本申請(qǐng)要求2014年3月4日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)朥S 61/947,755的權(quán)益，將其通過(guò)引用特此結(jié)合。

以電子方式提交的材料通過(guò)引用結(jié)合

通過(guò)引用以其整體結(jié)合在此的是一種計(jì)算機(jī)可讀的核苷酸/氨基酸序列表，該序列表在此同時(shí)提交，并確定如下：一份8,585字節(jié)的ASCII(文本)文件命名為“MR629-100WO1序列表.TXT”，創(chuàng)建于2015年3月4日。

發(fā)明背景

大多數(shù)人白血病和淋巴瘤，包括急性淋巴母細(xì)胞性白血病(ALL)、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)以及非霍奇金淋巴瘤(NHL)，起源于B細(xì)胞。基于通過(guò)使用單克隆抗體(mAbs)靶向B細(xì)胞限制性表面抗原的B細(xì)胞消耗的治療方法已經(jīng)獲得了越來(lái)越多的關(guān)注。人分化簇(CD)抗原19是一種B細(xì)胞特異的表面抗原和用于治療B細(xì)胞起源的惡性腫瘤的治療性單克隆抗體(mAb)方法的一個(gè)有吸引力的靶標(biāo)。具有增強(qiáng)抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)的親和優(yōu)化的并且非巖藻糖基化的CD19單克隆抗體已被證明在B細(xì)胞惡性腫瘤的臨床前模型中具有強(qiáng)的抗腫瘤活性。

人們?cè)絹?lái)越認(rèn)識(shí)到B細(xì)胞惡性腫瘤由各種各樣的致病機(jī)理引起，并且在分子水平表征這些惡性腫瘤的方法對(duì)患者分層是有用的，從而迅速地指導(dǎo)他們有效的療法。迫切需要改進(jìn)的方法以預(yù)測(cè)具有B細(xì)胞惡性腫瘤的受試者的響應(yīng)性。

發(fā)明概述

如下所述，本發(fā)明的特征是以下組合物和方法，這些的組合物和方法的特征是使用miR-629來(lái)鑒定響應(yīng)B細(xì)胞消耗療法(例如，使用抗-CD19抗體的治療)的受試者。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明的特征是使用miR-629以鑒定具有B細(xì)胞惡性腫瘤的受試者。

一方面，本發(fā)明總體上提供了為具有B細(xì)胞惡性腫瘤的受試者(例如人)選擇療法的方法，該方法涉及在受試者的血液樣品中檢測(cè)相對(duì)于參考水平降低的miR-629表達(dá)，其中對(duì)所述降低的檢測(cè)選擇受試者用于抗-CD19抗體療法。

另一方面，本發(fā)明提供了鑒定具有響應(yīng)抗-CD19抗體治療的B細(xì)胞惡性腫瘤的受試者的方法，該方法涉及在受試者的血液樣品中檢測(cè)相對(duì)于參考水平降低的miR-629表達(dá)，其中對(duì)所述降低的檢測(cè)將該受試者鑒定為響應(yīng)抗-CD19抗體治療。

另一方面，本發(fā)明提供了為具有B細(xì)胞惡性腫瘤的受試者選擇療法的方法，該方法涉及通過(guò)定量PCR或miRNA微陣列分析在受試者的血液樣品中檢測(cè)相對(duì)于參考水平降低的miR-629表達(dá)，其中對(duì)所述降低的檢測(cè)選擇受試者用于抗-CD19抗體療法。

再另一方面，本發(fā)明提供了鑒定具有響應(yīng)抗-CD19抗體治療的B細(xì)胞惡性腫瘤的受試者的方法，該方法涉及通過(guò)定量PCR或miRNA微陣列分析在受試者的血液樣品中檢測(cè)相對(duì)于參考水平降低的miR-629表達(dá)，其中對(duì)所述降低的檢測(cè)將該受試者鑒定為響應(yīng)抗-CD19抗體治療。

又另一方面，本發(fā)明提供了治療被選擇為具有響應(yīng)抗-CD19抗體治療的B細(xì)胞惡性腫瘤的受試者的方法，該方法涉及給予選擇的受試者有效量的抗-CD19抗體，其中該受試者是通過(guò)在該受試者的血液樣品中檢測(cè)相對(duì)于參考水平降低的miR-629表達(dá)來(lái)選擇的。

另一方面，本發(fā)明提供了對(duì)具有B細(xì)胞惡性腫瘤的受試者給藥的方法，其中該受試者是被鑒定為具有響應(yīng)抗-CD19抗體治療的B細(xì)胞惡性腫瘤，該鑒定是通過(guò)在該受試者的血液樣品中檢測(cè)相對(duì)于參考水平降低的miR-629表達(dá)。

再另一方面，本發(fā)明提供在具有B細(xì)胞惡性腫瘤的受試者體內(nèi)消耗B細(xì)胞的方法，該方法涉及在受試者的血液樣品中檢測(cè)相對(duì)于參考水平的降低的miR-629表達(dá)，其中對(duì)所述降低的檢測(cè)鑒定響應(yīng)抗-CD19抗體療法的受試者；并且給予受試者抗-CD19抗體，從而在受試者內(nèi)消耗B細(xì)胞。

又另一方面，本發(fā)明提供一種試劑盒，該試劑盒包含特異性地結(jié)合miR-629的引物或探針。在一個(gè)實(shí)施例中，該試劑盒進(jìn)一步包含使用該試劑盒來(lái)選擇或鑒定響應(yīng)抗-CD19抗體療法的受試者的說(shuō)明書(shū)。

另一方面，本發(fā)明提供一種試劑盒，該試劑盒包含抗-CD19抗體以及特異性地結(jié)合miR-629的引物或探針。在一個(gè)實(shí)施例中，該試劑盒進(jìn)一步包含使用該試劑盒來(lái)選擇或鑒定響應(yīng)抗-CD19抗體療法的受試者的說(shuō)明書(shū)。

再另一方面，本發(fā)明提供誘導(dǎo)或增加抗-CD19抗體在鑒定為具有B細(xì)胞惡性腫瘤的受試者內(nèi)的響應(yīng)性的方法，該方法涉及給予受試者有效量的靶向miR-629的抑制性核酸分子。

再另一方面，本發(fā)明提供在受試者內(nèi)消耗B細(xì)胞的一種方法，該方法涉及給予受試者一個(gè)有效數(shù)量的聯(lián)合抗-CD19抗體靶向miR-629的抑制性核酸分子，從而在受試者內(nèi)消耗B細(xì)胞。

再另一方面，本發(fā)明提供一種組合物，該組合物包含與抗-CD19抗體聯(lián)合靶向miR-629的抑制性核酸分子。

再另一方面，本發(fā)明提供了鑒定具有B細(xì)胞惡性腫瘤的受試者的方法，該方法包括在受試者的血液樣品中檢測(cè)相對(duì)于參考水平增加的miR-629表達(dá)，其中對(duì)所述增加的檢測(cè)鑒定該受試者為具有B細(xì)胞惡性腫瘤。

