離的進料組合物包含47％果糖(表A)，所以43.7％的總料流以具有＞90重量％DS果糖的果糖糖漿回收。此處43.7％回收率顯著優(yōu)于實施例5的34.5％回收率。因此，與從未水解的葡聚糖濾液中分離果糖時相比，從已被轉葡糖苷酶水解的葡聚糖濾液中分離果糖導致果糖的收率增加。實施例7通過發(fā)酵葡聚糖合成反應的濾液制備乙醇該實施例公開了將葡聚糖濾液酵母發(fā)酵為乙醇。通過使膏懸浮于自來水(2.4L，在600nm處光密度為65)中并然后采用LEGENDXTR離心機(ThermoScientific)在4500g下將酵母膏離心5分鐘來洗滌酵母(釀酒酵母)膏(Tononmill，Brazil)。在潷析上清液之后，通過再兩次離心使酵母細胞重懸和濃縮。在第三次洗滌之后，通過添加5重量％硫酸將pH調節(jié)至2。使用GENESYS204001分光光度計(ThermoScientific)測定光密度并通過添加自來水將其調節(jié)至100(在600nm處)。將經調節(jié)酵母膏(1.5L)添加至7.5-LBIOFLO310發(fā)酵罐容器(NewBrunswick)中。將發(fā)酵罐設定為維持于30℃的溫度，并在100rpm下攪拌。雖然在發(fā)酵期間測定了pH，但是其不通過添加酸或堿溶液來控制。制備包含酵母提取物(10g/L)、蛋白胨(20g/L)和得自葡聚糖濾液的200g/L糖的進料溶液并用PHOENIXAV-250PLUS高壓釜在121℃下滅菌15分鐘。在發(fā)酵開始之前，使進料溶液冷卻至25℃(室溫)。在684mL/小時速率下將經滅菌進料溶液(3.5L)添加至發(fā)酵罐約5小時，并使發(fā)酵進行22小時。在發(fā)酵期間定時取樣并用GENESYS204001分光光度計分析光密度，用PAL-3折射計(Atago)分析白利糖度，用HPLC(一般方法)分析糖和乙醇濃度。這些結果總結于表10中。表10第一乙醇發(fā)酵的進料和時程發(fā)酵特征列出了進料中的以及各個發(fā)酵時間點(0-22小時)的乙醇(EtOH)和糖化合物的濃度(g/L)。當發(fā)酵結束時，通過使用LEGENDXTR離心機在4500g下離心5分鐘來分離酵母細胞。在潷析上清液之后，通過再離心兩次使酵母重懸和濃縮。在第三次洗滌之后，通過添加5重量％硫酸將pH調節(jié)至2。使用GENESYS204001分光光度計測定光密度并通過添加自來水將其調節(jié)至100(在600nm處)。根據上述相同條件，使用從先前發(fā)酵回收的酵母細胞再進行兩次發(fā)酵循環(huán)，每次均使用新鮮進料。用第一次和第二次回收的酵母獲得的發(fā)酵結果分別提供于表11和12中。表11使用第一回收酵母細胞的進料和時程發(fā)酵特征列出了進料中的以及各個發(fā)酵時間點(0-21小時)的乙醇(EtOH)和糖化合物的濃度(g/L)。表12使用第二回收酵母細胞的進料和時程發(fā)酵特征列出了進料中的以及各個發(fā)酵時間點(0-21小時)的乙醇(EtOH)和糖化合物的濃度(g/L)。在第一次發(fā)酵中消耗了極少的明串珠菌二糖，但是酵母細胞經由第二回收開始適應并消耗明串珠菌二糖。在采用回收酵母的三個發(fā)酵循環(huán)之后，乙醇發(fā)酵滴度由33g/L(表10，22小時)增至54g/L(表12，21小時)，但是即使在最后一個循環(huán)后培養(yǎng)基中還是存在顯著量的明串珠菌二糖。因此，葡聚糖濾液可用于發(fā)酵過程以產生乙醇。實施例8通過發(fā)酵水解的葡聚糖濾液制備乙醇該實施例示出使其中明串珠菌二糖和低聚糖副產物組分先前已被糖化的葡聚糖濾液發(fā)酵導致乙醇收率增加。發(fā)酵根據實施例7描述的方法進行，但是這里使用先前已經轉葡糖苷酶(TGL-2000，SEQIDNO：1)處理的葡聚糖濾液。如下制備水解的葡聚糖濾液。將葡聚糖濾液調節(jié)至300g糖/L，然后使用1.0M氫氧化鈉和5重量％硫酸將pH調節(jié)至4.0。該制劑的最終體積為6.75L。然后使用PHOENIXAV-250PLUS高壓釜將濾液在121℃下滅菌15分鐘，然后將溫度調節(jié)至60℃。使如表4(135mL)所述的TGL-2000酶提取物與經滅菌濾液混合，并在60℃和100rpm下使溶液在培養(yǎng)搖床(IKAKS4000)中溫育72小時。由此制備了水解的葡聚糖濾液。通過使膏懸浮于自來水(2.4L，在600nm處光密度為65)并然后采用LEGENDXTR離心機在4500g下將酵母膏離心5分鐘來洗滌酵母(釀酒酵母)膏(BomRetiromill，Brazil)。在潷析上清液之后，通過再兩次離心使酵母重懸和濃縮。在第三次洗滌之后，通過添加5重量％硫酸將pH調節(jié)至4.5，并且使用GENESYS204001分光光度計測定光密度并通過添加自來水將其調節(jié)至100(在600nm處)。將經調節(jié)酵母膏(1.5L)添加至7.5-LBIOFLO310發(fā)酵罐容器中。將發(fā)酵罐設定為保持30℃的溫度，在100rpm下攪拌，并使用4M氫氧化銨水溶液或5重量％硫酸水溶液使pH維持于4.5。制備包含酵母提取物(10g/L)、蛋白胨(20g/L)和得自經水解的濾液的200g/L糖的進料溶液并用PHOENIXAV-250Plus高壓釜在121℃滅菌15分鐘。在發(fā)酵開始之前，使進料溶液冷卻至25℃(室溫)。在684mL/小時速率下將經滅菌進料溶液(3.5L)添加至發(fā)酵罐約5小時，并使發(fā)酵進行22小時。在發(fā)酵期間定時取樣并用GENESYS204001分光光度計分析光密度，用PAL-3折射計分析白利糖度，用HPLC(一般方法)分析糖和乙醇濃度。這些結果總結于表13中。表13采用經水解葡聚糖濾液的第一乙醇發(fā)酵的進料和時程發(fā)酵特征列出了進料中的以及各個發(fā)酵時間點(0-22小時)的乙醇(EtOH)和糖化合物的濃度(g/L)。當發(fā)酵結束時，通過使用LEGENDXTR離心機在4500g下離心5分鐘來分離酵母細胞。在潷析上清液之后，通過再離心兩次使酵母細胞重懸和濃縮。在第三次洗滌之后，通過添加5重量％硫酸將pH調節(jié)至2。使用GENESYS204001分光光度計測定光密度并通過添加自來水將其調節(jié)至100(在600nm處)。根據上述相同條件，采用從先前發(fā)酵回收的酵母細胞再進行兩次發(fā)酵循環(huán)，每次使用新鮮進料。使用第一次和第二次回收的酵母細胞獲得的發(fā)酵結果分別提供于表14和15中。