本發(fā)明提供用于誘導(dǎo)人和犬科動物受試者的對HER2/neu抗原表達(dá)腫瘤的免疫應(yīng)答以及用于治療該腫瘤和接種該腫瘤的疫苗的組合物和方法。在另一個(gè)實(shí)施例中，人受試者是兒童或青少年。

背景技術(shù)：

單核細(xì)胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)是主要感染抗原呈遞細(xì)胞并且已適應(yīng)在這些細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中生活的細(xì)胞內(nèi)病原體。宿主細(xì)胞諸如巨噬細(xì)胞、主動吞噬細(xì)胞單核細(xì)胞增多性李斯特菌和大部分細(xì)菌在吞噬溶酶體中降解。一些細(xì)菌通過溶血素、李斯特菌溶血素O(LLO)的作用刺穿噬菌溶酶體膜而逃入宿主胞質(zhì)溶膠。一旦處于胞質(zhì)溶膠中，單核細(xì)胞增多性李斯特菌即可使宿主肌動蛋白聚合，并且直接從細(xì)胞傳遞到細(xì)胞，從而進(jìn)一步入侵宿主免疫系統(tǒng)并產(chǎn)生可忽略的對單核細(xì)胞增多性李斯特菌的抗體應(yīng)答。

HER2/neu(在本文中也稱為“Her-2”)是185kDa的糖蛋白，它是酪氨酸激酶的表皮生長因子受體(EGFR)家族成員，并由胞外域、跨膜域和胞內(nèi)域(已知涉及細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo))組成。在人中，Her2抗原在所有乳腺癌的25至40％中過表達(dá)，并且也在很多骨(骨肉瘤–OSA)、卵巢、肺、胰腺、腦和胃腸道癌中過表達(dá)。Her-2的過表達(dá)與不受控制的細(xì)胞生長和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)，它們二者均有助于腫瘤的發(fā)展。過表達(dá)Her-2的癌癥患者表現(xiàn)出耐受性，即使存在可檢測的直接對Her-2的體液、CD8⁺T細(xì)胞和CD4⁺T細(xì)胞應(yīng)答。

大型養(yǎng)殖狗自發(fā)發(fā)展成OSA，再現(xiàn)了小兒OSA的多個(gè)方面，包括組織學(xué)異質(zhì)性、侵襲性局部疾病和早期轉(zhuǎn)移。在狗中，OSA可出現(xiàn)于任何骨骼中，但肢骨僅占所有受影響骨骼的75％-85％，并且在其中，OSA被稱為“肢體骨肉瘤”。其余的OSA影響中軸骨骼，包括上頜骨、下頜骨、脊骨、頭蓋骨、肋骨、鼻腔骨、鼻旁竇骨和骨盆。在診斷中，95％的狗患有微轉(zhuǎn)移性疾病，并且盡管進(jìn)行了截肢和化療，但中值存活時(shí)間也只有10個(gè)月，大部分狗由于進(jìn)行性轉(zhuǎn)移性疾病而被實(shí)施安樂死。肺轉(zhuǎn)移性疾病是兩個(gè)物種發(fā)病和死亡的主要原因。

小兒至年輕成年人群體的原發(fā)性惡性骨腫瘤相對不常見，在不到20歲的群體中占所有癌癥的約6％，并且在年齡范圍為15至29歲的青少年和年輕成年人(AYA)中占所有癌癥的3％。每年在美國骨肉瘤影響了約400名兒童和青少年，這代表了在幾十年里幾乎無治療改進(jìn)的小但高需求的領(lǐng)域。雖然骨肉瘤(OS)是罕見的惡性腫瘤，但在小兒年齡組中它被列為癌癥相關(guān)性死亡的主要原因?，F(xiàn)代、多藥劑、劑量密集化療與手術(shù)結(jié)合在60-70％局限于肢體的非轉(zhuǎn)移性疾病中實(shí)現(xiàn)了5年無事件存活期。然而，主要的、但未解決的問題是轉(zhuǎn)移性復(fù)發(fā)或再次出現(xiàn)以及中軸疾病患者的預(yù)后差。此外，在美國尚無批準(zhǔn)用于骨肉瘤的產(chǎn)品，表明對治療該疾病的新型療法具有強(qiáng)烈需求。

本發(fā)明通過提供使用LmddA疫苗載體生成的重組李斯特菌(Listeria)-HER2/neu疫苗株滿足了此需求，該載體具有明確的減毒機(jī)制且不含抗生素選擇標(biāo)記，并且據(jù)發(fā)現(xiàn)該載體在治療犬科動物骨肉瘤中有效。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在一個(gè)方面，本文提供的發(fā)明涉及包含融合多肽的免疫原性組合物，其中所述融合多肽包含融合至另外的多肽的HER2/neu嵌合抗原，并且其中將融合蛋白施用于患有HER2/neu表達(dá)腫瘤的受試者繞開腫瘤引起的突變回避(mutation avoidance)。在另一個(gè)實(shí)施例中，繞開突變回避是由于表位擴(kuò)展。在又一個(gè)實(shí)施例中，繞開突變回避是由于抗原的嵌合性質(zhì)。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供的發(fā)明涉及包含核酸分子的重組李斯特菌疫苗株，其中并且在另一個(gè)實(shí)施例中，核酸分子包含編碼多肽的第一開放閱讀框，其中該多肽包含HER2/neu嵌合抗原，其中該核酸分子還包含編碼代謝酶的第二開放閱讀框，并且其中該代謝酶互補(bǔ)重組李斯特菌菌株的染色體中突變的內(nèi)源性基因。

在一個(gè)實(shí)施例中，本文提供的發(fā)明涉及治療受試者的HER2/neu表達(dá)腫瘤生長或癌癥的方法，該方法包括施用包含編碼融合多肽的核酸的重組減毒李斯特菌的步驟，其中所述融合多肽包含融合至另外的多肽的HER2/neu嵌合抗原，其中所述核酸分子包含編碼所述融合多肽的第一開放閱讀框，其中所述核酸分子還包含編碼代謝酶的第二開放閱讀框，并且其中所述代謝酶互補(bǔ)所述重組李斯特菌疫苗株的染色體中突變的內(nèi)源性基因。在另一個(gè)實(shí)施例中，受試者是人。在另一個(gè)實(shí)施例中，人受試者可以是成人或兒童。在另一個(gè)實(shí)施例中，受試者是犬科動物。在另一個(gè)實(shí)施例中，嵌合HER2是犬科動物嵌合HER2。在另一個(gè)實(shí)施例中，嵌合HER2是人嵌合HER2。在另一個(gè)實(shí)施例中，將所述融合多肽施用于所述受試者防止所述腫瘤內(nèi)的逃逸突變。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述人HER2/neu嵌合抗原包含至少5、9、13、14或17個(gè)標(biāo)繪的人MHC I類表位。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供的發(fā)明涉及防止HER2/neu表達(dá)腫瘤生長或癌癥的方法。

在一個(gè)實(shí)施例中，治療HER2/neu表達(dá)腫瘤生長或癌癥的方法使所述受試者的總體存活期增加。在另一個(gè)實(shí)施例中，治療HER2/neu表達(dá)腫瘤生長或癌癥的方法使受試者的轉(zhuǎn)移性疾病延緩。在另一個(gè)實(shí)施例中，治療使HER2/neu特異性T細(xì)胞應(yīng)答增強(qiáng)。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供引起受試者的對HER2/neu表達(dá)腫瘤生長或癌癥的增強(qiáng)免疫應(yīng)答的方法，該方法包括施用包含編碼融合多肽的核酸的重組減毒李斯特菌的步驟，其中所述融合多肽包含融合至另外的多肽的HER2/neu嵌合抗原，其中所述核酸分子包含編碼所述融合多肽的第一開放閱讀框，其中所述核酸分子還包含編碼代謝酶的第二開放閱讀框，并且其中所述代謝酶互補(bǔ)所述重組李斯特菌疫苗株的染色體中缺乏的內(nèi)源性基因。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述引起增強(qiáng)免疫應(yīng)答的方法使所述受試者的總體存活期增加。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述引起增強(qiáng)免疫應(yīng)答的方法使受試者的轉(zhuǎn)移性疾病延緩。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述引起增強(qiáng)免疫應(yīng)答的方法使HER2/neu特異性T細(xì)胞應(yīng)答增強(qiáng)。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供延長患有HER2/neu表達(dá)腫瘤生長或癌癥的受試者的存活期的方法，該方法包括施用包含編碼融合多肽的核酸的重組減毒李斯特菌的步驟，其中所述融合多肽包含融合至另外的多肽的HER2/neu嵌合抗原，其中所述核酸分子包含編碼所述融合多肽的第一開放閱讀框，其中所述核酸分子還包含編碼代謝酶的第二開放閱讀框，并且其中所述代謝酶互補(bǔ)所述重組李斯特菌疫苗株的染色體缺乏的內(nèi)源性基因。在另一個(gè)實(shí)施例中，受試者是人。在另一個(gè)實(shí)施例中，人受試者可以是成人或兒童。在另一個(gè)實(shí)施例中，受試者是犬科動物。在一個(gè)實(shí)施例中，所述方法還包括在所述受試者中復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移后施用所述重組減毒李斯特菌。

在一個(gè)實(shí)施例中，本文提供的發(fā)明涉及延緩患有HER2/neu表達(dá)腫瘤生長或癌癥的受試者的轉(zhuǎn)移性疾病的方法，該方法包括施用包含編碼融合多肽的核酸的重組減毒李斯特菌的步驟，其中所述融合多肽包含融合至另外的多肽的HER2/neu嵌合抗原，其中所述核酸分子包含編碼所述融合多肽的第一開放閱讀框，其中所述核酸分子還包含編碼代謝酶的第二開放閱讀框，并且其中所述代謝酶互補(bǔ)所述重組李斯特菌疫苗株的染色體中缺乏的內(nèi)源性基因。在另一個(gè)實(shí)施例中，受試者是人。在另一個(gè)實(shí)施例中，人受試者可以是成人或兒童。在另一個(gè)實(shí)施例中，受試者是犬科動物。

附圖說明

被視為本發(fā)明的主題在說明書的結(jié)論部分特別指出并明確要求進(jìn)行保護(hù)。然而，在結(jié)合附圖閱讀時(shí)，通過參考以下具體實(shí)施方式，可以最好地理解本發(fā)明(對組織和操作方法來說皆是如此)及其目的、特征和優(yōu)點(diǎn)，在附圖中：

圖1.ADXS31-164的構(gòu)建。(A)pAdv164的質(zhì)粒圖譜，其具有在組成型李斯特菌p60啟動子控制下的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)dal基因，用于互補(bǔ)LmddA菌株的染色體dal-dat缺失。它還包含截短的LLO_(1-441)與嵌合人HER2/neu基因的融合體，該融合體通過3個(gè)HER2/neu片段：EC1(aa 40-170)、EC2(aa 359-518)和ICI(aa 679-808)的直接融合而構(gòu)建。右側(cè)的載體示意圖詳細(xì)示出，pAdv164表達(dá)由融合至截短的LLO的人HER2/neu的2個(gè)胞外域和一個(gè)胞內(nèi)域組成的嵌合HER2/neu融合蛋白。質(zhì)粒借助于dal基因的營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)而維持在重組dal/dat/actA^-李斯特菌菌株(LmddA)內(nèi)(參見實(shí)例)。(B)通過對用抗LLO抗體印跡的TCA沉淀細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行的Western印跡分析檢測了Lm-LLO-ChHer2(Lm-LLO-138)和LmddA-LLO-ChHer2(ADXS31-164)中tLLO-ChHer2的表達(dá)和分泌?！?04KD的差異條帶對應(yīng)于tLLO-ChHer2。檢測到內(nèi)源性LLO為58KD條帶。李斯特菌對照缺乏ChHer2表達(dá)。

圖2.ADXS31-164的免疫原性(A)基于HER2/neu李斯特菌的疫苗在免疫小鼠的脾細(xì)胞中引起的細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答使用NT-2細(xì)胞作為刺激因子、3T3/neu細(xì)胞作為靶標(biāo)進(jìn)行測試。Lm-對照基于在各個(gè)方面相同但表達(dá)不相關(guān)抗原(HPV16-E7)的LmddA背景。(B)免疫FVB/N小鼠的脾細(xì)胞分泌進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)基中的IFN-γ在使用絲裂霉素C處理的NT-2細(xì)胞體外刺激24小時(shí)后通過ELISA測定。(C)嵌合疫苗免疫的HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細(xì)胞響應(yīng)于來自蛋白不同區(qū)域的肽的體外溫育而分泌IFN-γ。重組ChHer2蛋白用作陽性對照，不相關(guān)肽或無肽組構(gòu)成陰性對照，如圖例中所列出。使用72小時(shí)共溫育后收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行ELISA分析，以測定IFN-γ分泌。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)為一式三份數(shù)據(jù)的平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)誤差。*P值<0.001。

圖3.李斯特菌-ChHER2/neu疫苗的腫瘤預(yù)防研究使用每種重組李斯特菌-ChHer2或?qū)φ绽钏固鼐呙缱⑸銱ER2/neu轉(zhuǎn)基因小鼠六次。免疫在6周齡開始，每三周一次延續(xù)直到第21周。每周監(jiān)測腫瘤的外觀并以無腫瘤小鼠的百分比表示。*p<0.05，N＝9只每組。

圖4.ADXS31-164免疫對脾臟中％Treg的作用。給FVB/N小鼠皮下接種1×10⁶個(gè)NT-2細(xì)胞，并且使用每種疫苗以一周為間隔免疫三次。在第二次免疫后7天收集脾臟。在分離免疫細(xì)胞后，對其進(jìn)行染色，以通過抗CD3、CD4、CD25和FoxP3抗體檢測Treg。來自代表性實(shí)驗(yàn)的Treg的點(diǎn)圖示出CD25⁺/FoxP3⁺T細(xì)胞的頻率，以不同治療組之間總CD3⁺或CD3⁺CD4⁺T細(xì)胞的百分比表示。

圖5.ADXS31-164免疫對NT-2腫瘤中％腫瘤浸潤Treg的作用。給FVB/N小鼠皮下接種1×10⁶個(gè)NT-2細(xì)胞，并且使用每種疫苗以一周為間隔免疫三次。在第二次免疫后7天收集腫瘤。在分離免疫細(xì)胞后，對其進(jìn)行染色，以通過抗CD3、CD4、CD25和FoxP3抗體檢測Treg。(A).來自代表性實(shí)驗(yàn)的Treg的點(diǎn)圖。(B).CD25⁺/FoxP3⁺T細(xì)胞的頻率，以不同治療組之間總CD3⁺或CD3⁺CD4⁺T細(xì)胞的百分比(左插圖)和腫瘤內(nèi)CD8/Treg比率(右插圖)表示。數(shù)據(jù)以2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)獲得的平均值±SEM表示。

圖6.ADXS31-164疫苗接種可延緩腦中乳腺癌細(xì)胞系的生長。Balb/c小鼠使用ADXS31-164或?qū)φ绽钏固鼐呙缑庖呷巍＝o麻醉小鼠顱內(nèi)注射EMT6-Luc細(xì)胞(5,000個(gè))。(A)小鼠的離體成像使用Xenogen X-100CCD照相機(jī)在指定的天數(shù)進(jìn)行。(B)像素強(qiáng)度以光子數(shù)/秒/cm2表面積繪圖；這以平均發(fā)光度表示。(C)EMT6-Luc細(xì)胞、4T1-Luc和NT-2細(xì)胞系的HER2/neu表達(dá)通過使用抗HER2/neu抗體的Western印跡檢測。鼠科動物巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞系J774.A2細(xì)胞用作陰性對照。

圖7.示出ADXS31-164接種的前18名患者。

圖8.示出ADXS31-164施用不會導(dǎo)致早期或晚期心臟損傷。A)心臟的超聲心動圖示出心臟外觀正常。B)在研究的過程中評估的連續(xù)心臟肌鈣蛋白I水平示出水平是正常的(另見圖26D)。

圖9.示出A)體溫和B)收縮壓的ADXS31-164相關(guān)變化。在基線和ADXS31-164施用后每2小時(shí)記錄體溫和收縮壓。示出每只狗每次疫苗接種時(shí)的參數(shù)。水平條表示每個(gè)劑量組、每個(gè)時(shí)間點(diǎn)所有狗的中值。p＜0.05，p＜0.005

圖10.示出ADXS31-164和姑息性放療(RT)聯(lián)合治療原發(fā)性疾病的計(jì)劃表。

圖11.放射照片未示出狗肱骨近端骨折后出現(xiàn)轉(zhuǎn)移性疾病的證據(jù)，并且還示出存在骨痂，表明骨折愈合。

圖12.前期I期臨床試驗(yàn)的時(shí)間線，其評估重組表達(dá)ADXS31-164的單核細(xì)胞增多性李斯特菌引起患有肢體骨肉瘤的狗的治療有效性抗腫瘤免疫的安全性和功效。

圖13.ADXS-31-164施用后的治療相關(guān)不良事件和存活期曲線。A)治療相關(guān)不良事件。B)在試驗(yàn)入選時(shí)所有狗均無轉(zhuǎn)移性疾病。對照組的狗接受了截肢，然后單獨(dú)施用卡鉑或卡鉑加上阿霉素。審查疫苗組的2只狗，因?yàn)樗鼈兯烙诓幌嚓P(guān)的原因(1只狗死于吸入性肺炎，另一只死于腎胚細(xì)胞瘤)。疫苗接種組：紅線；對照組：黑線。

圖14.人(A)和犬科動物(B)患者的原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性骨肉瘤(OSA)的放射圖像。在兩個(gè)物種中，原發(fā)性病灶的特征在于骨干骺端(A中箭頭)的顯著增生和溶解區(qū)域。

圖15.I期3+3臨床試驗(yàn)的示意圖，其在患有HER2+骨肉瘤(OSA)的狗中評估ADXS31-164的安全性和功效?；加凶园l(fā)性HER2+肢體OSA的私有狗接受了護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)截肢和隨訪卡鉑化療。在最終卡鉑劑量三周后，給狗靜脈內(nèi)接種2×10⁸、5×10⁸、1×10⁹或3×10⁹CFU的ADXS31-164(相隔三周進(jìn)行三次疫苗接種)。每2個(gè)月給狗進(jìn)行再分期直到死亡，以確定疫苗防止轉(zhuǎn)移性疾病的功效。

圖16.犬科動物原發(fā)性骨肉瘤中的HER2/neu表達(dá)。(A)狗原發(fā)性O(shè)SA的H&E染色示出惡性成骨細(xì)胞的巢和類骨質(zhì)沉積。(B)犬科動物原發(fā)性O(shè)SA的免疫組織化學(xué)評估示出HER2/neu在惡性成骨細(xì)胞中的表達(dá)。(C)5只私有狗的原發(fā)性O(shè)SA樣品的Western印跡示出HER2/neu表達(dá)是可變的。陽性對照為：MCF-7人乳腺癌細(xì)胞系和CAMAC2犬科動物乳腺癌細(xì)胞系。

圖17.基線和ADXS31-164施用后24小時(shí)的血液指標(biāo)值。對每個(gè)劑量組內(nèi)所有狗每次疫苗接種時(shí)的前值和后值取平均值。p＜0.05，p＜0.005。示出在ADXS31-164施用后24小時(shí)，白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(A-B)的瞬時(shí)、但統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的增加，并且伴有血小板和淋巴細(xì)胞(C-D)瞬時(shí)減少。

圖18.ADXS31-164誘導(dǎo)的白細(xì)胞(WBC)、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞計(jì)數(shù)增加與存活期相關(guān)。WBC、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞計(jì)數(shù)在基線和疫苗接種后24小時(shí)測定。在每次疫苗接種后計(jì)算增加的百分比，并且對每只狗取平均值。(A)結(jié)果根據(jù)存活(死亡或活著)顯示。(B)結(jié)果根據(jù)所接受的ADXS31-164劑量顯示。水平條表示該組的中值。

圖19.示出ADXS31-164誘導(dǎo)的Her-2特異性T細(xì)胞應(yīng)答的IFN-γELISpot評估結(jié)果。

圖20.示出重復(fù)“加強(qiáng)”疫苗接種刺激了Her-2特異性免疫。(A)示出患者289-003的結(jié)果。(B)示出患者289-004的結(jié)果。EC1、EC2和IC1表示HER2/neu多肽的肽片段。

圖21.(A)轉(zhuǎn)移時(shí)間(TTM)和(B)OSA特異性存活期的Kaplan Meier估計(jì)。

圖22.示出ADXS31-164防止轉(zhuǎn)移性疾病的發(fā)展。(A和B)在卡鉑治療后3周(A)和第三次ADXS31-164疫苗接種后3周(B)采集的胸部放射顯影照片示出右顱側(cè)肺葉預(yù)先存在的轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)大小增加，但在其余的肺葉中轉(zhuǎn)移性疾病不會進(jìn)一步發(fā)展。(C和D)在ICG施用后，肺結(jié)節(jié)的胸腔鏡檢查發(fā)現(xiàn)在近紅外光下發(fā)熒光(C)。在轉(zhuǎn)移灶切除時(shí)移除的外觀總體正常的肺組織示出在近紅外光下的熒光(插圖)(D)。(E和F)(E)肺結(jié)節(jié)和(F)發(fā)熒光正常肺組織的H&E染色組織病理學(xué)示出包裹性肺結(jié)節(jié)(E)和外觀總體正常的肺組織炎癥的局灶性區(qū)域(F)的顯著出血和壞死。(G和H)在低倍(G)和高倍(H)放大率下肺結(jié)節(jié)的免疫組織化學(xué)示出圍繞肺結(jié)節(jié)的CD3+T細(xì)胞以及腫瘤組織內(nèi)的微量CD3+T細(xì)胞。(I和J)在低倍(G)和高倍(H)放大率下外觀正常的肺組織的免疫組織化學(xué)顯示CD3+T細(xì)胞的局灶性積聚。(K)局灶性肺炎的高倍放大率H&E染色示出大異常細(xì)胞，其中有絲分裂象被淋巴細(xì)胞圍繞。(L)肺炎區(qū)域的波形蛋白染色示出大細(xì)胞，其中有絲分裂象被單核細(xì)胞圍繞。

圖23.ADXS31‐164延緩/防止轉(zhuǎn)移性疾病并且延長患有自發(fā)性HER2+骨肉瘤的狗的總體存活期。示出疫苗接種狗與歷史對照組相比的Kaplan‐Meier存活期曲線。對照組由患有HER2+肢體OSA的狗、截肢處理的狗和隨訪化療但未接受ADXS31-164的狗組成。P<0.0001。疫苗接種組：紅線；對照組：黑線。

圖24.示出ADXS31‐164破壞了對HER2/neu的耐受性。在基線、第3次疫苗接種后3周(9周)和2個(gè)月后(17周)收集PBMC，并通過IFN-γELISpot分析對HER2/neu的高度保守IC1域的應(yīng)答。所示的結(jié)果將狗分為早期應(yīng)答者、晚期應(yīng)答者和表觀無應(yīng)答者。NA表示這些狗的17周樣品未經(jīng)評估。

圖25A-D.示出ADXS31-164未對心臟功能造成不利影響。評估每只狗的基線、疫苗接種時(shí)和其后每2個(gè)月的心臟參數(shù)LVID(舒張期)(圖25A)、LVID(收縮期)(圖25B)和縮短分?jǐn)?shù)(圖25C)。在相同的時(shí)間點(diǎn)評估心臟肌鈣蛋白I水平(圖25D)。

圖26.示出ADXS31-164破壞了對HER2/neu的高度保守胞內(nèi)域的免疫耐受性。

應(yīng)當(dāng)理解，為了說明的簡潔和清晰起見，圖中示出的元件未必按比例繪制。例如，為清晰起見，一些元件的尺寸可相對于其他元件放大。另外，在適當(dāng)情況下，附圖標(biāo)號可在圖中重復(fù)用于表示對應(yīng)的或類似的元件。

具體實(shí)施方式

在以下具體實(shí)施方式中，陳述了多個(gè)具體細(xì)節(jié)，以提供對本發(fā)明的透徹理解。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解可在不具有這些具體細(xì)節(jié)的情況下實(shí)施本發(fā)明。在其他情況中，為避免使本發(fā)明復(fù)雜化，未對熟知的方法、工序和組分進(jìn)行詳細(xì)描述。

在一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了用于防止、治療Her2-neu抗原表達(dá)腫瘤和接種所述腫瘤的疫苗，并且誘導(dǎo)對Her2-neu抗原的次優(yōu)勢表位的免疫應(yīng)答，同時(shí)繞開突變回避的組合物和方法。在另一個(gè)實(shí)施例中，繞開突變回避是由于表位擴(kuò)展。在又一個(gè)實(shí)施例中，繞開突變回避是由于抗原的嵌合性質(zhì)。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了包含融合多肽的免疫原性組合物，其中所述融合多肽包含融合至另外的多肽的HER2/neu嵌合抗原，并且其中將融合蛋白施用于患有HER2/neu表達(dá)腫瘤的受試者防止所述腫瘤內(nèi)的逃逸突變。在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了包含免疫原性組合物的重組李斯特菌疫苗株。

在一個(gè)實(shí)施例中，受試者是人受試者。在另一個(gè)實(shí)施例中，人受試者是成人或兒童。在另一個(gè)實(shí)施例中，人受試者是兒童。在另一個(gè)實(shí)施例中，受試者是犬科動物受試者。在另一個(gè)實(shí)施例中，犬科動物是狗。

在一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了引起受試者的對HER2/neu表達(dá)腫瘤生長或癌癥的增強(qiáng)免疫應(yīng)答的方法，該方法包括施用包含編碼融合多肽的核酸的重組李斯特菌的步驟，其中所述融合多肽包含融合至另外的多肽的HER2/neu嵌合抗原。

在一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了防止受試者的HER2/neu表達(dá)腫瘤生長或癌癥的方法，該方法包括施用包含編碼融合多肽的核酸的重組李斯特菌的步驟，其中所述融合多肽包含融合至另外的多肽的HER2/neu嵌合抗原。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了治療受試者的HER2/neu表達(dá)腫瘤生長或癌癥的方法，該方法包括施用包含編碼融合多肽的核酸的重組李斯特菌的步驟，其中所述融合多肽包含融合至另外的多肽的HER2/neu嵌合抗原。

在一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了延長患有HER2/neu表達(dá)腫瘤生長或癌癥的受試者的存活期的方法，該方法包括施用包含編碼融合多肽的核酸的重組李斯特菌的步驟，其中所述融合多肽包含融合至另外的多肽的HER2/neu嵌合抗原。在一個(gè)實(shí)施例中，受試者是人。在另一個(gè)實(shí)施例中，受試者是犬科動物。

在一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了延緩患有HER2/neu表達(dá)腫瘤生長或癌癥的受試者的轉(zhuǎn)移性疾病的方法，該方法包括施用包含編碼融合多肽的核酸的重組李斯特菌的步驟，其中所述融合多肽包含融合至另外的多肽的HER2/neu嵌合抗原。在一個(gè)實(shí)施例中，受試者是人。在另一個(gè)實(shí)施例中，受試者是犬科動物。

在一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了治療受試者的HER2/neu表達(dá)腫瘤生長或癌癥的方法，該方法包括施用包含編碼融合多肽的核酸的重組減毒李斯特菌的步驟，其中所述融合多肽包含融合至另外的多肽的HER2/neu嵌合抗原，其中所述核酸分子包含編碼所述融合多肽的第一開放閱讀框，其中所述核酸分子還包含編碼代謝酶的第二開放閱讀框，并且其中所述代謝酶互補(bǔ)所述重組李斯特菌疫苗株的染色體中突變的內(nèi)源性基因。在另一個(gè)實(shí)施例中，受試者是人。在另一個(gè)實(shí)施例中，人受試者可以是成人或兒童。在另一個(gè)實(shí)施例中，受試者是犬科動物。在另一個(gè)實(shí)施例中，嵌合HER2是犬科動物嵌合HER2。在另一個(gè)實(shí)施例中，嵌合HER2是人嵌合HER2。在另一個(gè)實(shí)施例中，將所述融合多肽施用于所述受試者防止所述腫瘤內(nèi)的逃逸突變。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述人HER2/neu嵌合抗原包含至少5、9、13、14或17個(gè)標(biāo)繪的人MHC I類表位。

在一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了包含核酸分子的重組李斯特菌疫苗株，其中該核酸分子包含編碼多肽的第一開放閱讀框，其中該多肽包含HER2/neu嵌合抗原，其中該核酸分子還包含編碼代謝酶的第二開放閱讀框，并且其中該代謝酶互補(bǔ)重組李斯特菌菌株的染色體中缺乏的內(nèi)源性基因。在另一個(gè)實(shí)施例中，重組李斯特菌疫苗株還包含包括編碼代謝酶的第三開放閱讀框的核酸分子，并且其中該代謝酶互補(bǔ)重組李斯特菌菌株的染色體中缺乏的內(nèi)源性基因。

在一個(gè)實(shí)施例中，核酸分子整合進(jìn)李斯特菌基因組。在另一個(gè)實(shí)施例中，核酸分子在重組李斯特菌疫苗株的質(zhì)粒中。在又一個(gè)實(shí)施例中，質(zhì)粒在不存在抗生素選擇的情況下穩(wěn)定維持在重組李斯特菌疫苗株中。在另一個(gè)實(shí)施例中，質(zhì)粒不賦予重組李斯特菌抗生素抗性。在另一個(gè)實(shí)施例中，重組李斯特菌菌株是減毒的。在另一個(gè)實(shí)施例中，重組李斯特菌是減毒營養(yǎng)缺陷型菌株。在另一個(gè)實(shí)施例中，外源抗原表達(dá)對細(xì)菌諸如本發(fā)明的一種細(xì)菌施加的高代謝負(fù)擔(dān)也是減毒的重要機(jī)制。

在一個(gè)實(shí)施例中，減毒菌株是LmddA。在另一個(gè)實(shí)施例中，該菌株施加強(qiáng)佐劑效應(yīng)，該效應(yīng)是基于李斯特菌的疫苗的固有性質(zhì)。該佐劑效應(yīng)的一個(gè)表現(xiàn)是表達(dá)除嵌合HER2/neu之外的抗原的李斯特菌或ADXS-31-164(表達(dá)嵌合HER2/neu)疫苗導(dǎo)致的腫瘤內(nèi)Treg數(shù)量下降5倍(參見本文的圖5)。在另一個(gè)實(shí)施例中，表達(dá)不同抗原(HPV16E7)的LmddA載體還與腫瘤中Treg的頻率顯著下降相關(guān)，很可能是由于先天免疫應(yīng)答的結(jié)果。

在一個(gè)實(shí)施例中，本文提供的減毒營養(yǎng)缺陷型李斯特菌疫苗株是ADXS-31-164菌株。ADXADXS-31-164基于李斯特菌疫苗載體，該載體由于毒性基因actA的缺失而減毒，并且由于dal基因的互補(bǔ)而維持用于HER2/neu的體內(nèi)和體外表達(dá)的質(zhì)粒。在一個(gè)實(shí)施例中，ADXS31-164表達(dá)和分泌融合至李斯特菌溶血素O(LLO)的前441個(gè)氨基酸的嵌合HER2/neu蛋白，在另一個(gè)實(shí)施例中，李斯特菌溶血素O是截短的非溶血LLO。在另一個(gè)實(shí)施例中，ADXS31-164發(fā)揮強(qiáng)烈的和抗原特異性的抗腫瘤應(yīng)答，在轉(zhuǎn)基因動物中能夠破壞對HER2/neu的耐受性(參見實(shí)例，圖24)。在另一個(gè)實(shí)施例中，ADXS31-164菌株是高度減毒的，并且具有比前一代李斯特菌疫苗更高的安全譜，因?yàn)樗芨杆俚貜拿庖咝∈蟮钠⑴K清除。在另一個(gè)實(shí)施例中，ADXS31-164使轉(zhuǎn)基因動物中的腫瘤發(fā)病延緩期比Lm-LLO-ChHer2(該疫苗的抗生素抗性和毒性更強(qiáng)的形式)更長(參見圖3)。在另一個(gè)實(shí)施例中，ADXS31-164菌株具有高度免疫原性，能夠破壞對HER2/neu自體抗原的耐受性，并且防止HER2/neu轉(zhuǎn)基因動物中的腫瘤形成。在另一個(gè)實(shí)施例中，ADXS31-164使腫瘤內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)顯著減少。在另一個(gè)實(shí)施例中，LmddA疫苗處理的腫瘤中Treg頻率的下降使腫瘤內(nèi)CD8/Treg比率升高，暗示在LmddA疫苗免疫后可獲得更有利的腫瘤微環(huán)境。在另一個(gè)實(shí)施例中，該嵌合抗原的使用不產(chǎn)生逃逸突變，表明腫瘤的突變不會遠(yuǎn)離對使用該新型抗原進(jìn)行治療的治療有效應(yīng)答(參見實(shí)例6)。在另一個(gè)實(shí)施例中，ADXS31-164的外周免疫延緩了腦中轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞系的生長(參見實(shí)例7)。在另一個(gè)實(shí)施例中，與未接受ADXS31-164疫苗接種的對照受試者相比，將包括截肢、化療和ADXS31-164疫苗接種的治療提供給患有骨肉瘤犬科動物受試者延長了存活期(參見實(shí)例9和10)。在另一個(gè)實(shí)施例中，與未接受ADXS31-164疫苗接種的對照受試者相比，將包括截肢、化療和ADXS31-164疫苗接種的治療提供給患有骨肉瘤的犬科動物受試者顯示出轉(zhuǎn)移減少(參見實(shí)例10)。在另一個(gè)實(shí)施例中，與未接受ADXS31-164疫苗接種的對照受試者相比，將包括截肢、化療和ADXS31-164疫苗接種的治療提供給患有骨肉瘤的犬科動物受試者顯示出所誘導(dǎo)的特異性T細(xì)胞應(yīng)答增強(qiáng)(參見實(shí)例10)。

在一個(gè)實(shí)施例中，Lm-LLO-ChHer2菌株是Lm-LLO-138，并且包含從質(zhì)粒表達(dá)的抗生素抗性基因和prfA基因。

在一個(gè)實(shí)施例中，將重組減毒的表達(dá)嵌合抗原的無抗生素李斯特菌用于防止和治療癌癥或?qū)嶓w腫瘤，如本文所舉例說明。在另一個(gè)實(shí)施例中，腫瘤是HER2/neu陽性腫瘤。在另一個(gè)實(shí)施例中，癌癥是HER2/neu表達(dá)癌癥。在另一個(gè)實(shí)施例中，癌癥是乳腺癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)癌癥、頭頸癌、骨肉瘤(OSA)、犬科動物骨肉瘤、尤因氏肉瘤(ES)或本領(lǐng)域已知的任何HER2/neu表達(dá)癌癥。在另一個(gè)實(shí)施例中，犬科動物骨肉瘤是肢體骨肉瘤。在另一個(gè)實(shí)施例中，腫瘤是骨肉瘤、乳腺腫瘤、頭頸部腫瘤或本領(lǐng)域已知的任何其他抗原表達(dá)腫瘤。在另一個(gè)實(shí)施例中，本文所述的癌癥或?qū)嶓w腫瘤是復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性疾病的結(jié)果。