再另一方面，本發(fā)明提供鑒定具有B細(xì)胞惡性腫瘤的受試者的方法，該方法包括在受試者的血液樣品中通過(guò)定量PCR或miRNA微陣列分析檢測(cè)相對(duì)于參考水平增加的miR-629表達(dá)，其中對(duì)所述增加的檢測(cè)鑒定該受試者為具有B細(xì)胞惡性腫瘤。在一個(gè)實(shí)施例中，參考水平是健康的對(duì)照受試者的血液樣品中出現(xiàn)的miR-629表達(dá)水平。

再另一方面，本發(fā)明提供了為具有B細(xì)胞惡性腫瘤的受試者選擇療法的體外方法，該方法包括在受試者的血液樣品中檢測(cè)相對(duì)于參考水平降低的miR-629表達(dá)，其中對(duì)所述降低的檢測(cè)選擇受試者用于抗-CD19抗體療法。

再另一方面，本發(fā)明提供了鑒定具有響應(yīng)抗-CD19抗體治療的B細(xì)胞惡性腫瘤的受試者的體外方法，該方法包括在受試者的血液樣品中檢測(cè)相對(duì)于參考水平降低的miR-629表達(dá)，其中對(duì)所述降低的檢測(cè)將該受試者鑒定為響應(yīng)抗-CD19抗體治療。

再另一方面，本發(fā)明提供了為具有B細(xì)胞惡性腫瘤的受試者選擇療法的體外方法，該方法包括通過(guò)定量PCR或miRNA微陣列分析在受試者的血液樣品中檢測(cè)相對(duì)于參考水平降低的miR-629表達(dá)，其中對(duì)所述降低的檢測(cè)選擇受試者用于抗-CD19抗體療法。

再另一方面，本發(fā)明提供了鑒定具有響應(yīng)抗-CD19抗體治療的B細(xì)胞惡性腫瘤的受試者的體外方法，該方法包括通過(guò)定量PCR或miRNA微陣列分析在受試者的血液樣品中檢測(cè)相對(duì)于參考水平降低的miR-629表達(dá)，其中對(duì)所述降低的檢測(cè)將該受試者鑒定為響應(yīng)抗-CD19抗體治療。

另一方面，本發(fā)明提供了抗-CD19抗體在藥劑制造中的用途，該藥劑用于治療在體外方法中被選擇為具有響應(yīng)抗-CD19抗體治療的B細(xì)胞惡性腫瘤的受試者，其中通過(guò)在該受試者的血液樣品中檢測(cè)相對(duì)于參考水平降低的miR-629表達(dá)來(lái)選擇該受試者。在一個(gè)實(shí)施例中，該抗-CD19抗體是人的、人源化的或嵌合的抗體。在另一個(gè)實(shí)施例中，該抗-CD19抗體是低巖藻糖基化的或非巖藻糖基化的抗體。在再另一個(gè)實(shí)施例中，該抗-CD19抗體包含重鏈CDR1，其包含SEQ IDNO:2的氨基酸序列，重鏈CDR2，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，重鏈CDR3，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，輕鏈CDR1，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，輕鏈CDR2，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，以及輕鏈CDR3，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在再另一個(gè)實(shí)施例中，該抗-CD19抗體包含VH結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在再另一個(gè)實(shí)施例中，該抗-CD19抗體包含VL結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在再另一個(gè)實(shí)施例中，該抗-CD19抗體包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VH結(jié)構(gòu)域以及含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VL結(jié)構(gòu)域。

另一方面，本發(fā)明提供了抗-CD19抗體在藥劑制造中的用途，該藥劑用于在具有B細(xì)胞惡性腫瘤的受試者內(nèi)消耗B細(xì)胞，其中該受試者被選擇在一種體外方法中治療，該方法涉及在該受試者的血液樣品中檢測(cè)相對(duì)于參考水平降低的miR-629表達(dá)，其中對(duì)所述降低的檢測(cè)鑒定響應(yīng)抗-CD19抗體療法的受試者。在一個(gè)實(shí)施例中，該抗-CD19抗體是人的、人源化的或嵌合的抗體。在另一個(gè)實(shí)施例中，該抗-CD19抗體是低巖藻糖基化的或非巖藻糖基化的抗體。在再另一個(gè)實(shí)施例中，該抗-CD19抗體包含重鏈CDR1，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，重鏈CDR2，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，重鏈CDR3，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，輕鏈CDR1，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，輕鏈CDR2，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，以及輕鏈CDR3，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在再另一個(gè)實(shí)施例中，該抗-CD19抗體包含VH結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在再另一個(gè)實(shí)施例中，該抗-CD19抗體包含VL結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在再另一個(gè)實(shí)施例中，該抗-CD19抗體包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VH結(jié)構(gòu)域以及含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VL結(jié)構(gòu)域。

另一方面，本發(fā)明提供靶向miR-629的抑制性核酸分子在藥劑制造中的用途，該藥劑用于治療被鑒定為具有B細(xì)胞惡性腫瘤的受試者。

另一方面，本發(fā)明提供靶向miR-629的抑制性核酸分子在藥劑制造中的用途，該藥劑用于消耗受試者內(nèi)的B細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，該抑制性核酸分子是反義核酸分子、siRNA、或shRNA。

另一方面，本發(fā)明提供靶向miR-629的抑制性核酸分子與抗-CD19抗體聯(lián)合在藥劑制造中的用途，該藥劑用于治療被鑒定為具有B細(xì)胞惡性腫瘤的受試者。

另一方面，本發(fā)明提供了鑒定具有B細(xì)胞惡性腫瘤的受試者的體外方法，該方法涉及在受試者的血液樣品中檢測(cè)相對(duì)于參考水平增加的miR-629表達(dá)，其中對(duì)所述增加的檢測(cè)鑒定該受試者為具有B細(xì)胞惡性腫瘤。

另一方面，本發(fā)明提供鑒定具有B細(xì)胞惡性腫瘤的受試者的體外方法，該方法包括在受試者的血液樣品中通過(guò)定量PCR或miRNA微陣列分析檢測(cè)相對(duì)于參考水平增加的miR-629表達(dá)，其中對(duì)所述增加的檢測(cè)鑒定該受試者為具有B細(xì)胞惡性腫瘤。