表14使用第一回收酵母細胞和經水解葡聚糖濾液的進料和時程發(fā)酵特征列出了進料中的以及各個發(fā)酵時間點(0-21小時)的乙醇(EtOH)和糖化合物的濃度(g/L)。表15使用第二回收酵母細胞和經水解葡聚糖濾液的進料和時程發(fā)酵特征列出了進料中的以及各個發(fā)酵時間點(0-21小時)的乙醇(EtOH)和糖化合物的濃度(g/L)。在開始發(fā)酵約六小時內，所有發(fā)酵基本完成，并且導致57-60.0g/L的乙醇滴度。將這些發(fā)酵與實施例7的那些進行比較顯示出比與使用未水解的葡聚糖濾液發(fā)酵獲得的那些相比，葡聚糖濾液在其進行發(fā)酵之前水解導致更快和更大的乙醇收率。因此，使其中明串珠菌二糖和低聚糖副產物組分已被糖化的葡聚糖濾液發(fā)酵導致乙醇收率以更快的速率增加。該糖化可使用例如轉葡糖苷酶進行。實施例9葡聚糖濾液的同步糖化和發(fā)酵該實施例公開了包含葡聚糖濾液的進料的同步糖化和發(fā)酵可導致增強的發(fā)酵特性。通過使膏懸浮于自來水(2.4L，在600nm處光密度為65)并然后采用LEGENDXTR離心機在4500g下將酵母膏離心5分鐘來洗滌酵母(釀酒酵母)膏(BomRetiromill，Brazil)。在潷析上清液之后，通過再兩次離心使酵母細胞重懸和濃縮。在第三次洗滌之后，通過添加5重量％硫酸將pH調節(jié)至4.5，并且使用GENESYS204001分光光度計測定光密度并通過添加自來水將其調節(jié)至100(在600nm處)。將經調節(jié)酵母膏(1.5L)添加至7.5-LBIOFLO310發(fā)酵罐容器中。將發(fā)酵罐設定為保持30℃的溫度，在100rpm下攪拌，并使用4M氫氧化銨水溶液或5重量％硫酸水溶液使pH維持于4.5。制備包含酵母提取物(10g/L)、蛋白胨(20g/L)和得自葡聚糖濾液的200g/L糖的進料溶液并用PHOENIXAV-250PLUS高壓釜在121℃滅菌15分鐘。在發(fā)酵開始之前，使進料溶液冷卻至25℃(室溫)。緊接在將溶液添加至發(fā)酵罐之前，將如表4所述的TGL-2000轉葡糖苷酶(1％v/v)添加至經滅菌的進料溶液中。在684mL/小時下將包含TGL-2000酶的進料溶液(3.5L)添加至發(fā)酵罐約5小時，并使發(fā)酵進行48小時。在發(fā)酵期間定時取樣并用GENESYS204001分光光度計分析光密度，用PAL-3折射計(Atago)分析白利糖度，用HPLC(一般方法)分析糖和乙醇濃度。這些結果總結于表16中。表16葡聚糖濾液的同時糖化和乙醇發(fā)酵的進料和時程發(fā)酵特征列出了進料中的以及各個發(fā)酵時間點(0-48小時)的乙醇(EtOH)和糖化合物的濃度(g/L)。發(fā)酵在6小時內標稱地完成，類似于在發(fā)酵步驟之前濾液已被水解的發(fā)酵(實施例8)，并且給出相較于使用未水解濾液(實施例7)略微更優(yōu)異的乙醇滴度(62g/L)。此外，6小時消耗了幾乎所有的明串珠菌二糖(將表16與表13-15比較)。如果直接將糖化酶添加至發(fā)酵物，則除了在臨發(fā)酵前將糖化酶例如TGL-2000添加至包含葡聚糖濾液的進料之外，應當獲得類似的結果。因此，包含葡聚糖濾液的進料的同步糖化和發(fā)酵可導致增強的發(fā)酵特性，例如增大(i)葡聚糖濾液組分(例如明串珠菌二糖)的消耗和(ii)乙醇收率和產生速率。實施例10各種α-葡糖苷酶的制備該實施例公開了制備除了用于一些前述實施例的那些α-葡糖苷酶(轉葡糖苷酶、葡糖淀粉酶、DIAZYMERDFULTRA)之外的各種α-葡糖苷酶。測試這些另外的α-葡糖苷酶對包含α-1，5葡糖基-果糖鍵或α-1，3和/或α-1，6葡糖基-葡萄糖鍵的低聚糖的水解活性(在以下提供的實施例11、12、15和16中)。棒曲霉α-葡糖苷酶(Aclglu1)的發(fā)現(xiàn)棒曲霉的菌株被選為可用于各種工業(yè)應用的其它酶的可能來源。鑒定于棒曲霉中的一種基因編碼α-葡糖苷酶(稱為“Aclglu1”)，并且該基因的序列提供于SEQIDNO：4中。由SEQIDNO：4編碼的對應蛋白質提供于SEQIDNO：5。Aclglu1屬于基于PFAM搜索(pfam.sanger.ac.ukweblink)的糖基水解酶家族31。在N-末端，蛋白質(SEQIDNO：5)具有長度為19個氨基酸的信號肽，如SignalP版本4.0所預測(NordahlPetersen等人2011，NatureMethods，8：785-786)。信號肽的存在表明Aclglu1為分泌性性酶。預測的成熟形式的Aclglu1的氨基酸序列示出為SEQIDNO：6。棒曲霉α-葡糖苷酶Aclglu1的表達將合成Aclglu1基因克隆到pTrex3gM表達載體中(描述于美國專利申請公開2011/0136197，其以引用方式并入本文)并且將所得質粒命名為pJG294。Aclglu1基因的序列通過DNA測序加以證實。采用基因槍方法(Te′oVS等人，JMicrobiolMethods，51：393-9，2002)將質粒pJG294轉化到四重缺失的里氏木霉菌株中(在WO05/001036中有所描述)。預測包含SEQIDNO：6的蛋白質分泌到細胞外培養(yǎng)基中，并且過濾后的培養(yǎng)基用于進行SDS-PAGE和α-葡糖苷酶活性測定來證實酶表達。費氏新薩托菌(Neosartoryafischeri)α-葡糖苷酶Nfiglu1的發(fā)現(xiàn)費氏新薩托菌的菌株被選為可用于各種工業(yè)應用的其它酶的可能來源。鑒定于費氏新薩托菌中的一種基因編碼α-葡糖苷酶(稱為“Nfiglu1”)，并且該基因的序列提供于SEQIDNO：7中。由SEQIDNO：7編碼的對應蛋白質提供于SEQIDNO：8。Nfiglu1屬于基于PFAM搜索(pfam.sanger.ac.ukweblink)的糖基水解酶家族31。在N-末端，蛋白質(SEQIDNO：8)具有長度為19個氨基酸的信號肽，如SignalP版本4.0所預測(NordahlPetersen等人2011，NatureMethods，8：785-786)。信號肽的存在表明Nfiglu1為分泌性酶。預測的成熟形式的Nfiglu1的氨基酸序列示出為SEQIDNO：9。費氏新薩托菌α-葡糖苷酶Nfiglu1的表達將合成Nfiglu1基因克隆到pTrex3gM表達載體中(描述于美國專利申請公開2011/0136197)并且將所得質粒命名為pJG295。Nfiglu1基因的序列通過DNA測序加以證實。