在另一個(gè)實(shí)施例中，表達(dá)嵌合HER2/neu的重組李斯特菌可用作治療HER2/neu過表達(dá)實(shí)體腫瘤的治療性疫苗。在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供的HER2/neu嵌合抗原可用于治療HER2/neu表達(dá)腫瘤和防止該腫瘤的逃逸突變。在另一個(gè)實(shí)施例中，術(shù)語“逃逸突變”是指遠(yuǎn)離對治療的治療有效應(yīng)答的腫瘤突變。

在一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了包含編碼本文提供的重組多肽的第一開放閱讀框的核酸分子，其中核酸分子駐留在重組李斯特菌疫苗株內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施例中，將本文提供的核酸分子用于轉(zhuǎn)化李斯特菌，以獲得重組李斯特菌。在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供的核酸缺乏毒性基因。在另一個(gè)實(shí)施例中，整合進(jìn)李斯特菌基因組的核酸分子攜帶無功能的毒性基因。在另一個(gè)實(shí)施例中，毒性基因在重組李斯特菌的基因組中是突變的。在又一個(gè)實(shí)施例中，核酸分子用于使李斯特菌基因組中存在的內(nèi)源性基因失活。在又一個(gè)實(shí)施例中，毒性基因是actA基因。在另一個(gè)實(shí)施例中，毒性基因是prfA基因。技術(shù)人員將會理解，毒性基因可以是本領(lǐng)域已知的與重組李斯特菌中的毒性相關(guān)的任何基因。

在一個(gè)實(shí)施例中，本文提供的代謝基因、毒性基因等是李斯特菌菌株的染色體缺乏的。在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供的代謝基因、毒性基因等是李斯特菌菌株的染色體和任何游離體遺傳因子缺乏的。技術(shù)人員將會理解，術(shù)語“游離體”、“游離體的”等是指不整合進(jìn)本文提供的李斯特菌的染色體中的質(zhì)粒載體或其用途。在另一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語是指整合進(jìn)本文提供的李斯特菌的染色體中的質(zhì)粒載體。在另一個(gè)實(shí)施例中，代謝基因、毒性基因等是毒性菌株的基因組缺乏的。在一個(gè)實(shí)施例中，毒性基因在染色體中是突變的。在另一個(gè)實(shí)施例中，毒性基因是染色體缺失的。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供的核酸和質(zhì)粒不賦予本文提供的重組李斯特菌抗生素抗性。

在一個(gè)實(shí)施例中，本文提供的核酸分子包括質(zhì)粒。在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供的核酸分子是質(zhì)粒。在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供的質(zhì)粒是整合載體。在另一個(gè)實(shí)施例中，質(zhì)粒是非整合載體。在另一個(gè)實(shí)施例中，質(zhì)粒包括整合載體。在另一個(gè)實(shí)施例中，整合載體是位點(diǎn)特異性整合載體。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法和組合物的核酸分子由本領(lǐng)域已知的任何類型的核苷酸構(gòu)成。

技術(shù)人員將會理解，術(shù)語“代謝酶”可涵蓋宿主細(xì)菌所需的營養(yǎng)物質(zhì)的合成中涉及的酶。在另一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語是指宿主細(xì)菌所需的營養(yǎng)物質(zhì)的合成所需的酶。在另一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語是指宿主細(xì)菌利用的營養(yǎng)物質(zhì)的合成中涉及的酶。在另一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語是指宿主細(xì)菌的持續(xù)生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)的合成中涉及的酶。在另一個(gè)實(shí)施例中，酶是營養(yǎng)物質(zhì)的合成所需的。每種可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施例。

技術(shù)人員將會理解，術(shù)語“穩(wěn)定維持”可涵蓋在不存在選擇(如，抗生素選擇)的情況下使核酸分子或質(zhì)粒維持在宿主細(xì)胞或細(xì)菌中10代而不產(chǎn)生可檢測的損失。在另一個(gè)實(shí)施例中，該周期是15代。在另一個(gè)實(shí)施例中，該周期是20代。在另一個(gè)實(shí)施例中，該周期是25代。在另一個(gè)實(shí)施例中，該周期是30代。在另一個(gè)實(shí)施例中，該周期是40代。在另一個(gè)實(shí)施例中，該周期是50代。在另一個(gè)實(shí)施例中，該周期是60代。在另一個(gè)實(shí)施例中，該周期是80代。在另一個(gè)實(shí)施例中，該周期是100代。在另一個(gè)實(shí)施例中，該周期是150代。在另一個(gè)實(shí)施例中，該周期是200代。在另一個(gè)實(shí)施例中，該周期是300代。在另一個(gè)實(shí)施例中，該周期是500代。在另一個(gè)實(shí)施例中，該周期是更多代。在另一個(gè)實(shí)施例中，核酸分子或質(zhì)粒在體外(如，在培養(yǎng)中)穩(wěn)定維持。在另一個(gè)實(shí)施例中，核酸分子或質(zhì)粒在體內(nèi)穩(wěn)定維持。在另一個(gè)實(shí)施例中，核酸分子或質(zhì)粒既在體外也在體內(nèi)穩(wěn)定維持。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供表達(dá)該抗原的重組李斯特菌菌株。本發(fā)明還提供包含融合至HER2嵌合蛋白或其片段的李斯特菌溶血素(LLO)蛋白片段的重組多肽，包含該重組多肽的疫苗和免疫原性組合物，以及誘導(dǎo)抗HER2免疫應(yīng)答和治療HER2表達(dá)腫瘤及接種包含該重組多肽的疫苗的方法。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的重組李斯特菌菌株已在動物宿主中傳代。在另一個(gè)實(shí)施例中，該傳代使作為疫苗載體的菌株的功效最大化。在另一個(gè)實(shí)施例中，該傳代穩(wěn)定李斯特菌菌株的免疫原性。在另一個(gè)實(shí)施例中，該傳代穩(wěn)定李斯特菌菌株的毒性。在另一個(gè)實(shí)施例中，該傳代增加李斯特菌菌株的免疫原性。在另一個(gè)實(shí)施例中，該傳代增加李斯特菌菌株的毒性。在另一個(gè)實(shí)施例中，該傳代移除李斯特菌菌株的不穩(wěn)定亞株。在另一個(gè)實(shí)施例中，該傳代減少李斯特菌菌株的不穩(wěn)定亞株的流行。在另一個(gè)實(shí)施例中，李斯特菌菌株包含編碼含抗原重組肽的基因的基因組插入。在另一個(gè)實(shí)施例中，李斯特菌菌株攜帶包含編碼含抗原重組肽的基因的質(zhì)粒。在另一個(gè)實(shí)施例中，該傳代通過本領(lǐng)域已知的任何其他方法進(jìn)行。

在一個(gè)實(shí)施例中，本文提供的重組多肽包含本文提供的融合蛋白。在另一個(gè)實(shí)施例中，重組多肽是融合蛋白。在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供的融合蛋白包含嵌合HER2抗原和選自：a)非溶血LLO蛋白或N-末端片段、b)PEST序列或c)ActA片段的另外的多肽，另外其中所述另外的多肽融合至HER2/neu嵌合抗原。在另一個(gè)實(shí)施例中，另外的多肽是有功能的。在另一個(gè)實(shí)施例中，另外的多肽的片段具有免疫原性。在另一個(gè)實(shí)施例中，另外的多肽具有免疫原性。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供的融合蛋白包含融合至本文提供的HER2/neu嵌合抗原的非溶血LLO蛋白或N-末端片段。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法和組合物的融合蛋白包含來自李斯特菌生物體的ActA序列。ActA蛋白及其片段以類似于LLO的方式增強(qiáng)抗原呈遞和免疫。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法和組合物的融合蛋白包含來自李斯特菌生物體的截短的ActA序列。在另一個(gè)實(shí)施例中，截短的ActA由野生型ActA蛋白的前390個(gè)氨基酸組成，如美國專利No.7,655,238中所述，該專利全文以引用的方式并入本文。在另一個(gè)實(shí)施例中，截短的ActA是ActA-N100或其修飾型式(稱為ActA-N100*)，其中PEST基序缺失，并且包含非保守的QDNKR置換，如美國專利公布No.2014/0186387中所述。ActA蛋白及其片段以類似于LLO的方式增強(qiáng)抗原呈遞和免疫。

在本發(fā)明的方法和組合物的另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供的融合蛋白包含HER2/neu抗原和另外的多肽。在一個(gè)實(shí)施例中，另外的多肽是非溶血LLO蛋白或其片段(本文的實(shí)例)。在另一個(gè)實(shí)施例中，另外的多肽是PEST序列。在另一個(gè)實(shí)施例中，另外的多肽是ActA蛋白或其片段。ActA蛋白及其片段以類似于LLO的方式增強(qiáng)抗原呈遞和免疫。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法和組合物的另外的多肽是李斯特菌溶血素(LLO)肽。在另一個(gè)實(shí)施例中，另外的多肽是ActA肽。在另一個(gè)實(shí)施例中，另外的多肽是PEST序列肽。在另一個(gè)實(shí)施例中，另外的多肽是能夠增強(qiáng)抗原肽的免疫原性的任何其他肽。每種可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施例。

包含HER2/neu嵌合抗原的融合蛋白可通過任何合適的方法制備，包括例如克隆和適當(dāng)序列的限制或通過下文討論的方法直接化學(xué)合成?；蛘?，可克隆子序列并使用適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖懈钸m當(dāng)?shù)淖有蛄?。然后可連接片段以制備所需的DNA序列。在一個(gè)實(shí)施例中，編碼本文提供的抗原的DNA可使用DNA擴(kuò)增法例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)制備。首先，在天然DNA片段的新末端的任一側(cè)單獨(dú)擴(kuò)增。一個(gè)擴(kuò)增的序列的5'末端編碼肽接頭，而另一個(gè)擴(kuò)增的序列的3'末端也編碼肽接頭。由于第一片段的5'末端與第二片段的3'末端互補(bǔ)，兩個(gè)片段(在部分純化后，如在LMP瓊脂糖上)可在第三PCR反應(yīng)中用作重疊模板。擴(kuò)增的序列將包含密碼子、開口位點(diǎn)羧基側(cè)上的片段(現(xiàn)在形成氨基序列)、接頭和開口位點(diǎn)氨基側(cè)上的序列(現(xiàn)在形成羧基序列)。在另一個(gè)實(shí)施例中，將抗原連接至質(zhì)粒。每種方法表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施例。

本發(fā)明的結(jié)果表明，本發(fā)明的組合物的施用可用于誘導(dǎo)識別和殺死腫瘤細(xì)胞的抗原特異性T細(xì)胞(如，細(xì)胞毒性T細(xì)胞)的形成(本文的實(shí)例)。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供包含融合至HER2嵌合蛋白或融合至其片段的LLO蛋白的N-末端片段的重組多肽。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供由融合至HER2嵌合蛋白或融合至其片段的LLO蛋白的N-末端片段組成的重組多肽。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法和組合物的HER2嵌合蛋白是人HER2嵌合蛋白。在另一個(gè)實(shí)施例中，HER2嵌合蛋白是小鼠HER2嵌合蛋白。在另一個(gè)實(shí)施例中，HER2嵌合蛋白是大鼠HER2嵌合蛋白。在另一個(gè)實(shí)施例中，HER2嵌合蛋白是靈長類HER2嵌合蛋白。在另一個(gè)實(shí)施例中，HER2嵌合蛋白是犬科動物HER2嵌合蛋白。在另一個(gè)實(shí)施例中，Her-2蛋白是本領(lǐng)域已知的人或任何其他動物物種的HER2嵌合蛋白或它們的組合。每種可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施例。

在另一個(gè)實(shí)施例中，Her-2蛋白是稱為“HER2/neu”、“Erbb2”、“v-erb-b2”、“c-erb-b2”、“neu”或“cNeu”的蛋白。在另一個(gè)實(shí)施例中，HER2/neu在本文中也稱為“Her-2”、“Her-2蛋白”、“HER2蛋白”或“HER2”。

在一個(gè)實(shí)施例中，本文提供的Her2-neu嵌合蛋白具有HER2/neu抗原的兩個(gè)胞外片段和一個(gè)胞內(nèi)片段，該抗原示出癌基因的MHC I類表位簇，而在另一個(gè)實(shí)施例中，嵌合蛋白具有3個(gè)H2Dq和至少17個(gè)HER2/neu抗原的標(biāo)繪的人MHC I類表位(片段EC1、EC2和IC1)(參見圖1A)。在另一個(gè)實(shí)施例中，嵌合蛋白具有至少13個(gè)標(biāo)繪的人MHC I類表位(片段EC2和IC1)。在另一個(gè)實(shí)施例中，嵌合蛋白具有至少14個(gè)標(biāo)繪的人MHC I類表位(片段EC1和IC1)。在另一個(gè)實(shí)施例中，嵌合蛋白具有至少9個(gè)標(biāo)繪的人MHC I類表位(片段EC1和IC2)。在另一個(gè)實(shí)施例中，Her2-neu嵌合蛋白融合至非溶血李斯特菌溶血素O(LLO)。在另一個(gè)實(shí)施例中，Her2-neu嵌合蛋白融合至截短的李斯特菌溶血素O(tLLO)。在另一個(gè)實(shí)施例中，Her2-neu嵌合蛋白融合至單核細(xì)胞增多性李斯特菌李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白的前441個(gè)氨基酸，并且由單核細(xì)胞增多性李斯特菌減毒營養(yǎng)缺陷型菌株LmddA表達(dá)和分泌。在另一個(gè)實(shí)施例中，來自本文提供的減毒營養(yǎng)缺陷型菌株(表達(dá)嵌合HER2/neu抗原/LLO融合蛋白)的融合蛋白tLLO-ChHer2的表達(dá)和分泌與體外生長8小時(shí)后TCA沉淀細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Lm-LLO-ChHer2的表達(dá)和分泌相當(dāng)(參見圖1B)。

在一個(gè)實(shí)施例中，在未暴露的動物(animal)或不相關(guān)李斯特菌疫苗注射的小鼠中未檢測到CTL活性(參見圖2A)。而在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供的減毒營養(yǎng)缺陷型菌株(ADXS31-164)能夠通過野生型FVB/N小鼠的脾細(xì)胞刺激IFN-γ的分泌(圖2B)。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供的方法和組合物的代謝酶是氨基酸代謝酶，而在另一個(gè)實(shí)施例中，代謝酶是丙氨酸消旋酶。在另一個(gè)實(shí)施例中，代謝酶是D-氨基酸轉(zhuǎn)移酶。在另一個(gè)實(shí)施例中，代謝酶催化用于重組李斯特菌菌株中的細(xì)胞壁合成的氨基酸的形成，而在另一個(gè)實(shí)施例中，代謝酶是丙氨酸消旋酶。

在另一個(gè)實(shí)施例中，編碼該代謝酶的基因在李斯特菌p60啟動子的控制下表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施例中，使用inlA(編碼內(nèi)化素)啟動子。在另一個(gè)實(shí)施例中，使用hly啟動子。在另一個(gè)實(shí)施例中，使用ActA啟動子。在另一個(gè)實(shí)施例中，整合酶基因在任何其他革蘭氏陽性啟動子的控制下表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施例中，編碼代謝酶的基因在李斯特菌中發(fā)揮功能的任何其他啟動子的控制下表達(dá)。技術(shù)人員將會知道，其他啟動子或多順反子表達(dá)盒可用于驅(qū)動基因的表達(dá)。每種可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施例。

在另一個(gè)實(shí)施例中，HER2/neu嵌合蛋白由以下SEQ ID NO:1示出的核酸序列編碼

gagacccacctggacatgctccgccacctctaccagggctgccaggtggtgcagggaaacctggaactcacctacctgcccaccaatgccagcctgtccttcctgcaggatatccaggaggtgcagggctacgtgctcatcgctcacaaccaagtgaggcaggtcccactgcagaggctgcggattgtgcgaggcacccagctctttgaggacaactatgccctggccgtgctagacaatggagacccgctgaacaataccacccctgtcacaggggcctccccaggaggcctgcgggagctgcagcttcgaagcctcacagagatcttgaaaggaggggtcttgatccagcggaacccccagctctgctaccaggacacgattttgtggaagaatatccaggagtttgctggctgcaagaagatctttgggagcctggcatttctgccggagagctttgatggggacccagcctccaacactgccccgctccagccagagcagctccaagtgtttgagactctggaagagatcacaggttacctatacatctcagcatggccggacagcctgcctgacctcagcgtcttccagaacctgcaagtaatccggggacgaattctgcacaatggcgcctactcgctgaccctgcaagggctgggcatcagctggctggggctgcgctcactgagggaactgggcagtggactggccctcatccaccataacacccacctctgcttcgtgcacacggtgccctgggaccagctctttcggaacccgcaccaagctctgctccacactgccaaccggccagaggacgagtgtgtgggcgagggcctggcctgccaccagctgtgcgcccgagggcagcagaagatccggaagtacacgatgcggagactgctgcaggaaacggagctggtggagccgctgacacctagcggagcgatgcccaaccaggcgcagatgcggatcctgaaagagacggagctgaggaaggtgaaggtgcttggatctggcgcttttggcacagtctacaagggcatctggatccctgatggggagaatgtgaaaattccagtggccatcaaagtgttgagggaaaacacatcccccaaagccaacaaagaaatcttagacgaagcatacgtgatggctggtgtgggctccccatatgtctcccgccttctgggcatctgcctgacatccacggtgcagctggtgacacagcttatgccctatggctgcctcttagactaa(SEQ ID NO:1)。

在另一個(gè)實(shí)施例中，HER2/neu嵌合蛋白包含SEQ ID NO:2的序列：

E T H L D M L R H L Y Q G C Q V V Q G N L E L T Y L P T N A S L S F L Q D I Q E V Q G Y V L I A H N Q V R Q V P L Q R L R I V R G T Q L F E D N Y A L A V L D N G D P L N N T T P V T G A S P G G L R E L Q L R S L T E I L K G G V L I Q R N P Q L C Y Q D T I L W K N I Q E F A G C K K I F G S L A F L P E S F D G D P A S N T AP L Q P E Q L Q V F E T L E E I T G Y L Y I S AW P D S L P D L S V F Q N L Q V I R G R I L H N G A Y S L T L Q G L G I S W L G L R S L R E L G S G L A L I H H N T H L C F V H T V P W D Q L F R N P H Q A L L H T A N R P E D E C V G E G L A C H Q L C A R G Q Q K I R K Y T M R R L L Q E T E L V E P L T P S G A M P N Q A Q M R I L K E T E L R K V K V L G S G A F G T V Y K G I W I P D G E N V K I P V A I K V L R E N T S P K A N K E I L D E A Y V M A G V G S P Y V S R L L G I C L T S T V Q L V T Q L M P Y G C L L D(SEQ ID NO:2)。

下表1分別示出人和犬科動物Her-2EC和IC片段的氨基酸序列之間的百分比(％)同一性。

表1

在另一個(gè)實(shí)施例中，編碼人HER2/EC1片段的氨基酸序列在(SEQ ID NO:69)：SLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCK(SEQ ID NO:69)中示出。

在另一個(gè)實(shí)施例中，編碼犬科動物her2/neu EC1片段的氨基酸序列在(SEQ ID NO:70)：

SLSFLQDIQEVQGYVLIAHSQVRQIPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLEGGIPAPGAAPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRSPQLCHQDTILWKDVFHKNNQLALTLIDTNRSRACPPCSPACK(SEQ ID NO:70)中示出。

在另一個(gè)實(shí)施例中，編碼人HER2/neu EC2片段的氨基酸序列在(SEQ ID NO:71)：

TAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGS(SEQ ID NO:71)中示出。

在另一個(gè)實(shí)施例中，編碼犬科動物her2/neu EC2片段的氨基酸序列在(SEQ ID NO:72)：

TAPLQPEQLRVFEALEEITGYLYISAWPDSLPNLSVFQNLRVIRGRVLHDGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGS(SEQ ID NO:72)中示出。

在另一個(gè)實(shí)施例中，編碼人HER2/neu IC1片段的氨基酸序列在(SEQ ID NO:73)：

NQAQMRILKETELRKVKVLGSGAFGTVYKGIWIPDGENVKIPVAIKVLRENTSPKANKEILDEAYVMAGVGSPYVSRLLGICLTSTVQLVTQLMPYGCLLDHVRENRGRLGSQDLLNWCMQIAKGMSYLED(SEQ ID NO:73)中示出。

在另一個(gè)實(shí)施例中，編碼犬科動物her2/neu IC1片段的氨基酸序列在(SEQ ID NO:74)：

NQAQMRILKETELRKVKVLGSGAFGTVYKGIWIPDGENVKIPVAIKVLRENTSPKANKEILDEAYVMAGVGSPYVSRLLGICLTSTVQLVTQLMPYGCLLDHVRENRGRLGSQDLLNWCMQIAKGMSYLED(SEQ ID NO:74)中示出。在一個(gè)實(shí)施例中，人HER2EC1片段的氨基酸序列(SEQ ID NO:69)與犬科動物HER2EC1片段的氨基酸序列(SEQ ID NO:70)具有89％的同一性。在另一個(gè)實(shí)施例中，人HER2EC2片段的氨基酸序列(SEQ ID NO:71)與犬科動物HER2EC2片段的氨基酸序列(SEQ ID NO:72)具有93％的同一性。在另一個(gè)實(shí)施例中，人HER2IC1片段的氨基酸序列(SEQ ID NO:73)與犬科動物HER2IC1片段的氨基酸序列(SEQ ID NO:74)具有98％的同一性。

在一個(gè)實(shí)施例中，本文提供的方法和組合物的HER2嵌合蛋白或其片段不包括其信號序列。在另一個(gè)實(shí)施例中，由于信號序列的高疏水性，信號序列的省去使HER2片段能夠在李斯特菌中成功表達(dá)。每種可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施例。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法和組合物的HER2嵌合蛋白的片段不包括其跨膜域(TM)。在一個(gè)實(shí)施例中，由于TM的高疏水性，TM的省去使HER2片段能夠在李斯特菌中成功表達(dá)。每種可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施例。

在一個(gè)實(shí)施例中，編碼大鼠HER2/neu基因的核酸序列包含SEQ ID NO:45：CCGGAATCGCGGGCACCCAAGTGTGTACCGGCACAGACATGAAGTTGCGGCTCCCTGCCAGTCCTGAGACCCACCTGGACATGCTCCGCCACCTGTACCAGGGCTGTCAGGTAGTGCAGGGCAACTTGGAGCTTACCTACGTGCCTGCCAATGCCAGCCTCTCATTCCTGCAGGACATCCAGGAAGTTCAGGGTTACATGCTCATCGCTCACAACCAGGTGAAGCGCGTCCCACTGCAAAGGCTGCGCATCGTGAGAGGGACCCAGCTCTTTGAGGACAAGTATGCCCTGGCTGTGCTAGACAACCGAGATCCTCAGGACAATGTCGCCGCCTCCACCCCAGGCAGAACCCCAGAGGGGCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGTCTCACAGAGATCCTGAAGGGAGGAGTTTTGATCCGTGGGAACCCTCAGCTCTGCTACCAGGACATGGTTTTGTGGAAGGACGTCTTCCGCAAGAATAACCAACTGGCTCCTGTCGATATAGACACCAATCGTTCCCGGGCCTGTCCACCTTGTGCCCCCGCCTGCAAAGACAATCACTGTTGGGGTGAGAGTCCGGAAGACTGTCAGATCTTGACTGGCACCATCTGTACCAGTGGTTGTGCCCGGTGCAAGGGCCGGCTGCCCACTGACTGCTGCCATGAGCAGTGTGCCGCAGGCTGCACGGGCCCCAAGCATTCTGACTGCCTGGCCTGCCTCCACTTCAATCATAGTGGTATCTGTGAGCTGCACTGCCCAGCCCTCGTCACCTACAACACAGACACCTTTGAGTCCATGCACAACCCTGAGGGTCGCTACACCTTTGGTGCCAGCTGCGTGACCACCTGCCCCTACAACTACCTGTCTACGGAAGTGGGATCCTGCACTCTGGTGTGTCCCCCGAATAACCAAGAGGTCACAGCTGAGGACGGAACACAGCGTTGTGAGAAATGCAGCAAGCCCTGTGCTCGAGTGTGCTATGGTCTGGGCATGGAGCACCTTCGAGGGGCGAGGGCCATCACCAGTGACAATGTCCAGGAGTTTGATGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTTTGCCGGAGAGCTTTGATGGGGACCCCTCCTCCGGCATTGCTCCGCTGAGGCCTGAGCAGCTCCAAGTGTTCGAAACCCTGGAGGAGATCACAGGTTACCTGTACATCTCAGCATGGCCAGACAGTCTCCGTGACCTCAGTGTCTTCCAGAACCTTCGAATCATTCGGGGACGGATTCTCCACGATGGCGCGTACTCATTGACACTGCAAGGCCTGGGGATCCACTCGCTGGGGCTGCGCTCACTGCGGGAGCTGGGCAGTGGATTGGCTCTGATTCACCGCAACGCCCATCTCTGCTTTGTACACACTGTACCTTGGGACCAGCTCTTCCGGAACCCACATCAGGCCCTGCTCCACAGTGGGAACCGGCCGGAAGAGGATTGTGGTCTCGAGGGCTTGGTCTGTAACTCACTGTGTGCCCACGGGCACTGCTGGGGGCCAGGGCCCACCCAGTGTGTCAACTGCAGTCATTTCCTTCGGGGCCAGGAGTGTGTGGAGGAGTGCCGAGTATGGAAGGGGCTCCCCCGGGAGTATGTGAGTGACAAGCGCTGTCTGCCGTGTCACCCCGAGTGTCAGCCTCAAAACAGCTCAGAGACCTGCTTTGGATCGGAGGCTGATCAGTGTGCAGCCTGCGCCCACTACAAGGACTCGTCCTCCTGTGTGGCTCGCTGCCCCAGTGGTGTGAAACCGGACCTCTCCTACATGCCCATCTGGAAGTACCCGGATGAGGAGGGCATATGCCAGCCGTGCCCCATCAACTGCACCCACTCCTGTGTGGATCTGGATGAACGAGGCTGCCCAGCAGAGCAGAGAGCCAGCCCGGTGACATTCATCATTGCAACTGTAGTGGGCGTCCTGCTGTTCCTGATCTTAGTGGTGGTCGTTGGAATCCTAATCAAACGAAGGAGACAGAAGATCCGGAAGTATACGATGCGTAGGCTGCTGCAGGAAACTGAGTTAGTGGAGCCGCTGACGCCCAGCGGAGCAATGCCCAACCAGGCTCAGATGCGGATCCTAAAAGAGACGGAGCTAAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCAGGAGCTTTTGGCACTGTCTACAAGGGCATCTGGATCCCAGATGGGGAGAATGTGAAAATCCCCGTGGCTATCAAGGTGTTGAGAGAAAACACATCTCCTAAAGCCAACAAAGAAATTCTAGATGAAGCGTATGTGATGGCTGGTGTGGGTTCTCCGTATGTGTCCCGCCTCCTGGGCATCTGCCTGACATCCACAGTACAGCTGGTGACACAGCTTATGCCCTACGGCTGCCTTCTGGACCATGTCCGAGAACACCGAGGTCGCCTAGGCTCCCAGGACCTGCTCAACTGGTGTGTTCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGACGTGCGGCTTGTACACAGGGACCTGGCTGCCCGGAATGTGCTAGTCAAGAGTCCCAACCACGTCAAGATTACAGATTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGATGAGACAGAGTACCATGCAGATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAATGGATGGCATTGGAATCTATTCTCAGACGCCGGTTCACCCATCAGAGTGATGTGTGGAGCTATGGAGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGGCCAAACCTTACGATGGAATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGATTTGCTGGAGAAGGGAGAACGCCTACCTCAGCCTCCAATCTGCACCATTGATGTCTACATGATTATGGTCAAATGTTGGATGATTGACTCTGAATGTCGCCCGAGATTCCGGGAGTTGGTGTCAGAATTTTCACGTATGGCGAGGGACCCCCAGCGTTTTGTGGTCATCCAGAACGAGGACTTGGGCCCATCCAGCCCCATGGACAGTACCTTCTACCGTTCACTGCTGGAAGATGATGACATGGGTGACCTGGTAGACGCTGAAGAGTATCTGGTGCCCCAGCAGGGATTCTTCTCCCCGGACCCTACCCCAGGCACTGGGAGCACAGCCCATAGAAGGCACCGCAGCTCGTCCACCAGGAGTGGAGGTGGTGAGCTGACACTGGGCCTGGAGCCCTCGGAAGAAGGGCCCCCCAGATCTCCACTGGCTCCCTCGGAAGGGGCTGGCTCCGATGTGTTTGATGGTGACCTGGCAATGGGGGTAACCAAAGGGCTGCAGAGCCTCTCTCCACATGACCTCAGCCCTCTACAGCGGTACAGCGAGGACCCCACATTACCTCTGCCCCCCGAGACTGATGGCTATGTTGCTCCCCTGGCCTGCAGCCCCCAGCCCGAGTATGTGAACCAATCAGAGGTTCAGCCTCAGCCTCCTTTAACCCCAGAGGGTCCTCTGCCTCCTGTCCGGCCTGCTGGTGCTACTCTAGAAAGACCCAAGACTCTCTCTCCTGGGAAGAATGGGGTTGTCAAAGACGTTTTTGCCTTCGGGGGTGCTGTGGAGAACCCTGAATACTTAGTACCGAGAGAAGGCACTGCCTCTCCGCCCCACCCTTCTCCTGCCTTCAGCCCAGCCTTTGACAACCTCTATTACTGGGACCAGAACTCATCGGAGCAGGGGCCTCCACCAAGTAACTTTGAAGGGACCCCCACTGCAGAGAACCCTGAGTACCTAGGCCTGGATGTACCTGTA(SEQ ID NO:45)。

在一個(gè)實(shí)施例中，編碼大鼠HER2/neu EC1片段的核酸序列包含SEQ ID NO:46：

CCCAGGCAGAACCCCAGAGGGGCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGTCTCACAGAGATCCTGAAGGGAGGAGTTTTGATCCGTGGGAACCCTCAGCTCTGCTACCAGGACATGGTTTTGTGGAAGGACGTCTTCCGCAAGAATAACCAACTGGCTCCTGTCGATATAGACACCAATCGTTCCCGGGCCTGTCCACCTTGTGCCCCCGCCTGCAAAGACAATCACTGTTGGGGTGAGAGTCCGGAAGACTGTCAGATCTTGACTGGCACCATCTGTACCAGTGGTTGTGCCCGGTGCAAGGGCCGGCTGCCCACTGACTGCTGCCATGAGCAGTGTGCCGCAGGCTGCACGGGCCCCAAGCA(SEQ ID NO:46)。

在另一個(gè)實(shí)施例中，編碼大鼠HER2/neu EC2片段的核酸序列包含SEQ ID NO:47：

GGTCACAGCTGAGGACGGAACACAGCGTTGTGAGAAATGCAGCAAGCCCTGTGCTCGAGTGTGCTATGGTCTGGGCATGGAGCACCTTCGAGGGGCGAGGGCCATCACCAGTGACAATGTCCAGGAGTTTGATGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTTTGCCGGAGAGCTTTGATGGGGACCCCTCCTCCGGCATTGCTCCGCTGAGGCCTGAGCAGCTCCAAGTGTTCGAAACCCTGGAGGAGATCACAGGTTACCTGTACATCTCAGCATGGCCAGACAGTCTCCGTGACCTCAGTGTCTTCCAGAACCTTCGAATCATTCGGGGACGGATTCTCCACGATGGCGCGTACTCATTGACACTGCAAGGCCTGGGGATCCACTCGCTGGGGCTGCGCTCACTGCGGGAGCTGGGCAGTGGATTGGCTCTGATTCACCGCAACGCCCATCTCTGCTTTGTACACACTGTACCTTGGGACCAGCTCTTCCGGAACCCACATCAGGCCCTGCTCCACAGTGGGAACCGGCCGGAAGAGGATTGTGGTCTCGAGGGCTTGGTCTGTAACTCACTGTGTGCCCACGGGCACTGCTGGGGGCCAGGGCCCACCCA(SEQ ID NO:47)。

在另一個(gè)實(shí)施例中，編碼大鼠HER2/neu IC1片段的核酸序列包含SEQ ID NO:48：

CGCCCAGCGGAGCAATGCCCAACCAGGCTCAGATGCGGATCCTAAAAGAGACGGAGCTAAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCAGGAGCTTTTGGCACTGTCTACAAGGGCATCTGGATCCCAGATGGGGAGAATGTGAAAATCCCCGTGGCTATCAAGGTGTTGAGAGAAAACACATCTCCTAAAGCCAACAAAGAAATTCTAGATGAAGCGTATGTGATGGCTGGTGTGGGTTCTCCGTATGTGTCCCGCCTCCTGGGCATCTGCCTGACATCCACAGTACAGCTGGTGACACAGCTTATGCCCTACGGCTGCCTTCTGGACCATGTCCGAGAACACCGAGGTCGCCTAGGCTCCCAGGACCTGCTCAACTGGTGTGTTCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGACGTGCGGCTTGTACACAGGGACCTGGCTGCCCGGAATGTGCTAGTCAAGAGTCCCAACCACGTCAAGATTACAGATTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGATGAGACAGAGTACCATGCAGATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAATGGATGGCATTGGAATCTATTCTCAGACGCCGGTTCACCCATCAGAGTGATGTGTGGAGCTATGGAGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGGCCAAACCTTACGATGGAATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGATTTGCTGGAGAAGGGAGAACGCCTACCTCAGCCTCCAATCTGCACCATTGATGTCTACATGATTATGGTCAAATGTTGGATGATTGACTCTGAATGTCGCCCGAGATTCCGGGAGTTGGTGTCAGAATTTTCACGTATGGCGAGGGACCCCCAGCGTTTTGTGGTCATCCAGAACGAGGACTTGGGCCCATCCAGCCCCATGGACAGTACCTTCTACCGTTCACTGCTGGAA(SEQ ID NO:48)。