在以上任何方面或本發(fā)明在此描述的任何其它方面的各種各樣的實(shí)施例中，參考水平是通過(guò)將miR-629表達(dá)的水平與樣品中出現(xiàn)的其它微小RNA進(jìn)行比較獲得的；測(cè)定從具有對(duì)抗-CD19抗體治療不響應(yīng)的B細(xì)胞惡性腫瘤的受試者獲得的樣品中miR-629表達(dá)的范圍；或通過(guò)測(cè)量對(duì)于抗-CD19抗體治療具有降低的敏感性、對(duì)抗化療的抗增生效果具有抗性、或?qū)熣T導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有抗性的受試者或細(xì)胞系中miR-629表達(dá)的水平或范圍。在以上方面的其它實(shí)施例中，參考水平是通過(guò)使用Δ-ΔCt法測(cè)量miR-629表達(dá)的倍數(shù)變化。在以上方面的其它實(shí)施例中，參考水平是通過(guò)在受試者群體中測(cè)量miR-629表達(dá)的范圍或水平。在以上任何方面的各種各樣的實(shí)施例中，受試者具有B細(xì)胞起源的淋巴瘤或白血病(例如，非霍奇金淋巴瘤、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、或慢性淋巴細(xì)胞性白血病)。在以上方面的其它實(shí)施例中，相對(duì)于具有非響應(yīng)性的濾泡性淋巴瘤的受試者，miR-629表達(dá)在從具有響應(yīng)性的濾泡性淋巴瘤的受試者獲得的血液樣品中要低三至五倍。在以上方面的其它實(shí)施例中，相對(duì)于具有非響應(yīng)性的彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的受試者，miR-629表達(dá)在從具有響應(yīng)性的彌漫的大B細(xì)胞淋巴瘤的受試者獲得的血液樣品中要低五至七倍。在以上方面的其它實(shí)施例中，血液樣品是全血、外周血單核細(xì)胞(PBMC)樣品、血清、或血漿。在以上方面的其它實(shí)施例中，該抗-CD19抗體是人的、人源化的或嵌合的抗體。在以上方面的其它實(shí)施例中，該抗-CD19抗體是低巖藻糖基化的或非巖藻糖基化的。在以上方面的再其它實(shí)施例中，該抗-CD19抗體包含重鏈CDR1，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，重鏈CDR2，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，重鏈CDR3，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，輕鏈CDR1，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，輕鏈CDR2，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，以及一個(gè)輕鏈CDR3，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在以上方面的其它實(shí)施例中，該抗-CD19抗體包含VH結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在以上方面的其它實(shí)施例中，該抗-CD19抗體包含VL結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在以上方面的其它實(shí)施例中，該抗-CD19抗體包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VH結(jié)構(gòu)域以及含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VL結(jié)構(gòu)域。在以上方面的其它實(shí)施例中，該抗-CD19抗體是MEDI-551。在以上方面的其它實(shí)施例中，該抑制性核酸分子是反義核酸分子、siRNA、或shRNA。在以上方面的其它實(shí)施例中，該抑制性核酸分子是先于或同時(shí)與抗-CD19抗體給予的。

本發(fā)明的其它特征及優(yōu)點(diǎn)將在詳細(xì)說(shuō)明以及在權(quán)利要求書(shū)中呈現(xiàn)。

定義

除非另外說(shuō)明，本文所用的所有科技術(shù)語(yǔ)的意義都與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常所理解的意義一致。下面的參考文獻(xiàn)為技術(shù)人員提供了本發(fā)明所用的多個(gè)術(shù)語(yǔ)的通用定義：辛格爾頓(Singleton)等人，《微生物學(xué)和分子生物學(xué)詞典》(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology)(第2版，1994年)；《劍橋科學(xué)與技術(shù)的詞典》(The Cambridge Dictionary of Science and Technology)(沃克(Walker)編輯，1988年)；《遺傳學(xué)詞匯》(The Glossary of Genetics)，第5版，麗格(R.Rieger)等人(編輯)，施普林格出版社(1991)；以及哈勒(Hale)與邁爾哈姆(Marham)，《哈珀柯林斯生物學(xué)詞典》(The Harper Collins Dictionary of Biology)(1991)。除非另行指明，如在此使用的以下術(shù)語(yǔ)具有以下賦予它們的含意。

術(shù)語(yǔ)“B細(xì)胞惡性腫瘤”包括起源于B細(xì)胞譜系的細(xì)胞的任何惡性腫瘤。

“CD19”意指結(jié)合到其抗-CD19抗體或片段上的、約90kDa的抗原。CD19被發(fā)現(xiàn)在從干細(xì)胞階段通過(guò)終末分化成漿細(xì)胞的B-譜系細(xì)胞上。在優(yōu)選實(shí)施例中，被在此披露的抗體(例如MEDI-551)靶向的CD19抗原是人CD19抗原。在GenBank提供了一個(gè)示例性CD19抗原序列(GenBank登記號(hào)AAA69966)，并且顯示在下面SEQ ID NO.9中：

“抗-CD19抗體”意指特異地結(jié)合到CD19抗原上的抗體或其片段。在一個(gè)實(shí)施例中，抗CD19抗體包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VH結(jié)構(gòu)域以及含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VL結(jié)構(gòu)域。

“miR-629”指具有或包含下列序列(SEQ ID NO 10)的微小RNA(加工前)：

1 tccctttccc aggggagggg ctgggtttac gttgggagaa cttttacggt gaaccaggag 61 gttctcccaa cgtaagccca gcccctcccc tctgcct.(NCBI登記號(hào)NR_030714)。

在另一個(gè)實(shí)施例中，成熟的miR-629微小RNA具有或包含下列序列SEQ ID NO.11：

61-guucucccaacguaagcccagc-82(miRBase登記號(hào)MIMAT0003298)。

miR-629的功能和/或表達(dá)可被抑制，例如，被miRIDIAN微小RNA hsa-miR-629-3p發(fā)夾抑制劑抑制，該抑制劑從ThermoScientific公司購(gòu)買獲得。

“ΔCt法”意指測(cè)定每個(gè)淋巴瘤/白血病患者樣品的ΔCt，其被計(jì)算為miR-629的臨界循環(huán)(Ct)值減去四個(gè)管家基因(RNU48、RNU24、U6、和U47)的平均Ct值。所有正常個(gè)體的平均ΔCt值(如對(duì)于癌癥患者樣品所描述的計(jì)算)然后被從每個(gè)患者樣品的個(gè)體ΔCt值減去以產(chǎn)生對(duì)于每個(gè)淋巴瘤/白血病患者樣品的Δ-ΔCt值。這涉及下列方程式的倍數(shù)變化：倍數(shù)變化＝2^-(Δ-ΔCt)。

在此披露中，術(shù)語(yǔ)“包括(comprises、comprising)”、“包含(containing)”、“具有(having)”等具有美國(guó)專利法賦予它們的意義并且意味著“包括(includes、including)”等；“基本上由…組成(consisting essentially of或consists essentially)”同樣具有美國(guó)專利法賦予的意義并且該術(shù)語(yǔ)是開(kāi)放性的，允許超出所敘述的存在，只要所敘述的基本或新特征不被超過(guò)敘述的存在改變，但是排除現(xiàn)有技術(shù)實(shí)施例。