采用基因槍方法(Te′oVS等人，JMicrobiolMethods，51：393-9，2002)將質粒pJG295轉化到四重缺失的里氏木霉菌株中(在WO05/001036中有所描述)。預測包含SEQIDNO：9的蛋白質分泌到細胞外培養(yǎng)基中，并且過濾后的培養(yǎng)基用于進行SDS-PAGE和α-葡糖苷酶活性測定來證實酶表達。粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)α-葡糖苷酶Ncrglu1的發(fā)現(xiàn)粗糙脈孢菌的菌株被選為可用于各種工業(yè)應用的其它酶的可能來源。鑒定于粗糙脈孢菌中的一種基因編碼α-葡糖苷酶(稱為“Ncrglu1”)，并且該基因的序列提供于SEQIDNO：10中。由SEQIDNO：10編碼的對應蛋白質提供于SEQIDNO：11中。Ncrglu1屬于基于PFAM搜索(pfam.sanger.ac.ukweblink)的糖基水解酶家族31。在N-末端，蛋白質(SEQIDNO：11)具有長度為22個氨基酸的信號肽，如SignalP版本4.0所預測(NordahlPetersen等人2011，NatureMethods，8：785-786)。信號肽的存在表明Ncrglu1為分泌性酶。預測的成熟形式的Ncrglu1的氨基酸序列示出為SEQIDNO：12。粗糙脈孢菌α-葡糖苷酶Ncrglu1的表達將合成Ncrglu1基因克隆到pTrex3gM表達載體中(描述于美國專利申請公開2011/0136197)并且將所得質粒命名為pJG296。Ncrglu1基因的序列通過DNA測序加以證實。采用基因槍方法(Te′oVS等人，JMicrobiolMethods，51：393-399，2002)將質粒pJG296轉化到四重缺失的里氏木霉菌株中(在WO05/001036中有所描述)。預測包含SEQIDNO：12的蛋白質分泌到細胞外培養(yǎng)基中，并且過濾后的培養(yǎng)基用于進行SDS-PAGE和α-葡糖苷酶活性測定來證實酶表達。Rasamsoniacomposticolaα-葡糖苷酶TauSec098的發(fā)現(xiàn)Rasamsoniacomposticola的菌株被選為可用于各種工業(yè)應用的其它酶的可能來源。鑒定于Rasamsoniacomposticola中的一種基因編碼α-葡糖苷酶(稱為“TauSec098”)，并且該基因的序列提供于SEQIDNO：13中。由SEQIDNO：13編碼的對應蛋白質提供于SEQIDNO：14。TauSec098屬于基于PFAM搜索(pfam.sanger.ac.ukweblink)的糖基水解酶家族31并且包含N-末端CBM20域。在N-末端，蛋白質(SEQIDNO：14)具有長度為22個氨基酸的信號肽，如SignalP版本4.0所預測(NordahlPetersen等人2011，NatureMethods，8：785-786)。信號肽的存在表明TauSec098為分泌性酶。預測的成熟形式的TauSec098的氨基酸序列示出為SEQIDNO：15。Rasamsoniacomposticolaα-葡糖苷酶TauSec098的表達合成TauSec098基因由GenerayBiotechCo(Shanghai，China)克隆到里氏木霉表達載體pGXT(pTTT-衍生質粒)中并且將所得質粒命名為pGX256-TauSec098。TauSec098基因的序列通過DNA測序加以證實。采用原生質體轉化(Te’o等人，J.Microbiol.Methods51：393-9，2002)將質粒pGX256-TauSec098轉化到四重缺失的里氏木霉菌株中(在WO05/001036中有所描述)。在包含作為唯一氮源的乙酰胺的培養(yǎng)基(乙酰胺0.6g/L；氯化銫1.68g/L；葡萄糖20g/L；磷酸二氫鉀15g/L；七水硫酸鎂0.6g/L；二水氯化鈣0.6g/L；硫酸亞鐵(II)5mg/L；硫酸鋅1.4mg/L；氯化鈷(II)1mg/L；硫酸錳(II)1.6mg/L；瓊脂20g/L；pH4.25)上選擇轉化體。在約1周內出現(xiàn)轉化的菌落(約50-100個)。在乙酰胺平板上生長之后，收集轉化體的孢子并轉移到新乙酰胺瓊脂平板中。在乙酰胺平板上生長5天后，將1×108孢子接種到250-mL搖瓶中的30ml葡萄糖/槐糖確定成分培養(yǎng)基中。使搖瓶在28℃下?lián)u動5天。得自這些培養(yǎng)物的上清液用于證實成熟TauSec098酶(SEQIDNO：15)的表達(SDSPAGE)和活性。Rasamsoniacomposticolaα-葡糖苷酶TauSec099的發(fā)現(xiàn)Rasamsoniacomposticola的菌株被選為可用于各種工業(yè)應用的其它酶的可能來源。鑒定于Rasamsoniacomposticola中的一種基因編碼α-葡糖苷酶(稱為“TauSec099”)，并且該基因的序列提供于SEQIDNO：16中。由SEQIDNO：16編碼的對應蛋白質提供于SEQIDNO：17中。TauSec099屬于基于PFAM搜索(pfam.sanger.ac.ukweblink)的糖基水解酶家族31。在N-末端，蛋白質(SEQIDNO：17)具有長度為17個氨基酸的信號肽，如SignalP版本4.0所預測(NordahlPetersen等人2011，NatureMethods，8：785-786)。信號肽的存在表明TauSec099為分泌性酶。預測的成熟形式的TauSec099的氨基酸序列示出為SEQIDNO：18。Rasamsoniacomposticolaα-葡糖苷酶TauSec099的表達合成TauSec099基因由GenerayBiotechCo(Shanghai，China)克隆到里氏木霉表達載體pGXT(pTTT-衍生質粒)中并且將所得質粒命名為pGX256-TauSec099。TauSec0998基因的序列通過DNA測序加以證實。采用原生質體轉化(Te’o等人，J.Microbiol.Methods51：393-9，2002)將質粒pGX256-TauSec099轉化到四重缺失的里氏木霉菌株中(在WO05/001036中有所描述)。在包含作為唯一氮源的乙酰胺的培養(yǎng)基(乙酰胺0.6g/L；氯化銫1.68g/L；葡萄糖20g/L；磷酸二氫鉀15g/L；七水硫酸鎂0.6g/L；二水氯化鈣0.6g/L；硫酸亞鐵(II)5mg/L；硫酸鋅1.4mg/L；氯化鈷(II)1mg/L；硫酸錳(II)1.6mg/L；瓊脂20g/L；pH4.25)上選擇轉化體。