本發(fā)明涉及小鼠雜交瘤克隆，其產(chǎn)生針對心臟肌球蛋白結(jié)合蛋白C(C-蛋白、MYBPC3、cMyBP-C或My-C)的單克隆抗體(抗-My-C-cC0C2-235-3H8；IgG1，κ)，且其不與來自骨骼肌的My-C的密切相關(guān)異構(gòu)體反應(yīng)。這種mAb適合作為捕獲或檢測抗體用于ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)以定量測定血清、血漿、全血或其他體液中的My-C以用于心臟病早期診斷的開發(fā)。根據(jù)這一診斷程序，可以更早期治療心肌梗死。

背景技術(shù)：

由于存在急性生命危險(xiǎn)，必須迅速診斷心肌梗死并與其它胸部疼痛原因區(qū)分開來。[1]

心肌壞死生物標(biāo)志物的測定現(xiàn)在對于疑似NSTE-ACSs(非-ST抬高急性冠狀動脈綜合征)的梗死診斷是必需的并且是作出相應(yīng)臨床診斷的必要依據(jù)。心臟肌鈣蛋白(cTn)目前是十分重要的生物標(biāo)志物。他們是一般性梗死定義的一部分。[2]但是心臟肌鈣蛋白(cTn)有缺陷，新的生物標(biāo)志物可能是非常有價(jià)值的。[3]

血清中的cTn濃度只有在出現(xiàn)癥狀之后16～18小時(shí)才會達(dá)到最大值，并且之前cTn檢測的缺陷是缺乏分析敏感性，不足以在癥狀開始之后的起初數(shù)小時(shí)之內(nèi)檢測低cTn濃度。[4；5]

新的cTn檢測方法目的是可靠測定低cTn值，但是其對于梗死降低的特異性減少了其價(jià)值，因?yàn)閏Tn濃度在大約99％的健康對象中觀察到。但是即便如此，多達(dá)25％梗死患者的cTn濃度還是低于該閾值。[6]

鑒于cTn檢測的敏感性和特異性有限，在相應(yīng)的指南(NICE)中建議在癥狀(胸部疼痛)開始之后10～12小時(shí)測定cTn，以使得診斷可靠。[1]盡管有一系列生物標(biāo)志物會在梗死之后更快釋放，但因?yàn)樗麄儾皇切呐K特異性表達(dá)的，因此沒有一個(gè)能夠?qū)嵤7]為此，目前的努力均集中于分析cTn濃度隨時(shí)間變化的程度，以便改善cTn檢測的說服力。仍然不清楚絕對濃度差必須有多大，才會讓cTn濃度的分析和生物學(xué)變化差異對于預(yù)期診斷來說毫無意義。

理想的生物標(biāo)志物在梗死后從心肌快速釋放，但與以前類似的標(biāo)志物不同，其是心臟特異性的。心臟肌球蛋白結(jié)合蛋白C(C-蛋白、MYBPC3、cMyBP-C或My-C)是符合這些標(biāo)準(zhǔn)的一種蛋白質(zhì)。其在缺血小鼠心臟冠狀動脈流量蛋白質(zhì)組學(xué)分析中鑒別。[8]其是心肌中具有最高表達(dá)的蛋白質(zhì)之一(2300個(gè)蛋白質(zhì)中是19)并且是cTnI和cTnT濃度的至少兩倍(2300個(gè)蛋白質(zhì)中分別是92和118)。[9]

存在3種不同的My-C異構(gòu)體，通過不同基因編碼。與快骨骼肌的My-C和慢骨骼肌的My-C的區(qū)別在于，心臟特異性異構(gòu)體具有獨(dú)特的N端結(jié)構(gòu)域(圖1)并具有可作為特異性表位的其它心臟特異性區(qū)域。[10]

已證明心肌梗死或損傷之后釋放My-C[8；11；12；13；14]，并且將隨時(shí)間變化的濃度上升曲線與cTn的進(jìn)行了比較。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于，通過生成可產(chǎn)生表位特異性的特異性抗體的骨髓瘤細(xì)胞克隆，在體外生產(chǎn)抗人My-C心臟表位的單克隆抗體。此外，所述單克隆抗體還可以建立一種ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)，以沒有交叉反應(yīng)的方式特異性定量測定血清、血漿或者全血中形成的My-C。