B細(xì)胞“消耗”意指循環(huán)的B細(xì)胞和/或特定組織中的B細(xì)胞相對(duì)于基線水平減少。在具體實(shí)施例中，該消耗是指相對(duì)于治療前(例如抗-CD19抗體治療)在受試者內(nèi)出現(xiàn)的水平減少至少大約25％、40％、50％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多(例如，96％、97％、98％、或99％)。在一個(gè)具體實(shí)施例中，循環(huán)和/或特定一個(gè)或多個(gè)組織中的幾乎所有可檢測(cè)到的B細(xì)胞被消耗。

“檢測(cè)”是指鑒定待檢測(cè)的分析物的存在、不存在或數(shù)量。在一個(gè)實(shí)施例中，該分析物是miR-629。

“miR-629抑制性核酸分子”意指雙鏈RNA、siRNA、shRNA、或反義RNA、或其一部分、或其類似物當(dāng)給予哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)導(dǎo)致miR-629表達(dá)降低。典型地，核苷酸抑制劑包括靶核酸分子的至少一部分、或其類似物，或包括靶核酸分子互補(bǔ)鏈的至少一部分。在一個(gè)實(shí)施例中，miR-629抑制性核酸分子抑制細(xì)胞中miR-629表達(dá)的至少大約10％、25％、50％、75％、或甚至90％-100％。

“參考”意指用于比較的標(biāo)準(zhǔn)。在一個(gè)實(shí)施例中，參考水平是在全血樣品中的miR-629表達(dá)水平，該全血樣品是從健康的對(duì)照受試者獲得或從具有對(duì)抗-CD19抗體治療不響應(yīng)的B細(xì)胞惡性腫瘤的受試者獲得。

“miR-629siRNA”意指能在靶細(xì)胞中減少miR-629表達(dá)的雙鏈RNA。最佳地，siRNA的長(zhǎng)度是18、19、20、21、22、23或24個(gè)核苷酸并且在它的3’端具有2堿基突出。這些dsRNA可以被引入單獨(dú)細(xì)胞或引入完整的動(dòng)物；例如，它們可以經(jīng)由血流系統(tǒng)地引入以減少miR-629核酸分子的表達(dá)。

“特異地結(jié)合”意指抗體、引物或探針，其識(shí)別并且結(jié)合本發(fā)明的多肽或核酸分子，但是基本上不識(shí)別和結(jié)合在樣品(例如，生物樣品，其天然地包括本發(fā)明的多肽或聚核苷酸)中的其它分子。在一個(gè)實(shí)施例中，抗-CD19抗體是特異性地結(jié)合CD19多肽。典范的抗-CD19抗體在本領(lǐng)域中是熟知的并且在此以下進(jìn)行描述。

“受試者”意指哺乳動(dòng)物，但不限于人或非人類哺乳動(dòng)物，例如牛、馬、犬、羊、貓、或鼠。

在此提供的范圍被理解成對(duì)范圍內(nèi)的所有值的簡(jiǎn)寫(xiě)。例如，一個(gè)1到50的范圍應(yīng)當(dāng)理解為包括來(lái)自下組的任何數(shù)字、數(shù)字組合或子范圍，該組由以下各項(xiàng)組成：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。

如在此所使用的術(shù)語(yǔ)“治療(treat、treating、treatment等)”指的是減少或改善失調(diào)和/或與其相關(guān)聯(lián)的癥狀。在一個(gè)實(shí)施例中，B細(xì)胞惡性腫瘤治療導(dǎo)致B細(xì)胞消耗，導(dǎo)致減少或穩(wěn)定受試者內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)或增生，導(dǎo)致增加惡性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞死亡，或增加患者的存活。將被理解的是，盡管不能排除，治療失調(diào)或病癥并不要求完全地消除該失調(diào)、病癥或與其相關(guān)聯(lián)的癥狀。

除非明確聲明或從上下文顯而易見(jiàn)，如在此所使用的，術(shù)語(yǔ)“或”被理解為包括在內(nèi)。除非明確聲明或從上下文顯而易見(jiàn)，如在此所使用的，術(shù)語(yǔ)“一種”、“一個(gè)”和“該(the)”被理解為單數(shù)的或復(fù)數(shù)的。

除非確切規(guī)定或從上下文顯而易見(jiàn)，否則如在此所使用的術(shù)語(yǔ)“大約(about)”被理解為在本領(lǐng)域的正常公差范圍內(nèi)，例如，在平均數(shù)的2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差之內(nèi)。大約可以被理解為在聲明值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、或0.01％之內(nèi)。除非從上下文顯而易見(jiàn)，在此提供的所有數(shù)值被該術(shù)語(yǔ)大約修飾。

附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1A是圖表，該圖表顯示了相對(duì)于對(duì)于抗-CD19抗體具有低敏感性的細(xì)胞系，對(duì)于抗-CD19抗體治療具有高敏感性的彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)細(xì)胞系中miR-629表達(dá)降低。

圖1B是圖表，該圖表顯示對(duì)于抗-CD19抗體治療表現(xiàn)高和低敏感性的細(xì)胞系內(nèi)的表達(dá)強(qiáng)度miR簽名。圖1B顯示在對(duì)于抗-CD19抗體治療具有高敏感性的DLBCL細(xì)胞系中miR-629明顯更低。

圖2是散點(diǎn)圖，該圖顯示，相對(duì)于具有進(jìn)行性疾病(PD)的非響應(yīng)者，在對(duì)于抗-CD19抗體治療表現(xiàn)完全或部分響應(yīng)(CR/PR)的彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者中miR-629表達(dá)更低。

圖3是散點(diǎn)圖，該圖顯示在從響應(yīng)抗-CD19抗體治療(CR/PR)的濾泡性淋巴瘤患者獲得的全血樣品中miR-629表達(dá)比濾泡性淋巴瘤的非響應(yīng)者(PD)更低。

圖4是散點(diǎn)圖，該圖顯示在從響應(yīng)抗-CD19抗體治療(CR/PR)的慢性淋巴細(xì)胞性白血病患者獲得的全血樣品中miR-629表達(dá)比非響應(yīng)者更低。

圖5A和5B是散點(diǎn)圖，該圖顯示從慢性淋巴細(xì)胞性白血病患者在接受治療前獲得的全血樣品中測(cè)量的miR-629表達(dá)。對(duì)患者對(duì)利妥昔單抗-ICE治療(圖5B)與抗-CD19抗體-ICE治療(圖5A)的響應(yīng)進(jìn)行了表征。