在約1周內出現(xiàn)轉化的菌落(約50-100個)。在乙酰胺平板上生長之后，收集轉化體的孢子并轉移到新乙酰胺瓊脂平板中。在乙酰胺平板上生長5天后，將1×108孢子接種到250-mL搖瓶中的30ml葡萄糖/槐糖確定成分培養(yǎng)基中。使搖瓶在28℃下?lián)u動5天。得自這些培養(yǎng)物的上清液用于證實成熟TauSec099酶(SEQIDNO：18)的表達(SDSPAGE)和活性。長雙歧桿菌α-葡糖苷酶BloGlu1的序列從長雙歧桿菌亞種-長雙歧桿菌JDM301鑒定出α-葡糖苷酶基因“BloGlu1”。BloGlu1基因(SEQIDNO：19，GENBANK登錄號NC014169.1，140600至142414位的互補序列)的核酸序列和由SEQIDNO：19編碼的假定蛋白(SEQIDNO：20)的氨基酸序列存在于GENBANK登錄號YP_003660432.1中。長雙歧桿菌α-葡糖苷酶BloGlu1的表達對編碼整個BloGlu1蛋白質(SEQIDNO：20)的DNA序列進行優(yōu)化以在枯草芽孢桿菌中表達，然后由GenerayBiotechCo.(Shanghai，China)合成(獲得SEQIDNO：21)并插入到p3JM質粒中，導致p3JM-BloGlu1。p3JM-BloGlu1質粒包含aprE啟動子以驅動最優(yōu)化的BloGlu1序列(SEQIDNO：21)表達。質粒p3JM-BloGlu1用于轉化枯草芽孢桿菌細胞(degUHy32，ΔnprB，Δvpr，Δepr，ΔscoC，ΔwprA，Δmpr，ΔispA，Δbpr)，并且將轉化的細胞涂布在補充有5ppm氯霉素的Luria瓊脂平板上。選擇如由PCR和測序所證實的帶有具正確插入片段的菌落并使其在具有MBD培養(yǎng)基(MOPS-基確定成分培養(yǎng)基，補充有額外5mMCaCl2)的250-mL搖瓶中進行發(fā)酵，以表達BloGlu1蛋白質(SEQIDNO：20)。長雙歧桿菌α-葡糖苷酶BloGlu2的序列從長雙歧桿菌鑒定出α-葡糖苷酶基因BloGlu2。BloGlu2的氨基酸序列(SEQIDNO：22)存在于NCBI數據庫(GENBANK登陸號WP_007054665.10)中。長雙歧桿菌α-葡糖苷酶BloGlu2的表達對編碼BloGlu2蛋白質的DNA序列進行優(yōu)化以在枯草芽孢桿菌中表達，然后由GenerayBiotechCo.合成(獲得SEQIDNO：23)并插入到p3JM質粒中，導致p3JM-BloGlu2。SEQIDNO：23編碼SEQIDNO：24的氨基酸序列。p3JM-BloGlu2質粒包含aprE啟動子以驅動最優(yōu)化的BloGlu2序列(SEQIDNO：23)表達。質粒p3JM-BloGlu2用于轉化枯草芽孢桿菌細胞(degUHy32，ΔnprB，Δvpr，Δepr，ΔscoC，ΔwprA，Δmpr，ΔispA，Δbpr)，并且將轉化的細胞涂布在補充有5ppm氯霉素的Luria瓊脂平板上。選擇如由PCR和測序所證實的帶有具正確插入片段的菌落并使其在具有MBD培養(yǎng)基(MOPS-基確定成分培養(yǎng)基，補充有額外5mMCaCl2)的250-mL搖瓶中進行發(fā)酵，以表達BloGlu2蛋白質(SEQIDNO：24)。長雙歧桿菌α-葡糖苷酶BloGlu3的序列從長雙歧桿菌亞種-長雙歧桿菌F8鑒定出α-葡糖苷酶基因“BloGlu3”。BloGlu3基因(SEQIDNO：25，GENBANK登錄號NC_021008.1，2130627至2132441位)的核酸序列和由SEQIDNO：25編碼的假定蛋白(SEQIDNO：26)的氨基酸序列存在于GENBANK登錄號YP_007768249.1中。長雙歧桿菌α-葡糖苷酶BloGlu3的表達對編碼整個BloGlu3蛋白質(SEQIDNO：26)的DNA序列進行優(yōu)化以在枯草芽孢桿菌中表達，然后由GenerayBiotechCo.合成(獲得SEQIDNO：27)并插入到p3JM質粒中，導致p3JM-BloGlu3。p3JM-BloGlu3質粒包含aprE啟動子以驅動最優(yōu)化的BloGlu3序列(SEQIDNO：27)表達。質粒p3JM-BloGlu3用于轉化枯草芽孢桿菌細胞(degUHy32，ΔnprB，Δvpr，Δepr，ΔscoC，ΔwprA，Δmpr，ΔispA，Δbpr)，并且將轉化的細胞涂布在補充有5ppm氯霉素的Luria瓊脂平板上。選擇如由PCR和測序所證實的帶有具正確插入片段的菌落并使其在具有MBD培養(yǎng)基(MOPS-基確定成分培養(yǎng)基，補充有額外5mMCaCl2)的250-mL搖瓶中進行發(fā)酵，以表達BloGlu3蛋白質(SEQIDNO：26)。假長雙歧桿菌α-葡糖苷酶BpsGlul的序列從假長雙歧桿菌鑒定出α-葡糖苷酶基因BpsGlu1。BpsGlu1的氨基酸序列(SEQIDNO：28)存在于NCBI數據庫(GENBANK登陸號WP_022858408.1)中。假長雙歧桿菌α-葡糖苷酶BpsGlu1的表達對編碼BloGlu1蛋白質的DNA序列進行優(yōu)化以在枯草芽孢桿菌中表達，然后由GenerayBiotechCo.合成(獲得SEQIDNO：29)并插入到p3JM質粒中，導致p3JM-BpsGlul。SEQIDNO：29編碼SEQIDNO：30的氨基酸序列。p3JM-BpsGlu1質粒包含aprE啟動子以驅動最優(yōu)化的BpsGlu1序列(SEQIDNO：29)表達。質粒p3JM-BpsGlu1用于轉化枯草芽孢桿菌細胞(degUHy32，ΔnprB，Δvpr，Δepr，ΔscoC，ΔwprA，Δmpr，ΔispA，Δbpr)，并且將轉化的細胞涂布在補充有5ppm氯霉素的Luria瓊脂平板上。選擇如由PCR和測序所證實的帶有具正確插入片段的菌落并使其在具有MBD培養(yǎng)基(MOPS-基確定成分培養(yǎng)基，補充有額外5mMCaCl2)的250-mL搖瓶中進行發(fā)酵，以表達BpsGlu1蛋白質(SEQIDNO：30)。嗜熱雙歧桿菌α-葡糖苷酶BthGlu1的序列從嗜熱雙歧桿菌RBL67鑒定出α-葡糖苷酶基因“BthGlu1”。BthGlu1基因(SEQIDNO：31，GENBANK登錄號NC_020546.1，150690至152495位)的核酸序列和由SEQIDNO：31編碼的假定蛋白(SEQIDNO：32)的氨基酸序列存在于GENBANK登錄號YP_007592840.1中。