在一個(gè)實(shí)施例中，人HER2/neu基因的核酸序列包含SEQ ID NO:49：

ATGGAGCTGGCGGCCTTGTGCCGCTGGGGGCTCCTCCTCGCCCTCTTGCCCCCCGGAGCCGCGAGCACCCAAGTGTGCACCGGCACAGACATGAAGCTGCGGCTCCCTGCCAGTCCCGAGACCCACCTGGACATGCTCCGCCACCTCTACCAGGGCTGCCAGGTGGTGCAGGGAAACCTGGAACTCACCTACCTGCCCACCAATGCCAGCCTGTCCTTCCTGCAGGATATCCAGGAGGTGCAGGGCTACGTGCTCATCGCTCACAACCAAGTGAGGCAGGTCCCACTGCAGAGGCTGCGGATTGTGCGAGGCACCCAGCTCTTTGAGGACAACTATGCCCTGGCCGTGCTAGACAATGGAGACCCGCTGAACAATACCACCCCTGTCACAGGGGCCTCCCCAGGAGGCCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGCCTCACAGAGATCTTGAAAGGAGGGGTCTTGATCCAGCGGAACCCCCAGCTCTGCTACCAGGACACGATTTTGTGGAAGGACATCTTCCACAAGAACAACCAGCTGGCTCTCACACTGATAGACACCAACCGCTCTCGGGCCTGCCACCCCTGTTCTCCGATGTGTAAGGGCTCCCGCTGCTGGGGAGAGAGTTCTGAGGATTGTCAGAGCCTGACGCGCACTGTCTGTGCCGGTGGCTGTGCCCGCTGCAAGGGGCCACTGCCCACTGACTGCTGCCATGAGCAGTGTGCTGCCGGCTGCACGGGCCCCAAGCACTCTGACTGCCTGGCCTGCCTCCACTTCAACCACAGTGGCATCTGTGAGCTGCACTGCCCAGCCCTGGTCACCTACAACACAGACACGTTTGAGTCCATGCCCAATCCCGAGGGCCGGTATACATTCGGCGCCAGCTGTGTGACTGCCTGTCCCTACAACTACCTTTCTACGGACGTGGGATCCTGCACCCTCGTCTGCCCCCTGCACAACCAAGAGGTGACAGCAGAGGATGGAACACAGCGGTGTGAGAAGTGCAGCAAGCCCTGTGCCCGAGTGTGCTATGGTCTGGGCATGGAGCACTTGCGAGAGGTGAGGGCAGTTACCAGTGCCAATATCCAGGAGTTTGCTGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTCTGCCGGAGAGCTTTGATGGGGACCCAGCCTCCAACACTGCCCCGCTCCAGCCAGAGCAGCTCCAAGTGTTTGAGACTCTGGAAGAGATCACAGGTTACCTATACATCTCAGCATGGCCGGACAGCCTGCCTGACCTCAGCGTCTTCCAGAACCTGCAAGTAATCCGGGGACGAATTCTGCACAATGGCGCCTACTCGCTGACCCTGCAAGGGCTGGGCATCAGCTGGCTGGGGCTGCGCTCACTGAGGGAACTGGGCAGTGGACTGGCCCTCATCCACCATAACACCCACCTCTGCTTCGTGCACACGGTGCCCTGGGACCAGCTCTTTCGGAACCCGCACCAAGCTCTGCTCCACACTGCCAACCGGCCAGAGGACGAGTGTGTGGGCGAGGGCCTGGCCTGCCACCAGCTGTGCGCCCGAGGGCACTGCTGGGGTCCAGGGCCCACCCAGTGTGTCAACTGCAGCCAGTTCCTTCGGGGCCAGGAGTGCGTGGAGGAATGCCGAGTACTGCAGGGGCTCCCCAGGGAGTATGTGAATGCCAGGCACTGTTTGCCGTGCCACCCTGAGTGTCAGCCCCAGAATGGCTCAGTGACCTGTTTTGGACCGGAGGCTGACCAGTGTGTGGCCTGTGCCCACTATAAGGACCCTCCCTTCTGCGTGGCCCGCTGCCCCAGCGGTGTGAAACCTGACCTCTCCTACATGCCCATCTGGAAGTTTCCAGATGAGGAGGGCGCATGCCAGCCTTGCCCCATCAACTGCACCCACTCCTGTGTGGACCTGGATGACAAGGGCTGCCCCGCCGAGCAGAGAGCCAGCCCTCTGACGTCCATCGTCTCTGCGGTGGTTGGCATTCTGCTGGTCGTGGTCTTGGGGGTGGTCTTTGGGATCCTCATCAAGCGACGGCAGCAGAAGATCCGGAAGTACACGATGCGGAGACTGCTGCAGGAAACGGAGCTGGTGGAGCCGCTGACACCTAGCGGAGCGATGCCCAACCAGGCGCAGATGCGGATCCTGAAAGAGACGGAGCTGAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCTGGCGCTTTTGGCACAGTCTACAAGGGCATCTGGATCCCTGATGGGGAGAATGTGAAAATTCCAGTGGCCATCAAAGTGTTGAGGGAAAACACATCCCCCAAAGCCAACAAAGAAATCTTAGACGAAGCATACGTGATGGCTGGTGTGGGCTCCCCATATGTCTCCCGCCTTCTGGGCATCTGCCTGACATCCACGGTGCAGCTGGTGACACAGCTTATGCCCTATGGCTGCCTCTTAGACCATGTCCGGGAAAACCGCGGACGCCTGGGCTCCCAGGACCTGCTGAACTGGTGTATGCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGATGTGCGGCTCGTACACAGGGACTTGGCCGCTCGGAACGTGCTGGTCAAGAGTCCCAACCATGTCAAAATTACAGACTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGACGAGACAGAGTACCATGCAGATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAGTGGATGGCGCTGGAGTCCATTCTCCGCCGGCGGTTCACCCACCAGAGTGATGTGTGGAGTTATGGTGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGGCCAAACCTTACGATGGGATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGACCTGCTGGAAAAGGGGGAGCGGCTGCCCCAGCCCCCCATCTGCACCATTGATGTCTACATGATCATGGTCAAATGTTGGATGATTGACTCTGAATGTCGGCCAAGATTCCGGGAGTTGGTGTCTGAATTCTCCCGCATGGCCAGGGACCCCCAGCGCTTTGTGGTCATCCAGAATGAGGACTTGGGCCCAGCCAGTCCCTTGGACAGCACCTTCTACCGCTCACTGCTGGAGGACGATGACATGGGGGACCTGGTGGATGCTGAGGAGTATCTGGTACCCCAGCAGGGCTTCTTCTGTCCAGACCCTGCCCCGGGCGCTGGGGGCATGGTCCACCACAGGCACCGCAGCTCATCTACCAGGAGTGGCGGTGGGGACCTGACACTAGGGCTGGAGCCCTCTGAAGAGGAGGCCCCCAGGTCTCCACTGGCACCCTCCGAAGGGGCTGGCTCCGATGTATTTGATGGTGACCTGGGAATGGGGGCAGCCAAGGGGCTGCAAAGCCTCCCCACACATGACCCCAGCCCTCTACAGCGGTACAGTGAGGACCCCACAGTACCCCTGCCCTCTGAGACTGATGGCTACGTTGCCCCCCTGACCTGCAGCCCCCAGCCTGAATATGTGAACCAGCCAGATGTTCGGCCCCAGCCCCCTTCGCCCCGAGAGGGCCCTCTGCCTGCTGCCCGACCTGCTGGTGCCACTCTGGAAAGGGCCAAGACTCTCTCCCCAGGGAAGAATGGGGTCGTCAAAGACGTTTTTGCCTTTGGGGGTGCCGTGGAGAACCCCGAGTACTTGACACCCCAGGGAGGAGCTGCCCCTCAGCCCCACCCTCCTCCTGCCTTCAGCCCAGCCTTCGACAACCTCTATTACTGGGACCAGGACCCACCAGAGCGGGGGGCTCCACCCAGCACCTTCAAAGGGACACCTACGGCAGAGAACCCAGAGTACCTGGGTCTGGACGTGCCAGTGTGAACCAGAAGGCCAAGTCCGCAGAAGCCCTGA(SEQ ID NO:49)。

在另一個(gè)實(shí)施例中，以嵌合體實(shí)施的編碼人HER2/neu EC1片段的核酸序列跨越人EC1區(qū)域的120-510bp，并且包含SEQ ID NO:50：

GAGACCCACCTGGACATGCTCCGCCACCTCTACCAGGGCTGCCAGGTGGTGCAGGGAAACCTGGAACTCACCTACCTGCCCACCAATGCCAGCCTGTCCTTCCTGCAGGATATCCAGGAGGTGCAGGGCTACGTGCTCATCGCTCACAACCAAGTGAGGCAGGTCCCACTGCAGAGGCTGCGGATTGTGCGAGGCACCCAGCTCTTTGAGGACAACTATGCCCTGGCCGTGCTAGACAATGGAGACCCGCTGAACAATACCACCCCTGTCACAGGGGCCTCCCCAGGAGGCCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGCCTCACAGAGATCTTGAAAGGAGGGGTCTTGATCCAGCGGAACCCCCAGCTCTGCTACCAGGACACGATTTTGTGGAAG(SEQID NO:50)。

在一個(gè)實(shí)施例中，完整的EC1人HER2/neu片段跨越(人HER2/neu基因的58-979bp)，并且由包含SEQ ID NO:54的核酸序列編碼：

GCCGCGAGCACCCAAGTGTGCACCGGCACAGACATGAAGCTGCGGCTCCCTGCCAGTCCCGAGACCCACCTGGACATGCTCCGCCACCTCTACCAGGGCTGCCAGGTGGTGCAGGGAAACCTGGAACTCACCTACCTGCCCACCAATGCCAGCCTGTCCTTCCTGCAGGATATCCAGGAGGTGCAGGGCTACGTGCTCATCGCTCACAACCAAGTGAGGCAGGTCCCACTGCAGAGGCTGCGGATTGTGCGAGGCACCCAGCTCTTTGAGGACAACTATGCCCTGGCCGTGCTAGACAATGGAGACCCGCTGAACAATACCACCCCTGTCACAGGGGCCTCCCCAGGAGGCCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGCCTCACAGAGATCTTGAAAGGAGGGGTCTTGATCCAGCGGAACCCCCAGCTCTGCTACCAGGACACGATTTTGTGGAAGGACATCTTCCACAAGAACAACCAGCTGGCTCTCACACTGATAGACACCAACCGCTCTCGGGCCTGCCACCCCTGTTCTCCGATGTGTAAGGGCTCCCGCTGCTGGGGAGAGAGTTCTGAGGATTGTCAGAGCCTGACGCGCACTGTCTGTGCCGGTGGCTGTGCCCGCTGCAAGGGGCCACTGCCCACTGACTGCTGCCATGAGCAGTGTGCTGCCGGCTGCACGGGCCCCAAGCACTCTGACTGCCTGGCCTGCCTCCACTTCAACCACAGTGGCATCTGTGAGCTGCACTGCCCAGCCCTGGTCACCTACAACACAGACACGTTTGAGTCCATGCCCAATCCCGAGGGCCGGTATACATTCGGCGCCAGCTGTGTGACTGCCTGTCCCTACAACTACCTTTCTACGGACGTGGGATCCTGCACCCTCGTCTGCCCCCTGCACAACCAAGAGGTGACAGCAGAGGAT(SEQ ID NO:54)。

在另一個(gè)實(shí)施例中，以嵌合體實(shí)施的編碼人HER2/neu EC2片段的核酸序列跨越人HER2/neu EC2片段的1077-1554bp，并且包括50bp延伸，且包含SEQ ID NO:51：

AATATCCAGGAGTTTGCTGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTCTGCCGGAGAGCTTTGATGGGGACCCAGCCTCCAACACTGCCCCGCTCCAGCCAGAGCAGCTCCAAGTGTTTGAGACTCTGGAAGAGATCACAGGTTACCTATACATCTCAGCATGGCCGGACAGCCTGCCTGACCTCAGCGTCTTCCAGAACCTGCAAGTAATCCGGGGACGAATTCTGCACAATGGCGCCTACTCGCTGACCCTGCAAGGGCTGGGCATCAGCTGGCTGGGGCTGCGCTCACTGAGGGAACTGGGCAGTGGACTGGCCCTCATCCACCATAACACCCACCTCTGCTTCGTGCACACGGTGCCCTGGGACCAGCTCTTTCGGAACCCGCACCAAGCTCTGCTCCACACTGCCAACCGGCCAGAGGACGAGTGTGTGGGCGAGGGCCTGGCCTGCCACCAGCTGTGCGCCCGAGGG(SEQ ID NO:51)。

在一個(gè)實(shí)施例中，完整的EC2人HER2/neu片段跨越人HER2/neu基因的907-1504bp，并且由包含SEQ ID NO:55的核酸序列編碼：

TACCTTTCTACGGACGTGGGATCCTGCACCCTCGTCTGCCCCCTGCACAACCAAGAGGTGACAGCAGAGGATGGAACACAGCGGTGTGAGAAGTGCAGCAAGCCCTGTGCCCGAGTGTGCTATGGTCTGGGCATGGAGCACTTGCGAGAGGTGAGGGCAGTTACCAGTGCCAATATCCAGGAGTTTGCTGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTCTGCCGGAGAGCTTTGATGGGGACCCAGCCTCCAACACTGCCCCGCTCCAGCCAGAGCAGCTCCAAGTGTTTGAGACTCTGGAAGAGATCACAGGTTACCTATACATCTCAGCATGGCCGGACAGCCTGCCTGACCTCAGCGTCTTCCAGAACCTGCAAGTAATCCGGGGACGAATTCTGCACAATGGCGCCTACTCGCTGACCCTGCAAGGGCTGGGCATCAGCTGGCTGGGGCTGCGCTCACTGAGGGAACTGGGCAGTGGACTGGCCCTCATCCACCATAACACCCACCTCTGCTTCGTGCACACGGTGCCCTGGGACCAGCTCTTTCGGAACCCGCACCAAGCTCTGCTCCACACTGCCAACCGGCCAGAG(SEQ ID NO:55)。

在另一個(gè)實(shí)施例中，以嵌合體實(shí)施的編碼人HER2/neu IC1片段的核酸序列包含SEQ ID NO:52：

CAGCAGAAGATCCGGAAGTACACGATGCGGAGACTGCTGCAGGAAACGGAGCTGGTGGAGCCGCTGACACCTAGCGGAGCGATGCCCAACCAGGCGCAGATGCGGATCCTGAAAGAGACGGAGCTGAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCTGGCGCTTTTGGCACAGTCTACAAGGGCATCTGGATCCCTGATGGGGAGAATGTGAAAATTCCAGTGGCCATCAAAGTGTTGAGGGAAAACACATCCCCCAAAGCCAACAAAGAAATCTTAGACGAAGCATACGTGATGGCTGGTGTGGGCTCCCCATATGTCTCCCGCCTTCTGGGCATCTGCCTGACATCCACGGTGCAGCTGGTGACACAGCTTATGCCCTATGGCTGCCTCTTAGACT(SEQ ID NO:52)。

在另一個(gè)實(shí)施例中，編碼完整的人HER2/neu IC1片段的核酸序列跨越人HER2/neu基因的2034-3243，并且包含SEQ ID NO:56：

CAGCAGAAGATCCGGAAGTACACGATGCGGAGACTGCTGCAGGAAACGGAGCTGGTGGAGCCGCTGACACCTAGCGGAGCGATGCCCAACCAGGCGCAGATGCGGATCCTGAAAGAGACGGAGCTGAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCTGGCGCTTTTGGCACAGTCTACAAGGGCATCTGGATCCCTGATGGGGAGAATGTGAAAATTCCAGTGGCCATCAAAGTGTTGAGGGAAAACACATCCCCCAAAGCCAACAAAGAAATCTTAGACGAAGCATACGTGATGGCTGGTGTGGGCTCCCCATATGTCTCCCGCCTTCTGGGCATCTGCCTGACATCCACGGTGCAGCTGGTGACACAGCTTATGCCCTATGGCTGCCTCTTAGACCATGTCCGGGAAAACCGCGGACGCCTGGGCTCCCAGGACCTGCTGAACTGGTGTATGCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGATGTGCGGCTCGTACACAGGGACTTGGCCGCTCGGAACGTGCTGGTCAAGAGTCCCAACCATGTCAAAATTACAGACTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGACGAGACAGAGTACCATGCAGATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAGTGGATGGCGCTGGAGTCCATTCTCCGCCGGCGGTTCACCCACCAGAGTGATGTGTGGAGTTATGGTGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGGCCAAACCTTACGATGGGATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGACCTGCTGGAAAAGGGGGAGCGGCTGCCCCAGCCCCCCATCTGCACCATTGATGTCTACATGATCATGGTCAAATGTTGGATGATTGACTCTGAATGTCGGCCAAGATTCCGGGAGTTGGTGTCTGAATTCTCCCGCATGGCCAGGGACCCCCAGCGCTTTGTGGTCATCCAGAATGAGGACTTGGGCCCAGCCAGTCCCTTGGACAGCACCTTCTACCGCTCACTGCTGGAGGACGATGACATGGGGGACCTGGTGGATGCTGAGGAGTATCTGGTACCCCAGCAGGGCTTCTTCTGTCCAGACCCTGCCCCGGGCGCTGGGGGCATGGTCCACCACAGGCACCGCAGCTCATCTACCAGGAGTGGCGGTGGGGACCTGACACTAGGGCTGGAGCCCTCTGAAGAGGAGGCCCCCAGGTCTCCACTGGCACCCTCCGAAGGGGCT(SEQ ID NO:56)。

在一個(gè)實(shí)施例中，用于本文提供的方法和組合物的LLO是李斯特菌LLO。在一個(gè)實(shí)施例中，LLO來自的李斯特菌是單核細(xì)胞增多性李斯特菌(LM)。在另一個(gè)實(shí)施例中，李斯特菌是伊萬諾夫李斯特菌(Listeria ivanovii)。在另一個(gè)實(shí)施例中，李斯特菌是威耳遜李斯特菌(Listeria welshimeri)。在另一個(gè)實(shí)施例中，李斯特菌是西爾李斯特菌(Listeria seeligeri)。在另一個(gè)實(shí)施例中，LLO蛋白是非李斯特菌LLO蛋白。在另一個(gè)實(shí)施例中，LLO蛋白是合成LLO蛋白。在另一個(gè)實(shí)施例中，它是重組LLO蛋白。

在一個(gè)實(shí)施例中，LLO蛋白由包含SEQ ID NO:3的核酸序列編碼：

atgaaaaaaataatgctagtttttattacacttatattagttagtctaccaattgcgcaacaaactgaagcaaaggatgcatctgcattcaataaagaaaattcaatttcatccatggcaccaccagcatctccgcctgcaagtcctaagacgccaatcgaaaagaaacacgcggatgaaatcgataagtatatacaaggattggattacaataaaaacaatgtattagtataccacggagatgcagtgacaaatgtgccgccaagaaaaggttacaaagatggaaatgaatatattgttgtggagaaaaagaagaaatccatcaatcaaaataatgcagacattcaagttgtgaatgcaatttcgagcctaacctatccaggtgctctcgtaaaagcgaattcggaattagtagaaaatcaaccagatgttctccctgtaaaacgtgattcattaacactcagcattgatttgccaggtatgactaatcaagacaataaaatagttgtaaaaaatgccactaaatcaaacgttaacaacgcagtaaatacattagtggaaagatggaatgaaaaatatgctcaagcttatccaaatgtaagtgcaaaaattgattatgatgacgaaatggcttacagtgaatcacaattaattgcgaaatttggtacagcatttaaagctgtaaataatagcttgaatgtaaacttcggcgcaatcagtgaagggaaaatgcaagaagaagtcattagttttaaacaaatttactataacgtgaatgttaatgaacctacaagaccttccagatttttcggcaaagctgttactaaagagcagttgcaagcgcttggagtgaatgcagaaaatcctcctgcatatatctcaagtgtggcgtatggccgtcaagtttatttgaaattatcaactaattcccatagtactaaagtaaaagctgcttttgatgctgccgtaagcggaaaatctgtctcaggtgatgtagaactaacaaatatcatcaaaaattcttccttcaaagccgtaatttacggaggttccgcaaaagatgaagttcaaatcatcgacggcaacctcggagacttacgcgatattttgaaaaaaggcgctacttttaatcgagaaacaccaggagttcccattgcttatacaacaaacttcctaaaagacaatgaattagctgttattaaaaacaactcagaatatattgaaacaacttcaaaagcttatacagatggaaaaattaacatcgatcactctggaggatacgttgctcaattcaacatttcttgggatgaagtaaattatgat(SEQID NO:3)。

在另一個(gè)實(shí)施例中，LLO蛋白包含序列SEQ ID NO:4：

M K K I M L V F I T L I L V S L P I A Q Q T E A K D A S A F N K E N S I S S M A P P A S P P A S P K T P I E K K H A D E I D K Y I Q G L D Y N K N N V L V Y H G D A V T N V P P R K G Y K D G N E Y I V V E K K K K S I N Q N N A D I Q V V N A I S S L T Y P G A L V K A N S E L V E N Q P D V L P V K R D S L T L S I D L P G M T N Q D N K I V V K N A T K S N V N N A V N T L V E R W N E K Y A Q A Y P N V S A K I D Y D D E M A Y S E S Q L I A K F G T A F K A V N N S L N V N F G A I S E G K M Q E E V I S F K Q I Y Y N V N V N E P T R P S R F F G K A V T K E Q L Q A L G V N A E N P P A Y I S S V A Y G R Q V Y L K L S T N S H S T K V K A A F D A A V S G K S V S G D V E L T N I I K N S S F K A V I Y G G S A K D E V Q I I D G N L G D L R D I L K K G A T F N R E T P G V P I A Y T T N F L K D N E L A V I K N N S E Y I E T T S K A Y T D G K I N I D H S G G Y V A Q F N I S W D E V N Y D(SEQ ID NO:4)

對應(yīng)于該序列的前蛋白的前25個(gè)氨基酸為信號序列，并且在細(xì)菌分泌時(shí)從LLO切割。因此，在該實(shí)施例中，全長活性LLO蛋白的長度為504個(gè)殘基。在另一個(gè)實(shí)施例中，LLO蛋白具有GenBank登錄號DQ054588、DQ054589、AY878649、U25452或U25452示出的序列。在另一個(gè)實(shí)施例中，LLO蛋白是LLO蛋白的變體。在另一個(gè)實(shí)施例中，LLO蛋白是LLO蛋白的同源物。每種可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施例。

在另一個(gè)實(shí)施例中，“截短的LLO”或“tLLO”是指包含PEST域的LLO片段。在另一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語是指不包含氨基末端的活化域并且不包含胱氨酸484的LLO片段。在另一個(gè)實(shí)施例中，LLO片段由PEST序列組成。在另一個(gè)實(shí)施例中，LLO片段包含PEST序列。在另一個(gè)實(shí)施例中，LLO片段由529個(gè)氨基酸全長LLO蛋白的約前400至441個(gè)氨基酸組成。在另一個(gè)實(shí)施例中，LLO片段是LLO蛋白的非溶血形式。

在本發(fā)明的方法和組合物的另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法和組合物的核酸序列編碼的重組多肽是包含嵌合HER2/neu抗原和另外的多肽的融合蛋白，而在另一個(gè)實(shí)施例中，融合蛋白尤其包含LLO片段，該LLO片段在一個(gè)實(shí)施例中是LM非溶血LLO蛋白，或在另一個(gè)實(shí)施例中是截短的LLO(本文的實(shí)例)。

在一個(gè)實(shí)施例中，LLO片段由大約殘基1-25組成。在另一個(gè)實(shí)施例中，LLO片段由大約殘基1-50組成。在另一個(gè)實(shí)施例中，LLO片段由大約殘基1-75組成。在另一個(gè)實(shí)施例中，LLO片段由大約殘基1-100組成。在另一個(gè)實(shí)施例中，LLO片段由大約殘基1-125組成。在另一個(gè)實(shí)施例中，LLO片段由大約殘基1-150組成。在另一個(gè)實(shí)施例中，LLO片段由大約殘基1175組成。在另一個(gè)實(shí)施例中，LLO片段由大約殘基1-200組成。在另一個(gè)實(shí)施例中，LLO片段由大約殘基1-225組成。在另一個(gè)實(shí)施例中，LLO片段由大約殘基1-250組成。在另一個(gè)實(shí)施例中，LLO片段由大約殘基1-275組成。在另一個(gè)實(shí)施例中，LLO片段由大約殘基1-300組成。在另一個(gè)實(shí)施例中，LLO片段由大約殘基1-325組成。在另一個(gè)實(shí)施例中，LLO片段由大約殘基1-350組成。在另一個(gè)實(shí)施例中，LLO片段由大約殘基1-375組成。在另一個(gè)實(shí)施例中，LLO片段由大約殘基1-400組成。在另一個(gè)實(shí)施例中，LLO片段由大約殘基1-425組成。每種可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施例。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法和組合物的融合蛋白包含來自LLO蛋白或來自另一種生物體如原核生物體的PEST序列。

在另一個(gè)實(shí)施例中，PEST氨基酸(AA)序列包含選自SEQ ID NO:5-9的序列。在另一個(gè)實(shí)施例中，PEST序列是單核細(xì)胞增多性李斯特菌(Lm)ActA蛋白的PEST序列。在另一個(gè)實(shí)施例中，PEST序列包含KTEEQPSEVNTGPR(SEQ ID NO:5)、KASVTDTSEGDLDSSMQSADESTPQPLK(SEQ ID NO:6)、KNEEVNASDFPPPPTDEELR(SEQ ID NO:7)或RGGIPTSEEFSSLNSGDFTDDENSETTEEEIDR(SEQ ID NO:8)。在另一個(gè)實(shí)施例中，PEST序列來自鏈球菌屬(Streptococcus sp)的鏈球菌溶血素O蛋白。在另一個(gè)實(shí)施例中，PEST序列來自釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)鏈球菌溶血素O，如AA 35-51的KQNTASTETTTTNEQPK(SEQ ID NO:9)。在另一個(gè)實(shí)施例中，PEST序列來自類馬鏈球菌(Streptococcus equisimilis)鏈球菌溶血素O，如AA38-54的KQNTANTETTTTNEQPK(SEQ ID NO:10)。在另一個(gè)實(shí)施例中，PEST樣序列是來源于原核生物體的另一個(gè)PEST AA序列。在另一個(gè)實(shí)施例中，PEST序列是本領(lǐng)域已知的任何其他PEST序列。每種可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施例。

抗原融合至Lm的PEST序列增強(qiáng)了抗原的細(xì)胞介導(dǎo)免疫和抗腫瘤免疫。因此，抗原融合至來源于其他原核生物體的其他PEST序列也將增強(qiáng)抗原的免疫原性?？筛鶕?jù)諸如由例如Rechsteiner和Rogers(1996,Trends Biochem.Sci.21:267-271)針對Lm所述的方法鑒定其他原核生物體的PEST序列。或者，來自其他原核生物體的PEST AA序列可也根據(jù)此方法鑒定。其中預(yù)期存在PEST AA序列的其他原核生物體包括但不限于其他李斯特菌屬物種。在另一個(gè)實(shí)施例中，PEST序列嵌入抗原蛋白內(nèi)。因此，在另一個(gè)實(shí)施例中，“融合”是指既包含抗原也包含連接至抗原的一端或嵌入抗原內(nèi)的PEST氨基酸序列的抗原蛋白。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了包含本發(fā)明的重組多肽的疫苗。在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了包含本發(fā)明的重組多肽的組合物。在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了由本發(fā)明的重組多肽組成的疫苗。在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了由本發(fā)明的重組多肽組成的組合物。在另一個(gè)實(shí)施例中，組合物是免疫原性組合物。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了編碼本發(fā)明的重組多肽的核苷酸分子。在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了包含核苷酸分子的疫苗。在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了包含核苷酸分子的組合物。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了編碼本發(fā)明的重組多肽的核苷酸分子。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了本發(fā)明的核苷酸分子編碼的重組多肽。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了包含本發(fā)明的核苷酸分子或重組多肽的疫苗。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了包含本發(fā)明的核苷酸分子或重組多肽的免疫原性組合物。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了包含本發(fā)明的核苷酸分子或重組多肽的載體。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了包含本發(fā)明的核苷酸分子的李斯特菌的重組形式。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了包含本發(fā)明的李斯特菌的重組形式的疫苗。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了包含本發(fā)明的李斯特菌的重組形式的免疫原性組合物。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了本發(fā)明的李斯特菌的重組形式的培養(yǎng)物。

在一個(gè)實(shí)施例中，用于本發(fā)明的方法的疫苗或組合物包含本文所述的任何形式或?qū)嵤├闹亟M單核細(xì)胞增多性李斯特菌。在一個(gè)實(shí)施例中，用于本發(fā)明的疫苗或組合物由本文所述的任何形式或?qū)嵤├谋景l(fā)明的重組單核細(xì)胞增多性李斯特菌組成。在另一個(gè)實(shí)施例中，用于本發(fā)明的方法的疫苗或組合物基本上由本文所述的任何形式或?qū)嵤├谋景l(fā)明的重組單核細(xì)胞增多性李斯特菌組成。

在一個(gè)實(shí)施例中，術(shù)語“包含”是指疫苗或組合物中包含重組單核細(xì)胞增多性李斯特菌，以及包括可為本領(lǐng)域已知的其他疫苗、組合物或處理。在另一個(gè)實(shí)施例中，術(shù)語“基本上由...組成”是指功能組分為重組單核細(xì)胞增多性李斯特菌的疫苗，然而可包括不直接涉及疫苗的治療效果的其他疫苗或組合物組分，并且可以例如指有利于重組單核細(xì)胞增多性李斯特菌的效果(如，穩(wěn)定、維持等)的組分。在另一個(gè)實(shí)施例中，術(shù)語“組成”是指包含重組單核細(xì)胞增多性李斯特菌的疫苗。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法包括施用本文所述的任何形式或?qū)嵤├闹亟M單核細(xì)胞增多性李斯特菌的步驟。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法由施用本文所述的任何形式或?qū)嵤├谋景l(fā)明的重組單核細(xì)胞增多性李斯特菌的步驟組成。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法基本上由施用本文所述的任何形式或?qū)嵤├谋景l(fā)明的重組單核細(xì)胞增多性李斯特菌的步驟組成。在一個(gè)實(shí)施例中，術(shù)語“包括”是指方法包括施用重組單核細(xì)胞增多性李斯特菌的步驟，以及包括可為本領(lǐng)域已知的其他方法或處理。在另一個(gè)實(shí)施例中，術(shù)語“基本上由...組成”是指功能組成部分為施用重組單核細(xì)胞增多性李斯特菌的方法，然而可包括不直接涉及方法的治療效果的其他方法步驟，并且可以例如指有利于重組單核細(xì)胞增多性李斯特菌的施用效果的步驟。在一個(gè)實(shí)施例中，術(shù)語“組成”是指無另外的步驟的施用重組單核細(xì)胞增多性李斯特菌的方法。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法和組合物的李斯特菌是單核細(xì)胞增多性李斯特菌。在另一個(gè)實(shí)施例中，李斯特菌是伊萬諾夫李斯特菌(Listeria ivanovii)。在另一個(gè)實(shí)施例中，李斯特菌是威耳遜李斯特菌。在另一個(gè)實(shí)施例中，李斯特菌是西爾李斯特菌。每種類型的李斯特菌表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施例。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法和組合物的李斯特菌菌株是ADXS31-164菌株。在另一個(gè)實(shí)施例中，ADXS31-164刺激野生型FVB/N小鼠的脾細(xì)胞分泌IFN-γ。另外，本文提供的數(shù)據(jù)顯示，ADXS31-164能夠引起對位于靶抗原的不同域的人表位的抗HER2/neu特異性免疫應(yīng)答。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供包含編碼HER2嵌合蛋白或其片段的核苷酸分子的李斯特菌的重組形式。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供誘導(dǎo)受試者的抗HER2免疫應(yīng)答的方法，該方法包括將包含融合至HER2嵌合蛋白或融合至其片段的LLO蛋白的N-末端片段的重組多肽施用于受試者，從而誘導(dǎo)受試者的抗HER2免疫應(yīng)答。

在一個(gè)實(shí)施例中，融合蛋白的兩個(gè)分子(LLO、ActA片段或PEST序列和抗原)直接連接。在另一個(gè)實(shí)施例中，兩個(gè)分子通過由一個(gè)或多個(gè)氨基酸組成的短間隔肽連接。在一個(gè)實(shí)施例中，間隔肽除連接蛋白或維持一定的最小距離或它們之間的其他空間關(guān)系之外無特定生物學(xué)活性。在另一個(gè)實(shí)施例中，選擇間隔肽的組成氨基酸以影響分子的一些性質(zhì)，諸如折疊、凈電荷或疏水性。在另一個(gè)實(shí)施例中，兩個(gè)蛋白分子(LLO片段和抗原)是單獨(dú)合成的或不融合的。在另一個(gè)實(shí)施例中，兩個(gè)蛋白分子從相同的核酸單獨(dú)合成。在又一個(gè)實(shí)施例中，兩個(gè)分子從單獨(dú)的核酸各自合成。每種可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施例。

在一個(gè)實(shí)施例中，編碼本文提供的重組多肽的核酸還編碼信號肽或序列。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法和組合物的融合蛋白包含來自LLO的LLO信號序列。在一個(gè)實(shí)施例中，異源抗原可通過使用信號序列諸如李斯特菌信號序列例如溶血素信號序列或actA信號序列表達(dá)?；蛘?，例如，外源基因可在單核細(xì)胞增多性李斯特菌啟動子下游表達(dá)，而不形成融合蛋白。在另一個(gè)實(shí)施例中，信號肽是細(xì)菌的(李斯特菌的或非李斯特菌的)。在一個(gè)實(shí)施例中，信號肽是細(xì)菌天然的。在另一個(gè)實(shí)施例中，信號肽是細(xì)菌外源的。在另一個(gè)實(shí)施例中，信號肽是單核細(xì)胞增多性李斯特菌的信號肽，諸如secA1信號肽。在另一個(gè)實(shí)施例中，信號肽是乳乳球菌(Lactococcus lactis)的Usp45信號肽或炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)的保護(hù)抗原信號肽。在另一個(gè)實(shí)施例中，信號肽是secA2信號肽，例如單核細(xì)胞增多性李斯特菌的p60信號肽。此外，重組核酸分子任選地包含編碼p60或其片段的第三多核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施例中，信號肽是Tat信號肽，諸如枯草芽孢桿菌Tat信號肽(如，PhoD)。在一個(gè)實(shí)施例中，信號肽在編碼重組多肽的相同翻譯閱讀框中。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了誘導(dǎo)受試者的抗HER2免疫應(yīng)答的方法，該方法包括將編碼包含融合至HER2嵌合蛋白或融合至其片段的LLO蛋白的N-末端片段的重組多肽的重組核苷酸施用于受試者，從而誘導(dǎo)受試者的抗HER2免疫應(yīng)答。

在一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了引起受試者的對HER2/neu表達(dá)腫瘤的增強(qiáng)免疫應(yīng)答的方法，而在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括將包含本文提供的重組李斯特菌疫苗株的組合物施用于受試者。在另一個(gè)實(shí)施例中，對HER2表達(dá)腫瘤的免疫應(yīng)答包括對HER2蛋白的次優(yōu)勢表位的免疫應(yīng)答。在另一個(gè)實(shí)施例中，對HER2表達(dá)腫瘤的免疫應(yīng)答包括對HER2蛋白的多個(gè)次優(yōu)勢表位的免疫應(yīng)答。在另一個(gè)實(shí)施例中，對HER2表達(dá)腫瘤的免疫應(yīng)答包括對HER2蛋白的至少1-5個(gè)次優(yōu)勢表位的免疫應(yīng)答。在另一個(gè)實(shí)施例中，對HER2表達(dá)腫瘤的免疫應(yīng)答包括對HER2蛋白的至少1-10個(gè)次優(yōu)勢表位的免疫應(yīng)答。在另一個(gè)實(shí)施例中，對HER2表達(dá)腫瘤的免疫應(yīng)答包括對HER2蛋白的至少1-17個(gè)次優(yōu)勢表位的免疫應(yīng)答。在另一個(gè)實(shí)施例中，對HER2表達(dá)腫瘤的免疫應(yīng)答包括對HER2蛋白的至少17個(gè)次優(yōu)勢表位的免疫應(yīng)答。