圖5C和5D是散點(diǎn)圖，該圖分別顯示了對(duì)于抗-CD19抗體(MEDI-551)或利妥昔單抗治療呈現(xiàn)高和低敏感性的細(xì)胞系中的表達(dá)強(qiáng)度miR簽名。

圖5E是散點(diǎn)圖，該圖顯示對(duì)于抗-CD19抗體(MEDI-551)和化療響應(yīng)的DLBCL患者中基線miR-629表達(dá)更低。這個(gè)效果在利妥昔單抗中沒(méi)有觀察到。這個(gè)數(shù)據(jù)是在所有劑量(2mg/kg與4mg/kg MEDI-551和375mg/m²利妥昔單抗)處從治療的患者中獲得的。

圖5F是散點(diǎn)圖，該圖顯示對(duì)于抗-CD19抗體(MEDI-551)和化療響應(yīng)的DLBCL患者中基線miR-629表達(dá)更低?；熓峭ㄟ^(guò)如下所述給予的ICE或DHAP：ICE將通過(guò)如下所述的IV輸注給予：在21天的周期中，連續(xù)24小時(shí)的異環(huán)磷酰胺5g/m²，在第2天使用美司鈉；在第2天卡鉑AUC＝5mg/mL×min(最大值800mg)；在第1、2、和3天，依托泊苷100mg/m²)。DHAP將通過(guò)如下所述的IV輸注給予：在21天的周期中，在第1、2、3、和4天，地塞米松40mg；在定量給藥周期的第1天連續(xù)24小時(shí)的順鉑100mg/m²；在第2天在3小時(shí)內(nèi)輸注阿糖胞苷2g/m²，12小時(shí)后重復(fù)(2次給藥)。這個(gè)數(shù)據(jù)是從接受2mg/kg的抗-CD19抗體(MEDI-551)治療的患者中獲得。

圖6A-6C是散點(diǎn)圖。圖6A和6B顯示miR-629表達(dá)水平在對(duì)于抗-CD19抗體(CR/PR)響應(yīng)的DLBCL患者中在治療前和治療后相似(圖6A和6B)。圖6C顯示在具有進(jìn)行性疾病(PD)的DLBCL患者中治療后miR-629表達(dá)水平增加。

圖7A和7B是散點(diǎn)圖，該圖顯示相比健康的志愿者，具有淋巴瘤(彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤與濾泡性淋巴瘤)的患者中miR-629更高。圖7A顯示使用miRNA微陣列分析獲得的結(jié)果。圖7B顯示使用TaqMan定量PCR獲得的結(jié)果。

圖8是散點(diǎn)圖，該圖顯示在特定細(xì)胞類型中的miR-629表達(dá)。

圖9A-9C涉及miR-629過(guò)量表達(dá)。圖9A顯示miR-629/GFP表達(dá)載體。圖9B是顯微圖，該圖顯示在表達(dá)miR-629/GFP表達(dá)載體的細(xì)胞中的GFP表達(dá)。圖9C是圖表，該圖表顯示在DLBCL細(xì)胞系Karpas-422中miR-629的表達(dá)。慢病毒miR-629表達(dá)載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)后，使用GFP表達(dá)將Karpas-422細(xì)胞分為兩組，低miR-629組和高miR-629組。兩組中mir-629表達(dá)增加，但在具有增加的GFP表達(dá)的組中更高。

圖10A和10B是圖表，這些圖表顯示相對(duì)于未經(jīng)治療的對(duì)照細(xì)胞，接受5μM或10μM依托泊苷治療的、過(guò)量表達(dá)miR-629的Karpas-422淋巴瘤細(xì)胞中半胱天冬酶的激活。miR-629過(guò)量表達(dá)保護(hù)Karpas-422淋巴瘤細(xì)胞免受化療(依托泊苷)誘發(fā)的細(xì)胞凋亡。產(chǎn)生了miR-629過(guò)量表達(dá)細(xì)胞的多個(gè)克隆。隨著miR-629表達(dá)增加，觀察到防止化療(依托泊苷)誘發(fā)的細(xì)胞凋亡的保護(hù)增大。

圖11A和11B是圖表，這些圖表顯示相對(duì)于僅轉(zhuǎn)染了載體(打亂型)的對(duì)照細(xì)胞，接受了依托泊苷治療的過(guò)量表達(dá)miR-629的Karpas-422淋巴瘤細(xì)胞中細(xì)胞增生測(cè)定的結(jié)果。miR-629表達(dá)保護(hù)這些細(xì)胞免受化療(依托泊苷)誘發(fā)的細(xì)胞增生損失。如上所述，產(chǎn)生了miR-629過(guò)量表達(dá)細(xì)胞的多個(gè)克隆。隨著miR-629表達(dá)增加，觀察到防止化療(依托泊苷)誘發(fā)的增生損失的保護(hù)增大。

圖12A和12B是圖表。圖12A顯示，相對(duì)于僅表達(dá)載體的對(duì)照細(xì)胞，在低或高水平表達(dá)miR-629的Karpas-422細(xì)胞中體外抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)試驗(yàn)的結(jié)果。該ADCC結(jié)果很有意義，因?yàn)樗鼈冴U明了隨著miR-629的水平增加，ADCC對(duì)MEDI-551的響應(yīng)的改變。不想被理論束縛，這些結(jié)果表明，很有可能miR-629在介導(dǎo)對(duì)MEDI-551的響應(yīng)中有直接的作用。圖12B顯示自發(fā)的乳酸脫氫酶(LDH)在低或高水平表達(dá)miR-629的細(xì)胞中釋放。LDH釋放是多年來(lái)已經(jīng)熟知的淋巴瘤預(yù)后因子，它在臨床實(shí)踐中被進(jìn)行常規(guī)測(cè)量。這些結(jié)果顯示miR-629增加了在淋巴瘤細(xì)胞系中的LDH釋放。因此，很有可能miR-629表達(dá)水平與腫瘤的攻擊性有關(guān)。這可能部分解釋miR-629與對(duì)MEDI-551的響應(yīng)之間的關(guān)系。

圖13顯示在具有慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)的患者中，對(duì)于抗-CD19抗體(MEDI-551)治療響應(yīng)的邏輯回歸分析。點(diǎn)代表響應(yīng)者(上部)和非響應(yīng)者(底部)。該數(shù)據(jù)顯示miRNA簽名表達(dá)是MEDI-551在CLL中響應(yīng)的一個(gè)潛在的預(yù)測(cè)性的生物標(biāo)志物。

圖14A-D是圖表，該圖表顯示抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)試驗(yàn)的結(jié)果。miR-629在特定的細(xì)胞類型中過(guò)量表達(dá)，并且這些細(xì)胞然后接受抗-CD19抗體(MEDI551)治療。