嗜熱雙歧桿菌α-葡糖苷酶BthGlu1的表達對編碼整個BthGlu1蛋白質(SEQIDNO：32)的DNA序列進行優(yōu)化以在枯草芽孢桿菌中表達，然后由GenerayBiotechCo.合成(獲得SEQIDNO：33)并插入到p3JM質粒中，導致p3JM-BthGlu1。p3JM-BthGlu1質粒包含aprE啟動子以驅動最優(yōu)化的BthGlu1序列(SEQIDNO：33)表達。質粒p3JM-BthGlu1用于轉化枯草芽孢桿菌細胞(degUHy32，ΔnprB，Δvpr，Δepr，ΔscoC，ΔwprA，Δmpr，ΔispA，Δbpr)，并且將轉化的細胞涂布在補充有5ppm氯霉素的Luria瓊脂平板上。選擇如由PCR和測序所證實的帶有具正確插入片段的菌落并使其在具有MBD培養(yǎng)基(MOPS-基確定成分培養(yǎng)基，補充有額外5mMCaCl2)的250-mL搖瓶中進行發(fā)酵，以表達BthGlu1蛋白質(SEQIDNO：32)。短雙歧桿菌α-葡糖苷酶BbrGlu2的序列從短雙歧桿菌鑒定出α-葡糖苷酶基因BbrGlu2。BbrGlu2的氨基酸序列(SEQIDNO：34)存在于NCBI數據庫(GENBANK登陸號WP_003827971.1)中。短雙歧桿菌α-葡糖苷酶BbrGlu2的表達對編碼BbrGlu2蛋白質的DNA序列進行優(yōu)化以在枯草芽孢桿菌中表達，然后由GenerayBiotechCo.合成(獲得SEQIDNO：35)并插入到p3JM質粒中，導致p3JM-BbrGlu2。SEQIDNO：35編碼SEQIDNO：36的氨基酸序列。p3JM-BbrGlu2質粒包含aprE啟動子以驅動最優(yōu)化的BbrGlu2序列(SEQIDNO：35)表達。質粒p3JM-BbrGlu2用于轉化枯草芽孢桿菌細胞(degUHy32，ΔnprB，Δvpr，Δepr，ΔscoC，ΔwprA，Δmpr，ΔispA，Δbpr)，并且將轉化的細胞涂布在補充有5ppm氯霉素的Luria瓊脂平板上。選擇如由PCR和測序所證實的帶有具正確插入片段的菌落并使其在具有MBD培養(yǎng)基(MOPS-基確定成分培養(yǎng)基，補充有額外5mMCaCl2)的250-mL搖瓶中進行發(fā)酵，以表達SEQIDNO：36。短雙歧桿菌α-葡糖苷酶BbrGlu5的序列從短雙歧桿菌ACS-071-V-Sch8b鑒定出α-葡糖苷酶基因“BbrGlu5”。BbrGlu5基因(SEQIDNO：37，GENBANK登錄號NC_017218.1，2241075至2242895位的互補序列)的核酸序列和由SEQIDNO：37編碼的假定蛋白(SEQIDNO：38)的氨基酸序列存在于GENBANK登錄號YP_005583701.1中。雙歧桿菌α-葡糖苷酶BbrGlu5的表達對編碼整個BbrGlu5蛋白質(SEQIDNO：38)的DNA序列進行優(yōu)化以在枯草芽孢桿菌中表達，然后由GenerayBiotechCo.合成(獲得SEQIDNO：39)并插入到p3JM質粒中，導致p3JM-BbrGlu5。p3JM-BbrGlu5質粒包含aprE啟動子以驅動最優(yōu)化的BbrGlu5序列(SEQIDNO：39)表達。質粒p3JM-BbrGlu5用于轉化枯草芽孢桿菌細胞(degUHy32，ΔnprB，Δvpr，Δepr，ΔscoC，ΔwprA，Δmpr，ΔispA，Δbpr)，并且將轉化的細胞涂布在補充有5ppm氯霉素的Luria瓊脂平板上。選擇如由PCR和測序所證實的帶有具正確插入片段的菌落并使其在具有MBD培養(yǎng)基(MOPS-基確定成分培養(yǎng)基，補充有額外5mMCaCl2)的250-mL搖瓶中進行發(fā)酵，以表達BbrGlu5蛋白質(SEQIDNO：38)。從表達培養(yǎng)物純化α-葡糖苷酶AclGlu1和NcrGlu1采用兩個色譜步驟來純化AclGlu1(SEQIDNO：6)和NcrGlu1(SEQIDNO：12)α-葡糖苷酶兩者。對于每一種純化，濃縮搖瓶的粗發(fā)酵液，此后添加硫酸銨至最終濃度為2M。將溶液裝載到經20mMTris(pH8.0)、2M硫酸銨預平衡的50-mL苯基HP柱。用1M硫酸銨、20mMTris(pH8.0)從柱洗脫出目標蛋白質(SEQIDNO：6或SEQIDNO：12)。合并相應的級分，用VIVAFLOW200超濾設備(SartoriusStedim)使其濃縮并經緩沖液交換到20mMTris(pH8.0)(緩沖液A)中。將所得溶液施加于經緩沖液A預平衡的40-mLQHP柱。用含0.3MNaCl的緩沖液A從柱洗脫出目標蛋白質。然后將包含目標蛋白質的級分合并并用10KAMICONULTRA-15設備濃縮，并在-20℃儲存于40％甘油中直至使用。NfiGlu1使用兩個疏水作用色譜步驟來純化NfiGlu1α-葡糖苷酶(SEQIDNO：9)。濃縮搖瓶的粗發(fā)酵液，此后添加硫酸銨至最終濃度為1M。將溶液裝載到經20mMTris(pH8.0)、1M硫酸銨預平衡的50-mL苯基HP柱。使目標蛋白質(SEQIDNO：9)流動通過柱。合并流出級分，此后添加硫酸銨至最終濃度為2M。將溶液裝載到經20mMTris(pH8.0)、2M硫酸銨預平衡的相同苯基HP柱上。用1M硫酸銨、20mMTris(pH8.0)從柱洗脫出目標蛋白質。然后將包含目標蛋白質的級分合并并用10KAMICONULTRA-15設備濃縮，并在-20℃儲存于40％甘油中直至使用。TauSec098和TauSec099經由疏水作用色譜法來純化TauSec098(SEQIDNO：15)和TauSec099(SEQIDNO：18)α-葡糖苷酶兩者。對于每一種純化，將硫酸銨添加到7-L發(fā)酵罐的約180mL濃縮粗發(fā)酵液中至最終濃度為1M。然后將該溶液裝載到經20mM乙酸鈉(pH5.0)、1M硫酸銨(緩沖液A)預平衡的50-mLHIPREP苯基-FF瓊脂糖柱(GEHealthcare)。在用三個柱體積(CV)的相同緩沖液洗滌之后，采用75％、50％和0％緩沖液A各用三個CV逐步洗脫柱，之后用兩CV的MILLIQH2O洗脫。通過SDS-PAGE分析所有級分。目標蛋白質(SEQIDNO：15或SEQIDNO：18)主要存在于流出級分中，其采用10KDaAMICONULTRA-15設備進行濃縮和緩沖液更換以移除過量硫酸銨。在-80℃下，將純度大于90％的最終產物儲存于40％甘油中直至使用。