據(jù)報(bào)告，當(dāng)基于小片段李斯特菌的疫苗或曲妥單抗(針對位于HER2/neu抗原的胞外域的表位的單克隆抗體)靶向這些腫瘤時(shí)，致癌蛋白HER2/neu的點(diǎn)突變或氨基酸缺失介導(dǎo)了耐藥腫瘤細(xì)胞的治療。本文描述了基于嵌合HER2/neu的組合物，該組合物具有HER2/neu抗原的兩個(gè)胞外片段和一個(gè)胞內(nèi)片段，該抗原示出癌基因的MHC I類表位簇。該嵌合蛋白具有3個(gè)H2Dq和至少17個(gè)HER2/neu抗原的標(biāo)繪的人MHC I類表位，并且融合至單核細(xì)胞增多性李斯特菌李斯特菌溶血素O蛋白的前441個(gè)氨基酸，由單核細(xì)胞增多性李斯特菌減毒菌株LmddA表達(dá)和分泌。

前述報(bào)告示出，當(dāng)使用分別表達(dá)和分泌HER2/neu抗原的小片段的基于李斯特菌的疫苗(每種疫苗僅具有HER2/neu癌基因的一個(gè)H2Dq表位)免疫HER2/neu轉(zhuǎn)基因小鼠時(shí)，由于每種疫苗靶向的HER2/neu抗原的那些表位的突變，HER2/neu過表達(dá)腫瘤可逃逸(參見Singh R,Paterson Y.Immunoediting sculpts tumor epitopes during immunotherapy.Cancer Res 2007；67:1887-92)。本文示出了出乎意料的結(jié)果，當(dāng)HER2/neu蛋白的三個(gè)或更多個(gè)表位并入嵌合疫苗時(shí)，可通過逃逸突變消除這些腫瘤的選擇和逃逸。使用新型HER2/neu嵌合李斯特菌疫苗免疫不會導(dǎo)致可能與HER2/neu抗原的點(diǎn)突變或氨基酸缺失相關(guān)的任何逃逸突變(參見本文的實(shí)例4)。

在一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了將李斯特菌疫苗株工程化為表達(dá)HER2嵌合蛋白或表達(dá)嵌合蛋白的重組多肽的方法，該方法包括用核酸分子轉(zhuǎn)化李斯特菌菌株。在另一個(gè)實(shí)施例中，核酸分子包含編碼多肽的第一開放閱讀框，其中該多肽包含HER2/neu嵌合抗原。在另一個(gè)實(shí)施例中，核酸分子還包含編碼代謝酶的第二開放閱讀框，并且其中所述代謝酶互補(bǔ)重組李斯特菌菌株的染色體中缺乏的內(nèi)源性基因，從而將李斯特菌疫苗株工程化為表達(dá)HER2嵌合蛋白。

在一個(gè)實(shí)施例中，本文提供的方法和組合物還包含佐劑，而在另一個(gè)實(shí)施例中，佐劑包括粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白、編碼GM-CSF蛋白的核苷酸分子、皂草苷QS21、單磷酰脂質(zhì)A、未經(jīng)甲基化的含CpG寡核苷酸或本領(lǐng)域已知的任何佐劑。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明使用減毒李斯特菌菌株，諸如LMδ-actA突變體(Brundage et al,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,90:11890-11894)、單核細(xì)胞增多性李斯特菌δ-plcA(Camilli et al,1991,J.Exp.Med.,173:751-754)或δ-ActA、δINL-b(Brockstedt et 5al,2004,PNAS,101:13832–13837)。在另一個(gè)實(shí)施例中，減毒李斯特菌菌株通過引入一個(gè)或多個(gè)減毒突變構(gòu)建，如本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員了解本文的公開內(nèi)容時(shí)所理解。此類菌株的例子包括但不限于芳族氨基酸營養(yǎng)缺陷型李斯特菌菌株(Alexander et al,1993,Infection and Immunity 1061:2245-2248)和形成脂磷壁酸的突變體(Abachin et al,2002,Mol.Microbiol.43:1-14)和由于缺乏毒性基因而減毒的那些菌株(參見本文的實(shí)例)。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法和組合物的核酸分子可操作地連接至啟動子/調(diào)控序列。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法和組合物的第一開放閱讀框可操作地連接至啟動子/調(diào)控序列。在另一個(gè)實(shí)施例中，核酸分子包含可操作地連接至啟動子/調(diào)控序列的第二開放閱讀框。在另一個(gè)實(shí)施例中，每個(gè)開放閱讀框可操作地連接至啟動子/調(diào)控序列。每種可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施例。

技術(shù)人員在了解本文提供的本公開內(nèi)容和方法時(shí)，將易于理解不同的轉(zhuǎn)錄啟動子、終止子、載體或特定基因序列(如，市售的克隆載體中的那些)可成功地用于本發(fā)明的方法和組合物。如本發(fā)明所設(shè)想，這些功能在例如稱為pUC系列的市售載體中提供。在另一個(gè)實(shí)施例中，移除非必需DNA序列(如，抗生素抗性基因)。每種可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施例。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明使用市售的質(zhì)粒。此類質(zhì)?？蓮亩鄠€(gè)來源獲得，例如Invitrogen(La Jolla,CA)、Stratagene(La Jolla,CA)、Clontech(Palo Alto,CA)，或可使用本領(lǐng)域熟知的方法構(gòu)建。

另一個(gè)實(shí)施例是諸如pCR2.1(Invitrogen,La Jolla,CA)的質(zhì)粒，該質(zhì)粒是具有原核復(fù)制起點(diǎn)和啟動子/調(diào)控元件以便有利于在原核生物體中表達(dá)的原核表達(dá)載體。在另一個(gè)實(shí)施例中，移除外源性核苷酸序列以減小質(zhì)粒的大小并增加可置于其中的盒的大小。

此類方法是本領(lǐng)域熟知的，并且在例如Sambrook et al.(1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York)和Ausubei et al.(1997,Current Protocols in Molecular Biology,Green&Wiley,New York)中有所描述。

將抗生素抗性基因用于分子生物學(xué)和疫苗制備通常使用的常規(guī)選擇和克隆工藝。本發(fā)明設(shè)想的抗生素抗性基因包括但不限于賦予氨芐青霉素、青霉素、甲氧西林、鏈霉素、紅霉素、卡那霉素、四環(huán)素、氯霉素(CAT)、新霉素、潮霉素、慶大霉素以及本領(lǐng)域熟知的其他抗生素抗性的基因產(chǎn)物。每個(gè)基因表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施例。

轉(zhuǎn)化細(xì)菌的方法是本領(lǐng)域熟知的，并且包括基于氯化鈣感受態(tài)細(xì)胞的方法、電穿孔法、噬菌體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)、化學(xué)和物理轉(zhuǎn)化技術(shù)(de Boer et al,1989,Cell 56:641-649；Miller et al,1995,FASEB J.,9:190-199；Sambrook et al.1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York；Ausubel et al.,1997,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York；Gerhardt et al.,eds.,1994,Methods for General and Molecular Bacteriology,American Society for Microbiology,Washington,DC；Miller,1992,A Short Course in Bacterial Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的李斯特菌疫苗株通過電穿孔轉(zhuǎn)化。每種方法表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施例。

在另一個(gè)實(shí)施例中，將接合用于將遺傳物質(zhì)和/或質(zhì)粒引入細(xì)菌。接合的方法是本領(lǐng)域熟知的，并且例如在Nikodinovic J et al.(A second generation snp-derived Escherichia coli-Streptomyces shuttle expression vector that is generally transferable by conjugation.Plasmid.2006Nov；56(3):223-7)和Auchtung JM et al (Regulation of a Bacillus subtilis mobile genetic element by intercellular signaling and the global DNA damage response.Proc Natl Acad Sci U S A.2005Aug 30；102(35):12554-9)中有所描述。每種方法表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施例。

在一個(gè)實(shí)施例中，“轉(zhuǎn)化”與術(shù)語“轉(zhuǎn)染”等同使用，是指將細(xì)菌細(xì)胞工程化為吸收質(zhì)?；蚱渌愒葱訢NA分子。在另一個(gè)實(shí)施例中，“轉(zhuǎn)化”是指將細(xì)菌細(xì)胞工程化為表達(dá)質(zhì)粒的基因或其他異源性DNA分子。每種可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施例。

本發(fā)明可用的質(zhì)粒和其他表達(dá)載體在本文別處有所描述，并且可包括例如啟動子/調(diào)控序列、革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的復(fù)制起點(diǎn)、編碼融合蛋白的分離的核酸以及編碼氨基酸代謝基因的分離的核酸等特征。另外，編碼融合蛋白和氨基酸代謝基因的分離的核酸將具有適用于驅(qū)動此類分離的核酸的表達(dá)的啟動子。用于驅(qū)動在細(xì)菌系統(tǒng)中表達(dá)的啟動子是本領(lǐng)域熟知的，并且包括噬菌體λ、pBR322的β-內(nèi)酰胺酶基因的bla啟動子和pBR325的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的CAT啟動子。原核啟動子的另外例子包括5噬菌體λ的主要右和左啟動子(PL和PR)，大腸桿菌的trp、recA、lacZ、lad和gal啟動子，α-淀粉酶(Ulmanen et al,1985.J.Bacteriol.162:176-182)和枯草芽孢桿菌的S28特異性啟動子(Gilman et al,1984Gene 32:11-20)、芽孢桿菌(Bacillus)的噬菌體的啟動子(Gryczan,1982,In:The Molecular Biology of the Bacilli,Academic Press,Inc.,New York)以及鏈霉菌啟動子(Ward et al,1986,Mol.Gen.Genet.203:468-478)。本發(fā)明設(shè)想的另外的原核啟動子在例如Glick(1987,J.Ind.Microbiol.1:277-282)；Cenatiempo,(1986,Biochimie,68:505-516)和Gottesman,(1984,Ann.Rev.Genet.18:415-442中進(jìn)行了綜述。本發(fā)明設(shè)想的啟動子/調(diào)控元件的另外例子包括但不限于李斯特菌prfA啟動子、李斯特菌hly啟動子、李斯特菌p60啟動子和李斯特菌actA啟動子(GenBank登錄號NC_003210)或其片段。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法和組合物的質(zhì)粒包含編碼融合蛋白的基因。在另一個(gè)實(shí)施例中，克隆子序列并使用適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖懈钸m當(dāng)?shù)淖有蛄?。在另一個(gè)實(shí)施例中，然后連接片段生成所需的DNA序列。在另一個(gè)實(shí)施例中，編碼抗原的DNA使用DNA擴(kuò)增法例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)制備。首先，在天然DNA片段的新末端的任一側(cè)單獨(dú)擴(kuò)增。一個(gè)擴(kuò)增的序列的5'末端編碼肽接頭，而另一個(gè)擴(kuò)增的序列的3'末端也編碼肽接頭。由于第一片段的5'末端與第二片段的3'末端互補(bǔ)，兩個(gè)片段(在部分純化后，如在LMP瓊脂糖上)可在第三PCR反應(yīng)中用作重疊模板。擴(kuò)增的序列將包含密碼子、開口位點(diǎn)羧基側(cè)上的片段(現(xiàn)在形成氨基序列)、接頭和開口位點(diǎn)氨基側(cè)上的序列(現(xiàn)在形成羧基序列)。將抗原連接至質(zhì)粒。每種方法表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施例。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明還包括用于臨床應(yīng)用的基于噬菌體的染色體整合系統(tǒng)。使用必需酶(包括但不限于D-丙氨酸消旋酶)營養(yǎng)缺陷型宿主菌株，例如Lmdal(-)dat(-)。在另一個(gè)實(shí)施例中，為避免“噬菌體治愈步驟”(phage curing step)，使用基于PSA的噬菌體整合系統(tǒng)(Lauer,et al.,2002J Bacteriol,184:4177-4186)。在另一個(gè)實(shí)施例中，這需要抗生素的連續(xù)選擇來維持整合基因。因此，在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明允許建立不需要抗生素選擇的基于噬菌體的染色體整合系統(tǒng)。相反，營養(yǎng)缺陷型宿主菌株將是互補(bǔ)的。

在另一個(gè)實(shí)施例中，使用重組DNA方法合成本發(fā)明的重組蛋白。在一個(gè)實(shí)施例中，這涉及形成編碼融合蛋白的DNA序列，將DNA置于具體啟動子/調(diào)控元件的控制下的表達(dá)盒(諸如本發(fā)明的質(zhì)粒)中，以及表達(dá)蛋白。在另一個(gè)實(shí)施例中，通過任何合適的方法，包括例如適當(dāng)序列的克隆和限制或通過諸如Narang et al.(1979,Meth.Enzymol.68:90-99)的磷酸三酯法、Brown et al.(1979,Meth.Enzymol 68:109-151)的磷酸二酯法、Beaucage et al.(1981,Tetra.Lett.,22:15 1859-1862)的二乙基亞磷酰胺法和美國專利No.4,458,066的固相載體法的方法直接化學(xué)合成來制備編碼本發(fā)明的融合蛋白(如，非溶血LLO/抗原)的DNA。

在另一個(gè)實(shí)施例中，使用化學(xué)合成制備單鏈寡核苷酸。在各種實(shí)施例中，該單鏈寡核苷酸通過與互補(bǔ)序列雜交或使用單鏈作為模板通過DNA聚合酶聚合轉(zhuǎn)換為雙鏈DNA。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到，雖然DNA的化學(xué)合成僅限于約100個(gè)堿基的序列，但較長的序列可通過較短的序列的連接獲得。在另一個(gè)實(shí)施例中，克隆子序列并使用適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖懈钸m當(dāng)?shù)淖有蛄?。然后連接片段以制備所需的DNA序列。

在另一個(gè)實(shí)施例中，使用DNA擴(kuò)增法諸如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)克隆編碼本發(fā)明的融合蛋白或重組蛋白的DNA。因此，使用包含合適的限制性位點(diǎn)的正義引物和包含另一個(gè)限制性位點(diǎn)(如，不相同的限制性位點(diǎn)以有利于克隆)的反義引物PCR擴(kuò)增非溶血LLO的基因。重復(fù)相同的步驟擴(kuò)增編碼抗原的分離的核酸。連接非溶血LLO和抗原序列并插入質(zhì)?；蜉d體，以生成編碼連接至抗原末端的非溶血LLO的載體。兩個(gè)分子直接或通過限制性位點(diǎn)引入的短間隔肽連接。

在另一個(gè)實(shí)施例中，分子通過由一個(gè)或多個(gè)氨基酸組成的間隔肽隔離，通常間隔肽除連接蛋白或維持一定的最小距離或它們之間的其他空間關(guān)系之外無特定生物學(xué)活性。在另一個(gè)實(shí)施例中，選擇間隔肽的組成AA以影響分子的一些性質(zhì)，諸如折疊、凈電荷或疏水性。在另一個(gè)實(shí)施例中，將編碼融合或重組蛋白的核酸序列轉(zhuǎn)化至多種宿主細(xì)胞，包括大腸桿菌、其他細(xì)菌宿主諸如李斯特菌、酵母和各種高等真核細(xì)胞諸如COS、CHO和HeLa細(xì)胞系以及骨髓瘤細(xì)胞系。重組融合蛋白基因?qū)⒖刹僮鞯剡B接至每個(gè)宿主的適當(dāng)表達(dá)控制序列。啟動子/調(diào)控序列在本文別處詳細(xì)描述。在另一個(gè)實(shí)施例中，質(zhì)粒還包含另外的啟動子調(diào)控元件，以及核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止信號。對于真核細(xì)胞，調(diào)控序列將包括啟動子和來源于如免疫球蛋白基因、SV40、細(xì)胞巨化病毒等的增強(qiáng)子，以及聚腺苷酸化序列。在另一個(gè)實(shí)施例中，序列包括剪接供體和受體序列。

在一個(gè)實(shí)施例中，術(shù)語“可操作地連接”是指其中這樣描述的組成部分處于允許其以預(yù)期方式發(fā)揮功能的關(guān)系的并置?！翱刹僮鞯剡B接”至編碼序列的控制序列的連接方式使得編碼序列的表達(dá)在與控制序列相容的條件下實(shí)現(xiàn)。

在另一個(gè)實(shí)施例中，為了選擇包含質(zhì)粒的營養(yǎng)缺陷型細(xì)菌，使轉(zhuǎn)化的營養(yǎng)缺陷型細(xì)菌在將選擇氨基酸代謝基因表達(dá)的培養(yǎng)基上生長。在另一個(gè)實(shí)施例中，使用包含用于D-谷氨酸合成的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化D-谷氨酸合成營養(yǎng)缺陷型細(xì)菌，并且該營養(yǎng)缺陷型細(xì)菌在不存在D-谷氨酸的情況下生長，而未使用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化或不表達(dá)編碼用于D-谷氨酸合成的蛋白的質(zhì)粒的營養(yǎng)缺陷型細(xì)菌則不能生長。在另一個(gè)實(shí)施例中，當(dāng)轉(zhuǎn)化和表達(dá)本發(fā)明的質(zhì)粒時(shí)，如果質(zhì)粒包含編碼用于D-丙氨酸合成的氨基酸代謝酶的分離的核酸，則D-丙氨酸合成營養(yǎng)缺陷型細(xì)菌將在不存在D-丙氨酸的情況下生長。此類用于制備包含或缺乏必要生長因子、補(bǔ)充劑、氨基酸、維生素、抗生素等等的適當(dāng)培養(yǎng)基的方法是本領(lǐng)域熟知的，并且可商購獲得(Becton-Dickinson,Franklin Lakes,NJ)。每種方法表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施例。

在另一個(gè)實(shí)施例中，一旦在適當(dāng)培養(yǎng)基上選擇包含本發(fā)明的質(zhì)粒的營養(yǎng)缺陷型細(xì)菌后，細(xì)菌即可在存在選擇壓力的情況下增殖。此類增殖包括使細(xì)菌在無營養(yǎng)缺陷型因子的培養(yǎng)基中生長。營養(yǎng)缺陷型細(xì)菌中存在表達(dá)氨基酸代謝酶的質(zhì)粒確保質(zhì)粒將與細(xì)菌一起復(fù)制，從而連續(xù)選擇具有質(zhì)粒的細(xì)菌。技術(shù)人員在了解本文的本公開內(nèi)容和方法時(shí)，將易于通過調(diào)整包含質(zhì)粒的營養(yǎng)缺陷型細(xì)菌生長所處的培養(yǎng)基的量來擴(kuò)大李斯特菌疫苗載體的制備。

技術(shù)人員將會知道，在另一個(gè)實(shí)施例中，采用其他營養(yǎng)缺陷型菌株和互補(bǔ)系統(tǒng)與本發(fā)明一起使用。

在一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了阻礙受試者的HER2表達(dá)腫瘤生長的方法，其中并且在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括將包含本文所述的重組李斯特菌疫苗株的組合物施用于受試者的步驟。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了阻礙或延緩來源于受試者的HER2表達(dá)腫瘤的轉(zhuǎn)移性疾病的方法，其中并且在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括將包含本文所述的重組李斯特菌疫苗株的組合物施用于受試者的步驟。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了引起受試者的對HER2/neu表達(dá)腫瘤的增強(qiáng)免疫應(yīng)答的方法，其中并且在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括將包含本文所述的重組李斯特菌疫苗株的組合物施用于受試者的步驟。在又一個(gè)實(shí)施例中，對HER2/neu表達(dá)腫瘤的免疫應(yīng)答包括對HER2/neu蛋白的至少一個(gè)次優(yōu)勢表位的免疫應(yīng)答。

在一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了防止HER2/neu表達(dá)腫瘤治療中的逃逸突變的方法，其中并且在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括將包含本文提供的重組李斯特菌疫苗株的組合物施用于所述受試者的步驟。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了防止受試者的HER2/neu抗原表達(dá)腫瘤發(fā)病的方法，其中并且在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括將包含本文提供的重組李斯特菌疫苗株的組合物施用于受試者的步驟。

在一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了降低腫瘤內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的頻率的方法，其中并且在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括將包含本文提供的重組李斯特菌疫苗株的組合物施用于受試者的步驟。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了降低腫瘤內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的頻率的方法，其中并且在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括將包含本文提供的重組李斯特菌疫苗株的組合物施用于受試者的步驟。

在一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了降低腫瘤內(nèi)骨髓來源的抑制性細(xì)胞的頻率的方法，其中并且在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括將包含本文提供的重組李斯特菌疫苗株的組合物施用于受試者的步驟。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了降低骨髓來源的抑制性細(xì)胞的頻率的方法，其中并且在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括將包含本文提供的重組李斯特菌疫苗株的組合物施用于受試者的步驟。

在一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了防止受試者中形成HER2/neu表達(dá)腫瘤的方法，其中并且在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括將包含本文提供的重組李斯特菌疫苗株的組合物施用于受試者的步驟。在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了防止受試者中形成來源于HER2/neu表達(dá)腫瘤的轉(zhuǎn)移性疾病的方法，其中并且在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括將包含本文提供的重組李斯特菌疫苗株的組合物施用于受試者的步驟。在一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了治療受試者的HER2/neu表達(dá)腫瘤的方法，其中并且在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括將包含本文提供的重組李斯特菌疫苗株的組合物施用于受試者的步驟。在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了治療受試者的來源于HER2/neu表達(dá)腫瘤的轉(zhuǎn)移性疾病的方法，其中并且在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括將包含本文提供的重組李斯特菌疫苗株的組合物施用于受試者的步驟。在一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了施用本發(fā)明的組合物的方法。在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了施用本發(fā)明的疫苗的方法。在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了施用本發(fā)明的重組多肽或重組核苷酸的方法。在另一個(gè)實(shí)施例中，施用本發(fā)明的組合物、疫苗、重組多肽或重組核苷酸的步驟通過各自本身為分立的實(shí)施例的李斯特菌的減毒重組形式進(jìn)行，該李斯特菌包括組合物、疫苗、重組核苷酸或表達(dá)重組多肽。在另一個(gè)實(shí)施例中，施用通過不同的減毒細(xì)菌載體進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施例中，施用通過DNA疫苗(如，裸DNA疫苗)進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的重組多肽的施用通過重組生成蛋白，然后將重組蛋白施用于受試者來進(jìn)行。每種可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施例。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的組合物的重復(fù)施用(加強(qiáng)劑量)可在治療的第一療程后立即進(jìn)行或在幾天、幾周或幾個(gè)月的間隔后進(jìn)行，以實(shí)現(xiàn)腫瘤消退。在另一個(gè)實(shí)施例中，重復(fù)劑量可在治療的第一療程后立即進(jìn)行或在幾天、幾周或幾個(gè)月的間隔后進(jìn)行，以實(shí)現(xiàn)腫瘤生長的抑制。評估可通過本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)確定，包括診斷方法諸如成像技術(shù)、血清腫瘤標(biāo)志物分析、活組織檢查、腫瘤相關(guān)癥狀的存在、不存在或改善。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法和組合物引起的免疫應(yīng)答包括CD8⁺T細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答。在另一個(gè)實(shí)施例中，免疫應(yīng)答主要由CD8⁺T細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答組成。在另一個(gè)實(shí)施例中，免疫應(yīng)答的僅有可檢測組成部分是CD8⁺T細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供的方法和組合物引起的免疫應(yīng)答包括CD4⁺T細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答。在另一個(gè)實(shí)施例中，免疫應(yīng)答主要由CD4⁺T細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答組成。在另一個(gè)實(shí)施例中，免疫應(yīng)答的僅有可檢測組成部分是CD4⁺T細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答。在另一個(gè)實(shí)施例中，CD4⁺T細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答伴有對抗原的可測定抗體應(yīng)答。在另一個(gè)實(shí)施例中，CD4⁺T細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答不伴有對抗原的可測定抗體應(yīng)答。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供誘導(dǎo)受試者的對抗原的次優(yōu)勢CD8⁺T細(xì)胞表位的CD8⁺T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括以下步驟：(a)使編碼Her2-neu嵌合抗原或其片段的核苷酸分子融合至編碼LLO蛋白的N-末端片段的核苷酸分子，從而形成編碼LLO-抗原融合蛋白的重組核苷酸；以及(b)將重組核苷酸或LLO-抗原融合體施用于受試者；從而誘導(dǎo)對抗原的次優(yōu)勢CD8⁺T細(xì)胞表位的CD8⁺T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。

在一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了提高腫瘤內(nèi)CD8+/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比率的方法，其中并且在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括將包含本發(fā)明的重組多肽、重組李斯特菌或重組載體的組合物施用于受試者的步驟。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了提高腫瘤內(nèi)CD8+/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比率的方法，其中并且在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括將包含本發(fā)明的重組多肽、重組李斯特菌或重組載體的組合物施用于受試者的步驟。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供的方法和組合物引起的免疫應(yīng)答包括對抗原的至少一個(gè)次優(yōu)勢表位的免疫應(yīng)答。在另一個(gè)實(shí)施例中，免疫應(yīng)答不包括對次優(yōu)勢表位的免疫應(yīng)答。在另一個(gè)實(shí)施例中，免疫應(yīng)答主要由對至少一個(gè)次優(yōu)勢表位的免疫應(yīng)答組成。在另一個(gè)實(shí)施例中，免疫應(yīng)答的僅有可測定組成部分是對至少一個(gè)次優(yōu)勢表位的免疫應(yīng)答。每種類型的免疫應(yīng)答表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施例。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法破壞了受試者對HER2/表達(dá)腫瘤或所述受試者的癌癥的耐受性，其中并且在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括將包含本文提供的重組李斯特菌疫苗株的組合物施用于受試者的步驟。

測定免疫應(yīng)答的方法是本領(lǐng)域熟知的，并且包括如測定腫瘤生長的抑制、流式細(xì)胞術(shù)、靶細(xì)胞裂解分析(如，鉻釋放分析)、四聚物的使用等等。每種方法表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施例。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供延緩或抑制受試者的來源于Her-2表達(dá)腫瘤的轉(zhuǎn)移性疾病的方法，其中并且在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括將包含融合至HER2嵌合蛋白或其片段的LLO蛋白的N-末端片段的重組多肽或編碼重組多肽的重組核苷酸施用于受試者，其中該受試者產(chǎn)生對HER2表達(dá)腫瘤的免疫應(yīng)答，從而延緩或抑制受試者的來源于HER2表達(dá)腫瘤的轉(zhuǎn)移性疾病。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供改善HER2嵌合蛋白的抗原性的方法，其中并且在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括使編碼LLO蛋白的N-末端片段的核苷酸融合至編碼Her-2蛋白或其片段的核苷酸，以形成重組多肽的步驟，從而改善HER2嵌合蛋白的抗原性。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了改善HER2嵌合蛋白的抗原性的方法，其中并且在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括將李斯特菌菌株工程化為表達(dá)重組核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施例中，使用不同的細(xì)菌載體表達(dá)重組核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)菌載體是減毒的。在另一個(gè)實(shí)施例中，使用DNA疫苗(如，裸DNA疫苗)表達(dá)重組核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施例中，核苷酸編碼的LLO-HER2嵌合體融合肽的施用通過重組生成蛋白，然后將重組蛋白施用于受試者來進(jìn)行。每種可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施例。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供用于腫瘤的“表位擴(kuò)展”的方法。在另一個(gè)實(shí)施例中，使用本文提供的組合物和方法的免疫誘導(dǎo)具有除本發(fā)明的疫苗攜帶的抗原之外的抗原的其他腫瘤上的表位擴(kuò)展。

在另一個(gè)實(shí)施例中，優(yōu)勢表位或次優(yōu)勢表位在進(jìn)行治療的受試者中分別是優(yōu)勢的或次優(yōu)勢的。在另一個(gè)實(shí)施例中，優(yōu)勢表位或次優(yōu)勢表位在進(jìn)行治療的群體中是優(yōu)勢的或次優(yōu)勢的。

在一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了通過表位擴(kuò)展治療、阻遏或抑制受試者的癌癥或腫瘤生長的方法，其中并且在另一個(gè)實(shí)施例中，所述癌癥與本發(fā)明的組合物中包含的抗原或其片段的表達(dá)相關(guān)。在另一個(gè)實(shí)施例中，方法包括將包含本發(fā)明的重組多肽、重組李斯特菌或重組載體的組合物施用于所述受試者。在又一個(gè)實(shí)施例中，受試者產(chǎn)生對抗原表達(dá)癌癥或抗原表達(dá)腫瘤的免疫應(yīng)答，從而治療、阻遏或抑制受試者的癌癥或腫瘤生長。

在一個(gè)實(shí)施例中，“優(yōu)勢CD8⁺T細(xì)胞表位”是指蛋白或包含蛋白的病原體或癌細(xì)胞的疫苗接種、感染或惡性生長引起的超過30％的抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞識別的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語是指由此引起的超過35％的抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞識別的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語是指超過40％的抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞識別的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語是指超過45％的抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞識別的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語是指超過50％的抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞識別的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語是指超過55％的抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞識別的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語是指超過60％的抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞識別的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語是指超過65％的抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞識別的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語是指超過70％的抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞識別的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語是指超過75％的抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞識別的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語是指超過80％的抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞識別的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語是指超過85％的抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞識別的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語是指超過90％的抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞識別的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語是指超過95％的抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞識別的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語是指超過96％的抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞識別的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語是指超過97％的抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞識別的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語是指超過98％的抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞識別的表位。

在一個(gè)實(shí)施例中，“次優(yōu)勢CD8⁺T細(xì)胞表位”是指蛋白或包含蛋白的病原體或癌細(xì)胞的疫苗接種、感染或惡性生長引起的少于30％的抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞識別的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語是指少于28％的抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞識別的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語是指超過26％的抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞識別的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語是指少于24％的抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞識別的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語是指超過22％的抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞識別的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語是指少于20％的抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞識別的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語是指超過18％的抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞識別的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語是指少于16％的抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞識別的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語是指超過14％的抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞識別的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語是指超過12％的抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞識別的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語是指少于10％的抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞識別的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語是指超過8％的抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞識別的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語是指少于6％的抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞識別的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語是指少于5％的抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞識別的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語是指超過4％的抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞識別的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語是指少于3％的抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞識別的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語是指少于2％的抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞識別的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語是指少于1％的抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞識別的表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語是指少于0.5％的抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞識別的表位。

每種類型的優(yōu)勢表位和次優(yōu)勢表位表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施例。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法和組合物中的抗原以可檢測水平在受試者非腫瘤細(xì)胞上表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施例中，抗原以可檢測水平在至少某一百分比(如，0.01％、0.03％、0.1％、0.3％、1％、2％、3％或5％)的受試者非腫瘤細(xì)胞上表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施例中，“非腫瘤細(xì)胞”是指腫瘤體外的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施例中，“非腫瘤細(xì)胞”是指非惡性細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施例中，“非腫瘤細(xì)胞”是指未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施例中，非腫瘤細(xì)胞是體細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施例中，非腫瘤細(xì)胞是生殖細(xì)胞。每種可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施例。

在一個(gè)實(shí)施例中，“可檢測水平”是指可使用標(biāo)準(zhǔn)分析檢測的水平。在一個(gè)實(shí)施例中，分析是免疫分析。在一個(gè)實(shí)施例中，分析是酶聯(lián)免疫分析(ELISA)。在另一個(gè)實(shí)施例中，分析是Western印跡。在另一個(gè)實(shí)施例中，分析是FACS。技術(shù)人員將會知道，本文提供的方法可使用本領(lǐng)域可用的任何其他分析。在另一個(gè)實(shí)施例中，可檢測水平相對于具體分析的背景水平確定。用于執(zhí)行每種這些技術(shù)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且每種技術(shù)表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施例。

在一個(gè)實(shí)施例中，使用重組抗原表達(dá)LM進(jìn)行疫苗接種誘導(dǎo)了表位擴(kuò)展。在另一個(gè)實(shí)施例中，即使在Her2的范圍外，使用LLO-抗原融合體的疫苗接種也誘導(dǎo)了表位擴(kuò)展。每種可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施例。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供阻礙受試者中HER2表達(dá)腫瘤的生長的方法，該方法包括將包含融合至HER2嵌合抗原的LLO蛋白的N-末端片段的重組多肽施用于受試者，其中抗原具有一個(gè)或多個(gè)次優(yōu)勢CD8⁺T細(xì)胞表位，其中受試者產(chǎn)生對抗原表達(dá)腫瘤的免疫應(yīng)答，從而阻礙受試者中HER2表達(dá)腫瘤的生長。在另一個(gè)實(shí)施例中，抗原不包含任何優(yōu)勢CD8⁺T細(xì)胞表位。在另一個(gè)實(shí)施例中，本文提供了阻礙受試者中HER2表達(dá)腫瘤生長的方法，該方法包括將包含編碼本文提供的重組多肽的重組核苷酸的李斯特菌的重組形式施用于受試者。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供誘導(dǎo)在患有癌癥的宿主中形成細(xì)胞毒性T細(xì)胞的方法，該方法包括將本發(fā)明的組合物施用于宿主，從而誘導(dǎo)在患有癌癥的宿主中形成細(xì)胞毒性T細(xì)胞。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供減少癌癥發(fā)生的方法，該方法包括施用本發(fā)明的組合物。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供改善癌癥的方法，該方法包括施用本發(fā)明的組合物。每種可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施例。

在一個(gè)實(shí)施例中，將組合物離體施用于受試者的細(xì)胞；在另一個(gè)實(shí)施例中，將組合物離體施用于供體的細(xì)胞；在另一個(gè)實(shí)施例中，將組合物體內(nèi)施用于供體的細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)移到受試者。每種可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施例。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法治療的癌癥是乳腺癌。在另一個(gè)實(shí)施例中，癌癥是含Her2癌癥。在另一個(gè)實(shí)施例中，癌癥是黑素瘤。在另一個(gè)實(shí)施例中，癌癥是胰腺癌。在另一個(gè)實(shí)施例中，癌癥是卵巢癌。在另一個(gè)實(shí)施例中，癌癥是胃癌。在另一個(gè)實(shí)施例中，癌癥是胰腺的癌性灶。在另一個(gè)實(shí)施例中，癌癥是肺腺癌。在另一個(gè)實(shí)施例中，癌癥是結(jié)腸直腸腺癌。在另一個(gè)實(shí)施例中，癌癥是肺鱗狀腺癌。在另一個(gè)實(shí)施例中，癌癥是胃腺癌。在另一個(gè)實(shí)施例中，癌癥是卵巢表面上皮瘤(如，它們的良性、增生性或惡性形式)。在另一個(gè)實(shí)施例中，癌癥是口腔鱗狀上皮細(xì)胞癌。在另一個(gè)實(shí)施例中，癌癥是非小細(xì)胞肺癌。在另一個(gè)實(shí)施例中，癌癥是CNS癌癥。在另一個(gè)實(shí)施例中，癌癥是子宮內(nèi)膜癌。在另一個(gè)實(shí)施例中，癌癥是膀胱癌。在另一個(gè)實(shí)施例中，癌癥是間皮瘤。在另一個(gè)實(shí)施例中，癌癥是惡性間皮瘤(MM)。在另一個(gè)實(shí)施例中，癌癥是頭頸癌。在另一個(gè)實(shí)施例中，癌癥是前列腺癌。在另一個(gè)實(shí)施例中，癌癥是骨肉瘤。在另一個(gè)實(shí)施例中，癌癥是HER2/neu表達(dá)骨肉瘤。在另一個(gè)實(shí)施例中，骨肉瘤是犬科動物骨肉瘤。在另一個(gè)實(shí)施例中，骨肉瘤是局部骨肉瘤。在另一個(gè)實(shí)施例中，骨肉瘤是轉(zhuǎn)移性骨肉瘤。在另一個(gè)實(shí)施例中，骨肉瘤是高度骨肉瘤。在另一個(gè)實(shí)施例中，骨肉瘤是犬科動物肢體骨肉瘤。