圖15A和15B是圖表，這些圖表顯示在對(duì)于抗-CD19抗體(MEDI551)治療具有不同的敏感性的九個(gè)細(xì)胞系中使用別藻藍(lán)蛋白(APC)標(biāo)記的第二抗體測(cè)定的CD19(圖15A)和CD20(圖15B)表達(dá)。在對(duì)照轉(zhuǎn)染細(xì)胞、miR轉(zhuǎn)染細(xì)胞、和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞中測(cè)量了平均熒光強(qiáng)度(MFI)比值。miR-629過(guò)量表達(dá)后，CD19和CD20的表達(dá)都沒(méi)有改變。

圖16是圖表，該圖表顯示，DLBCL患者的基線血液樣品中的miR-629表達(dá)水平(相對(duì)于正常血液的倍數(shù)變化)與先前顯示的使用化學(xué)治療劑組合(包括利妥昔單抗、環(huán)磷酰胺、羥基柔紅霉素(或阿霉素)、長(zhǎng)春新堿也稱為和潑尼松龍(R-CHOP)(阿倫卡爾(Alencar)等人，《臨床腫瘤研究》(Clin Cancer Res)；17(12)2011年6月15日))治療后預(yù)測(cè)增加患者的存活率的血液樣品中的miRNA的表達(dá)簽名不相關(guān)。在DLBCL血液中，該R-CHOP響應(yīng)相關(guān)的miRNA簽名與MEDI-551響應(yīng)相關(guān)的miRNA簽名不相關(guān)。

圖17是圖表，該圖表顯示在穩(wěn)定表達(dá)miR-629的細(xì)胞中分離的外排體中存在miR-629。事實(shí)上，在這些外排體中存在12-20倍更高水平的miR-629。

圖18A和18B是圖表，這些圖表顯示miR-629核轉(zhuǎn)染對(duì)自然殺傷(NK)細(xì)胞的影響的初步分析。核轉(zhuǎn)染后miR-629表達(dá)增加(圖18A)；并且在溶細(xì)胞通路和相關(guān)自然殺傷細(xì)胞活化/粘附通路中基因的表達(dá)減少40％-60％。分析的基因包括顆粒酶B(GZMB)、GZMA、GZMM、組織蛋白酶D(CTSD)、穿孔素1(PRF1)、CD63、CD96、和干擾素調(diào)節(jié)因子7。

抗-CD19(16C4)抗體序列說(shuō)明

VH結(jié)構(gòu)域SEQ ID NO:1：Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Val Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys The Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Phe Ile Thr Thr Val Arg Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

VH CDR1SEQ ID NO:2：SSWMN

VH CDR2SEQ ID NO:3：RIYPGDGDTNYNVKFKG

VH CDR3SEQ ID NO:4：SGFITTVRDFDY

VL結(jié)構(gòu)域SEQ ID NO:5：Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe Gly Ile Ser Phe Ile Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile His Glu Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Lys GluVal Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

VL CDR1 SEQ ID NO:6：RASESVDTFGISFMN

VL CDR2 SEQID NO:7：EASNQGS

VL CDR3 SEQ ID NO:8：QQSKEVPET

發(fā)明詳細(xì)說(shuō)明

本發(fā)明提供組合物和方法，這些的組合物和方法特征是使用miR-629來(lái)鑒定對(duì)B細(xì)胞消耗療法(例如，使用抗-CD19抗體的治療)響應(yīng)的受試者。

本發(fā)明是基于(至少部分地)一個(gè)發(fā)現(xiàn)，該發(fā)現(xiàn)是具有B細(xì)胞惡性腫瘤的受試者的血液樣品中的miR-629表達(dá)可以被用來(lái)表征受試者對(duì)于抗-CD19抗體治療的響應(yīng)性。如下文詳細(xì)報(bào)道，使用體外抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)試驗(yàn)，許多人類非霍奇金B(yǎng)細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系被鑒定為對(duì)于抗-CD19抗體治療具有高或低敏感性。在響應(yīng)抗-CD19抗體治療的彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤受試者中獲得的血液樣品中miR-629表達(dá)水平降低了。在響應(yīng)抗-CD19抗體治療的濾泡性淋巴瘤受試者和慢性淋巴細(xì)胞性白血病受試者中獲得的血液樣品中的miR-629表達(dá)水平也降低了。

相應(yīng)地，基于在受試者血液樣品中miR-629表達(dá)的水平，本發(fā)明提供用于鑒定受試者的方法，這些受試者具有可能響應(yīng)抗-CD19抗體治療的B細(xì)胞惡性腫瘤。

生物樣品類型

在表征受試者的B細(xì)胞惡性腫瘤對(duì)抗-CD19抗體治療的響應(yīng)性中，對(duì)不同類型的生物樣品中的miR-629表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定。在一個(gè)實(shí)施例中，該生物樣品是血液、血清或血漿樣品。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，生物樣品是包括外周血單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的血液樣品。

miR-629表達(dá)在從響應(yīng)抗-CD19抗體治療的受試者獲得的血液樣品中比非響應(yīng)受試者(例如，具有進(jìn)行性疾病的受試者)的表達(dá)水平可以至少低約三至五倍或低約五至七倍。在另一個(gè)實(shí)施例中，miR-629表達(dá)在具有B細(xì)胞惡性腫瘤的受試者中比在健康的對(duì)照中至少高大約5、10、20、或30倍。使用任何本技術(shù)領(lǐng)域已知的方法來(lái)確定倍數(shù)變化值。在一個(gè)實(shí)施例中，倍數(shù)變化是通過(guò)使用在健康的志愿者中或抗-CD19抗體非響應(yīng)受試者中的miR-629表達(dá)計(jì)算2^-ΔΔCt來(lái)確定的。

治療方法的選擇

如下文報(bào)道，在選擇治療方法的過(guò)程中，可以測(cè)試患有B細(xì)胞惡性腫瘤的受試者的miR-629表達(dá)。以具有相對(duì)于參考水平降低的miR-629表達(dá)為特征的患者被鑒定為響應(yīng)抗-CD19抗體。

許多標(biāo)準(zhǔn)治療方案可供選擇的患者使用。這些治療可以與本發(fā)明的方法聯(lián)合使用。在特定的實(shí)施例中，抗-CD19治療是與ICE(異環(huán)磷酰胺、卡鉑和依托泊苷)聯(lián)合給予的。

CD19

人的分化簇(CD)抗原19的是一種B細(xì)胞特異性抗原，該抗原屬于含有免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的跨膜受體超家族。當(dāng)CD19表達(dá)被下調(diào)時(shí)，CD19在B細(xì)胞上從原始B細(xì)胞至漿細(xì)胞階段的其整個(gè)譜系中受到表達(dá)。CD19不在造血干細(xì)胞上或在祖B細(xì)胞階段之前的B細(xì)胞上表達(dá)。重要的是，CD19的表達(dá)在B細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化之后得以維持，并且CD19在大多數(shù)B細(xì)胞惡性腫瘤上表達(dá)。CD19在B細(xì)胞惡性腫瘤上的廣泛且相對(duì)穩(wěn)定的表達(dá)使得此抗原成為基于mAb療法的有吸引力的靶標(biāo)。