BloGlu1、BloGlu2和BloGlu3使BloGlu1(SEQIDNO：20)、BloGlu2(SEQIDNO：24)、BloGlu3(SEQIDNO：26)α-葡糖苷酶均以三個步驟純化。對于每一種純化，濃縮1-LDASGIP發(fā)酵罐的粗發(fā)酵液，此后添加硫酸銨至60％飽和度。將溶液在4℃下攪拌1小時，然后在8000×g下離心30分鐘。使所得沉淀物重懸于20mMTris(pH8.0，緩沖液A)中。將硫酸銨添加到最終溶液中至最終濃度為1M；然后將該制劑裝載到經20mMTris(pH8.0)、1M硫酸銨(緩沖液B)預平衡的40-mLHiPrepTM苯基-FF柱。在洗滌后，用75％、50％和0％緩沖液B以及H2O各用三個柱體積進行逐步洗脫。所有級分采用SDS-PAGE和活性測定進行分析。合并包含目標蛋白質(SEQIDNO：20、SEQIDNO：24或SEQIDNO：26)的級分，濃縮并隨后裝載到經20mM磷酸鈉(pH7.0)、0.15MNaCl預平衡的HiLoadTM26/60SuperdexTM75柱。然后將包含目標蛋白質的流出級分合并并用10KAMICONULTRA-15設備濃縮，并在-20℃儲存于40％甘油中直至使用。BpsGlu1和BthGlu1以兩個步驟純化BpsGlu1(SEQIDNO：30)和BthGlu1(SEQIDNO：32)α-葡糖苷酶兩者。對于每一種純化，濃縮1-LDASGIP發(fā)酵罐的粗發(fā)酵液，此后添加硫酸銨至60％飽和度。將溶液在4℃下攪拌1小時，然后在8000×g下離心30分鐘。使所得沉淀物重懸于20mMTris(pH8.0，緩沖液A)中。將硫酸銨添加到最終溶液中至最終濃度為1M；然后將該制劑裝載到經20mMTris(pH8.0)、1M硫酸銨(緩沖液B)預平衡的40-mLHiPrepTM苯基-FF柱。在洗滌后，用75％、50％和0％緩沖液B以及H2O各用三個柱體積進行逐步洗脫。所有級分采用SDS-PAGE和活性測定進行分析。目標蛋白質(SEQIDNO：30或SEQIDNO：32)存在于0％緩沖液B洗脫步驟的洗脫物中；合并該洗脫物并用10KAMICONULTRA-15設備濃縮。在-20℃下，將純度大于95％的最終產物儲存于40％甘油中直至使用。BbrGlu2和BbrGlu5以四個步驟純化BbrGlu2(SEQIDNO：36)和BbrGlu5(SEQIDNO：38)α-葡糖苷酶兩者。對于每一種純化，濃縮1-LDASGIP發(fā)酵罐的粗發(fā)酵液，此后添加硫酸銨至60％飽和度。將溶液在4℃下攪拌1小時，然后在8000×g下離心30分鐘。使所得沉淀物重懸于20mMHEPES(pH7.0，緩沖液A)中。將硫酸銨添加到最終溶液中至最終濃度為1M；然后將該制劑裝載到經20mMHEPES(pH7.0)、1M硫酸銨預平衡的HiPrepTM苯基-FF柱上。用0.5M硫酸銨從柱洗脫出目標蛋白質(SEQIDNO：36或SEQIDNO：38)。合并相應的級分，用VIVAFLOW200超濾設備(SartoriusStedim)使其濃縮并經緩沖液交換到緩沖液A中。將所得溶液施加于經緩沖液A預平衡的HiPrepTMQFF16/10柱。用含有線性梯度的0-0.5MNaCl的緩沖液A從柱洗脫出目標蛋白質。將包含目標蛋白質的級分合并，濃縮并隨后裝載到經20mMHEPES(pH7.0)、0.15MNaCl預平衡的HiLoadTM26/60SuperdexTM75柱上。然后將包含目標蛋白質的級分合并并用10KAMICONULTRA-15設備濃縮，并在-20℃儲存于40％甘油中直至使用。因此，表達并純化了各種其它的α-葡糖苷酶。測試這些α-葡糖苷酶對α-1，5葡糖基-果糖鍵和α-1，3和/或α-1，6葡糖基-葡萄糖鍵的水解活性(在以下提供的實施例11、12、15和16中)。實施例11測試α-葡糖苷酶對各種糖苷鍵的水解活性該實施例公開了測試α-葡糖苷酶是否具有超越先前該類酶(EC3.2.1.20)相關的水解活性。實施例10的α-葡糖苷酶示出對α-1，5葡糖基-果糖鍵以及α-1，3和α-1，6葡糖基-葡萄糖鍵具有水解活性。α-葡糖苷酶的底物特異性基于當底物與α-葡糖苷酶溫育時葡萄糖從特定底物(異麥芽糖、麥芽糖、潘糖、明串珠菌二糖或黑曲霉糖)釋放，分析實施例10公開的各個α-葡糖苷酶的底物特異性。葡萄糖釋放速率使用偶聯(lián)葡萄糖氧化酶/過氧化物酶(GOX/HRP)方法(1980，Anal.Biochem.105：389-397)進行測定。葡萄糖釋放定量為偶聯(lián)GOX/HRP酶與葡萄糖反應所產生的過氧化物對2，2′-連氮基-二3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)進行氧化的速率。通過使9mL的底物溶液(水中1％，w/v)與1mL的0.5M(pH5.0)乙酸鈉緩沖液和40μL的0.5M氯化鈣在15-mL錐形管中混合制備各個底物溶液。在50mM乙酸鈉緩沖液(pH5.0)中制備具有ABTS的偶聯(lián)酶(GOX/HRP)溶液，最終濃度為2.74mg/mLABTS、0.1U/mLHRP和1U/mLGOX。在MILLIQ水中制出各個α-葡糖苷酶樣品和葡萄糖標準的一系列稀釋液。對于黑曲霉糖，僅采用一種劑量10ppm來測試α-葡糖苷酶樣品，原因是底物溶液的原液有限。將各個α-葡糖苷酶樣品(10μL)轉移到包含90μL的在50℃和600rpm下預溫育5分鐘的底物溶液的新微量滴定板(Corning3641)中。在搖動(600rpm)下，使反應在50℃下于THERMOMIXER(Eppendorf)中進行10分鐘(對于異麥芽糖、麥芽糖、潘糖和黑曲霉糖底物)或60分鐘(對于明串珠菌二糖底物)。然后分別將10μL的各反應混合物以及10μL的系列稀釋的標準葡萄糖快速轉移到新微量滴定板(Corning3641)中，然后向其中相應地添加90μL的ABTS/GOX/HRP溶液。使用SOFTMAXPRO讀板機(MolecularDevices)以11秒間隔在405nm處快速測定包含反應混合物的微量滴定板5分鐘。對于各個酶濃度，輸出為反應速率Vo。使用線性回歸來測定曲線Vo與酶劑量的斜率。使用式1基于葡萄糖標準曲線計算各個α-葡糖苷酶的比活性：比活性(單位/mg)＝斜率(酶)/斜率(標準)×1000(1)，其中1單位＝1μmol葡萄糖/分鐘。對于黑曲霉糖，在10ppm的酶劑量下反應速率值直接用于指示酶活性。使用前述方法，測定各個α-葡糖苷酶對各個底物的特異性。還測定了寡-1，6-葡糖苷酶(購自Megazyme，參見表4)和轉葡糖苷酶(TGL-2000，參見表4)對各個底物的活性。