在本發(fā)明的方法的另一個(gè)實(shí)施例中，受試者產(chǎn)生對抗原表達(dá)腫瘤或靶抗原的免疫應(yīng)答，從而介導(dǎo)抗腫瘤效應(yīng)。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供用于治療癌癥的免疫原性組合物，該組合物包含截短的LLO與HER2嵌合蛋白的融合體。在另一個(gè)實(shí)施例中，免疫原性組合物還包含表達(dá)該融合體的李斯特菌菌株。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供用于治療癌癥的免疫原性組合物，該組合物包含表達(dá)HER2嵌合蛋白的李斯特菌菌株。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的治療方案是治療性的。在另一個(gè)實(shí)施例中，方案是預(yù)防性的。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的疫苗或組合物用于保護(hù)由于家族遺傳或使其傾向于患有這些類型疾病的其他情況而存在癌癥(諸如乳腺癌或其他類型的含HER2腫瘤)風(fēng)險(xiǎn)的人，如技術(shù)人員所理解。在另一個(gè)實(shí)施例中，疫苗在通過手術(shù)、常規(guī)化療或放療摧毀腫瘤生長后用作癌癥免疫療法。在此類治療后，本發(fā)明的疫苗的施用使得對疫苗的腫瘤抗原的CTL應(yīng)答破壞了其余的轉(zhuǎn)移并且延長了癌癥的緩解。在另一個(gè)實(shí)施例中，疫苗與手術(shù)、常規(guī)化療或放療聯(lián)合用作癌癥免疫療法。在另一個(gè)實(shí)施例中，此類聯(lián)合治療用于不能經(jīng)受截肢的受試者。在另一個(gè)實(shí)施例中，此類聯(lián)合治療用于患有原發(fā)性骨肉瘤的不能經(jīng)受截肢的受試者。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的疫苗用于影響此前建立的腫瘤的生長和殺死現(xiàn)有的腫瘤細(xì)胞。

在一個(gè)實(shí)施例中，“腫瘤抗原或其片段”、“腫瘤相關(guān)抗原或其片段”、“異源性抗原或其片段”或“抗原肽或其片段”在本文中可互換使用，并且包括本領(lǐng)域已知的任何抗原，包括腫瘤抗原、血管新生抗原或感染性疾病抗原。在另一個(gè)實(shí)施例中，抗原是自體抗原。

在一個(gè)實(shí)施例中，本文提供的抗原來源于腫瘤相關(guān)抗原，在一個(gè)實(shí)施例中，它是以下腫瘤抗原中的一者：生存素、MAGE(黑素瘤相關(guān)抗原E)蛋白如MAGE1、MAGE 2、MAGE 3、MAGE 4、酪氨酸酶；突變r(jià)as蛋白；突變p53蛋白；p97黑素瘤抗原、晚期癌癥相關(guān)的ras肽或p53肽；子宮頸癌相關(guān)的HPV 16/18抗原、乳腺癌相關(guān)的KLH抗原、結(jié)腸直腸癌相關(guān)的CEA(癌胚抗原)、gp100、黑素瘤相關(guān)的MART1抗原或前列腺癌相關(guān)的PSA抗原。在另一個(gè)實(shí)施例中，用于本文提供的組合物和方法的抗原是黑素瘤相關(guān)抗原，在一個(gè)實(shí)施例中，它是TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、gp-100、酪氨酸酶、HSP-70、β-HCG或它們的組合。本發(fā)明還設(shè)想了本領(lǐng)域已知的其他腫瘤相關(guān)抗原。

在另一個(gè)實(shí)施例中，抗原或其片段來源于選自HPV-E7(來自HPV16或HPV18菌株)、HPV-E6(來自HPV16或HPV18菌株)、Her-2/neu、NY-ESO-1、端粒酶(TERT)、SCCE、CEA、LMP-1、p53、碳酸酐酶IX(CAIX)、PSMA、前列腺干細(xì)胞抗原(PSCA)、HMW-MAA、WT-1、HIV-1Gag、蛋白酶3、酪氨酸酶相關(guān)蛋白2、PSA(前列腺特異性抗原)、EGFR-III、生存素、凋亡重復(fù)序列包含棒狀病毒抑制因子5(BIRC5)、LMP-1、p53、PSMA、PSCA、Muc1、PSA(前列腺特異性抗原)或它們的組合的抗原。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的組合物和方法用于針對腫瘤或癌癥的疫苗接種。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的治療方案是治療性的。在另一個(gè)實(shí)施例中，方案是預(yù)防性的。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的疫苗或組合物用于保護(hù)由于家族遺傳或使其傾向于患有這些類型疾病的其他情況而存在癌癥(諸如乳腺癌或其他類型的含HER2腫瘤)風(fēng)險(xiǎn)的人，如技術(shù)人員所理解。在另一個(gè)實(shí)施例中，疫苗在通過手術(shù)、常規(guī)化療或放療摧毀腫瘤生長后用作癌癥免疫療法。在此類治療后，本發(fā)明的疫苗的施用使得對疫苗的腫瘤抗原的CTL應(yīng)答破壞了其余的轉(zhuǎn)移并且延長了癌癥的緩解。在另一個(gè)實(shí)施例中，疫苗與手術(shù)或常規(guī)化療聯(lián)合用作癌癥免疫療法。在另一個(gè)實(shí)施例中，此類聯(lián)合治療用于不能經(jīng)受截肢的受試者。在另一個(gè)實(shí)施例中，此類聯(lián)合治療用于患有原發(fā)性骨肉瘤的不能經(jīng)受截肢的受試者。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的疫苗用于影響此前建立的腫瘤的生長和殺死現(xiàn)有的腫瘤細(xì)胞。

在另一個(gè)實(shí)施例中，上述任何方法所用的疫苗和免疫原性組合物具有本發(fā)明的疫苗和免疫原性組合物的任何特性。每種特性表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施例。

本發(fā)明設(shè)想了劑量范圍的各種實(shí)施例。在一個(gè)實(shí)施例中，就疫苗載體而言，劑量在0.4LD₅₀/劑的范圍內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為約0.4-4.9LD₅₀/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為約0.5-0.59LD₅₀/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為約0.6-0.69LD₅₀/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為約0.7-0.79LD₅₀/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為約0.8LD₅₀/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為0.4LD₅₀/劑至0.8LD₅₀/劑。

在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為10⁷個(gè)細(xì)菌/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為1.5×10⁷個(gè)細(xì)菌/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為2×10⁷個(gè)細(xì)菌/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為3×10⁷個(gè)細(xì)菌/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為4×10⁷個(gè)細(xì)菌/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為6×10⁷個(gè)細(xì)菌/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為8×10⁷個(gè)細(xì)菌/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為1×10⁸個(gè)細(xì)菌/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為1.5×10⁸個(gè)細(xì)菌/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為2×10⁸個(gè)細(xì)菌/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為3×10⁸個(gè)細(xì)菌/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為4×10⁸個(gè)細(xì)菌/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為6×10⁸個(gè)細(xì)菌/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為8×10⁸個(gè)細(xì)菌/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為1×10⁹個(gè)細(xì)菌/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為1.5×10⁹個(gè)細(xì)菌/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為2×10⁹個(gè)細(xì)菌/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為3×10⁹個(gè)細(xì)菌/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為5×10⁹個(gè)細(xì)菌/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為6×10⁹個(gè)細(xì)菌/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為8×10⁹個(gè)細(xì)菌/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為1×10¹⁰個(gè)細(xì)菌/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為1.5×10¹⁰個(gè)細(xì)菌/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為2×10¹⁰個(gè)細(xì)菌/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為3×10¹⁰個(gè)細(xì)菌/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為5×10¹⁰個(gè)細(xì)菌/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為6×10¹⁰個(gè)細(xì)菌/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為8×10¹⁰個(gè)細(xì)菌/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為8×10⁹個(gè)細(xì)菌/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為1×10¹¹個(gè)細(xì)菌/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為1.5×10¹¹個(gè)細(xì)菌/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為2×10¹¹個(gè)細(xì)菌/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為3×10¹¹個(gè)細(xì)菌/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為5×10¹¹個(gè)細(xì)菌/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為6×10¹¹個(gè)細(xì)菌/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為8×10¹¹個(gè)細(xì)菌/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為5.0×10⁸個(gè)細(xì)菌/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，劑量為3.3×10⁹個(gè)細(xì)菌/劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，用于本文提供的方法的組合物包含3.3×10⁹個(gè)李斯特菌/劑。每種可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施例。

在一個(gè)實(shí)施例中，將本發(fā)明的疫苗或免疫原性組合物單獨(dú)施用于受試者。在另一個(gè)實(shí)施例中，疫苗或免疫原性組合物與另一種癌癥療法一起施用。每種可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施例。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法和組合物的重組李斯特菌與編碼HER2嵌合抗原或LLO-HER2嵌合抗原融合體的構(gòu)建體一起穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。在一個(gè)實(shí)施例中，構(gòu)建體包含多接頭以有利于另外的亞克隆。制備重組李斯特菌的多種技術(shù)是已知的。

在一個(gè)實(shí)施例中，使用同源重組將構(gòu)建體或核酸分子整合進(jìn)李斯特菌染色體。同源重組技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的，并且例如在Baloglu S,Boyle SM,et al.(Immune responses of mice to vaccinia virus recombinants expressing either Listeriamonocytogenes partial listeriolysin or Brucella abortus ribosomal L7/L12protein.Vet Microbiol 2005,109(1-2):11-7)和Jiang LL,Song HH,et al.,(Characterization of a mutant Listeriamonocytogenes strain expressing green fluorescent protein.Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai)2005,37(1):19-24)中有所描述。在另一個(gè)實(shí)施例中，同源重組如美國專利No.6,855,320中所述進(jìn)行。在這種情況下，表達(dá)E7的重組LM菌株通過E7基因(在hly啟動子控制下，并且包括hly信號序列，以確?；虍a(chǎn)物的分泌)的染色體整合來制備，從而得到稱為Lm-AZ/E7的重組體。在另一個(gè)實(shí)施例中，使用溫敏型質(zhì)粒選擇重組體。每種技術(shù)表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施例。

在另一個(gè)實(shí)施例中，使用轉(zhuǎn)座子插入將構(gòu)建體或核酸分子整合進(jìn)李斯特菌染色體。轉(zhuǎn)座子插入技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的，并且特別是由Sun et al.(Infection and Immunity 1990,58:3770-3778)在DP-L967的構(gòu)建中進(jìn)行了描述。在另一個(gè)實(shí)施例中，轉(zhuǎn)座子誘變具有可形成穩(wěn)定基因組插入突變體的優(yōu)點(diǎn)，但也具有外源基因插入基因組的位置未知的缺點(diǎn)。

在另一個(gè)實(shí)施例中，使用噬菌體整合位點(diǎn)將構(gòu)建體或核酸分子整合進(jìn)李斯特菌染色體(Lauer P,Chow MY et al,Construction,characterization,and use of two Listeriamonocytogenes site-specific phage integration vectors.J Bacteriol 2002；184(15):4177-86)。在此方法的某些實(shí)施例中，使用噬菌體的整合酶基因和連接位點(diǎn)(如，U153或PSA李斯特菌噬菌體)將異源性基因插入對應(yīng)的連接位點(diǎn)，該連接位點(diǎn)可以是基因組中的任何適當(dāng)位點(diǎn)(如，comK或arg tRNA基因的3’末端)。在另一個(gè)實(shí)施例中，在構(gòu)建體或異源性基因的整合之前從所用的連接位點(diǎn)治愈內(nèi)源性原噬菌體。在另一個(gè)實(shí)施例中，此方法形成單拷貝整合子。每種可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施例。

在另一個(gè)實(shí)施例中，使用各種啟動子中的一者表達(dá)抗原或包含該抗原的融合蛋白。在一個(gè)實(shí)施例中，使用Lm啟動子，如基因hly、actA、plca、plcB和mpl的啟動子，這些基因分別編碼李斯特菌蛋白溶血素、actA、磷脂酰肌醇特異性磷脂酶、磷脂酶C和金屬蛋白酶。每種可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施例。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法和組合物采用HER2嵌合蛋白的同源物或本發(fā)明的LLO序列。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法和組合物采用非人類哺乳動物的HER2嵌合蛋白。在一個(gè)實(shí)施例中，當(dāng)術(shù)語“同源性”、“同源的”等涉及任何蛋白或肽時(shí)，是指在對齊序列和引入空位(如有必要)，以實(shí)現(xiàn)最大同源性百分比，并且不考慮作為序列同一性的一部分的任何保守置換之后，候選序列中與對應(yīng)天然多肽的殘基相同的氨基酸殘基的百分比。用于比對的方法和計(jì)算機(jī)程序是本領(lǐng)域熟知的。

在另一個(gè)實(shí)施例中，類似地，當(dāng)術(shù)語“同源性”涉及任何核酸序列時(shí)，表示候選序列中與對應(yīng)天然核酸序列的核苷酸相同的核苷酸的百分比。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供編碼信號肽或本發(fā)明的重組多肽或融合蛋白的分離的核酸。在一個(gè)實(shí)施例中，分離的核酸包含與編碼信號肽或本發(fā)明的重組多肽或融合蛋白的核酸共有至少65％同源性的序列。在另一個(gè)實(shí)施例中，分離的核酸包含與編碼信號肽或本發(fā)明的重組多肽或融合蛋白的核酸共有至少75％同源性的序列。在另一個(gè)實(shí)施例中，分離的核酸包含與編碼信號肽或本發(fā)明的重組多肽或融合蛋白的核酸共有至少85％同源性的序列。在另一個(gè)實(shí)施例中，分離的核酸包含與編碼信號肽或本發(fā)明的重組多肽或融合蛋白的核酸共有至少90％同源性的序列。在另一個(gè)實(shí)施例中，分離的核酸包含與編碼信號肽或本發(fā)明的重組多肽或融合蛋白的核酸共有至少95％同源性的序列。在另一個(gè)實(shí)施例中，分離的核酸包含與編碼信號肽或本發(fā)明的重組多肽或融合蛋白的核酸共有至少97％同源性的序列。在另一個(gè)實(shí)施例中，分離的核酸包含與編碼信號肽或本發(fā)明的重組多肽或融合蛋白的核酸共有至少99％同源性的序列。

在一個(gè)實(shí)施例中，同源性通過本領(lǐng)域詳細(xì)描述的方法由序列比對的計(jì)算機(jī)算法確定。例如，核酸序列同源性的計(jì)算機(jī)算法分析可包括采用可得自諸如BLAST、DOMAIN、BEAUTY(BLAST Enhanced Alignment Utility)、GENPEPT和TREMBL軟件包的多個(gè)軟件包。

在另一個(gè)實(shí)施例中，“同源性”是指與選自本文提供的序列(核酸或氨基酸序列)的序列的同一性大于65％。在另一個(gè)實(shí)施例中，“同源性”是指與選自本文提供的序列的序列的同一性大于70％。在另一個(gè)實(shí)施例中，同一性大于75％。在另一個(gè)實(shí)施例中，同一性大于78％。在另一個(gè)實(shí)施例中，同一性大于80％。在另一個(gè)實(shí)施例中，同一性大于82％。在另一個(gè)實(shí)施例中，同一性大于83％。在另一個(gè)實(shí)施例中，同一性大于85％。在另一個(gè)實(shí)施例中，同一性大于87％。在另一個(gè)實(shí)施例中，同一性大于88％。在另一個(gè)實(shí)施例中，同一性大于90％。在另一個(gè)實(shí)施例中，同一性大于92％。在另一個(gè)實(shí)施例中，同一性大于93％。在另一個(gè)實(shí)施例中，同一性大于95％。在另一個(gè)實(shí)施例中，同一性大于96％。在另一個(gè)實(shí)施例中，同一性大于97％。在另一個(gè)實(shí)施例中，同一性大于98％。在另一個(gè)實(shí)施例中，同一性大于99％。在另一個(gè)實(shí)施例中，同一性為100％。每種可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施例。

在另一個(gè)實(shí)施例中，同源性通過候選序列雜交測定來確定，其方法是本領(lǐng)域熟知的(參見例如“Nucleic Acid Hybridization"Hames,B.D.,and Higgins S.J.,Eds.(1985)；Sambrook et al.,2001,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,N.Y.；and Ausubel et al.,1989,Current Protocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y)。例如，與編碼天然半胱天冬酶肽的DNA的互補(bǔ)序列雜交的方法可在中度至嚴(yán)格條件下進(jìn)行。雜交條件為例如在溶液中42℃下溫育過夜，該溶液包含：10-20％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl、15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH 7.6)、5×Denhardt溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml變性剪切鮭精DNA。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，“核酸”是指一串至少兩個(gè)堿基-糖-磷酸組合。在一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語包括DNA和RNA。在一個(gè)實(shí)施例中，“核苷酸”是指核酸聚合物的單體單元。在一個(gè)實(shí)施例中，RNA可為tRNA(轉(zhuǎn)運(yùn)RNA)、snRNA(小核RNA)、rRNA(核糖體RNA)、mRNA(信使RNA)、反義RNA、小干擾RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)和核糖酶的形式。siRNA和miRNA的使用已有所描述(Caudy AA et al,Genes&Devel 16:2491-96和其中引用的參考文獻(xiàn))。DNA可以是質(zhì)粒DNA、病毒DNA、線性DNA或染色體DNA或這些分組的衍生物的形式。此外，這些形式的DNA和RNA可以是單鏈、雙鏈、三鏈或四鏈的。在另一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語還包括可包含其他類型的主鏈但具有相同堿基的人工核酸。在一個(gè)實(shí)施例中，人工核酸是PNA(肽核酸)。PNA包含肽主鏈和核苷酸堿基，并且在一個(gè)實(shí)施例中能夠結(jié)合DNA和RNA兩種分子。在另一個(gè)實(shí)施例中，核苷酸是氧雜環(huán)丁烷修飾的。在另一個(gè)實(shí)施例中，核苷酸通過用硫代磷酸鍵代替一個(gè)或多個(gè)磷酸二酯鍵來修飾。在另一個(gè)實(shí)施例中，人工核酸包含本領(lǐng)域已知的天然核酸的磷酸主鏈的任何其他變體。硫代磷酸核酸和PNA的使用是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，并且在例如Neilsen PE,Curr Opin Struct Biol 9:353-57和Raz NK et al Biochem Biophys Res Commun.297:1075-84中有所描述。核酸的制備和使用是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，并且在例如Molecular Cloning,(2001),Sambrook and Russell,eds.和Methods in Enzymology:Methods for molecular cloning in eukaryotic cells(2003)Purchio and G.C.Fareed中有所描述。每種核酸衍生物表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施例。

在一個(gè)實(shí)施例中，通過本領(lǐng)域熟知的方法，包括免疫印跡分析，或采用任何多種可用的軟件包通過氨基酸序列的計(jì)算機(jī)算法分析，通過已建立的方法確定本文列出的任何氨基酸序列的蛋白和/或肽同源性。這些軟件包中的一些可包括FASTA、BLAST、MPsrch或Scanps軟件包，并且可采用例如Smith和Waterman算法和/或分析的全局/局部或BLOCKS比對。每種確定同源性的方法表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施例。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供包括用于執(zhí)行本發(fā)明的方法的試劑的試劑盒。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供包括本發(fā)明的組合物、工具或儀器的試劑盒。

在一個(gè)實(shí)施例中，術(shù)語“接觸”或“施用”是指使本發(fā)明的組合物直接接觸癌細(xì)胞或腫瘤。在另一個(gè)實(shí)施例中，該術(shù)語是指使本發(fā)明的組合物間接接觸癌細(xì)胞或腫瘤。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法包括其中受試者接觸本發(fā)明的組合物，然后組合物通過擴(kuò)散或本領(lǐng)域已知的任何其他主動運(yùn)輸或被動運(yùn)輸過程(化合物通過該過程在體內(nèi)循環(huán))接觸癌細(xì)胞或腫瘤的方法。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法可包括至少單次施用本發(fā)明的組合物，其中在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法可包括多次施用本發(fā)明的組合物。每種可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施例。

在另一個(gè)實(shí)施例中，術(shù)語“基因”和“重組基因”是指包含編碼本發(fā)明的多肽的開放閱讀框的核酸分子。此類天然等位基因變異通常可導(dǎo)致給定基因的核苷酸序列的1-5％變化。可通過多個(gè)不同個(gè)體或生物體中所關(guān)注的基因的測序鑒定替代等位基因。這易于通過使用雜交探針鑒定多個(gè)個(gè)體或生物體中相同的遺傳基因座來進(jìn)行。作為天然等位基因變異的結(jié)果并且不改變功能活性的任何和所有此類核苷酸變異和所得的氨基酸多態(tài)性或變異均旨在在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。

藥物組合物

在另一個(gè)實(shí)施例中，通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任何方法，諸如腸胃外、癌旁側(cè)、經(jīng)粘膜、鼻內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、腹腔內(nèi)、心室內(nèi)、顱內(nèi)、陰道內(nèi)或腫瘤內(nèi)將包含本發(fā)明的疫苗和組合物的藥物組合物施用于受試者。

在本文提供的方法和組合物的另一個(gè)實(shí)施例中，疫苗或組合物口服施用，因此配制為適用于口服施用的形式，即固體或液體制劑。合適的固體口服制劑包括片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、小丸劑等等。合適的液體口服制劑包括溶液、懸浮液、分散體、乳劑、油劑等等。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，活性成分配制為膠囊劑。根據(jù)該實(shí)施例，除活性化合物和惰性載體或稀釋劑之外，本發(fā)明的組合物還包括硬明膠膠囊。

在另一個(gè)實(shí)施例中，疫苗或組合物通過液體制劑的靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)或肌肉內(nèi)注射施用。合適的液體制劑包括溶液、懸浮液、分散體、乳劑、油劑等等。在一個(gè)實(shí)施例中，藥物組合物靜脈內(nèi)施用，因此配制為適用于靜脈內(nèi)施用的形式。在另一個(gè)實(shí)施例中，藥物組合物動脈內(nèi)施用，因此配制為適用于動脈內(nèi)施用的形式。在另一個(gè)實(shí)施例中，藥物組合物肌肉內(nèi)施用，因此配制為適用于肌肉內(nèi)施用的形式。

在一個(gè)實(shí)施例中，術(shù)語“治療”是指治愈疾病。在另一個(gè)實(shí)施例中，“治療”是指防止疾病。在另一個(gè)實(shí)施例中，“治療”是指減少疾病的發(fā)生。在另一個(gè)實(shí)施例中，“治療”是指改善疾病的癥狀。在另一個(gè)實(shí)施例中，“治療”是指提高患者的無進(jìn)展存活期或總體存活期。在另一個(gè)實(shí)施例中，“治療”是指穩(wěn)定疾病的進(jìn)展。在另一個(gè)實(shí)施例中，“治療”是指誘導(dǎo)緩解。在另一個(gè)實(shí)施例中，“治療”是指減緩疾病的進(jìn)展。在另一個(gè)實(shí)施例中，術(shù)語“減少”、“阻遏”和“抑制”是指減輕或降低。每種可能性表示本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施例。

如本文所用，術(shù)語“約”是數(shù)量術(shù)語，意指加或減5％，或在另一個(gè)實(shí)施例中，加或減10％，或在另一個(gè)實(shí)施例中，加或減15％，或在另一個(gè)實(shí)施例中，加或減20％。

技術(shù)人員理解，術(shù)語“受試者”可涵蓋哺乳動物，包括需要治療病癥或其后遺癥或易受其影響的人類成人或兒童、少年或青少年，并且還可包括非人類哺乳動物，諸如狗、貓、豬、乳牛、綿羊、山羊、馬、大鼠和小鼠。還將認(rèn)識到，該術(shù)語可涵蓋牲畜。無論如何，術(shù)語“受試者”都不排除正常個(gè)體。

在一個(gè)實(shí)施例中，術(shù)語“受試者”還涵蓋寵物狗和貓，包括不能經(jīng)受截肢的狗和貓。在另一個(gè)實(shí)施例中，術(shù)語“受試者”還涵蓋不能經(jīng)受手術(shù)的人。在另一個(gè)實(shí)施例中，術(shù)語“受試者”還涵蓋不能經(jīng)受截肢的人。在另一個(gè)實(shí)施例中，術(shù)語“受試者”還涵蓋人類兒童。

技術(shù)人員將會知道，出于治療目的，術(shù)語“哺乳動物”是指被歸為哺乳動物的任何動物，包括但不限于人、家畜和農(nóng)畜以及動物園、比賽動物或?qū)櫸?，諸如包括狗的犬科動物和馬、貓、黃牛、豬、綿羊等。

涉及腫瘤治療的“治療有效量”是指能夠產(chǎn)生一種或多種以下效應(yīng)的量：(1)在一定程度上抑制腫瘤生長，包括減緩和完全生長停滯；(2)減少腫瘤細(xì)胞的數(shù)量；(3)減小腫瘤的大小；(4)抑制(即，減少、緩解或完全阻止)腫瘤細(xì)胞浸潤外周器官；(5)抑制(即，減少、緩解或完全阻止)轉(zhuǎn)移；(6)增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答，這可以(但不一定)導(dǎo)致腫瘤消退或排斥；和/或(7)在一定程度上減輕與失調(diào)相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)癥狀。出于腫瘤治療的目的，本文提供的疫苗的“治療有效量”可憑經(jīng)驗(yàn)以及以慣例方式確定。

提供以下實(shí)例以更完整地示出本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例。然而，它們無論如何都不應(yīng)被解釋為限制本發(fā)明的廣泛范圍。

實(shí)例

材料和方法

寡核苷酸由Invitrogen(Carlsbad,CA)合成，DNA測序由Genewiz Inc,South Plainfield,NJ進(jìn)行。流式細(xì)胞術(shù)試劑購自Becton Dickinson Biosciences(BD,San Diego,CA)。除非另外指明，否則細(xì)胞培養(yǎng)基、補(bǔ)充劑和所有其他試劑均購自Sigma(St.Louise,MO)。HER2/neu HLA-A2肽由EZbiolabs(Westfield,IN)合成。完全RPMI 1640(C-RPMI)培養(yǎng)基包含2mM谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸和1mM丙酮酸鈉、10％胎牛血清、青霉素/鏈霉素、Hepes(25mM)。多克隆抗LLO抗體如上文所述，并且抗HER2/neu抗體購自Sigma。

小鼠和細(xì)胞系

所有動物實(shí)驗(yàn)均根據(jù)University of Pennsylvania或Rutgers University的IACUC批準(zhǔn)的方案進(jìn)行。FVB/N小鼠購自Jackson laboratories(Bar Harbor,ME)。過表達(dá)大鼠HER2/neu癌蛋白的FVB/N HER2/neu轉(zhuǎn)基因小鼠關(guān)在University of Pennsylvania的動物飼養(yǎng)中心(animal core facility)并繁殖。表達(dá)高水平的大鼠HER2/neu蛋白的NT-2腫瘤細(xì)胞系來源于這些小鼠的自發(fā)性乳腺腫瘤，并且如上文所述生長。DHFR-G8(3T3/neu)細(xì)胞得自ATCC并且根據(jù)ATCC推薦方案生長。EMT6-Luc細(xì)胞系由John Ohlfest博士(University of Minnesota,MN)慷慨贈送，并在完全C-RPMI培養(yǎng)基中生長。生物熒光工作在University of Pennsylvania(Philadelphia,PA)的Small Animal Imaging Facility(SAIF)的指導(dǎo)下進(jìn)行。

李斯特菌構(gòu)建體和抗原表達(dá)

HER2/neu-pGEM7Z由University of Pennsylvania的Mark Greene博士友情提供，并且包含克隆至pGEM7Z質(zhì)粒(Promega,Madison WI)的全長人HER2/neu(hHer2)基因。該質(zhì)粒用作擴(kuò)增三個(gè)hHER2/neu片段的模板，即EC1、EC2和IC1，該擴(kuò)增使用pfx DNA聚合酶(Invitrogen)和表1示出的寡核苷酸通過PCR進(jìn)行。

表1：人HER2-嵌合體的克隆引物

HER2/neu嵌合構(gòu)建體通過SOEing PCR法直接融合生成，每個(gè)單獨(dú)的hHER2/neu片段作為模板。引物在表2中示出。

用于擴(kuò)增不同片段人Her2區(qū)域的引物序列

使用XhoI和SpeI限制性酶從pAdv138切下ChHer2基因，并與Lmdd穿梭載體pAdv134中截短的LLO非溶血片段在同一閱讀框內(nèi)克隆。插入序列LLO和hly啟動子通過DNA測序分析確認(rèn)。將該質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)化至電感受態(tài)actA、dal、dat突變單核細(xì)胞增多性李斯特菌菌株，在包含鏈霉素(250μg/ml)的腦心浸液(BHI)瓊脂平板上選擇LmddA和陽性克隆。在一些實(shí)驗(yàn)中，表達(dá)hHER2/neu(Lm-hHER2)片段的類似李斯特菌菌株用于比較目的。這些內(nèi)容在上文有所描述。在所有研究中，包括不相關(guān)李斯特菌構(gòu)建體(Lm-對照)，以考慮到李斯特菌對免疫系統(tǒng)的抗原非依賴性效應(yīng)。Lm-對照基于與ADXS31-164相同的李斯特菌平臺，但表達(dá)不同的抗原，諸如HPV16-E7或NY-ESO-1。測試?yán)钏固鼐娜诤系鞍椎谋磉_(dá)和分泌。每個(gè)構(gòu)建體體內(nèi)傳代兩次。

細(xì)胞毒性分析

以3-5只FVB/N小鼠為一組，使用1×10⁸個(gè)集落形成單位(CFU)的Lm-LLO-ChHer2、ADXS31-164、Lm-hHer2ICI或Lm-對照(表達(dá)不相關(guān)抗原)以一周為間隔免疫三次或保持未暴露的。使NT-2細(xì)胞體外生長，通過胰蛋白酶脫壁，并用絲裂霉素C(250μg/ml，溶于無血清C-RPMI培養(yǎng)基)在37°℃下處理45分鐘。在洗滌5次后，將其與從免疫或未暴露的動物收集的脾細(xì)胞以1:5(刺激因子:應(yīng)答者)的比率在37°℃和5％CO₂下共溫育5天。標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞毒性分析使用銪標(biāo)記的3T3/neu(DHFR-G8)細(xì)胞作為靶標(biāo)根據(jù)前述方法進(jìn)行。在4小時(shí)溫育后使用分光光度計(jì)(Perkin Elmer，Victor²)在590nm下測定從殺死的靶細(xì)胞釋放的銪。特異性裂解的百分比定義為(實(shí)驗(yàn)組的裂解-自發(fā)性裂解)/(最大裂解-自發(fā)性裂解)。

免疫小鼠的脾細(xì)胞分泌的干擾素-γ

以3-5只FVB/N或HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠為一組，使用1×10⁸個(gè)CFU的陰性李斯特菌對照ADXS31-164(表達(dá)不相關(guān)抗原)以一周為間隔免疫三次或保持未暴露的。在最后免疫后一周分離FVB/N小鼠的脾細(xì)胞，并以5×10⁶個(gè)細(xì)胞/孔在24孔板中的C-RPMI培養(yǎng)基中在存在絲裂霉素C處理的NT-2細(xì)胞的情況下共培養(yǎng)。HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細(xì)胞在存在1μM HLA-A2特異性肽或1μg/ml重組His標(biāo)記ChHer2蛋白(在大腸桿菌中制備，通過基于鎳的親和色譜系統(tǒng)純化)的情況下溫育。在24或72小時(shí)后從上清液獲得樣品，使用小鼠IFN-γ酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒根據(jù)制造商的推薦方案測試干擾素-γ(IFN-γ)的存在。

INF-γELISpot分析

在每個(gè)指定的時(shí)間點(diǎn)解凍冷藏的PBMC，在37℃下放置過夜，然后計(jì)數(shù)。細(xì)胞用2.5μM重疊人HER2/Neu肽庫(11個(gè)單位重疊5個(gè)氨基酸)(表示嵌合疫苗中存在的HER2/Neu的EC1、EC2和IC1域)和重組人IL-2(Invitrogen,Fredrick,MD)刺激5天。收集細(xì)胞，在1×PBS中洗滌兩次并計(jì)數(shù)。IFN-γELISpot分析使用商業(yè)化犬科動物IFN-γELISpot分析試劑盒(R&D Systems,Minneapolis,MN)根據(jù)制造商的方案進(jìn)行。簡而言之，將0.8-2×105個(gè)經(jīng)刺激的細(xì)胞與2.5μM EC1、EC2或IC1肽庫加上IL-2或單獨(dú)的IL-2(以測定背景計(jì)數(shù))一起溫育。所有分析一式兩份地進(jìn)行。根據(jù)制造商的說明對平板顯色。使用CTL-Immunospot分析儀(C.T.L,Shaker Heights,OH)對斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)。斑點(diǎn)的數(shù)量通過減去未刺激孔中的斑點(diǎn)數(shù)量的兩倍進(jìn)行歸一化。

Her2轉(zhuǎn)基因動物中的腫瘤研究

六周齡FVB/N大鼠HER2/neu轉(zhuǎn)基因小鼠(9-14只/組)使用5×10⁸個(gè)CFU的Lm-LLO-ChHer2、ADXS31-164或Lm-對照免疫6次。每周觀察自發(fā)性乳腺腫瘤的出現(xiàn)兩次，使用電子卡尺測量腫瘤，最多52周。當(dāng)平均直徑大小達(dá)到1cm²時(shí)切下逃逸的腫瘤，在-20℃下保存于RNAlater中°。為確定HER2/neu蛋白中的突變對這些腫瘤逃逸的影響，使用基因組DNA分離試劑盒提取基因組DNA，并測序。

ADXS31-164對脾臟和腫瘤中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的作用

給小鼠皮下(s.c.)植入1×10⁶個(gè)NT-2細(xì)胞。在第7、14和21天，使用1×10⁸個(gè)CFU的ADXS31-164、LmddA-對照對它們進(jìn)行免疫或保持未暴露的。在第28天提取腫瘤和脾臟并通過FACS分析測試CD3⁺/CD4⁺/FoxP3⁺Treg的存在。簡而言之，通過在C-RPMI培養(yǎng)基中勻化兩個(gè)載玻片之間的脾臟而分離脾細(xì)胞。使用無菌刀片切碎腫瘤，并用包含DNA酶(12U/ml)和溶于PBS的膠原酶(2mg/ml)的緩沖液消化。在室溫下攪拌溫育60min后，通過猛烈吹打而分離細(xì)胞。用RBC裂解緩沖液裂解紅細(xì)胞，然后用包含10％FBS的完全RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌多次。在通過尼龍網(wǎng)過濾后，將腫瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞重懸于FACS緩沖液(2％FBS/PBS)中，用抗CD3-PerCP-Cy5.5、CD4-FITC、CD25-APC抗體染色，然后進(jìn)行透化和抗Foxp3-PE染色。使用4色FACS calibur(BD)進(jìn)行流式細(xì)胞分析，使用cell quest軟件(BD)分析數(shù)據(jù)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

將對數(shù)秩卡方檢驗(yàn)用于存活期數(shù)據(jù)，并將學(xué)生t-檢驗(yàn)用于CTL和ELISA分析，所述分析一式三份地進(jìn)行。在這些分析中，小于0.05的p-值(以*標(biāo)記)被視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均使用Prism軟件V.4.0a(2006)或SPSS軟件V.15.0(2006)進(jìn)行。對于所有FVB/N大鼠HER2/neu轉(zhuǎn)基因研究，我們使用了8-14只小鼠/組，對于所有野生型FVB/N研究，我們使用了至少8只小鼠/組，除非另外指明。除HER2/neu轉(zhuǎn)基因小鼠模型中的長期腫瘤研究外，所有研究重復(fù)至少一次。