抗-CD19抗體

通過(guò)表征存在其血液中的miR-629表達(dá)水平來(lái)鑒定具有響應(yīng)抗-CD19抗體治療的B細(xì)胞惡性腫瘤的受試者。一旦選擇治療，這樣的受試者實(shí)際上可以被給予本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)已知的任何抗-CD19抗體。合適的抗CD19抗體包括，例如，已知的抗CD19抗體、可商購(gòu)的抗CD19抗體、或使用本領(lǐng)域熟知的方法開(kāi)發(fā)的抗CD19抗體。

MEDI-551是具有強(qiáng)有力的ADCC效應(yīng)子功能的CD19單克隆抗體。MEDI-551是CD19mAb抗-CD19-2的非巖藻糖基化的形式，是通過(guò)HB12b mAb的人源化和親和力最優(yōu)化發(fā)展來(lái)的(堪薩斯(Kansas)和特德(Tedder)，1991；矢澤(Yazawa)等人，2005；赫布斯特(Herbst)等人，2010)。MEDI-551是通過(guò)mAb抗CD19-2在巖藻糖轉(zhuǎn)移酶缺陷的生產(chǎn)者細(xì)胞系中的表達(dá)產(chǎn)生的，這是一種產(chǎn)生具有對(duì)FccRIIIA增加的親和力和增強(qiáng)的ADCC活性的均勻非巖藻糖基化mAb的過(guò)程(赫布斯特(Herbst)等人，《藥理學(xué)與實(shí)驗(yàn)治療學(xué)雜志》(J Pharmacol Exp Ther)，2010.335(1)：213-222)。

在某些實(shí)施例中，本文所述的方法和組合物利用抗-CD19抗體16C4或其抗原結(jié)合片段(參見(jiàn)(例如)美國(guó)出版號(hào)2008/0138336)，將其通過(guò)引用結(jié)合。16C4是一種CD19mAb，它顯示具有有力的ADCC效應(yīng)子功能。16C4是CD19單克隆抗體抗-CD19-2的非巖藻糖基化的形式，其是通過(guò)HB12b mAb的人類化和親和力最優(yōu)化發(fā)展來(lái)的(堪薩斯(Kansas G S)和特德(Tedder T F)，《免疫學(xué)雜志》(J Immunol)，1991；147：4094-4102；矢澤(Yazawa)等人，赫布斯特(Herbst)等人，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc Natl Acad Sci)，2005：102(42)：15178-15183；赫布斯特(Herbst)等人，《藥理學(xué)與實(shí)驗(yàn)治療學(xué)雜志》(J Pharmacol Exp Ther)，2010.335(1)：213-222)。16C4和MEDI-551都包括重鏈CDR，該重鏈CDR包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:4的氨基酸序列，以及輕鏈CDR，該輕鏈CDR包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、和SEQ ID NO:8。SEQ ID NO:2至4和SEQ ID NO:6至8的CDR被包括在SEQ ID NO:1的VH結(jié)構(gòu)域和SEQ ID NO:5的VL結(jié)構(gòu)域中。如此，本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解包括SEQ ID No:2至4和SEQ ID NO:6至8的CDR的抗體也可以被本發(fā)明的方法和組合物使用。

本披露涵蓋是結(jié)合至人CD19的抗體16C4的衍生物的多種抗體。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以用于在編碼一種抗體的核苷酸序列中引入突變(例如，添加、缺失和/或置換)，包括例如通常用于產(chǎn)生氨基酸置換的定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變。在一個(gè)實(shí)施例中，相對(duì)于16C4抗CD19抗體的原始VH和/或VK CDR，這些VH和/或VK CDR的衍生物可以包括小于25個(gè)氨基酸置換、小于20個(gè)氨基酸置換、小于15個(gè)氨基酸置換、小于10個(gè)氨基酸置換、小于5個(gè)氨基酸置換、小于4個(gè)氨基酸置換、小于3個(gè)氨基酸置換、小于2個(gè)氨基酸置換、或小于1個(gè)氨基酸置換。在另一個(gè)實(shí)施例中，這些VH和/或VK CDR衍生物可以具有在一個(gè)或多個(gè)預(yù)測(cè)的非必需的氨基酸殘基(例如，對(duì)抗體特異性結(jié)合至人CD19不重要的氨基酸殘基)上進(jìn)行的保守性氨基酸置換。突變還可以例如通過(guò)飽和誘變，沿著所有或部分VH和/或VK CDR編碼序列來(lái)隨機(jī)引入，并且可以針對(duì)生物活性篩選生成的突變體以鑒別保留活性的突變體。誘變之后，可以表達(dá)編碼的抗體并且可以測(cè)定該抗體的活性。兩種氨基酸序列的百分比一致性可以通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所已知的任何方法(包括但不限于BLAST蛋白質(zhì)搜索)來(lái)測(cè)定。

在其它實(shí)施例中，該抗-CD19抗體被描述在例如美國(guó)專利申請(qǐng)出版物20130330328、20130183306、20110104150中，其中每一個(gè)都以其整體通過(guò)引用在此結(jié)合。在某些實(shí)施例中，本披露的抗-CD19抗體是已知的抗-CD19抗體，包括但不限于HD37(IgG1，κ)(Dako北美公司(DAKO North America,Inc.)，加利福尼亞州卡平特里亞(Carpinteria))、BU12(卡拉爾(Callard)等人，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunology)，148(10)：2983-7(1992))、4G7(IgG1)(米克爾(Meeker等人，《雜交瘤》(Hybridoma)，3(4)：305-20(1984冬季))、J4.119(貝克曼庫(kù)爾特公司(Beckman Coulter)，克雷費(fèi)爾德，德國(guó))、B43(PharMingen公司，加利福尼亞州圣地亞哥)、SJ25C1(BD PharMingen公司，加利福尼亞州圣地亞哥)、FMC63(IgG2a)(左拉(Zola)等人，《免疫Cell.細(xì)胞生物學(xué)》(Cell.Immunol.Cell.Biol.)，69(PT6)：411-22(1991)；尼克爾森(Nicholson)等人，《分子免疫學(xué)》(Mol.Immunol.)，34：1157-1165(1997)；彼得斯(Pietersz)等人，《癌癥免疫學(xué)免疫治療》(Cancer Immunol.Immunotherapy)，41：53-60(1995))、89B(B4)(IgG1)(貝克曼庫(kù)爾特公司(Beckman Coulter)，佛羅里達(dá)州邁阿密；納德勒(Nadler)等人，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)，131：244-250(1983))、和/或HD237(IgG2b)(第四次人類白細(xì)胞分化抗原國(guó)際研討會(huì)(Fourth International Workshop on Human Leukocyte Differentiation Antigens)，奧地利維也納，1989；以及佩楚托(Pezzutto)等人，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)，138(9)：2793-2799(1987))。在其他實(shí)施例中，本披露的抗-CD19抗體是在美國(guó)專利申請(qǐng)好2008/0138336和2009/0142349以及美國(guó)專利號(hào)7,462,352和7,109,304中描述的任何抗-CD19抗體。在示例性實(shí)施例中，抗-CD19抗體是16C4抗體或其抗原結(jié)合片段，如美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2008/0138336和下文所描述的。