該分析的結果提供于表17中。表17各種α-葡糖苷酶對不同底物的活性a對于黑曲霉糖，以一種劑量(10ppm)使用各個酶。令人感興趣地，據發(fā)現(xiàn)α-葡糖苷酶除了表現(xiàn)出對α-1，4葡糖基-葡萄糖鍵(麥芽糖)的水解活性之外，還表現(xiàn)出對α-1，6葡糖基-葡萄糖鍵(異麥芽糖)、α-1，3葡糖基-葡萄糖鍵(黑曲霉糖)和α-1，5葡糖基-果糖鍵(明串珠菌二糖)的水解活性(表17)。因此，α-葡糖苷酶具有超越先前EC3.2.1.20酶相關的水解活性。具體地，α-葡糖苷酶對α-1，5葡糖基-果糖鍵和α-1，3以及α-1，6葡糖基-葡萄糖鍵具有水解活性。實施例12用α-葡糖苷酶水解葡聚糖反應濾液中明串珠菌二糖和低聚糖該實施例描述了使用α-葡糖苷酶水解存在于獲自葡聚糖合成反應的濾液中的明串珠菌二糖及其它低聚糖。具體地，研究了實施例10公開的α-葡糖苷酶對不溶性葡聚糖(聚α-1，3-葡聚糖)合成反應的濾液中明串珠菌二糖和低聚糖DP2、DP3和HS(高糖，DP4+)的水解的影響。用于對α-葡糖苷酶活性進行測試的低聚糖的分離和分析首先根據實施例1制備葡聚糖合成反應的濃縮濾液。簡而言之，通過色譜分離從濃縮濾液分離低聚糖，并分析糖苷鍵鍵特征。采用強酸性陽離子交換樹脂的色譜分離用于分離濃縮濾液的低聚糖級分。用于該分離的柱的物理參數如下：FINEXCS11GC，#227樹脂；Na+離子形式；5％二乙烯基苯(交聯(lián))；0.34mm粒度；1.64m床長度；0.093m柱直徑。更具體地，使表3所述濃縮的糖溶液(即濃縮濾液)過濾并用自來水稀釋至25g干固體/100g溶液。在將該糖溶液添加至柱樹脂之前，用六個床體積(BV)的氯化鈉溶液(10重量％氯化鈉的三個BV，之后5重量％氯化鈉的三個BV)洗滌該樹脂以將樹脂轉化為鈉形式。然后將糖溶液(0.6L)進料至柱，其后用流速為50L/小時的水洗脫柱。色譜分離的運行條件概述如下：0.6L進料體積(size)，25g干固體/100g溶液，65℃柱溫，50mL/min流速。在11至21分鐘之間洗脫出低聚糖溶液。少量鹽——指示傳導性增大——同時洗脫出來。通過HPLC分析由此制備的低聚糖級分來確定其產物分布。總之，級分包含＞89％的含有三種或更多種己糖單元的低聚糖和少于1.5％的可識別的單糖和二糖。使用薄膜蒸發(fā)器(LCICorporation，Charlotte，NC)將該級分濃縮至317g/L的總干重，之后用ROTAVAPOR(R-151；Buchi，NewCastle，DE)進行旋轉蒸發(fā)。如HPLC所測的濃縮級分的產物分布顯示于表18中。表18濃縮低聚糖級分的產物分布初步篩選對葡聚糖低聚物水解的α-葡糖苷酶分別針對以上制備的純化低聚糖級分(表18)評估十一種不同α-葡糖苷酶的活性(實施例10)以及兩種基準酶即寡-1，6-葡糖苷酶(購自Megazyme)和轉葡糖苷酶(TGL-2000)的活性。在pH5.0和60℃下，在包含低聚糖底物(2.9％干固體)和2mM氯化鈣的溶液中溫育各個α-葡糖苷酶(劑量為1mg/mL)。在溫育24小時之后，通過添加50μL的0.5MNaOH將各個反應淬滅。如下測定經淬滅反應的低聚糖/單糖內容物。用水將各反應的樣品稀釋5倍以用于HPLC分析。在85℃下使用具有AMINEXHPX-42A柱(300mm×7.8mm)的Agilent1200系列HPLC系統(tǒng)進行HPLC分離。將樣品(10mL)施加于HPLC柱并在0.6mL/min流速下采用等梯度MILLI-Q水作為流動相進行分離。使用折射率檢測器來檢測低聚糖產物。提供于下表19的數字反映各個DPn的平均峰面積百分比(由各樣品得到，一式兩份)作為DPI至DP7的總數的一部分。表19分析用α-葡糖苷酶處理之后的葡聚糖濾液低聚糖如在表19中用陰影所表示的，相較于不存在酶的對照反應(“空白”)，反應的低聚糖內容物通常偏向更小粒度的糖。這些結果指出，α-葡糖苷酶可用于水解在葡聚糖合成反應內所含的低聚糖及其級分。另外，基于低聚糖的鍵特征(實施例3和4)以及α-葡糖苷酶對除α-1，4鍵(實施例11)之外的各種糖苷鍵的活性，顯而易見的是，α-葡糖苷酶可用于分解具有α-1，5葡糖基-果糖鍵和/或α-1，3和α-1，6葡糖基-葡萄糖鍵的低聚糖。表19提供的結果還表明，相較于細菌α-葡糖苷酶，真菌α-葡糖苷酶對可溶性低聚糖具有更好的水解活性。α-葡糖苷酶對葡聚糖合成反應的低聚糖產物的水解活性的證實進行了這樣一種反應，其包括一種或兩種α-葡糖苷酶和獲自聚α-1，3-葡聚糖合成反應的濃縮濾液(表3)。α-葡糖苷酶反應的劑量為4ppm的酶，或者對于共混物，各個酶以1：1的比率使用，最終劑量為4ppm。將濃縮濾液以10％干固體裝載于各個反應中。各個反應還包含2mM氯化鈣(pH5.0)，并在60℃或65℃下進行。在溫育23小時之后，通過添加50μL的0.5MNaOH淬滅反應。如下測定經淬滅反應的低聚糖/單糖內容物。用水將各個反應的樣品稀釋25倍以用于HPLC分析。在85℃下使用具有AMINEXHPX-42A柱(300mm×7.8mm)的Agilent1200系列HPLC系統(tǒng)進行HPLC分離。將樣品(10mL)施加于HPLC柱并在0.6mL/min流速下采用等梯度MILLI-Q水作為流動相進行分離。使用折射率檢測器來檢測低聚糖產物。提供于下表20的數字反映各個DPn的峰面積平均百分比(來自一式兩份各樣品)作為總數的一部分。表20所提供的結果通常證實了如上所討論特定α-葡糖苷酶的活性(關于提供于表19的結果)。因此，α-葡糖苷酶可用于水解存在于獲自葡聚糖合成反應例如聚α-1，3-葡聚糖合成反應的級分(例如濾液)中的明串珠菌二糖及其它低聚糖。實施例13從gtf-S/MUT3325反座物中分離低聚物/明串珠菌二糖極分將蔗糖(4.50kg)溶解于蒸餾過的去離子水至最終總體積為9.5L，并且在攪拌下，將所得溶液在80℃加熱5分鐘并然后冷卻至47℃。在攪拌下，添加包含0.6g/L的gtf-S酶(GTF0459，SEQIDNO：42)的500克粗提取物和包含10g/L突變酶(MUT3325，SEQIDNO：47)的15.0mL粗提取物(參見用于酶制備的一般方法)。在攪拌下，通過緩慢添加37重量％HCl的1∶10(v/v)稀釋液將所得的混合物的pH立即調節(jié)至pH5.5至pH6.0。使反應溫度和pH分別維持于47℃和pH5.5-6.0，直至根據HPLC分析蔗糖轉化率＞95％，此后將反應混合物立即調節(jié)至pH7.0至7.5并加熱至90℃20分鐘，然后冷卻至25℃以立即過濾來移除顆粒和沉淀。