實(shí)例1

產(chǎn)生分泌融合至Her-2片段的LLO片段的單核細(xì)胞增多性李斯特菌菌株：ADXS31-164的構(gòu)建。

嵌合HER2/neu基因(ChHer2)的構(gòu)建如上文所述。簡而言之，ChHer2基因通過SOEing PCR法直接融合HER2/neu蛋白的兩個(gè)胞外片段(aa 40-170和aa359-433)和一個(gè)胞內(nèi)片段(aa 678-808)來制備。嵌合蛋白具有蛋白的大部分已知的人MHC I類表位。從質(zhì)粒pAdv138(其用于構(gòu)建Lm-LLO-ChHer2)切下ChHer2基因并克隆至LmddA穿梭質(zhì)粒中，得到質(zhì)粒pAdv164(圖1A)。這兩個(gè)質(zhì)粒骨架之間有兩個(gè)主要差異。1)pAdv138使用氯霉素抗性標(biāo)記(cat)進(jìn)行重組細(xì)菌的體外選擇，而pAdv164具有枯草芽孢桿菌的D-丙氨酸消旋酶基因(dal)，它使用缺乏dal-dat基因的LmddA菌株中的體外選擇和體內(nèi)質(zhì)粒保持的代謝互補(bǔ)途徑。此疫苗平臺被設(shè)計(jì)和開發(fā)成解決FDA對工程化李斯特菌疫苗株的抗生素抗性的關(guān)注。2)與pAdv138不同，pAdv164不具有質(zhì)粒中的prfA基因拷貝(參見以下序列和圖1A)，因?yàn)檫@不是Lmdd菌株的體內(nèi)互補(bǔ)必需的。LmddA疫苗株還缺乏actA基因(負(fù)責(zé)李斯特菌的胞內(nèi)移動和細(xì)胞間播散)，因此來源于此骨架的重組疫苗株的毒性比來源于其親代菌株Lmdd的那些小100倍?；贚mddA的疫苗從免疫小鼠脾臟的清除也比基于Lmdd的疫苗快(在不到48小時(shí)內(nèi))。來自此菌株的融合蛋白tLLO-ChHer2的表達(dá)和分泌與在體外生長8小時(shí)后TCA沉淀細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的Lm-LLO-ChHer2相當(dāng)(圖1B)，因?yàn)槭褂肳estern印跡分析通過抗LLO抗體檢測到～104KD的條帶。僅表達(dá)tLLO的李斯特菌骨架菌株用作陰性對照。

pAdv164序列(7075個(gè)堿基對)(參見圖1)：

cggagtgtatactggcttactatgttggcactgatgagggtgtcagtgaagtgcttcatgtggcaggagaaaaaaggctgcaccggtgcgtcagcagaatatgtgatacaggatatattccgcttcctcgctcactgactcgctacgctcggtcgttcgactgcggcgagcggaaatggcttacgaacggggcggagatttcctggaagatgccaggaagatacttaacagggaagtgagagggccgcggcaaagccgtttttccataggctccgcccccctgacaagcatcacgaaatctgacgctcaaatcagtggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggcggctccctcgtgcgctctcctgttcctgcctttcggtttaccggtgtcattccgctgttatggccgcgtttgtctcattccacgcctgacactcagttccgggtaggcagttcgctccaagctggactgtatgcacgaaccccccgttcagtccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggaaagacatgcaaaagcaccactggcagcagccactggtaattgatttagaggagttagtcttgaagtcatgcgccggttaaggctaaactgaaaggacaagttttggtgactgcgctcctccaagccagttacctcggttcaaagagttggtagctcagagaaccttcgaaaaaccgccctgcaaggcggttttttcgttttcagagcaagagattacgcgcagaccaaaacgatctcaagaagatcatcttattaatcagataaaatatttctagccctcctttgattagtatattcctatcttaaagttacttttatgtggaggcattaacatttgttaatgacgtcaaaaggatagcaagactagaataaagctataaagcaagcatataatattgcgtttcatctttagaagcgaatttcgccaatattataattatcaaaagagaggggtggcaaacggtatttggcattattaggttaaaaaatgtagaaggagagtgaaacccatgaaaaaaataatgctagtttttattacacttatattagttagtctaccaattgcgcaacaaactgaagcaaaggatgcatctgcattcaataaagaaaattcaatttcatccatggcaccaccagcatctccgcctgcaagtcctaagacgccaatcgaaaagaaacacgcggatgaaatcgataagtatatacaaggattggattacaataaaaacaatgtattagtataccacggagatgcagtgacaaatgtgccgccaagaaaaggttacaaagatggaaatgaatatattgttgtggagaaaaagaagaaatccatcaatcaaaataatgcagacattcaagttgtgaatgcaatttcgagcctaacctatccaggtgctctcgtaaaagcgaattcggaattagtagaaaatcaaccagatgttctccctgtaaaacgtgattcattaacactcagcattgatttgccaggtatgactaatcaagacaataaaatagttgtaaaaaatgccactaaatcaaacgttaacaacgcagtaaatacattagtggaaagatggaatgaaaaatatgctcaagcttatccaaatgtaagtgcaaaaattgattatgatgacgaaatggcttacagtgaatcacaattaattgcgaaatttggtacagcatttaaagctgtaaataatagcttgaatgtaaacttcggcgcaatcagtgaagggaaaatgcaagaagaagtcattagttttaaacaaatttactataacgtgaatgttaatgaacctacaagaccttccagatttttcggcaaagctgttactaaagagcagttgcaagcgcttggagtgaatgcagaaaatcctcctgcatatatctcaagtgtggcgtatggccgtcaagtttatttgaaattatcaactaattcccatagtactaaagtaaaagctgcttttgatgctgccgtaagcggaaaatctgtctcaggtgatgtagaactaacaaatatcatcaaaaattcttccttcaaagccgtaatttacggaggttccgcaaaagatgaagttcaaatcatcgacggcaacctcggagacttacgcgatattttgaaaaaaggcgctacttttaatcgagaaacaccaggagttcccattgcttatacaacaaacttcctaaaagacaatgaattagctgttattaaaaacaactcagaatatattgaaacaacttcaaaagcttatacagatggaaaaattaacatcgatcactctggaggatacgttgctcaattcaacatttcttgggatgaagtaaattatgatctcgagacccacctggacatgctccgccacctctaccagggctgccaggtggtgcagggaaacctggaactcacctacctgcccaccaatgccagcctgtccttcctgcaggatatccaggaggtgcagggctacgtgctcatcgctcacaaccaagtgaggcaggtcccactgcagaggctgcggattgtgcgaggcacccagctctttgaggacaactatgccctggccgtgctagacaatggagacccgctgaacaataccacccctgtcacaggggcctccccaggaggcctgcgggagctgcagcttcgaagcctcacagagatcttgaaaggaggggtcttgatccagcggaacccccagctctgctaccaggacacgattttgtggaagaatatccaggagtttgctggctgcaagaagatctttgggagcctggcatttctgccggagagctttgatggggacccagcctccaacactgccccgctccagccagagcagctccaagtgtttgagactctggaagagatcacaggttacctatacatctcagcatggccggacagcctgcctgacctcagcgtcttccagaacctgcaagtaatccggggacgaattctgcacaatggcgcctactcgctgaccctgcaagggctgggcatcagctggctggggctgcgctcactgagggaactgggcagtggactggccctcatccaccataacacccacctctgcttcgtgcacacggtgccctgggaccagctctttcggaacccgcaccaagctctgctccacactgccaaccggccagaggacgagtgtgtgggcgagggcctggcctgccaccagctgtgcgcccgagggcagcagaagatccggaagtacacgatgcggagactgctgcaggaaacggagctggtggagccgctgacacctagcggagcgatgcccaaccaggcgcagatgcggatcctgaaagagacggagctgaggaaggtgaaggtgcttggatctggcgcttttggcacagtctacaagggcatctggatccctgatggggagaatgtgaaaattccagtggccatcaaagtgttgagggaaaacacatcccccaaagccaacaaagaaatcttagacgaagcatacgtgatggctggtgtgggctccccatatgtctcccgccttctgggcatctgcctgacatccacggtgcagctggtgacacagcttatgccctatggctgcctcttagactaatctagacccgggccactaactcaacgctagtagtggatttaatcccaaatgagccaacagaaccagaaccagaaacagaacaagtaacattggagttagaaatggaagaagaaaaaagcaatgatttcgtgtgaataatgcacgaaatcattgcttatttttttaaaaagcgatatactagatataacgaaacaacgaactgaataaagaatacaaaaaaagagccacgaccagttaaagcctgagaaactttaactgcgagccttaattgattaccaccaatcaattaaagaagtcgagacccaaaatttggtaaagtatttaattactttattaatcagatacttaaatatctgtaaacccattatatcgggtttttgaggggatttcaagtctttaagaagataccaggcaatcaattaagaaaaacttagttgattgccttttttgttgtgattcaactttgatcgtagcttctaactaattaattttcgtaagaaaggagaacagctgaatgaatatcccttttgttgtagaaactgtgcttcatgacggcttgttaaagtacaaatttaaaaatagtaaaattcgctcaatcactaccaagccaggtaaaagtaaaggggctatttttgcgtatcgctcaaaaaaaagcatgattggcggacgtggcgttgttctgacttccgaagaagcgattcacgaaaatcaagatacatttacgcattggacaccaaacgtttatcgttatggtacgtatgcagacgaaaaccgttcatacactaaaggacattctgaaaacaatttaagacaaatcaataccttctttattgattttgatattcacacggaaaaagaaactatttcagcaagcgatattttaacaacagctattgatttaggttttatgcctacgttaattatcaaatctgataaaggttatcaagcatattttgttttagaaacgccagtctatgtgacttcaaaatcagaatttaaatctgtcaaagcagccaaaataatctcgcaaaatatccgagaatattttggaaagtctttgccagttgatctaacgtgcaatcattttgggattgctcgtataccaagaacggacaatgtagaattttttgatcccaattaccgttattctttcaaagaatggcaagattggtctttcaaacaaacagataataagggctttactcgttcaagtctaacggttttaagcggtacagaaggcaaaaaacaagtagatgaaccctggtttaatctcttattgcacgaaacgaaattttcaggagaaaagggtttagtagggcgcaatagcgttatgtttaccctctctttagcctactttagttcaggctattcaatcgaaacgtgcgaatataatatgtttgagtttaataatcgattagatcaacccttagaagaaaaagaagtaatcaaaattgttagaagtgcctattcagaaaactatcaaggggctaatagggaatacattaccattctttgcaaagcttgggtatcaagtgatttaaccagtaaagatttatttgtccgtcaagggtggtttaaattcaagaaaaaaagaagcgaacgtcaacgtgttcatttgtcagaatggaaagaagatttaatggcttatattagcgaaaaaagcgatgtatacaagccttatttagcgacgaccaaaaaagagattagagaagtgctaggcattcctgaacggacattagataaattgctgaaggtactgaaggcgaatcaggaaattttctttaagattaaaccaggaagaaatggtggcattcaacttgctagtgttaaatcattgttgctatcgatcattaaattaaaaaaagaagaacgagaaagctatataaaggcgctgacagcttcgtttaatttagaacgtacatttattcaagaaactctaaacaaattggcagaacgccccaaaacggacccacaactcgatttgtttagctacgatacaggctgaaaataaaacccgcactatgccattacatttatatctatgatacgtgtttgtttttctttgctggctagcttaattgcttatatttacctgcaataaaggatttcttacttccattatactcccattttccaaaaacatacggggaacacgggaacttattgtacaggccacctcatagttaatggtttcgagccttcctgcaatctcatccatggaaatatattcatccccctgccggcctattaatgtgacttttgtgcccggcggatattcctgatccagctccaccataaattggtccatgcaaattcggccggcaattttcaggcgttttcccttcacaaggatgtcggtccctttcaattttcggagccagccgtccgcatagcctacaggcaccgtcccgatccatgtgtctttttccgctgtgtactcggctccgtagctgacgctctcgccttttctgatcagtttgacatgtgacagtgtcgaatgcagggtaaatgccggacgcagctgaaacggtatctcgtccgacatgtcagcagacgggcgaaggccatacatgccgatgccgaatctgactgcattaaaaaagccttttttcagccggagtccagcggcgctgttcgcgcagtggaccattagattctttaacggcagcggagcaatcagctctttaaagcgctcaaactgcattaagaaatagcctctttctttttcatccgctgtcgcaaaatgggtaaatacccctttgcactttaaacgagggttgcggtcaagaattgccatcacgttctgaacttcttcctctgtttttacaccaagtctgttcatccccgtatcgaccttcagatgaaaatgaagagaaccttttttcgtgtggcgggctgcctcctgaagccattcaacagaataacctgttaaggtcacgtcatactcagcagcgattgccacatactccgggggaaccgcgccaagcaccaatataggcgccttcaatccctttttgcgcagtgaaatcgcttcatccaaaatggccacggccaagcatgaagcacctgcgtcaagagcagcctttgctgtttctgcatcaccatgcccgtaggcgtttgctttcacaactgccatcaagtggacatgttcaccgatatgttttttcatattgctgacattttcctttatcgcggacaagtcaatttccgcccacgtatctctgtaaaaaggttttgtgctcatggaaaactcctctcttttttcagaaaatcccagtacgtaattaagtatttgagaattaattttatattgattaatactaagtttacccagttttcacctaaaaaacaaatgatgagataatagctccaaaggctaaagaggactataccaactatttgttaattaa(SED ID NO:53)

實(shí)例2：ADXS31-164的免疫原性與LM-LLO-ChHER2一樣。

在標(biāo)準(zhǔn)CTL分析中將ADXS31-164產(chǎn)生抗HER2/neu特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的免疫原性與Lm-LLO-ChHer2疫苗進(jìn)行比較。兩種疫苗均引起對3T3/neu靶細(xì)胞表達(dá)的HER2/neu抗原的強(qiáng)烈但類似的細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答。因此，使用僅表達(dá)融合至LLO的Her2胞內(nèi)片段的李斯特菌免疫的小鼠顯示出比包含多個(gè)MHC I類表位的嵌合體更低的裂解活性。在未暴露的動物或不相關(guān)李斯特菌疫苗注射的小鼠中未檢測到CTL活性(圖2A)。ADXS31-164也能夠刺激野生型FVB/N小鼠的脾細(xì)胞分泌IFN-γ(圖2B)。這在與絲裂霉素C處理的NT-2細(xì)胞(表達(dá)高水平的HER2/neu抗原)共培養(yǎng)的這些細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中檢測到(圖5C)。

在HLA-A2小鼠中測試了ADXS31-164免疫后人MHC I類表位的適當(dāng)處理和呈遞。經(jīng)免疫的HLA-A2轉(zhuǎn)基因動物的脾細(xì)胞與位于HER2/neu分子的胞外(HLYQGCQVV SEQ ID NO:11或KIFGSLAFL SEQ ID NO:12)或胞內(nèi)(RLLQETELV SEQ ID NO:13)域的標(biāo)繪的HLA-A2限制表位對應(yīng)的肽共溫育72小時(shí)(圖2C)。重組ChHer2蛋白用作陽性對照，不相關(guān)肽或無肽作為陰性對照。該實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)顯示，ADXS31-164能夠引起對位于靶抗原的不同域的人表位的抗HER2/neu特異性免疫應(yīng)答。

實(shí)例3：ADXS31-164抑制自發(fā)性乳腺腫瘤的發(fā)病比LM-LLO-ChHER2更有效。

將ADXS31-164的抗腫瘤效應(yīng)與HER2/neu轉(zhuǎn)基因動物中的Lm-LLO-ChHer2比較，該HER2/neu轉(zhuǎn)基因動物在20-25周齡患上緩慢生長的自發(fā)性乳腺腫瘤。所有使用不相關(guān)李斯特菌對照疫苗免疫的動物在21-25周內(nèi)患上乳腺腫瘤并且在第33周前處死。相比之下，李斯特菌-HER2/neu重組疫苗使乳腺腫瘤的形成顯著延緩。在第45周，超過50％的ADXS31-164疫苗接種的小鼠(9只中的5只)仍無腫瘤，相比之下，使用Lm-LLO-ChHer2免疫的小鼠只有25％。在第52周，使用ADXS31-164免疫的8只小鼠中的2只仍無腫瘤，而其他實(shí)驗(yàn)組的所有小鼠已死于疾病(圖3)。這些結(jié)果表明，盡管是減毒程度更高的，但ADXS31-164防止HER2/neu轉(zhuǎn)基因動物的自發(fā)性乳腺腫瘤的發(fā)病比Lm-LLO-ChHer2更有效。

實(shí)例4：ADXS31-164免疫時(shí)HER2/NEU基因的突變。

HER2/neu的MHC I類表位的突變已被視為在小片段疫苗或曲妥單抗(Herceptin)(一種靶向HER2/neu的胞外域中的表位的單克隆抗體)免疫時(shí)負(fù)責(zé)腫瘤逃逸。為評估該作用，從轉(zhuǎn)基因動物中的逃逸腫瘤提取基因組物質(zhì)，并對嵌合或?qū)φ找呙缑庖叩哪[瘤中neu基因的對應(yīng)片段進(jìn)行測序。任何疫苗接種的腫瘤樣品的HER2/neu基因內(nèi)均未觀察到突變，暗示存在替代逃逸機(jī)制(數(shù)據(jù)未示出)。

實(shí)例5：ADXS31-164使腫瘤內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞顯著減少。

為闡明ADXS31-164對脾臟和腫瘤中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞頻率的影響，將NT-2腫瘤細(xì)胞植入小鼠。在三次免疫后分離脾細(xì)胞和腫瘤內(nèi)淋巴細(xì)胞并對Treg染色，Treg定義為CD3⁺/CD4⁺/CD25⁺/FoxP3⁺細(xì)胞，但是當(dāng)單獨(dú)分析時(shí)，F(xiàn)oxP3或CD25標(biāo)記獲得了類似的結(jié)果。結(jié)果表明，與不相關(guān)李斯特菌疫苗或未暴露的動物相比，ADXS31-164免疫對脾臟中Treg的頻率無影響(參見圖4)。相比之下，李斯特菌疫苗免疫對腫瘤中Treg的存在產(chǎn)生很大的影響(圖5A)。而未治療的腫瘤中平均而言所有CD3⁺T細(xì)胞的19.0％為Treg，對于不相關(guān)疫苗該頻率降低至4.2％，對于ADXS31-164降低至3.4％，腫瘤內(nèi)Treg的頻率降低5倍(圖5B)。任一LmddA疫苗治療的小鼠中腫瘤內(nèi)Treg的頻率降低不能歸因于腫瘤大小的差異。在代表性實(shí)驗(yàn)中，ADXS31-164免疫的小鼠的腫瘤顯著小于[平均直徑(mm)±SD，6.71±0.43，n＝5]未治療的小鼠(8.69±0.98,n＝5,p<0.01)或不相關(guān)疫苗治療的小鼠(8.41±1.47,n＝5,p＝0.04)的腫瘤，而最后兩組的比較未顯示出腫瘤大小的統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(p＝0.73)。LmddA疫苗處理的腫瘤中Treg頻率的下降使腫瘤內(nèi)CD8/Treg比率升高，暗示在LmddA疫苗免疫后可獲得更有利的腫瘤微環(huán)境。然而，只有表達(dá)靶抗原HER2/neu的疫苗(ADXS31-164)能夠減緩腫瘤生長，表明Treg的減少僅在腫瘤中存在抗原特異性應(yīng)答的情況下具有作用。

實(shí)例6：表達(dá)HER-2嵌合體的李斯特菌疫苗未引入逃逸突變

收集不同疫苗諸如Lm-LLO-138、LmddA164和不相關(guān)疫苗Lm-LLO-NY免疫的小鼠的腫瘤樣品。從這些樣品純化DNA，擴(kuò)增HER2/neu區(qū)域IC1、EC1和EC2對應(yīng)的DNA片段，并測序以確定是否存在任何免疫逃逸突變。使用CLUSTALW進(jìn)行每個(gè)DNA的序列比對。分析結(jié)果表明，從腫瘤收集的DNA序列中無突變。這些序列的詳細(xì)分析如下所示。

EC2的比對(HER2/neu的975-1029bp)

參考

GGTCACAGCTGAGGACGGAACACAGCGTTGTGAGAAATGCAGCAAGCCCTGTGCT(SEQ ID NO:14)

Lm-LLO-138-2

GGTCACAGCTGAGGACGGAACACAGCGTTGTGAGAAATGCAGCAAGCCCTGTGCT

Lm-LLO-138-3

GGTCACAGCTGAGGACGGAACACAGCGTTGTGAGAAATGCAGCAAGCCCTGTGCT

Lm-ddA-164-1

GGTCACAGCTGAGGACGGAACACAGCGTTGTGAGAAATGCAGCAAGCCCTGTGCT

LmddA164-2

GGTCACAGCTGAGGACGGAACACAGCGTTGTGAGAAATGCAGCAAGCCCTGTGCT

Lm-ddA-164-3

GGTCACAGCTGAGGACGGAACACAGCGTTGTGAGAAATGCAGCAAGCCCTGTGCT

LmddA164-4

GGTCACAGCTGAGGACGGAACACAGCGTTGTGAGAAATGCAGCAAGCCCTGTGCT

Lm-ddA-164-5

GGTCACAGCTGAGGACGGAACACAGCGTTGTGAGAAATGCAGCAAGCCCTGTGCT

LmddA-164-6

GGTCACAGCTGAGGACGGAACACAGCGTTCTGAGAAATGCAGCAAGCCCTGTGCT

參考

CGAGTGTGCTATGGTCTGGGCATGGAGCACCTTCGAGGGGCGAGGGCCATCACCAGTGAC(SEQ ID NO:15)

Lm-LLO-138-2

CGAGTGTGCTATGGTCTGGGCATGGAGCACCTTCGAGGGGCGAGGGCCATCACCAGTGAC

Lm-LLO-138-3

CGAGTGTGCTATGGTCTGGGCATGGAGCACCTTCGAGGGGCGAGGGCCATCACCAGTGAC

Lm-ddA-164-1

CGAGTGTGCTATGGTCTGGGCATGGAGCACCTTCGAGGGGCGAGGGCCATCACCAGTGAC

LmddA164-2

CGAGTGTGCTATGGTCTGGGCATGGAGCACCTTCGAGGGGCGAGGGCCATCACCAGTGAC

Lm-ddA-164-3

CGAGTGTGCTATGGTCTGGGCATGGAGCACCTTCGAGGGGCGAGGGCCATCACCAGTGAC

LmddA164-4

CGAGTGTGCTATGGTCTGGGCATGGAGCACCTTCGAGGGGCGAGGGCCATCACCAGTGAC

Lm-ddA-164-5

CGAGTGTGCTATGGTCTGGGCATGGAGCACCTTCGAGGGGCGAGGGCCATCACCAGTGAC

LmddA-164-6

CGAGTGTGCTATGGTCTGGGCATGGAGCACCTTCGAGGGGCGAGGGCCATCACCAGTGAC

參考

AATGTCCAGGAGTTTGATGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTTTGCCGGAG(SEQ ID No:16)

Lm-LLO-138-2

AATGTCCAGGAGTTTGATGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTTTGCCGGAG

Lm-LLO-138-3

AATGTCCAGGAGTTTGATGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTTTGCCGGAG

Lm-ddA-164-1

AATGTCCAGGAGTTTGATGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTTTGCCGGAG

LmddA164-2

AATGTCCAGGAGTTTGATGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTTTGCCGGAG

Lm-ddA-164-3

AATGTCCAGGAGTTTGATGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTTTGCCGGAG

LmddA164-4

AATGTCCAGGAGTTTGATGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTTTGCCGGAG

Lm-ddA-164-5

AATGTCCAGGAGTTTGATGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTTTGCCGGAG

LmddA-164-6

AATGTCCAGGAGTTTGATGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTTTGCCGGAG

參考

AGCTTTGATGGGGACCCCTCCTCCGGCATTGCTCCGCTGAGGCCTGAGCAGCTCCAAGTG(SEQ ID No:17)

Lm-LLO-138-2

AGCTTTGATGGGGACCCCTCCTCCGGCATTGCTCCGCTGAGGCCTGAGCAGCTCCAAGTG

Lm-LLO-138-3

AGCTTTGATGGGGACCCCTCCTCCGGCATTGCTCCGCTGAGGCCTGAGCAGCTCCAAGTG

Lm-ddA-164-1

AGCTTTGATGGGGACCCCTCCTCCGGCATTGCTCCGCTGAGGCCTGAGCAGCTCCAAGTG

LmddA164-2

AGCTTTGATGGGGACCCCTCCTCCGGCATTGCTCCGCTGAGGCCTGAGCAGCTCCAAGTG

Lm-ddA-164-3

AGCTTTGATGGGGACCCCTCCTCCGGCATTGCTCCGCTGAGGCCTGAGCAGCTCCAAGTG

LmddA164-4

AGCTTTGATGGGGACCCCTCCTCCGGCATTGCTCCGCTGAGGCCTGAGCAGCTCCAAGTG

Lm-ddA-164-5

AGCTTTGATGGGGACCCCTCCTCCGGCATTGCTCCGCTGAGGCCTGAGCAGCTCCAAGTG

LmddA-164-6

AGCTTTGATGGGGACCCCTCCTCCGGCATTGCTCCGCTGAGGCCTGAGCAGCTCCAAGTG

參考

TTCGAAACCCTGGAGGAGATCACAGGTTACCTGTACATCTCAGCATGGCCAGACAGTCTC(SEQ ID NO:18)

Lm-LLO-138-2

TTCGAAACCCTGGAGGAGATCACAGGTTACCTGTACATCTCAGCATGGCCAGACAGTCTC

Lm-LLO-138-3

TTCGAAACCCTGGAGGAGATCACAGGTTACCTGTACATCTCAGCATGGCCAGACAGTCTC

Lm-ddA-164-1

TTCGAAACCCTGGAGGAGATCACAGGTTACCTGTACATCTCAGCATGGCCAGACAGTCTC

LmddA164-2

TTCGAAACCCTGGAGGAGATCACAGGTTACCTGTACATCTCAGCATGGCCAGACAGTCTC

Lm-ddA-164-3

TTCGAAACCCTGGAGGAGATCACAGGTTACCTGTACATCTCAGCATGGCCAGACAGTCTC

LmddA164-4

TTCGAAACCCTGGAGGAGATCACAGGTTACCTGTACATCTCAGCATGGCCAGACAGTCTC

Lm-ddA-164-5

TTCGAAACCCTGGAGGAGATCACAGGTTACCTGTACATCTCAGCATGGCCANACAGTCTC

LmddA-164-6

TTCGAAACCCTGGAGGAGATCACAGGTTACCTGTACATCTCAGCATGGCCAGACAGTCT

參考

CGTGACCTCAGTGTCTTCCAGAACCTTCGAATCATTCGGGGACGGATTCTCCACGATGGC(SEQ ID NO:19)

Lm-LLO-138-2

CGTGACCTCAGTGTCTTCCAGAACCTTCGAATCATTCGGGGACGGATTCTCCACGATGGC

Lm-LLO-138-3

CGTGACCTCAGTGTCTTCCAGAACCTTCGAATCATTCGGGGACGGATTCTCCACGATGGC

Lm-ddA-164-1

CGTGACCTCAGTGTCTTCCAGAACCTTCGAATCATTCGGGGACGGATTCTCCACGATGGC

LmddA164-2

CGTGACCTCAGTGTCTTCCAGAACCTTCGAATCATTCGGGGACGGATTCTCCACGATGGC

Lm-ddA-164-3

CGTGACCTCAGTGTCTTCCAGAACCTTCGAATCATTCGGGGACGGATTCTCCACGATGGC

LmddA164-4

CGTGACCTCAGTGTCTTCCAAAACCTTCGAATCATTCGGGGACGGATTCTCCACGATGGC

Lm-ddA-164-5

CGTGACCTCAGTGTCTTCCAAAACCTTCGAATCATTCGGGGACGGATTCTCCACGATGGC

LmddA-164-6

CGTGACCTCAGTGTCTTCCAAAACCTTCGAATCATTCGGGGACGGATTCTCCACGATGGC

參考

GCGTACTCATTGACACTGCAAGGCCTGGGGATCCACTCGCTGGGGCTGCGCTCACTGCGG(SEQ ID NO:20)

Lm-LLO-138-2

GCGTACTCATTGACACTGCAAGGCCTGGGGATCCACTCGCTGGGGCTGCGCTCACTGCGG

Lm-LLO-138-3

GCGTACTCATTGACACTGCAAGGCCTGGGGATCCACTCGCTGGGGCTGCGCTCACTGCGG

Lm-ddA-164-1

GCGTACTCATTGACACTGCAAGGCCTGGGGATCCACTCGCTGGGGCTGCGCTCACTGCGG

LmddA164-3

GCGTACTCATTGACACTGCAAGGCCTGGGGATCCACTCGCTGGGGCTGCGCTCACTGCGG

Lm-ddA-164-5

GCGTACTCATTGACACTGCAAGGCCTGGGGATCCACTCGCTGGGGCTGCGCTCACTGCGG

Lm-ddA-164-6

GCGTACTCATTGACACTGCAAGGCCTGGGGATCCACTCGCTGGGGCTGCGCTCACTGCGG

參考

GAGCTGGGCAGTGGATTGGCTCTGATTCACCGCAACGCCCATCTCTGCTTTGTACACACT(SEQ ID NO:21)

Lm-LLO-138-2

GAGCTGGGCAGTGGATTGGCTCTGATTCACCGCAACGCCCATCTCTGCTTTGTACACACT

Lm-LLO-138-3

GAGCTGGGCAGTGGATTGGCTCTGATTCACCGCAACGCCCATCTCTGCTTTGTACACACT

Lm-ddA-164-1

GAGCTGGGCAGTGGATTGGCTCTGATTCACCGCAACGCCCATCTCTGCTTTGTACACACT

LmddA164-3

GAGCTGGGCAGTGGATTGGCTCTGATTCACCGCAACGCCCATCTCTGCTTTGTACACACT

Lm-ddA-164-5

GAGCTGGGCAGTGGATTGGCTCTGATTCACCGCAACGCCCATCTCTGCTTTGTACACACT

Lm-ddA-164-6

GAGCTGGGCAGTGGATTGGCTCTGATTCACCGCAACGCCCATCTCTGCTTTGTACACACT

參考

GTACCTTGGGACCAGCTCTTCCGGAACCCACATCAGGCCCTGCTCCACAGTGGGAACCGG(SEQ ID NO:22)

Lm-LLO-138-2

GTACCTTGGGACCAGCTCTTCCGGAACCCACATCAGGCCCTGCTCCACAGTGGGAACCGG

Lm-LLO-138-3

GTACCTTGGGACCAGCTCTTCCGGAACCCACATCAGGCCCTGCTCCACAGTGGGAACCGG

Lm-ddA-164-1

GTACCTTGGGACCAGCTCTTCCGGAACCCACATCAGGCCCTGCTCCACAGTGGGAACCGG

LmddA164-3

GTACCTTGGGACCAGCTCTTCCGGAACCCACATCAGGCCCTGCTCCACAGTGGGAACCGG

Lm-ddA-164-5

GTACCTTGGGACCANCTCTTCCGGAACCCACATCAGGCCCTGCTCCACAGTGGGAACCGG

Lm-ddA-164-6

GTACCTTGGGACCAGCTCTTCCGGAACCCACATCAGGCCCTGCTCCACAGTGGGAACCGG

參考

CCGGAAGAGGATTGTGGTCTCGAGGGCTTGGTCTGTAACTCACTGTGTGCCCACGGGCAC(SEQ ID NO:23)

Lm-LLO-138-2

CCGGAAGAGGATTGTGGTCTCGAGGGCTTGGTCTGTAACTCACTGTGTGCCCACGGGCAC

Lm-LLO-138-3

CCGGAAGAGGATTGTGGTCTCGAGGGCTTGGTCTGTAACTCACTGTGTGCCCACGGGCAC

Lm-ddA-164-1

CCGGAAGAGGATTGTGGTCTCGAGGGCTTGGTCTGTAACTCACTGTGTGCCCACGGGCAC

LmddA164-3

CCGGAAGAGGATTGTGGTCTCGAGGGCTTGGTCTGTAACTCACTGTGTGCCCACGGGCAC

Lm-ddA-164-6

CCGGAAGAGGATTGTGGTCTCGAGGGCTTGGTCTGTAACTCACTGTGTGCCCACGGGCAC

參考

TGCTGGGGGCCAGGGCCCACCCAGTGTGTCAACTGCAGTCATTTCCTTCGGGGCCAGGAG(SEQ ID NO:24)

Lm-LLO-138-2

TGCTGGGGGCCAGGGCCCACCCAGTGTGTCAACTGCAGTCATTTCCTTCGGGGCCAGGAG

Lm-LLO-138-3

TGCTGGGGGCCAGGGCCCACCCAGTGTGTCAACTGCAGTCATTTCCTTCGGGGCCAGGAG

Lm-ddA-164-1

TGCTGGGGGCCAGGGCCCACCCAGTGTGTCAACTGCAGTCATTTCCTTCGGGGCCAGGAG

LmddA164-3

TGCTGGGGGCCAGGGCCCACCCAGTGTGTCAACTGCAGTCATTTCCTTCGGGGCCAGGAG

Lm-ddA-164-6

TGCTGGGGGCCAGGGCCCACCCA-------------------------------------

IC1的比對(HER2/neu的2114-3042bp)

參考

CGCCCAGCGGAGCAATGCCCAACCAGGCTCAGATGCGGATCCTAAAAGAGACGGAGC(SEQ ID NO:25)

Lm-LLO-NY-2

CGCCCAGCGGAGCAATGCCCAACCAGGCTCAGATGCGGATCCTAAAAGAGACGGAGC

Lm-LLO-138-4

CGCCCAGCGGAGCAATGCCCAACCAGGCTCAGATGCGGATCCTAAAAGAGACGGAGC

Lm-ddA-164-2

CGCCCAGCGGAGCAATGCCCAACCAGGCTCAGATGCGGATCCTAAAAGAGACGGAGC

Lm-ddA-164-3

CGCCCAGCGGAGCAATGCCCAACCAGGCTCAGATGCGGATCCTAAAAGAGACGGAGC

Lm-ddA164-6

CGCCCAGCGGAGCAATGCCCAACCAGGCTCAGATGCGGATCCTAAAAGAGACGGAGC

參考

TAAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCAGGAGCTTTTGGCACTGTCTACAAGGGCATCTGGA(SEQ ID NO:26)