通過產(chǎn)生生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞克隆實(shí)現(xiàn)該目的，所述單克隆抗體識別并結(jié)合My-C中的心臟表位，并且對骨骼肌的肌球蛋白結(jié)合蛋白沒有交叉反應(yīng)性。將骨髓瘤細(xì)胞與一種對重組My-C免疫的試驗(yàn)動物尤其是小鼠的脾細(xì)胞融合，即可獲得所述雜交瘤細(xì)胞系。根據(jù)布達(dá)佩[斯條約的要求，已在2013年12月10日以登記號DSM ACC3223將雜交瘤細(xì)胞系保藏于DSMZ。]該雜交瘤細(xì)胞克隆產(chǎn)生的抗體組合一或多種其他mAb適用于ELISA中以用于靈敏測定血清中My-C的濃度并且因此適合于早期診斷心肌梗死。

本發(fā)明的另一目的是雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的表位特異性抗體及其應(yīng)用。

為了生成生產(chǎn)抗人心臟特異性My-C的單克隆抗體的雜交瘤克隆，以已知方式間隔六至八周使用My-C的重組結(jié)構(gòu)域cC0C2(圖2)對Balb/c小鼠進(jìn)行免疫。在取出脾臟之前給予小鼠加強(qiáng)劑量。以已知方式將分離的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞系P3X63Ag8.653(ATCC CPL 1580)的細(xì)胞融合，并且在合適的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。[15]

選擇僅產(chǎn)生抗人My-C的抗體的雜交瘤，多次克隆和增殖。將My-C的C0C2肽吸附到微量滴定板的表面上，利用ELISA初步選擇這些特異性雜交瘤。

通過肽掃描(Pepscan)確定根據(jù)這些標(biāo)準(zhǔn)從克隆中選擇的本發(fā)明所述克隆的單克隆抗體的表位特異性(16，17，18)。為此合成了長度為15個(gè)氨基酸殘基的肽(與用于免疫的My-c的cC0C2結(jié)構(gòu)域序列一致)作為膜上的各個(gè)斑點(diǎn)。相鄰斑點(diǎn)的15肽的序列相互重疊，使得My-C的cC0C2結(jié)構(gòu)域的整個(gè)氨基酸序列在總計(jì)111個(gè)斑點(diǎn)中重疊合成。在具有本發(fā)明所述單克隆抗體的定位膜上保溫這些肽。在膜上利用ECL^TM系統(tǒng)(增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法)檢測已結(jié)合的抗體。

可以借助該方法確定按照本發(fā)明所述生產(chǎn)的單克隆抗體識別哪些15肽。所檢測的單個(gè)斑點(diǎn)中肽的已知序列(參考圖3)表明雜交瘤克隆的單克隆抗體識別的人My-C的表位的氨基酸序列。(圖4)

按本發(fā)明所述生成的雜交瘤克隆所產(chǎn)生的單克隆抗體3H8結(jié)合人My-C中具有以下序列的表位

-A149-P-D-D-P-I-G-L-F-V-M-

在ELISA的使用證明按照本發(fā)明所述制備的單克隆抗體不僅可檢測Pepspot膜上的肽，而且也可檢測含有該表位的人My-C的cC0C2結(jié)構(gòu)域的整個(gè)分子。圖5示出使用單克隆抗體3H8的ELISA示例。

可以修飾或者標(biāo)記以上列舉的表位特征化單克隆抗體(IgG₁，kappa)的天然形式或者片段。該抗體或者其修飾形式可用于解釋人My-C的處理、其釋放動力學(xué)及其血清清除，可在免疫組織學(xué)領(lǐng)域用于定性檢測和定量測定(例如ELISA和Western Blot)或者作為診斷劑。