使用以下樹脂和條件，在IEX/SEC柱層析之前將所得濾液保持在5℃：FINEXCS11GCSAC(Ca2+形式)，柱i.d＝9.3cm，柱床高度1.58m，T＝70℃，流速＝51mL/min，線性流速＝0.44m/h，進料體積＝0.6L＝171g，進料RI-DS＝25.1g/100g，采樣間隔＝3min。合并在30min至67min之間收集的柱級分，通過蒸發(fā)濃縮為66％溶解的固體并且如一般方法中所述通過HPLC進行分析。表21示出由此制備的分離級分的低聚糖和單糖組分。表21得自gtf-S/MUT3325反應的低聚物/明串珠菌二糖級分的分析在該實施例中，葡聚糖合成反應用于產生至少一種可溶性α-葡聚糖產物。該可溶性產物由均存在于葡糖基轉移酶反應的葡糖基轉移酶(GTF0459，SEQIDNO：42)和α-葡聚糖水解酶(MUT3325，SEQIDNO：47)兩者的協(xié)同作用產生。該實施例還示出由葡聚糖合成反應制備的色譜級分。該級分因此用于以下實施例15和16，以測試α-葡糖苷酶的活性。實施例14從Gtf-C反應物中分離低聚物/明串珠菌二糖級分將蔗糖(4.50kg)溶解于蒸餾過的去離子水至最終總體積為9.5L，并且在攪拌下，將所得溶液在80℃加熱5分鐘并然后冷卻至47℃。在攪拌下，添加包含0.41g/L的gtf-C酶(GTF0088BsT1，SEQIDNO：45)的500克粗提取物(參見用于酶制備的一般方法)。在攪拌下，通過緩慢添加37重量％HCl的1∶10(v/v)稀釋液將所得的混合物的pH立即調節(jié)至pH5.5至pH6.0。使反應溫度和pH分別維持于47℃和pH5.5-6.0，直至根據HPLC分析蔗糖轉化率＞95％，此后將反應混合物立即調節(jié)至pH7.0至7.5并加熱至90℃20分鐘，然后冷卻至25℃以立即過濾來移除顆粒和沉淀。使用以下樹脂和條件，在IEX/SEC柱層析之前將所得濾液保持在5℃：FINEXCS11GCSAC(Ca2+形式)，柱i.d＝9.3cm，柱床高度1.58m，T＝70℃，流速＝50mL/min，線性流速＝0.44m/h，進料體積＝0.6L＝171g，進料RI-DS＝25.8g/100g，采樣間隔＝3min。合并在34min至72min之間收集的柱級分，通過蒸發(fā)濃縮為67％溶解的固體并且如一般方法中所述通過HPLC進行分析。表22示出由此制備的分離級分的低聚糖和單糖組分。表22得自Gtf-C反應的低聚物/明串珠菌二糖級分的分析在該實施例中，葡聚糖合成反應用于產生至少一種可溶性α-葡聚糖產物。該實施例還示出由產生可溶性α-葡聚糖產物的葡聚糖合成反應制備的色譜級分。該級分因此用于以下實施例15和16，以測試α-葡糖苷酶的活性。實施例15用得自Gtf-S/MUT3325和Gtf-C反應的低聚物/明串珠菌二糖級分初步篩選α-葡糖苷酶該實施例描述了使用α-葡糖苷酶水解存在于獲自產生可溶性α-葡聚糖產物的葡聚糖合成反應的色譜級分中的明串珠菌二糖及其它低聚糖。具體地，對實施例10公開的α-葡糖苷酶對于實施例13和14所制備的級分中明串珠菌二糖和低聚糖的水解的影響進行了研究。用得自gtf-S/MUT3325(實施例13)和gtf-C(實施例14)反應的低聚物/明串珠菌二糖級分作為底物物質來篩選總共十二種α-葡糖苷酶和兩種基準酶(寡-1，6-葡糖苷酶和TGL-2000轉葡糖苷酶)。所有酶(α-葡糖苷酶和基準酶)用量均為相同的蛋白質濃度。在pH5.5和47℃下，在包含低聚物/明串珠菌二糖底物(10％干固體)和2mM氯化鈣的溶液中溫育各個α-葡糖苷酶(劑量為100ppm)。在溫育21小時之后，通過添加50μL的0.5MNaOH將各個反應淬滅。如下測定經淬滅反應的低聚糖/單糖內容物。使各個反應的樣品離心并用水將其中的上清液稀釋25倍以用于HPLC分析(一般方法)。記錄于表23的百分比反映各個DPn的平均峰面積百分比(由分析各樣品得到，一式兩份)作為總數的一部分。結果表明，當與細菌α-葡糖苷酶比較時，真菌α-葡糖苷酶對葡聚糖低聚物具有更好的水解活性。如在表23中用陰影所表示的，相較于不存在酶的對照反應(“空白”)，反應的低聚糖內容物通常偏向更小粒度的糖。這些結果指出，α-葡糖苷酶可用于水解包含在葡聚糖合成反應內的低聚糖及其級分，特別是產生可溶性α-葡聚糖產物的葡聚糖合成反應的色譜級分。另外，基于低聚糖的鍵特征(實施例13和14)以及α-葡糖苷酶對除α-1，4鍵(實施例11)之外的各種糖苷鍵的活性，顯而易見的是，α-葡糖苷酶可用于分解具有α-1，5葡糖基-果糖鍵也可能具有α-1，3和α-1，6葡糖基-葡萄糖鍵的低聚糖。表23提供的結果還表明，相較于細菌α-葡糖苷酶，真菌α-葡糖苷酶對可溶性低聚糖具有更好的水解活性。因此，α-葡糖苷酶可用于水解存在于獲自葡聚糖合成反應例如合成可溶性α-葡聚糖產物的反應的級分(例如色譜級分)中的明串珠菌二糖及其它低聚糖。實施例16用得自Gtf-S/MUT3325和Gtf-C反應的低聚物/明串珠菌二糖級分選篩α-葡糖苷酶該實施例根據實施例15，描述了使用α-葡糖苷酶水解存在于獲自產生可溶性α-葡聚糖產物的葡聚糖合成反應的色譜級分中的明串珠菌二糖及其它低聚糖。通過分析導致包含相同蛋白質濃度用量的酶的反應的糖組合物評估對于得自gtf-S/MUT3325和gtf-C反應的低聚物/明串珠菌二糖級分(實施例15)最具水解活性的α-葡糖苷酶。分別在60℃和65℃下，在2mM氯化鈣存在下，在pH5.5下對α-葡糖苷酶(用量為4ppm；對于共混物，兩種酶的比率為1∶1并且總用量為4ppm)和低聚物/明串珠菌二糖底物(10％ds)進行溫育。在溫育23小時之后，通過添加50ul的0.5mMNaOH來淬滅反應。如下測定經淬滅反應的低聚糖/單糖內容物。對得自各個反應的樣品進行離心并用水將其中的上清液稀釋25倍以用于HPLC分析(一般方法)。記錄于表24(下文)的百分比反映各個DPn的平均峰面積百分比(由分析各樣品得到，一式兩份)作為總數的一部分。結果表明當在65℃下進行溫育時，TauSec098對于水解DP2至DP7低聚物是有效的，并且TauSec099對于明串珠菌二糖的水解優(yōu)于TGL-2000。TauSec098與TauSec099(或TGL-2000)的共混物有效地水解低聚物和明串珠菌二糖來產生DP1。因此，α-葡糖苷酶可用于水解存在于獲自葡聚糖合成反應例如合成可溶性α-葡聚糖產物的反應的級分(例如色譜級分)中的明串珠菌二糖及其它低聚糖。當前第1頁1 2 3