Lm-LLO-NY-1

TAAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCAGGAGCTTTTGGCACTGTCTACAAGGGCATCTGGA

Lm-LLO-NY-2

TAAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCAGGAGCTTTTGGCACTGTCTACAAGGGCATCTGGA

Lm-LLO-138-1

TAAGGAAGGTGAACGTGCTTGGATCAGGAGCTTTTGGCACTGTCTACAAGGGCATCTGGA

Lm-LLO-138-2

TAAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCAGGAGCTTTTGGCACTGTCTACAAGGGCATCTGGA

Lm-LLO-138-3

TAAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCAGGAGCTTTTGGCACTGTCTACAAGGGCATCTGGA

Lm-LLO-138-4

TAAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCAGGAGCTTTTGGCACTGTCTACAAGGGCATCTGGA

Lm-ddA-164-1

TAAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCAGGAGCTTTTGGCACTGTCTACAAGGGCATCTGGA

Lm-ddA-164-2

TAAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCAGGAGCTTTTGGCACTGTCTACAAGGGCATCTGGA

Lm-ddA-164-3

TAAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCAGGAGCTTTTGGCACTGTCTACAAGGGCATCTGGA

Lm-ddA-164-4

TAAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCAGGAGCTTTTGGCACTGTCTACAAGGGCATCTGGA

Lm-ddA-164-5

TAAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCAGGAGCTTTTGGCACTGTCTACAAGGGCATCTGGA

Lm-ddA164-6

TAAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCAGGAGCTTTTGGCACTGTCTACAAGGGCATCTGGA

參考

TCCCAGATGGGGAGAATGTGAAAATCCCCGTGGCTATCAAGGTGTTGAGAGAAAACACAT(SEQ ID NO:27)

Lm-LLO-NY-1

TCCCAGATGGGGAGAATGTGAAAATCCCCGTGGCTATCAAGGTGTTGAGAGAAAACACAT

Lm-LLO-NY-2

TCCCAGATGGGGAGAATGTGAAAATCCCCGTGGCTATCAAGGTGTTGAGAGAAAACACAT

Lm-LLO-138-1

TCCCAGATGGGGAGAATGTGAAAATCCCCGTGGCTATCAAGGTGTTGAGAGAAAACACAT

Lm-LLO-138-2

TCCCAGATGGGGAGAATGTGAAAATCCCCGTGGCTATCAAGGTGTTGAGAGAAAACACAT

Lm-LLO-138-3

TCCCAGATGGGGAGAATGTGAAAATCCCCGTGGCTATCAAGGTGTTGAGAGAAAACACAT

Lm-LLO-138-4

TCCCAGATGGGGAGAATGTGAAAATCCCCGTGGCTATCAAGGTGTTGAGAGAAAACACAT

Lm-ddA-164-1

TCCCAGATGGGGAGAATGTGAAAATCCCCGTGGCTATCAAGGTGTTGAGAGAAAACACAT

Lm-ddA-164-2

TCCCAGATGGGGAGAATGTGAAAATCCCCGTGGCTATCAAGGTGTTGAGAGAAAACACAT

Lm-ddA-164-3

TCCCAGATGGGGAGAATGTGAAAATCCCCGTGGCTATCAAGGTGTTGAGAGAAAACACAT

Lm-ddA-164-4

TCCCAGATGGGGAGAATGTGAAAATCCCCGTGGCTATCAAGGTGTTGAGAGAAAACACAT

Lm-ddA-164-5

TCCCAGATGGGGAGAATGTGAAAATCCCCGTGGCTATCAAGGTGTTGAGAGAAAACACAT

Lm-ddA164-6

TCCCAGATGGGGAGAATGTGAAAATCCCCGTGGCTATCAAGGTGTTGAGAGAAAACACAT

參考CTCCTAAAGCCAACAAAGAAATTCTAGATGAAGCGTATGTGATGGCTGGTGTGGGTTCTC(SEQ ID NO:28)

Lm-LLO-NY-1

CTCCTAAAGCCAACAAAGAAATTCTAGATGAAGCGTATGTGATGGCTGGTGTGGGTTCTC

Lm-LLO-NY-2

CTCCTAAAGCCAACAAAGAAATTCTAGATGAAGCGTATGTGATGGCTGGTGTGGGTTCTC

Lm-LLO-138-1

CTCCTAAAGCCAACAAAGAAATTCTAGATGAAGCGTATGTGATGGCTGGTGTGGGTTCTC

Lm-LLO-138-2

CTCCTAAAGCCAACAAAGAAATTCTAGATGAAGCGTATGTGATGGCTGGTGTGGGTTCTC

Lm-LLO-138-3

CTCCTAAAGCCAACAAAGAAATTCTAGATGAAGCGTATGTGATGGCTGGTGTGGGTTCTC

lm-LLO-138-4

CTCCTAAAGCCAACAAAGAAATTCTAGATGAAGCGTATGTGATGGCTGGTGTGGGTTCTC

Lm-ddA-164-1

CTCCTAAAGCCAACAAAGAAATTCTAGATGAAGCGTATGTGATGGCTGGTGTGGGTTCTC

Lm-ddA-164-2

CTCCTAAAGCCAACAAAGAAATTCTAGATGAAGCGTATGTGATGGCTGGTGTGGGTTCTC

Lm-ddA-164-3

CTCCTAAAGCCAACAAAGAAATTCTAGATGAAGCGTATGTGATGGCTGGTGTGGGTTCTC

Lm-ddA-164-4

CTCCTAAAGCCAACAAAGAAATTCTAGATGAAGCGTATGTGATGGCTGGTGTGGGTTCTC

Lm-ddA-164-5

CTCCTAAAGCCAACAAAGAAATTCTAGATGAAGCGTATGTGATGGCTGGTGTGGGTTCTC

Lm-ddA164-6

CTCCTAAAGCCAACAAAGAAATTCTAGATGAAGCGTATGTGATGGCTGGTGTGGGTTCTC

參考

CGTATGTGTCCCGCCTCCTGGGCATCTGCCTGACATCCACAGTACAGCTGGTGACACAGC(SEQ ID NO:29)

Lm-LLO-NY-1

CGTATGTGTCCCGCCTCCTGGGCATCTGCCTGACATCCACAGTACAGCTGGTGACACAGC

Lm-LLO-NY-2

CGTATGTGTCCCGCCTCCTGGGCATCTGCCTGACATCCACAGTACAGCTGGTGACACAGC

Lm-LLO-138-1

CGTATGTGTCCCGCCTCCTGGGCATCTGCCTGACATCCACAGTACAGCTGGTGACACAGC

Lm-LLO-138-2

CGTATGTGTCCCGCCTCCTGGGCATCTGCCTGACATCCACAGTACAGCTGGTGACACAGC

Lm-LLO-138-3

CGTATGTGTCCCGCCTCCTGGGCATCTGCCTGACATCCACAGTACAGCTGGTGACACAGC

Lm-LLO-138-4

CGTATGTGTCCCGCCTCCTGGGCATCTGCCTGACATCCACAGTACAGCTGGTGACACAGC

Lm-ddA-164-1

CGTATGTGTCCCGCCTCCTGGGCATCTGCCTGACATCCACAGTACAGCTGGTGACACAGC

Lm-ddA-164-2

CGTATGTGTCCCGCCTCCTGGGCATCTGCCTGACATCCACAGTACAGCTGGTGACACAGC

Lm-ddA-164-3

CGTATGTGTCCCGCCTCCTGGGCATCTGCCTGACATCCACAGTACAGCTGGTGACACAGC

Lm-ddA-164-4

CGTATGTGTCCCGCCTCCTGGGCATCTGCCTGACATCCACAGTACAGCTGGTGACACAGC

Lm-ddA-164-5

CGTATGTGTCCCGCCTCCTGGGCATCTGCCTGACATCCACAGTACAGCTGGTGACACAGC

Lm-ddA164-6

CGTATGTGTCCCGCCTCCTGGGCATCTGCCTGACATCCACAGTACAGCTGGTGACACAGC

參考

TTATGCCCTACGGCTGCCTTCTGGACCATGTCCGAGAACACCGAGGTCGCCTAGGCTCCC(SEQ ID NO:30)

Lm-LLO-NY-1

TTATGCCCTACGGCTGCCTTCTGGACCATGTCCGAGAACACCGAGGTCGCCTAGGCTCCC

Lm-LLO-NY-2

TTATGCCCTACGGCTGCCTTCTGGACCATGTCCGAGAACACCGAGGTCGCCTAGGCTCCC

Lm-LLO-138-1

TTATGCCCTACGGCTGCCTTCTGGACCATGTCCGAGAACACCGAGGTCGCCTAGGCTCCC

Lm-LLO-138-2

TTATGCCCTACGGCTGCCTTCTGGACCATGTCCGAGAACACCGAGGTCGCCTAGGCTCCC

Lm-LLO-138-3

TTATGCCCTACGGCTGCCTTCTGGACCATGTCCGAGAACACCGAGGTCGCCTAGGCTCCC

Lm-LLO-138-4

TTATGCCCTACGGCTGCCTTCTGGACCATGTCCGAGAACACCGAGGTCGCCTAGGCTCCC

Lm-ddA-164-1

TTATGCCCTACGGCTGCCTTCTGGACCATGTCCGAGAACACCGAGGTCGCCTAGGCTCCC

Lm-ddA-164-2

TTATGCCCTACGGCTGCCTTCTGGACCATGTCCGAGAACACCGAGGTCGCCTAGGCTCCC

Lm-ddA-164-3

TTATGCCCTACGGCTGCCTTCTGGACCATGTCCGAGAACACCGAGGTCGCCTAGGCTCCC

Lm-ddA-164-4

TTATGCCCTACGGCTGCCTTCTGGACCATGTCCGAGAACACCGAGGTCGCCTAGGCTCCC

Lm-ddA-164-5

TTATGCCCTACGGCTGCCTTCTGGACCATGTCCGAGAACACCGAGGTCGCCTAGGCTCCC

Lm-ddA164-6

TTATGCCCTACGGCTGCCTTCTGGACCATGTCCGAGAACACCGAGGTCGCCTAGGCTCCC

參考

AGGACCTGCTCAACTGGTGTGTTCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGACGTGC(SEQ ID NO:31)

Lm-LLO-NY-1

AGGACCTGCTCAACTGGTGTGTTCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGACGTGC

Lm-LLO-NY-2

AGGACCTGCTCAACTGGTGTGTTCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGACGTGC

Lm-LLO-138-1

AGGACCTGCTCAACTGGTGTGTTCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGACGTGC

Lm-LLO-138-2

AGGACCTGCTCAACTGGTGTGTTCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGACGTGC

Lm-LLO-138-3

AGGACCTGCTCAACTGGTGTGTTCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGACGTGC

Lm-LLO-138-4

AGGACCTGCTCAACTGGTGTGTTCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGACGTGC

Lm-ddA-164-1

AGGACCTGCTCAACTGGTGTGTTCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGACGTGC

Lm-ddA-164-2

AGGACCTGCTCAACTGGTGTGTTCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGACGTGC

Lm-ddA-164-3

AGGACCTGCTCAACTGGTGTGTTCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGACGTGC

Lm-ddA-164-4

AGGACCTGCTCAACTGGTGTGTTCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGACGTGC

Lm-ddA-164-5

AGGACCTGCTCAACTGGTGTGTTCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGACGTGC

Lm-ddA164-6

AGGACCTGCTCAACTGGTGTGTTCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGACGTGC

參考

GGCTTGTACACAGGGACCTGGCTGCCCGGAATGTGCTAGTCAAGAGTCCCAACCACGTCA(SEQ ID NO:32)

Lm-LLO-NY-1

GGCTTGTACACAGGGACCTGGCTGCCCGGAATGTGCTAGTCAAGAGTCCCAACCACGTCA

Lm-LLO-NY-2

GGCTTGTACACAGGGACCTGGCTGCCCGGAATGTGCTAGTCAAGAGTCCCAACCACGTCA

Lm-LLO-138-1

GGCTTGTACACAGGGACCTGGCTGCCCGGAATGTGCTAGTCAAGAGTCCCAACCACGTCA

Lm-LLO-138-2

GGCTTGTACACAGGGACCTGGCTGCCCGGAATGTGCTAGTCAAGAGTCCCAACCACGTCA

Lm-LLO-138-3

GGCTTGTACACAGGGACCTGGCTGCCCGGAATGTGCTAGTCAAGAGTCCCAACCACGTCA

Lm-LLO-138-4

GGCTTGTACACAGGGACCTGGCTGCCCGGAATGTGCTAGTCAAGAGTCCCAACCACGTCA

Lm-ddA-164-1

GGCTTGTACACAGGGACCTGGCTGCCCGGAATGTGCTAGTCAAGAGTCCCAACCACGTCA

Lm-ddA-164-2

GGCTTGTACACAGGGACCTGGCTGCCCGGAATGTGCTAGTCAAGAGTCCCAACCACGTCA

Lm-ddA-164-4

GGCTTGTACACAGGGACCTGGCTGCCCGGAATGTGCTAGTCAAGAGTCCCAACCACGTCA

Lm-ddA-164-3

GGCTTGTACACAGGGACCTGGCTGCCCGGAATGTGCTAGTCAAGAGTCCCAACCACGTCA

Lm-ddA-164-5

GGCTTGTACACAGGGACCTGGCTGCCCGGAATGTGCTAGTCAAGAGTCCCAACCACGTCA

Lm-ddA164-6

GGCTTGTACACAGGGACCTGGCTGCCCGGAATGTGCTAGTCAAGAGTCCCAACCACGTCA

參考

AGATTACAGATTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGATGAGACAGAGTACCATGCAG(SEQ ID NO:33)

Lm-LLO-NY-1

AGATTACAGATTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGATGAGACAGAGTACCATGCAG

Lm-LLO-NY-2

AGATTACAGATTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGATGAGACAGAGTACCATGCAG

Lm-LLO-138-1

AGATTACAGATTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGATGAGACAGAGTACCATGCAG

Lm-LLO-138-2

AGATTACAGATTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGATGAGACAGAGTACCATGCAG

Lm-LLO-138-3

AGATTACAGATTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGATGAGACAGAGTACCATGCAG

Lm-LLO-138-4

AGATTACAGATTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGATGAGACAGAGTACCATGCAG

Lm-ddA-164-1

AGATTACAGATTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGATGAGACAGAGTACCATGCAG

Lm-ddA-164-2

AGATTACAGATTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGATGAGACAGAGTACCATGCAG

Lm-ddA-164-3

AGATTACAGATTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGATGAGACAGAGTACCATGCAG

Lm-ddA-164-4

AGATTACAGATTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGATGAGACAGAGTACCATGCAG

Lm-ddA-164-5

AGATTACAGATTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGATGAGACAGAGTACCATGCAG

Lm-ddA164-6

AGATTACAGATTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGATGAGACAGAGTACCATGCAG

參考

ATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAATGGATGGCATTGGAATCTATTCTCAGACGCCGGTTCA(SEQ ID NO:34)

Lm-LLO-NY-1

ATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAATGGATGGCATTGGAATCTATTCTCAGACGCCGGTTCA

Lm-LLO-NY-2

ATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAATGGATGGCATTGGAATCTATTCTCAGACGCCGGTTCA

Lm-LLO-138-1

ATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAATGGATGGCATTGGAATCTATTCTCAGACGCCGGTTCA

Lm-LLO-138-2

ATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAATGGATGGCATTGGAATCTATTCTCAGACGCCGGTTCA

Lm-LLO-138-3

ATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAATGGATGGCATTGGAATCTATTCTCAGACGCCGGTTCA

Lm-LLO-138-4

ATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAATGGATGGCATTGGAATCTATTCTCAGACGCCGGTTCA

Lm-ddA-164-1

ATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAATGGATGGCATTGGAATCTATTCTCAGACGCCGGTTCA

Lm-ddA-164-2

ATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAATGGATGGCATTGGAATCTATTCTCAGACGCCGGTTCA

Lm-ddA-164-3

ATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAATGGATGGCATTGGAATCTATTCTCAGACGCCGGTTCA

Lm-ddA-164-4

ATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAATGGATGGCATTGGAATCTATTCTCAGACGCCGGTTCA

Lm-ddA-164-5

ATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAATGGATGGCATTGGAATCTATTCTCAGACGCCGGTTCA

Lm-ddA-164-6

ATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAATGGATGGCATTGGAATCTATTCTCAGACGCCGGTTCA

參考

CCCATCAGAGTGATGTGTGGAGCTATGGAGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGG(SEQ ID NO:35)

Lm-LLO-NY-1

CCCATCAGAGTGATGTGTGGAGCTATGGAGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGG

Lm-LLO-NY-2

CCCATCAGAGTGATGTGTGGAGCTATGGAGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGG

Lm-LLO-138-1

CCCATCAGAGTGATGTGTGGAGCTATGGAGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGG

Lm-LLO-138-2

CCCATCAGAGTGATGTGTGGAGCTATGGAGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGG

Lm-LLO-138-3

CCCATCAGAGTGATGTGTGGAGCTATGGAGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGG

Lm-LLO-138-4

CCCATCAGAGTGATGTGTGGAGCTATGGAGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGG

Lm-ddA-164-1

CCCATCAGAGTGATGTGTGGAGCTATGGAGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGG

Lm-ddA-164-2

CCCATCAGAGTGATGTGTGGAGCTATGGAGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGG

Lm-ddA-164-3

CCCATCAGAGTGATGTGTGGAGCTATGGAGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGG

Lm-ddA-164-4

CCCATCAGAGTGATGTGTGGAGCTATGGAGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGG

Lm-ddA-164-5

CCCATCAGAGTGATGTGTGGAGCTATGGAGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGG

Lm-ddA164-6

CCCATCAGAGTGATGTGTGGAGCTATGGAGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGG

參考

CCAAACCTTACGATGGAATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGATTTGCTGGAGAAGGGAGAA(SEQ ID NO:36)

Lm-LLO-NY-1

CCAAACCTTACGATGGAATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGATTTGCTGGAGAAGGGAGAA

Lm-LLO-NY-2

CCAAACCTTACGATGGAATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGATTTGCTGGAGAAGGGAGAA

Lm-LLO-138-1

CCAAACCTTACGATGGAATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGATTTGCTGGAGAAGGGAGAA

Lm-LLO-138-3

CCAAACCTTACGATGGAATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGATTTGCTGGAGAAGGGAGAA

Lm-LLO-138-4

CCAAACCTTACGATGNAATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGATTTGCTGGAGAAGGGAGAA

Lm-ddA164-6

CCAAACCTTACGATGGAATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGATTTGCTGGAGAAGGGAGAA

Lm-ddA-164-2

CCAAACCTTACGATGGAATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGATTTGCTGGAGAAGGGAGAA

Lm-LLO-138-2

CCAAACCTTACGATGGAATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGATTTGCTGGAGAAGGGAGAA

Lm-ddA-164-3

CCAAACCTTACGATGGAATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGATTTGCTGGAGAAGGGAGAA

Lm-ddA-164-5

CCAAACCTTACGATGGAATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGATTTGCTGGAGAAGGGAGAA

Lm-ddA-164-1

CCAAACCTTACGATGGAATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGATTTGCTGGAGAAGGGAGAA

Lm-ddA-164-4

CCAAACCTTACGATGGAATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGATTTGCTGGAGAAGGGAGAA

參考

CGCCTACCTCAGCCTCCAATCTGCACCATTGATGTCTACATGATTATGGTCAAATGTT(SEQ ID NO:37)

Lm-LLO-NY-1

CGCCTACCTCAGCCTCCAATCTGCACCATTGATGTCTACATGATTATGGTCAAATGTT

Lm-LLO-NY-2

CGCCTACCTCAGCCTCCAATCTGCACCATTGATGTCTACATGATTATGGTCAAATGTT

Lm-LLO-138-1

CGCCTACCTCAGCCTCCAATCTGCACCATTGATGTCTACATGATTATGGTCAAATGTT

Lm-LLO-138-2

CGCCTACCTCAGCCTCCAATCTGCACCATTGATGTCTACATGATTATGGTCAAATGTT

Lm-LLO-138-3

CGCCTACCTCAGCCTCCAATCTGCACCATTGATGTCTACATGATTATGGTCAAATGTT

Lm-LLO-138-4

CGCCTACCTCAGCCTCCAATCTGCACCATTGATGTCTACATGATTATGGTCAAATGTT

Lm-ddA-164-1

CGCCTACCTCAGCCTCCAATCTGCACCATTGATGTCTACATGATTATGGTCAAATGTT

Lm-ddA-164-2

CGCCTACCTCAGCCTCCAATCTGCACCATTGATGTCTACATGATTATGGTCAAATGTT

Lm-ddA-164-3

CGCCTACCTCAGCCTCCAATCTGCACCATTGATGTCTACATGATTATGGTCAAATGTT

Lm-ddA-164-4

CGCCTACCTCAGCCTCCAATCTGCACCATTGATGTCTACATGATTATGGTCAAATGTT

Lm-ddA-164-5

CGCCTACCTCAGCCTCCAATCTGCACCATTGATGTCTACATGATTATGGTCAAATGTT

Lm-ddA164-6

CGCCTACCTCAGCCTCCAATCTGCACCATTGATGTCTACATGATTATGGTCAAATGTT

參考

GGATGATTGACTCTGAATGTCGCCCGAGATTCCGGGAGTTGGTGTCAGAATTTT(SEQ ID NO:38)

Lm-LLO-NY-1

GGATGATTGACTCTGAATGTCGCCCGAGATTCCGGGAGTTGGTGTCAGAATTTT

Lm-LLO-NY-2

GGATGATTGACTCTGAATGTCGCCCGAGATTCCGGGAGTTGGTGTCAGAATTTT

Lm-LLO-138-2

GGATGATTGACTCTGAATGTCCCCCGAGATTCCGGGAGTTGGTGTCAAAATTTT

Lm-LLO-138-3

GGATGATTGACTCTGAATGTCGCCCGAGATTCCGGGAGTTGGTGTCAGAATTTT

Lm-LLO-138-4

GGATGATTGACTCTGAATGTCGCCCGAGATTCCGGGAGTTGGTGTCAGAATTTT

Lm-ddA-164-1

GGATGATTGACTCTGAATGTCGCCCGAGATTCCGGGAGTTGGTGTCAGAATTTT

Lm-ddA-164-2

GGATGATTGACTCTGAATGTCGCCCGAGATTCCGGGAGTTGGTGTCAGAATTTT

Lm-ddA-164-3

GGATGATTGACTCTGAATGTCGCCCGAGATTCCGGGAGTTGGTGTCAGAATTTT

Lm-ddA-164-5

GGATGATTGACTCTGAATGTCGCCCGAGATTCCGGGAGTTGGTGTCAGAATTTT

Lm-ddA-164-4

GGATGATTGACTCTGAATGTCGCCCGAGATTCCGGGAGTTGGTGTCAGAATTTT

Lm-ddA164-6

GGATGATTGACTCTGAATGTCGCCCGAGATTCCGGGAGTTGGTGTCAGAATTTT

參考

CACGTATGGCGAGGGACCCCCAGCGTTTTGTGGTCATCCAGAACGAGGACTT(SEQ ID NO:39)

Lm-LLO-NY-1

CACGTATGGCGAGGGACCCCCAGCGTTTTGTGGTCATCCAGAACGAGGACTT

Lm-LLO-NY-2

CACGTATGGCGAGGGACCCCCAGCGTTTTGTGGTCATCCAGAACGAGGACTT

Lm-LLO-138-2

CACGTATGGCGAGGGACCCCCAGCGTTTTGTGGTCATCCAGAACGAGGACTT

Lm-LLO-138-3

CACGTATGGCGAGGGACCCCCAGCGTTTTGTGGTCATCCAGAACGAGGACTT

Lm-LLO-138-4

CACGTATGGCGAGGGACCCCCAGCGTTTTGTGGTCATCCAGAACGAGGACTT

Lm-ddA-164-1

CACGTATGGCGAGGGACCCCCAGCGTTTTGTGGTCATCCAGAACGAGGACTT

Lm-ddA-164-2

CACGTATGGCGAGGGACCCCCAGCGTTTTGTGGTCATCCAGAACGAGGACTT

Lm-ddA-164-3

CACGTATGGCGAGGGACCCCCAGCGTTTTGTGGTCATCCAGAACGAGGACTT

Lm-ddA-164-5

CACGTATGGCGAGGGACCCCCAGCGTTTTGTGGTCATCCAGAACGAGGACTT

Lm-ddA-164-6

CACGTATGGCGAGGGACCCCCAGCGTTTTGTGGTCATCCAGAACGAGGACTT

EC1的比對(HER2/neu的399-758bp)

參考

CCCAGGCAGAACCCCAGAGGGGCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGTCTCACAGAGATCCT(SEQ ID NO:40)

Lm-LLO-138-1

CCCAGGCAGAACCCCAGAGGGGCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGTCTCACAGAGATCCT

Lm-LLO-138-2

CCCAGGCAGAACCCCAGAGGGGCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGTCTCACAGAGATCCT

Lm-ddA-164-1

CCCAGGCAGAACCCCAGAGGGGCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGTCTCACAGAGATCCT

LmddA-164-2

CCCAGGCAGAACCCCAGAGGGGCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGTCTCACAGAGATCCT

LmddA-164-3

CCCAGGCAGAACCCCAGAGGGGCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGTCTCACAGAGATCCT

LmddA164-4

CCCAGGCAGAACCCCAGAGGGGCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGTCTCACAGAGATCCT

參考

GAAGGGAGGAGTTTTGATCCGTGGGAACCCTCAGCTCTGCTACCAGGACATGGTTTTGTG(SEQ ID NO:41)

Lm-LLO-138-1

GAAGGGAGGAGTTTTGATCCGTGGGAACCCTCAGCTCTGCTACCAGGACATGGTTTTGTG

Lm-LLO-138-2

GAAGGGAGGAGTTTTGATCCGTGGGAACCCTCAGCTCTGCTACCAGGACATGGTTTTGTG

Lm-ddA-164-1

GAAGGGAGGAGTTTTGATCCGTGGGAACCCTCAGCTCTGCTACCAGGACATGGTTTTGTG

LmddA-164-2

GAAGGGAGGAGTTTTGATCCGTGGGAACCCTCAGCTCTGCTACCAGGACATGGTTTTGTG

LmddA-164-3

GAAGGGAGGAGTTTTGATCCGTGGGAACCCTCAGCTCTGCTACCAGGACATGGTTTTGTG

LmddA164-4

GAAGGGAGGAGTTTTGATCCGTGGGAACCCTCAGCTCTGCTACCAGGACATGGTTTTGTG

參考

CCGGGCCTGTCCACCTTGTGCCCCCGCCTGCAAAGACAATCACTGTTGGGGTGAGAGTCC(SEQ ID NO:42)

Lm-LLO-138-1

CCGGGCCTGTCCACCTTGTGCCCCCGCCTGCAAAGACAATCACTGTTGGGGTGAGAGTCC

Lm-LLO-138-2

CCGGGCCTGTCCACCTTGTGCCCCCGCCTGCAAAGACAATCACTGTTGGGGTGAGAGTCC

Lm-ddA-164-1

CCGGGCCTGTCCACCTTGTGCCCCCGCCTGCAAAGACAATCACTGTTGGGGTGAGAGTCC

LmddA-164-2

CCGGGCCTGTCCACCTTGTGCCCCCGCCTGCAAAGACAATCACTGTTGGGGTGAGAGTCC

LmddA-164-3

CCGGGCCTGTCCACCTTGTGCCCCCGCCTGCAAAGACAATCACTGTTGGGGTGAGAGTCC

LmddA164-4

CCGGGCCTGTCCACCTTGTGCCCCCGCCTGCAAAGACAATCACTGTTGGGGTGAGAGTCC

參考

GGAAGACTGTCAGATCTTGACTGGCACCATCTGTACCAGTGGTTGTGCCCGGTGCAAGGG(SEQ ID NO:43)

Lm-LLO-138-1

GGAAGACTGTCAGATCTTGACTGGCACCATCTGTACCAGTGGTTGTGCCCGGTGCAAGGG

Lm-LLO-138-2

GGAAGACTGTCAGATCTTGACTGGCACCATCTGTACCAGTGGTTGTGCCCGGTGCAAGGG

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LmddA164-4

GGAAGACTGTCAGATCTTGACTGGCACCATCTGTACCAGTGGTTGTGCCCGGTGCAAGGG

參考

CCGGCTGCCCACTGACTGCTGCCATGAGCAGTGTGCCGCAGGCTGCACGGGCCCCAAGCA(SEQ ID NO:44)

Lm-LLO-138-1

CCGGCTGCCCACTGACTGCTGCCATGAGCAGTGTGCCGCAGGCTGCACGGGCCCCAAGCA

Lm-LLO-138-2

CCGGCTGCCCACTGACTGCTGCCATGAGCAGTGTGCCGCAGGCTGCACGGGCCCCAAGCA

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實(shí)例7：ADXS31-164的外周免疫可延緩腦中轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞系的生長。

使用ADXS31-164或不相關(guān)Lm-對照疫苗IP免疫小鼠，然后顱內(nèi)植入5,000個(gè)表達(dá)熒光素酶和低水平HER2/neu的EMT6-Luc腫瘤細(xì)胞(圖6C)。在接種后的不同時(shí)間通過麻醉小鼠的離體成像監(jiān)測腫瘤。在腫瘤接種后第8天，檢測所有對照動物中的腫瘤，但ADXS31-164中的小鼠均未顯示出任何可檢測的腫瘤(圖6A和B)。ADXS31-164可明顯延緩這些腫瘤的發(fā)病，因?yàn)樵谀[瘤接種后第11天陰性對照組中的所有小鼠已死于腫瘤，但ADXS31-164組中的所有小鼠仍然存活，并且僅顯示出少量腫瘤生長的跡象。這些結(jié)果強(qiáng)烈暗示，ADXS31-164的外周施用得到的免疫應(yīng)答可能到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并且基于LmddA的疫苗可具有治療CNS腫瘤的潛在用途。

實(shí)例8：通過ADXS31-164免疫治療犬科動物骨肉瘤。

犬科動物骨肉瘤是長(腿)骨的癌癥，是年齡超過10歲的大狗的主要?dú)⑹?。?biāo)準(zhǔn)治療是在診斷后立即截肢，然后化療。然而，不變的是癌癥轉(zhuǎn)移到肺。與未治療的6-12個(gè)月存活期相比，通過化療可使狗存活約18個(gè)月。據(jù)信，HER2抗原存在于多達(dá)50％的骨肉瘤中。ADXS31-164對表達(dá)此抗原的細(xì)胞形成免疫攻擊，并且已開發(fā)用于治療人乳腺癌。

組織學(xué)診斷為骨肉瘤并且具有惡性細(xì)胞表達(dá)HER2/neu的證據(jù)的狗符合入選資格。

犬科動物骨肉瘤試驗(yàn)

在第一隊(duì)中，進(jìn)行截肢，然后接受幾輪化療治療。隨后施用3劑Her-2疫苗，6個(gè)月間隔期后加強(qiáng)或不加強(qiáng)。

所有狗接受4周的卡鉑治療。在最后卡鉑給藥后四周，狗每三周接受一次ADXS-HER2，總共給藥3次。第1組(3只狗)接受1×10⁸個(gè)CFU/劑，第2組(3只狗)每只接受5×10⁸個(gè)CFU/劑，第3組(3只狗)接受1×10⁹個(gè)CFU/劑。如果觀察到潛在的劑量限制毒性，則向組中加入另外的狗以收集更多的數(shù)據(jù)。因此，在初步研究中可治療9-18只狗。

在第二隊(duì)中，與第一隊(duì)相同重復(fù)治療，不同的是在化療前(1個(gè)月前)僅施用單劑疫苗，總共給藥4次。

另外，在化療后一個(gè)月給兩隊(duì)施用單劑。

實(shí)例9：評估ADXS-cHER2在患有HER2/NEU過表達(dá)的犬科動物骨肉瘤的伴侶狗中的安全性的1期劑量遞增研究

進(jìn)行前期I期劑量遞增研究以確定可安全和有效地刺激患有骨肉瘤的狗的腫瘤特異性免疫的表達(dá)人HER2/neu重組疫苗的單核細(xì)胞增多性李斯特菌的劑量。例行收集由于懷疑或確認(rèn)患有OSA而提供給PennVet進(jìn)行截肢的所有狗的腫瘤，并進(jìn)行組織病理學(xué)評估以確認(rèn)OSA的診斷。此外，通過IHC和Western印跡分析來評估所有狗的腫瘤切片，以確定腫瘤是否表達(dá)HER2/neu。只有組織學(xué)診斷為OSA并且具有惡性細(xì)胞表達(dá)HER2/neu的證據(jù)的狗才符合入選資格。冷藏在手術(shù)時(shí)采集的腫瘤組織的單細(xì)胞懸液，并在鉻釋放分析中用作自體腫瘤靶標(biāo)，以確定抗腫瘤免疫。

入選了最多18只患有肢體OSA并確認(rèn)表達(dá)Her2-neu的私有狗(圖7)。在入選時(shí)(最后卡鉑治療后3周)，所有狗接受了基本臨床實(shí)驗(yàn)室測試，包括全血細(xì)胞計(jì)數(shù)(CBC)、化學(xué)篩選(CS)和尿分析(UA)以及通過超聲心動描記法進(jìn)行心臟功能的基線評估和測定心臟特異性肌鈣蛋白I(cTnI)水平。通過胸部放射顯影確定是否存在肺轉(zhuǎn)移。只有無肺轉(zhuǎn)移證據(jù)的狗才符合研究入選資格。在入選時(shí)，收集外周血單核細(xì)胞(PBMC)以評估抗腫瘤免疫的基線水平(參見抗腫瘤免疫的評估)。此外，采血評估基線免疫功能，以確保它們不再受卡鉑免疫抑制。只有具有功能完整的免疫系統(tǒng)的狗才符合接受李斯特菌疫苗的資格。

Lm重組給藥和數(shù)據(jù)采集

使用單個(gè)ADXS31-164ADXS31-164重組疫苗給所有狗接種。在最后卡鉑給藥后三周給予第一次Lm-huHer2-neu疫苗，此后每三周給予一次，總共給藥3次(圖7)。

第1組(3只狗)接受1×10⁸個(gè)CFU/劑的ADXS31-164(Lm-人嵌合HER2/neu)疫苗，第2組(3只狗)每只接受5×10⁸個(gè)CFU/劑，第3組(3只狗)接受1×10⁹個(gè)CFU/劑和3.3×10⁹個(gè)CFU/劑(1只狗)。重組Lm經(jīng)30分鐘以緩慢靜脈內(nèi)輸注而施用。第1組所選的劑量為小鼠中嵌合ADXS31-164重組體的確定安全劑量。在人中，Lovaxin C的無毒劑量僅比小鼠中確定的劑量高一個(gè)數(shù)量級，并且該劑量為該前期試驗(yàn)中第3組評估的劑量。

在Lm施用時(shí)，監(jiān)測狗的全身性不利影響的證據(jù)。在輸注期間，通過ECG監(jiān)測心搏率和心律并記錄呼吸率。另外，使用超聲波并通過測定肌鈣蛋白I水平來監(jiān)測心臟損傷(圖8)。在輸注后，密切監(jiān)測狗48小時(shí)。在輸注后使用MiniMitterRespironics制造的Vital Sense連續(xù)體溫監(jiān)控系統(tǒng)(獸醫(yī)臨床試驗(yàn)中心(VCIC)常用儀器)連續(xù)監(jiān)控核心體溫<12小時(shí)。在前6小時(shí)的每小時(shí)和其后的每4小時(shí)監(jiān)測并記錄脈搏率、脈搏節(jié)律和脈象、呼吸率和呼吸努力，以及血壓和體溫(圖9)。記錄所有符合免疫刺激的癥狀，根據(jù)需要使用流體、止痛劑、止吐劑和抗組胺劑控制嚴(yán)重反應(yīng)。所有狗每天觀察六次，記錄重組體的任何毒性效應(yīng)的跡象，包括不適、嗜睡、惡心、嘔吐和腹瀉。在第一次ADXS31-164疫苗接種后24、48和72小時(shí)采集血樣進(jìn)行培養(yǎng)，以評估全身施用后Lm的清除。