通過以下示例性實(shí)施方案更詳細(xì)說明本發(fā)明。

實(shí)施例

實(shí)施例1：

制備雜交瘤細(xì)胞系

在無菌條件下取出以已知方式用My-C的cC0C2免疫的小鼠的脾臟，使用RPMI 1640培養(yǎng)基(Life Technologies^TM，Karlsruhe)利用注射器從脾包膜中沖洗出并稀釋脾細(xì)胞。沉淀脾細(xì)胞(10分鐘，300xg)，使用RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌三次，重懸于RPMI 1640培養(yǎng)基中。然后，將其與骨髓瘤細(xì)胞系P3X63Ag8.653(ATTC CPL 1580)融合。為此，同樣沉淀經(jīng)過培養(yǎng)后處在生長對數(shù)期的骨髓瘤細(xì)胞并洗滌三次。將1x 10⁸脾細(xì)胞和5x 10⁷骨髓瘤細(xì)胞吸移到離心管中，充分混合并離心，離心管在37℃連續(xù)旋轉(zhuǎn)，在一分鐘之內(nèi)將1.Sml預(yù)熱的50％聚乙二醇1500(Roche，Basel)逐滴加入到細(xì)胞沉淀物中。然后將融合反應(yīng)在37℃再保溫一分鐘。在隨后的三分鐘內(nèi)逐滴加入預(yù)熱的培養(yǎng)基(RPMI 1640)-在第一分鐘內(nèi)加入1ml，在第二分鐘內(nèi)加入3ml，然后加入18ml。接著，立即以200xg離心10分鐘。將細(xì)胞沉淀收入在含有10％FCS和HAT的RPMI 1640培養(yǎng)基中。將一部分細(xì)胞沉淀接種在96孔培養(yǎng)板中，在-196℃液氮中冷凍其余部分。培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞，在融合之前將其培養(yǎng)1天(每孔1x 10⁴巨噬細(xì)胞，HAT培養(yǎng)基)。在CO₂-培養(yǎng)箱中37℃保溫細(xì)胞。每3～5天，將培養(yǎng)基替換成新鮮的RPMI 1640-HAT培養(yǎng)基，根據(jù)融合細(xì)胞的生長情況，大約2周后利用ELISA檢測培養(yǎng)上清液對抗原(My-C)的反應(yīng)性。

實(shí)施例2：

選擇產(chǎn)生抗體的克隆

利用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)檢測所有生長克隆或者其抗體的反應(yīng)性。使用的免疫吸附劑是免疫原，My-C的重組cC0C2結(jié)構(gòu)域(大約2μg/ml)。ELISA方案：

1.在4℃用每孔50μl免疫原溶液包被微量滴定板(Costar，高結(jié)合力)過夜；

2.洗滌微量滴定板(MTP)，用TBS(TRIS-緩沖鹽水)pH 7.4洗3次；

3.封閉MTP，每孔200μl封閉劑(Boehringer，Mannheim)，37℃、1小時(shí)；

4.洗滌MTP，用NaCl-Tween 20洗3次；

5.使用雜交瘤培養(yǎng)上清液保溫；每孔50μl，用TBS-Tween 20大約1∶2稀釋；

6.洗滌MTP，用NaCl-Tween 20洗3次；

7.使用偶聯(lián)過氧環(huán)物酶的抗小鼠Ig抗體保溫，每孔50μl，室溫1小時(shí)；

8.洗滌MTP，用NaCl-Tween 20洗3次；

9.用ABTS溶液(100mg ABTS每100ml底物緩沖液[檸檬酸鹽，過硼酸鈉，pH 4.4])保溫，每孔50μl；

10.室溫保溫60分鐘后，用微孔板讀數(shù)器(SLT)在405nm測量。

實(shí)施例3：

人心臟特異性My-C中單克隆抗體3H8的表位作圖

利用肽掃描方法鑒定單克隆抗體3H8的結(jié)合位點(diǎn)。為此，將用于免疫的My-C的人cC0C2結(jié)構(gòu)域的全部氨基酸序列分為總計(jì)111個(gè)相互重疊的氨基酸序列，長度15個(gè)氨基酸。直接在纖維素膜上合成這些序列作為斑點(diǎn)中的各個(gè)肽。用含有抗體的雜交瘤培養(yǎng)上清液保溫膜，并且通過用過氧化物酶偶聯(lián)的抗小鼠Ig抗體保溫使得抗體結(jié)合位點(diǎn)可見。為此，在用TBS-Tween洗滌三次后，將膜放在復(fù)制膠片之間，然后與ECL^TM(增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法)檢測試劑(Amersham，Braunschweig)保溫3分鐘。接著將放置的膠片(Hyperfilm-ECL^TM[RPN 2103H Amersham，Braunschweig])曝光30秒-3分鐘。

將膠片上曝光的斑點(diǎn)37和38(圖4)對應(yīng)于位于斑點(diǎn)中的免疫原(My-C的cC0C2結(jié)構(gòu)域)的15肽亞序列，鑒定抗體檢測的序列。

斑點(diǎn)37 145 PTPGAPDDPIGLFVM 15 3H8

斑點(diǎn)38 149 APDDPIGLFVMRPQD 15 3H8

識別的兩個(gè)亞序列的中心序列是氨基酸序列-A149-P-D-D-P-I-G-L-F-V-M-。該序列是所檢測的人My-C中抗體3H8結(jié)合的表位。

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