抗腫瘤免疫的評估

在最后卡鉑給藥后三周，狗接受常規(guī)臨床檢查和基線血液工作，包括CBC、CS、UA和cTnI水平。在該時(shí)間采集PBMC進(jìn)行抗腫瘤免疫的基線評估。在每次疫苗接種時(shí)和最后疫苗接種后三周進(jìn)行重復(fù)的免疫評估。通過CFSE增殖、細(xì)胞因子生成(ELISpot和qRT-PCR)和CTL分析法來分析PBMC對自體腫瘤靶標(biāo)的HER2/neu特異性T細(xì)胞應(yīng)答，如下文所概述(圖12)。

結(jié)果

迄今為止，我們在16只狗中進(jìn)行了總共41次ADXS31-164輸注。

ADXS31-164劑量的范圍為1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹和3.3×10⁹個(gè)CFU。

疫苗施用的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

開發(fā)ADXS31-164施用的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。在疫苗接種前一小時(shí)，患者通過肌內(nèi)注射接受2mg/kg苯海拉明，以及緩慢靜脈推注0.2mg/kg昂丹司瓊。疫苗保持在-80℃下，在給患者施用時(shí)解凍。它溶于200ml 0.9％NaCl中經(jīng)30分鐘施用。然后用30ml Plasmalyte沖洗輸注管線。將狗送回籠舍，三天一個(gè)療程施用阿莫西林(疫苗接種后72小時(shí)開始)，7天一個(gè)療程施用肝臟補(bǔ)充劑(S-腺苷-甲硫氨酸)，以幫助細(xì)胞生長和修復(fù)。

研究的主要終點(diǎn)是確定ADXS31-164的最大耐受劑量。

體重在25kg至67kg范圍內(nèi)的狗能很好地耐受高達(dá)3.3×10⁹的劑量。所有報(bào)告的副作用均為I級毒性，最大耐受劑量尚未達(dá)到。通常在疫苗施用的2-4小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)副作用。高熱通常以維持速率(4ml/kg/小時(shí))靜脈內(nèi)遞送等滲流體2-4小時(shí)而消退。在其中發(fā)熱達(dá)到104.7和更高的兩種情況下，單次皮下注射卡洛芬在1-2小時(shí)內(nèi)使體溫恢復(fù)正常。惡心和嘔吐通常是自限性的，但在其中記錄到多次發(fā)作的情況下，施用1mg/kg Cerenia，這對預(yù)防進(jìn)一步的惡心和嘔吐非常有效。在疫苗施用的48小時(shí)內(nèi)，總共5只狗的肝臟酶出現(xiàn)輕度、I級升高，這在疫苗接種一周后消退。

李斯特菌的清除

在對迄今為止接種疫苗的所有16只狗進(jìn)行血液培養(yǎng)后，疫苗接種后24小時(shí)任何一只狗的外周循環(huán)中均未檢測到李斯特菌。未評估疫苗接種狗的尿液和糞便中李斯特菌的流出。

研究的次要終點(diǎn)是無進(jìn)展存活期和總體存活期。在截肢和4劑卡鉑后施用ADXS31-164時(shí)已觀察到患有骨肉瘤的狗具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性的總體存活期優(yōu)勢。前兩劑組(6只狗)的早期結(jié)果顯示，與其主人選擇不參與試驗(yàn)但跟蹤存活期的6只狗相比，接受ADXS31-164的狗具有顯著的存活期優(yōu)勢(p＝0.003)(圖13)。未接種疫苗的狗的平均存活時(shí)間為239.5天。未到達(dá)接種疫苗的狗的平均存活時(shí)間。當(dāng)分析包括意向治療組中的所有狗時(shí)，這也成立。

因此，沒有證據(jù)顯示對心血管、造血、肝臟或腎臟系統(tǒng)造成顯著的短期或長期副作用。此外，在存在微小殘留病的情況下，ADXS31-164的施用可延緩/防止轉(zhuǎn)移性疾病，并延長患有HER2/neu陽性骨肉瘤的狗的總體存活期。

實(shí)例10：

在骨肉瘤(OSA)的自發(fā)性犬科動物模型中評估ADXS31-164的1期臨床試驗(yàn)

材料和方法

疫苗制造

ADXS31-164的設(shè)計(jì)和產(chǎn)生。簡而言之，用攜帶嵌合人HER2/neu構(gòu)建體的pADV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染單核細(xì)胞增多性李斯特菌(Lm)的dal dat actA突變體菌株。該構(gòu)建體包含人HER2/neu分子的2個(gè)胞外域(EC1和EC2)和一個(gè)胞內(nèi)域(IC1)，人HER2/neu分子包含大部分融合至截短的李斯特菌溶血素O構(gòu)建體的HLA-A2限制免疫優(yōu)勢表位。轉(zhuǎn)移質(zhì)粒還包含芽孢桿菌p60dal基因，并且通過營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)而維持在突變體Lm內(nèi)。不存在細(xì)菌抗性盒。疫苗由Vibalogics GmbH(Cuxhaven,Germany)制造，在使用之前保存在-80℃。

組織病理學(xué)、分期和免疫組織化學(xué)

所有原發(fā)性肢體骨肉瘤腫瘤的組織病理學(xué)評估由委員會認(rèn)證的獸醫(yī)病理學(xué)家(J.E.)進(jìn)行。根據(jù)組織學(xué)特征將腫瘤描述為成骨細(xì)胞腫瘤、軟骨母細(xì)胞腫瘤、纖維母細(xì)胞腫瘤和血管擴(kuò)張性腫瘤。根據(jù)有絲分裂指數(shù)、核多形性以及基質(zhì)和壞死的存在量對原發(fā)性腫瘤進(jìn)行評分。將組織學(xué)評分轉(zhuǎn)換為級別(I、II或III)。

對于HER2/neu染色，將福爾馬林固定、脫鈣、石蠟包埋組織的5微米厚連續(xù)切片安裝到帶負(fù)電的載玻片上。切片在80℃下加熱20分鐘，浸入Pro Par(clearant)中，在乙醇中再水化。通過在檸檬酸鈉緩沖液(pH～9.0)中煮沸切片進(jìn)行抗原修復(fù)。使用3％過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶。使用兔抗人HER2/neu抗體(Neu(c-18):sc-284,Santa Cruz Biotecnology)或兔IgG同種型(通用陰性對照血清(Universal Negative Control serum)，NC498，Biocare Medical)進(jìn)行染色。使用通用鏈親和素-生物素2系統(tǒng)(Universal Streptavadin-Biotin2System)(DAKO/LSAB2,HRP)檢測結(jié)合的抗體。組織用3,3'-二氨基聯(lián)苯胺溶液(DAKO)染色，并用蘇木精復(fù)染色。使用Nikon E600infinity經(jīng)校正的正立顯微鏡觀察玻片。使用Nikon Digital Sight DS-Fi1彩色照相機(jī)獲取亮視野圖像，并使用NIS-Element BR3.0進(jìn)行圖像分析。由委員會認(rèn)證的病理學(xué)家(J.E.)根據(jù)贅生性細(xì)胞的HER2/neu染色百分比(<10％＝1,10％-50％＝2,>50％＝3)和HER2/neu染色強(qiáng)度(弱＝1、中＝2、強(qiáng)＝3)對組織切片的HER2/neu陽性進(jìn)行評估和評分。每個(gè)組織切片的得分基于10hpf內(nèi)分析的細(xì)胞。合并的HER2/neu得分通過HER2/neu染色陽性的腫瘤細(xì)胞百分比和HER2/neu染色強(qiáng)度給出的兩個(gè)單獨(dú)的得分相乘得到。只有HER2/neu染色陽性的腫瘤細(xì)胞大于10％的狗才符合試驗(yàn)入選資格。

合格標(biāo)準(zhǔn)和臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)

組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)診斷為HER2/neu陽性O(shè)SA的狗接受了通過截肢或保肢手術(shù)進(jìn)行的原發(fā)性腫瘤摘除，并接受了4劑300mg/m²的卡鉑作為輔助性化療，卡鉑每3周給予一次(或如果出現(xiàn)骨髓抑制，則每4周一次)，此類狗符合篩選資格。在最后卡鉑治療后三周對狗進(jìn)行篩選。進(jìn)行全面體檢、全血細(xì)胞計(jì)數(shù)(CBC)、化學(xué)篩選(CS)和尿分析(UA)以確定一般健康狀態(tài)。分別使用流式細(xì)胞中性粒細(xì)胞氧化爆發(fā)分析和有絲分裂原誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖分析來測試基本先天性和適應(yīng)性免疫功能。通過心電描記法、超聲心動描記法和血清心臟肌鈣蛋白I水平評估基線心臟狀態(tài)。進(jìn)行胸部放射顯影以確定肺轉(zhuǎn)移性疾病的存在(參見圖14B)。只有經(jīng)發(fā)現(xiàn)全身健康、先天性和適應(yīng)性免疫功能完整、無潛在心臟疾病證據(jù)并且無肺轉(zhuǎn)移性疾病證據(jù)的那些狗才符合入選資格。在研究的過程中死亡的狗接受尸檢。記錄轉(zhuǎn)移性疾病的存在和位置，進(jìn)行組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)分析，以評估轉(zhuǎn)移性病灶中的HER2/neu表達(dá)。

免疫分析

中性粒細(xì)胞氧化爆發(fā)分析。使用0.83％NH₄Cl裂解肝素鈉抗凝血中的紅細(xì)胞，其余的白細(xì)胞在1×PBS中洗滌兩次。用15μg/ml二氫若丹明123(DHR-123；Molecular Probes,Grand Island,NY)標(biāo)記細(xì)胞，并用3nM佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯(PMA,Sigma,St.Louis,MO)在37℃下活化30分鐘。將細(xì)胞置于冰上15分鐘，然后進(jìn)行流式細(xì)胞分析。在FACS Canto細(xì)胞計(jì)數(shù)器(BD Biosciences,San Jose,CA)上獲取細(xì)胞，并使用FloJo軟件(Treestar,San Carlos,CA)進(jìn)行分析。

淋巴細(xì)胞增殖分析。通過密度離心從肝素鈉抗凝全血分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)。PBMC在1×PBS中洗滌兩次并計(jì)數(shù)。用5μM CFSE標(biāo)記細(xì)胞，并用1.25μM伴刀豆球蛋白A在37℃下刺激5天。收集細(xì)胞，在FACS緩沖液中洗滌兩次，用APC綴合的大鼠抗犬科動物CD4和PE綴合的大鼠抗犬科動物CD8抗體Serotec,Raleigh,NC)標(biāo)記，并通過流式細(xì)胞術(shù)分析。對于免疫功能分析，使用從健康集落狗(IACUC#804197)采集的外周血作為陽性對照。

T細(xì)胞亞群分析。在基線、每次疫苗接種之前、再分期時(shí)以及其后每2個(gè)月采集PBMC，進(jìn)行CD4和CD8T細(xì)胞亞群分析。簡而言之，解凍冷藏的細(xì)胞，在FACS緩沖液(1×PBS、0.2％BSA組分V和4mM疊氮化鈉)中洗滌兩次，然后用小鼠抗犬科動物CD3、PE標(biāo)記的大鼠抗狗CD8或Alexa標(biāo)記的大鼠抗狗CD4(Serotec,Raleigh,NC)進(jìn)行表面染色。在流式細(xì)胞采集之前立即用活體染料7-ADD溫育細(xì)胞。由使用Cell Dyn 3700CS血液分析儀測定的流式細(xì)胞百分比和總淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)來計(jì)算CD4⁺和CD8⁺T細(xì)胞總數(shù)。

疫苗施用

在疫苗接種之前，狗接受靜脈內(nèi)施用5HT3拮抗劑昂丹司瓊(0.2mg/kg)和肌內(nèi)施用H1受體阻斷劑苯海拉明(2mg/kg)，分別用于預(yù)防惡心和過敏。利用標(biāo)準(zhǔn)3+3臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)。ADXS31-164按以下劑量施用；第1組(2×10⁸個(gè)CFU)、第2組(5×10⁸個(gè)CFU)、第3組(1×10⁹個(gè)CFU)以及第4組(3.3×10⁹個(gè)CFU)。在100ml 0.9％NaCl(第1和2組)和200ml 0.9％NaCl(第3和4組)中稀釋ADXS31-164，并經(jīng)30分鐘靜脈內(nèi)施用。在輸注后每小時(shí)監(jiān)測體溫、脈搏、呼吸率、心率和心律(通過EKG)以及血壓。在其中體溫超過103℉的情況下，給狗靜脈內(nèi)施用4ml/kg/h Plasmalyte，直到體溫降至103℉之下。每小時(shí)監(jiān)測狗的嗜睡、惡心或嘔吐跡象。在24小時(shí)和疫苗接種后一周采集血樣，以評估血液學(xué)或生物化學(xué)參數(shù)的任何變化，并且在疫苗接種后24小時(shí)進(jìn)行血液培養(yǎng)，以確定血流中活細(xì)菌的持續(xù)存在性。在疫苗接種后72小時(shí)，所有狗接受短療程的阿莫西林和S-腺苷甲硫氨酸(SAMe)，以殺死任何殘留的李斯特菌，以及為肝臟提供抗氧化劑支持。

在接受初始系列中的最后疫苗后至少5個(gè)月無轉(zhuǎn)移性疾病的狗的主人可選擇接受1×10⁹個(gè)CFU的標(biāo)準(zhǔn)劑量的加強(qiáng)疫苗。如上文所述施用加強(qiáng)疫苗，并且如上文所述在輸注后對狗進(jìn)行監(jiān)測。

毒性

根據(jù)Veterinary Co-operative Oncology Group-Common Terminology Criteria for Adverse Events(VCOG-CTCAE)(獸醫(yī)合作腫瘤學(xué)組-不良事件的常用術(shù)語標(biāo)準(zhǔn))對毒性進(jìn)行分級。在基線、每次疫苗接種時(shí)、最后疫苗接種后3周以及其后每2個(gè)月通過連續(xù)心電圖、超聲心動圖和血清心臟肌鈣蛋白I水平進(jìn)行心臟毒性的評估，直到死亡。所評估的參數(shù)包括左室縮短分?jǐn)?shù)(LVFS)和左室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)以及左室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)。將LVIDd和LVIDs歸一化為體重，以考慮狗中寬范圍的體格大小。

ELISpot分析

在每個(gè)指定的時(shí)間點(diǎn)解凍冷藏的PBMC，在37℃下放置過夜，然后計(jì)數(shù)。細(xì)胞用2.5μM重疊人HER2/Neu肽庫(11個(gè)單位重疊5個(gè)氨基酸)(表示嵌合疫苗中存在的HER2/Neu的EC1、EC2和IC1域)和重組人IL-2(Invitrogen,Fredrick,MD)刺激5天。收集細(xì)胞，在1×PBS中洗滌兩次并計(jì)數(shù)。IFN-γELISpot分析使用商業(yè)化犬科動物IFN-γELISpot分析試劑盒(R&D Systems,Minneapolis,MN)根據(jù)制造商的方案進(jìn)行。簡而言之，將0.8-2×10⁵個(gè)經(jīng)刺激的細(xì)胞與2.5μM EC1、EC2或IC1肽庫加上IL-2或單獨(dú)的IL-2(以測定背景計(jì)數(shù))一起溫育。所有分析一式兩份地進(jìn)行。根據(jù)制造商的說明對平板顯色。使用CTL-Immunospot分析儀(C.T.L,ShakerHeights,OH)對斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)。

主要和次要結(jié)局測定

轉(zhuǎn)移時(shí)間(TTM)以截肢和發(fā)生轉(zhuǎn)移性疾病之間的時(shí)間計(jì)算。OSA特異性存活期以截肢和死亡之間的時(shí)間計(jì)算。對死于不相關(guān)原因的患者在死亡時(shí)進(jìn)行審查。

結(jié)果

達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)的十八只狗入選該I期臨床試驗(yàn)。記錄年齡、品種、性別、腫瘤位置、亞類、等級和HER2/neu狀態(tài)(表4)。利用標(biāo)準(zhǔn)3+3臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)。ADXS31-164按以下劑量施用；第1組：2×10⁸個(gè)CFU(n＝3)、第2組：5×10⁸個(gè)CFU(n＝3)、第3組：1×10⁹個(gè)CFU(n＝9)以及第4組：3×10⁹個(gè)CFU(n＝3)。出于關(guān)懷護(hù)理，五只另外的在篩選時(shí)鑒定為患有預(yù)先存在的肺轉(zhuǎn)移性疾病的狗也接受ADXS31-164(表4)。這些狗中的四只在>50％的來自原發(fā)性腫瘤的贅生性細(xì)胞中具有強(qiáng)HER2/neu染色。在篩選時(shí)，這些狗中的三只具有多個(gè)肺轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)，兩只狗具有單個(gè)轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)。具有多個(gè)肺結(jié)節(jié)的狗每只在疾病進(jìn)展前接受一劑疫苗，并退出研究進(jìn)行替代治療。具有單個(gè)結(jié)節(jié)的兩只狗每只接受全程三劑疫苗?；加蓄A(yù)先存在的轉(zhuǎn)移性疾病的狗接受1×10⁹個(gè)CFU(n＝3)或3×10⁹個(gè)CFU(n＝2)ADXS31-164(表5)。

圖15示出了1期臨床試驗(yàn)的時(shí)間線示意圖，其中三次疫苗接種在截肢和隨訪化療后施用。

表4：入選的狗的特征描述和腫瘤特征

表5：出于關(guān)懷護(hù)理而治療的患有預(yù)先存在的轉(zhuǎn)移性疾病的狗的特征描述和腫瘤特征

結(jié)果

安全性和毒性＝評估所有23只疫苗接種狗的安全性。所有狗能很好地耐受ADXS31-164施用，僅在疫苗接種日觀察到瞬時(shí)低級別毒性(表6)。在所有組中，ADXS31-164施用后4小時(shí)出現(xiàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性的體溫升高，與劑量無關(guān)(圖9A)。在任何時(shí)間點(diǎn)或任何劑量下均未觀察到低血壓(圖9B)。8/18只狗(未患預(yù)先存在的轉(zhuǎn)移性疾病)和3/5只狗(患有預(yù)先存在的轉(zhuǎn)移性疾病)在疫苗接種的4小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)>103℉的發(fā)熱，此時(shí)給予靜脈補(bǔ)液。三只狗接受單劑量的非甾體抗炎藥，以降低體溫。在所有情況下，發(fā)熱的消退無需另外干預(yù)。在疫苗接種的4小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)不需要治療干預(yù)的瞬時(shí)嗜睡、惡心和嘔吐，與劑量無關(guān)。在疫苗接種后不久，在兩只狗中鑒定到瞬時(shí)單或二聯(lián)室性早搏。在疫苗接種的2小時(shí)內(nèi)，一只患有預(yù)先存在的轉(zhuǎn)移性疾病的狗出現(xiàn)室性心動過速。然而，利多卡因、普魯卡因胺、索他洛爾和皮質(zhì)類固醇的治療沒有效果，心律失常在72小時(shí)內(nèi)消退。在ADXS31-164施用24小時(shí)后出現(xiàn)瞬時(shí)、但具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性的白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)增加，并且伴有血小板和淋巴細(xì)胞瞬時(shí)減少(圖17)。雖然ADXS31-164劑量和血液學(xué)變化幅度之間無相關(guān)性，但存活的狗和死亡的狗之間的白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞應(yīng)答幅度存在顯著的差異(圖18A-F)。大約一半的狗的肝臟酶血清濃度出現(xiàn)輕度、瞬時(shí)升高，與親肝李斯特菌引起的輕度炎癥一致(表6)。外周血中鑒定的所有變化均為無癥狀的，并且在ADXS31-164施用的一周內(nèi)消退。在任何狗中均未記錄到腎功能的顯著變化。19/23只狗在ADXS31-164施用后24小時(shí)進(jìn)行了血液培養(yǎng)，并且均為陰性的，與高度減毒LmddA菌株的快速清除一致。

鑒于HER2/neu靶向單克隆抗體會引起心臟毒性，我們在基線、每次疫苗接種之前以及其后每2個(gè)月評估了心臟損傷的生物標(biāo)志物和機(jī)能障礙的超聲心動描記計(jì)測量，包括心臟肌鈣蛋白I、縮短分?jǐn)?shù)(％)、LVIDd和LVIDs。在任何疫苗接種狗中均未鑒定到心臟肌鈣蛋白I、縮短分?jǐn)?shù)、LVIDd或LVIDs的顯著、持續(xù)變化(圖26A-D)。然而，第3組的一只狗在每次疫苗接種時(shí)顯示出血清心臟肌鈣蛋白I的階躍升高，不伴有超聲心動描記的機(jī)能障礙跡象。值在最后疫苗接種后返回基線，并且在重復(fù)評估時(shí)未升高。

在整個(gè)臨床試驗(yàn)中，測定心臟肌鈣蛋白I水平，以及縮短分?jǐn)?shù)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)和左室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)，如圖25(A-D)所示，在ADXS31-164的施用后，不存在長期或短期心臟毒性的證據(jù)。

下表6提供的數(shù)據(jù)示出，在臨床試驗(yàn)期間報(bào)告了極少的治療相關(guān)不良事件。

表6：在ADXS31-164疫苗接種時(shí)或48小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)的治療相關(guān)不良事件。

結(jié)論：ADSX31-164毒性是低級別的并且是瞬時(shí)的。

對ADXS31-164的免疫應(yīng)答

圖18提供的結(jié)果證實(shí)，在接受疫苗的狗中，對ADXS31-164的早期免疫應(yīng)答預(yù)測了狗的存活期。圖18顯示，ADXS31-164誘導(dǎo)了與存活期相關(guān)的WBC、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞計(jì)數(shù)增加，并且伴有血小板和淋巴細(xì)胞的瞬時(shí)減少(圖17)。

在臨床試驗(yàn)期間評估了ADXS31-164誘導(dǎo)和維持免疫應(yīng)答，具體地講誘導(dǎo)HER2/neu特異性T細(xì)胞免疫的能力。為了評估免疫應(yīng)答以及確定ADXS31-164是否誘導(dǎo)了HER2/neu特異性T細(xì)胞應(yīng)答，通過IFN-γELISpot評估了HER2/neu特異性T細(xì)胞數(shù)量。在基線(卡鉑施用后3周)、每次疫苗接種時(shí)以及其后每2個(gè)月采集樣品。圖19示出了ELISpot分析的結(jié)果。

HER2/neu特異性免疫應(yīng)答。在基線分別對4/18、6/18和1/18只狗檢測對人HER2/neu的EC1、EC2和IC1域(分別與犬科動物HER2/neu共有89％、93％和98％同一性)的免疫應(yīng)答。在第三次ADXS31-164疫苗接種后3周對7只狗檢測對一個(gè)或多個(gè)HER2/neu域的誘導(dǎo)的IFN-γ應(yīng)答(表7)。這些狗中的五只出現(xiàn)對高度保守的IC1域的免疫應(yīng)答。在2個(gè)月后五只另外的狗出現(xiàn)對IC1域的IFN-γ應(yīng)答。在復(fù)發(fā)時(shí)，三只另外的狗出現(xiàn)對單獨(dú)的EC2、EC2和IC1或EC1、EC2和EC3的IFN-γ應(yīng)答(狗001、002和017)。通過IFN-γELISpot評估在初始疫苗接種系列期間出現(xiàn)對HER2/neu的免疫應(yīng)答的3只狗15至17個(gè)月。然而，并未維持HER2/neu特異性IFN-γ應(yīng)答，在此期間狗仍無轉(zhuǎn)移性疾病。10只狗接受另外的加強(qiáng)疫苗接種，其中6只可評估，在加強(qiáng)疫苗接種后2個(gè)月，2只狗檢測到HER2/neu特異性IFN-γ應(yīng)答增加。在ADXS31-164施用后3周，復(fù)發(fā)的8只狗中，5只的HER2/neu特異性IFN-γ應(yīng)答不增加。

表7

加強(qiáng)疫苗接種。在18只入選時(shí)無轉(zhuǎn)移性疾病的狗中，十只在初始疫苗系列后5和10個(gè)月之間施用單劑加強(qiáng)疫苗。這些狗中的四只接受在首次加強(qiáng)疫苗后4和15個(gè)月之間給予的另外加強(qiáng)疫苗。在加強(qiáng)疫苗接種時(shí)，與初始疫苗接種系列一樣，記錄到了類似的低級別、瞬時(shí)副作用。

圖20(A和B)示出，重復(fù)加強(qiáng)疫苗接種還刺激了HER2特異性免疫。在6和10個(gè)月對動物289-003施用重復(fù)加強(qiáng)疫苗接種，在8個(gè)月對動物289-004施用。臨床結(jié)局。疫苗接種組中8/18只狗復(fù)發(fā)，4只患有肺轉(zhuǎn)移性疾病，4只出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移。兩只骨轉(zhuǎn)移的狗進(jìn)展到肺轉(zhuǎn)移。一只骶骨具有骨病灶的狗死于吸入性肺炎，一只具有單個(gè)肺結(jié)節(jié)的狗死于腎胚細(xì)胞瘤，然而，分別來自骨和肺病灶的尸檢樣本不適于轉(zhuǎn)移性骨肉瘤的組織病理學(xué)確認(rèn)。通過OSA特異性存活期分析，對這兩只狗進(jìn)行審查。復(fù)發(fā)的狗在初診判斷時(shí)接受不同的挽救化療和放療。4只骨轉(zhuǎn)移的狗僅用止痛劑治療(1只狗)、單獨(dú)的姑息性放療(1只狗)或與化療聯(lián)合(2只狗)。兩只狗接受阿霉素，1只狗接受Palladia，以治療肺轉(zhuǎn)移性疾病。未達(dá)到疫苗接種狗的中值OSA特異性存活期。TTM的Kaplan-Meier存活期曲線和OSA特異性存活期如圖21所示。疫苗接種狗的1年和2年總體存活率分別為71.4％和57％。在疫苗接種的2個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)HER2/neu特異性IFN-γ應(yīng)答的12只狗中，9只仍然存活(3只狗>900天，1只狗>700天，3只狗>400天，2只狗>300天，并且7只目前仍無腫瘤(表7))。圖24提供的結(jié)果顯示，ADXS31-164破壞了對HER2/Neu的耐受性。這對OSA以及其他HER2/neu腫瘤和/或癌癥的治療是重要的。

尸檢結(jié)果。6/18只狗在研究期間死亡，對這些狗中的4只進(jìn)行尸檢。三只狗被發(fā)現(xiàn)患有多灶性II和III級轉(zhuǎn)移性骨肉瘤，涉及肺(3只狗)、骨(2只狗)、縱隔(1只狗)和腎(1只狗)。一只狗由于大型進(jìn)行性腎臟腫塊而被實(shí)施安樂死，被發(fā)現(xiàn)患有腎胚細(xì)胞瘤。這只狗還具有單個(gè)肺結(jié)節(jié)，但遺憾的是未通過組織病理學(xué)評估。

ADXS31-164施用后的存活期、長存活期、腫瘤進(jìn)展

在篩選時(shí)三只具有多個(gè)轉(zhuǎn)移性肺結(jié)節(jié)的狗，出于關(guān)懷護(hù)理，在疾病進(jìn)行前每只接受一劑疫苗治療，并從研究中移除。在篩選時(shí)兩只存在孤立性轉(zhuǎn)移性肺結(jié)節(jié)的狗接受全部三劑疫苗(參見表5的特征描述和腫瘤特征)。盡管進(jìn)行了疫苗接種，這些狗中的一只仍出現(xiàn)進(jìn)行性肺轉(zhuǎn)移性疾病。在第二只狗中，盡管預(yù)先存在的肺結(jié)節(jié)每3周大小加倍，但未出現(xiàn)另外的肺病灶(圖22A和B)。在最后疫苗接種后一周，CT掃描確認(rèn)不存在另外的轉(zhuǎn)移性病灶，并且狗接受轉(zhuǎn)移灶切除。在手術(shù)前，靜脈內(nèi)施用用于檢測腫瘤邊緣和炎癥區(qū)域的染料吲哚菁綠(ICG)，在手術(shù)時(shí)，在近紅外光下觀察到肺結(jié)節(jié)中以及孤立性結(jié)節(jié)附近的多個(gè)其他外觀健康的肺實(shí)質(zhì)區(qū)域中的熒光(圖22C和D)。肺結(jié)節(jié)的組織病理學(xué)揭示，轉(zhuǎn)移性O(shè)SA具有被厚纖維囊圍繞的很大的出血和壞死區(qū)域(圖22E)。IHC顯示CD3⁺T細(xì)胞在纖維囊周圍積聚，結(jié)節(jié)本身內(nèi)的T細(xì)胞很少(圖22G和H)。近紅外熒光識別的其他區(qū)域示出了T細(xì)胞浸潤的局灶性區(qū)域(圖22F、22I和22J)。在具有顯著的有絲分裂象的異常大的波形蛋白陽性細(xì)胞周圍觀察到T細(xì)胞(圖22K和22L)。這些發(fā)現(xiàn)暗示，單個(gè)轉(zhuǎn)移性肉瘤細(xì)胞可被肺內(nèi)的腫瘤特異性T細(xì)胞有效地靶向，并且提供ADXS31-164防止轉(zhuǎn)移性肺疾病的可能機(jī)制。狗能很好地從手術(shù)恢復(fù)，并且保持無肺轉(zhuǎn)移性疾病5個(gè)月，隨后在皮下組織(成骨細(xì)胞腫瘤，II級；和軟骨母細(xì)胞腫瘤，III級)、縱隔(成骨細(xì)胞腫瘤，II級)和隔膜(成骨細(xì)胞腫瘤，III級)中出現(xiàn)廣泛的侵襲性HER2/neu+轉(zhuǎn)移性疾病。結(jié)果顯示，盡管誘導(dǎo)了HER2/neu特異性T細(xì)胞應(yīng)答，但未鑒定到脫腫瘤副作用，因此HER2/neu特異性T細(xì)胞的誘導(dǎo)負(fù)責(zé)消除HER2/neu陽性轉(zhuǎn)移性細(xì)胞，以及長期防止疾病復(fù)發(fā)。這可由以下方面支持：HER2/Neu-特異性T細(xì)胞擴(kuò)增的時(shí)間(在5只狗中出現(xiàn)在診斷后大約8個(gè)月，當(dāng)時(shí)很多狗將出現(xiàn)轉(zhuǎn)移性疾病)，以及疫苗接種和轉(zhuǎn)移灶切除后一只狗的肺實(shí)質(zhì)內(nèi)局灶性T細(xì)胞應(yīng)答的組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)。

圖22和圖23提供的結(jié)果證實(shí)，ADXS31-164的施用延緩了和/或防止了轉(zhuǎn)移性疾病，并且延長了患有自發(fā)性HER2+骨肉瘤的狗的總體存活期。從兩張圖中可以看出，接受疫苗的狗的存活時(shí)間顯著延長，而其他的則未達(dá)到那些接受疫苗的狗的中值存活期。

雖然我們的研究證實(shí)了此方法防止轉(zhuǎn)移性疾病的有效性，但在出于關(guān)懷護(hù)理治療的5只狗中，ADXS31-164疫苗接種不能誘導(dǎo)預(yù)先存在的嚴(yán)重肺轉(zhuǎn)移性疾病的消退。在一只狗中，這似乎與T細(xì)胞不能穿透圍繞轉(zhuǎn)移性病灶的纖維囊或那些細(xì)胞不能在已建立的腫瘤微環(huán)境中存活相關(guān)(圖22C)。然而，在相同的狗中，總體正常的肺實(shí)質(zhì)中觀察到大型、活躍分裂的旨在成為轉(zhuǎn)移性O(shè)SA細(xì)胞的間充質(zhì)細(xì)胞周圍的T細(xì)胞浸潤的局灶性區(qū)域，出乎意料的是，在轉(zhuǎn)移灶切除后，該狗未發(fā)生進(jìn)一步的肺轉(zhuǎn)移性疾病。這些數(shù)據(jù)共同暗示，ADXS31-164通過其誘導(dǎo)強(qiáng)大先天性免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的能力防止了肺轉(zhuǎn)移性疾病，該先天性免疫應(yīng)答可敏化轉(zhuǎn)移性O(shè)SA細(xì)胞發(fā)生FAS/FASL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，該適應(yīng)性免疫應(yīng)答為消除微轉(zhuǎn)移性肺疾病的HER2/neu特異性T細(xì)胞的形式。

結(jié)論：

在提交本申請時(shí)，12/18只狗未發(fā)生肺轉(zhuǎn)移性疾病，證實(shí)了在微小殘留病的背景中施用時(shí)，ADXS31-164防止了患有自發(fā)性HER2+骨肉瘤的受試者的轉(zhuǎn)移性疾病。與歷史HER2/Neu+對照組相比，疫苗接種狗顯示出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性的總體存活期增加。HER2/Neu+對照狗(n＝11)的中值存活期為316天(p＝0.032)，其中未達(dá)到ADSX31-164治療狗的中值存活期。另外，結(jié)果表明，ADXS31-164破壞了對HER2/neu的高度保守IC1域的外周耐受性(圖26)。在ADXS31-164施用24小時(shí)內(nèi)白細(xì)胞增加的幅度(圖18)與存活期相關(guān)，暗示結(jié)局部分取決于狗的免疫系統(tǒng)對疫苗作出應(yīng)答的能力。重要的是，本研究顯示將高達(dá)3×10⁹個(gè)CFU的ADXS31-164施用于患有自發(fā)性O(shè)SA的狗是安全的，并且在施用時(shí)僅引起瞬時(shí)、低級別的副作用。此外，防止肺轉(zhuǎn)移性疾病可能部分地與肺中CD3+T細(xì)胞介導(dǎo)的微觀轉(zhuǎn)移性疾病消除相關(guān)。本研究對于表達(dá)HER2/Neu的小兒OSA和其他人類癌癥具有重要意義。

此外，我們在這里示出，在狗中劑量高達(dá)3.3×10^9個(gè)CFU的ADXS31-164的施用是安全的，盡管誘導(dǎo)了HER2/neu特異性免疫但不會導(dǎo)致短期或長期心臟毒性。包括心臟毒性的在靶、脫腫瘤副作用與大量HER2/neu特異性T細(xì)胞的施用相關(guān)，或當(dāng)曲妥單抗與蒽環(huán)類同時(shí)使用時(shí)出現(xiàn)。我們利用無多柔比星的標(biāo)準(zhǔn)化療方案減小心臟毒性的任何潛在風(fēng)險(xiǎn)。

我們的研究證實(shí)，ADXS31-164可防止患有OSA的狗的肺轉(zhuǎn)移性疾病。這些結(jié)果證實(shí)了患有OSA的狗的安全性和史無前例的存活時(shí)間，并且為研究ADXS31-164防止患有HER2/neu表達(dá)腫瘤(包括小兒骨肉瘤和乳腺癌)的患者的轉(zhuǎn)移性疾病的能力鋪平了道路。

雖然本文已示出和描述了本發(fā)明的某些特征，但現(xiàn)在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將想到許多修改、置換、變化和等同形式。因此，應(yīng)當(dāng)理解，所附權(quán)利要求書旨在涵蓋落在本發(fā)明的真實(shí)精神范圍內(nèi)的所有此類修改和變化。