本發(fā)明使用的抗體包括免疫球蛋白、單克隆抗體(包括全長(zhǎng)單克隆抗體)、多克隆抗體、由至少兩個(gè)不同表位結(jié)合片段形成的多特異抗體(例如，雙特異抗體)、人抗體、人源化抗體、駱駝化抗體、嵌合抗體、單鏈Fvs(scFv)、單鏈抗體、單域抗體、域抗體、Fab片段、F(ab')2片段、展現(xiàn)出所希望的生物活性的抗體片段(例如，抗原結(jié)合部分)、二硫鍵結(jié)合的Fvs(dsFv)，以及抗獨(dú)特型(抗Id)抗體(包括(例如)針對(duì)本文披露的抗體的抗Id抗體)、細(xì)胞內(nèi)抗體、以及任何以上的表位結(jié)合片段。具體而言，抗體包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，例如含有至少一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子。

抗-CD19抗體包含單克隆的人的、人源化的或嵌合的抗-CD19抗體。在本發(fā)明的組合物和方法中使用的抗-CD19抗體可以是裸抗體、免疫偶聯(lián)物或融合蛋白。在某些實(shí)施例中，抗CD19抗體介導(dǎo)人抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)、補(bǔ)體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(CDC)、和/或足以消耗循環(huán)B細(xì)胞的量的細(xì)胞凋亡。

當(dāng)給予至人類，在本發(fā)明的方法中使用的抗-CD19抗體減少或消耗B細(xì)胞(例如惡性的B細(xì)胞)。B細(xì)胞的消耗可以是在循環(huán)B細(xì)胞中、或在特定的組織中，這些組織如但不限于骨髓、脾臟、腸相關(guān)淋巴樣組織、和/或淋巴結(jié)。在一個(gè)實(shí)施例中，抗-CD19抗體可能消耗循環(huán)B細(xì)胞、血液B細(xì)胞、脾B細(xì)胞、邊緣區(qū)B細(xì)胞、濾泡性B細(xì)胞、腹膜B細(xì)胞和/或骨髓B細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，抗-CD19抗體消耗：祖B細(xì)胞、早期祖B細(xì)胞、晚期祖B細(xì)胞、大前B細(xì)胞、小前B細(xì)胞、未成熟的B細(xì)胞、成熟的B細(xì)胞、抗原刺激的B細(xì)胞、和/或漿細(xì)胞。通過(guò)(例如)以下來(lái)完成這種消耗：抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)、和/或通過(guò)阻斷CD19與其預(yù)期配體的相互作用、和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)、B細(xì)胞增生的抑制和/或B細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)(例如，通過(guò)細(xì)胞凋亡)。

若需要，相對(duì)于親本抗體，抗-CD19抗體被設(shè)計(jì)具有增加的ADCC活性。用于產(chǎn)生具有增強(qiáng)的ADCC活性的抗體變體的方法是本技術(shù)領(lǐng)域已知的并且在下文進(jìn)行描述。在某些實(shí)施例中，抗-CD19抗體是具有增強(qiáng)的ADCC活性的非巖藻糖基化的抗體。

在某些實(shí)施例中，抗CD19抗體可以是具有IgG同種型、特別是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4人同種型或在人群體中發(fā)現(xiàn)的任何IgG1、IgG2、IgG3或IgG4等位基因的人、人源化或嵌合抗體。人IgG類抗體具有多種有益的功能特征，例如在血清中的長(zhǎng)半衰期和介導(dǎo)不同的效應(yīng)子功能的能力(《單克隆抗體：原理與應(yīng)用》(Monoclonal Antibodies:Principles and Applications)，威利-利斯公司(Wiley-Liss,Inc.)，第一章(1995))。人IgG類抗體被進(jìn)一步分成以下4個(gè)亞類：IgG1、IgG2、IgG3以及IgG4。該IgG1亞類在人類中具有高的ADCC活性和CDC活性(《化學(xué)免疫學(xué)》(Chemical Immunology)，65，88(1997))。

在其它實(shí)施例中，抗-CD19抗體是如以上所述的那些的已知的抗-CD19抗體的一種同種型轉(zhuǎn)換變體(例如，轉(zhuǎn)換成IgG1或IgG3人同種型)。在其它實(shí)施例中，抗-CD19抗體免疫特異性地結(jié)合至人CD19，并且具有如使用本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員所已知的方法(例如，BIAcore試驗(yàn)，ELISA)(Biacore International AB公司，瑞典(Sweden)烏普薩拉(Uppsala))評(píng)估的小于3000pM、小于2500pM、小于2000pM、小于1500pM、小于1000pM、小于750pM、小于500pM、小于250pM、小于200pM、小于150pM、小于100pM、小于75pM的解離常數(shù)(K_D)。在其它實(shí)施例中，本披露的抗-CD19抗體可能免疫特異性地結(jié)合至人CD19抗原，并且可能具有如使用本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員所已知的方法(例如，BIAcore試驗(yàn)，ELISA)評(píng)估的在25至3400pM、25至3000pM、25至2500pM、25至2000pM、25至1500pM、25至1000pM、25至750pM、25至500pM、25至250pM、25至100pM、25至75pM、25至50pM之間的解離常數(shù)(K_D)。在某些實(shí)施例中，本披露的抗CD19抗體可以免疫特異性地結(jié)合至人CD19，并且可以具有如使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員所已知的方法(例如，BIAcore測(cè)定，ELISA)所評(píng)定的為500pM、100pM、75pM或50pM的解離常數(shù)(K_D)。

工程化效應(yīng)子功能

若需要，被鑒定為響應(yīng)抗-CD19抗體療法的受試者被給予關(guān)于效應(yīng)子功能修飾過(guò)的抗-CD19抗體，以至于(例如)增強(qiáng)該抗體在治療B細(xì)胞惡性腫瘤中的有效性。一種示例性效應(yīng)子功能是抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性或ADCC，它是這樣一種細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)：其中非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞識(shí)別靶細(xì)胞上的結(jié)合抗體并且隨后導(dǎo)致該靶細(xì)胞溶解。這些細(xì)胞毒性細(xì)胞或效應(yīng)細(xì)胞可以是表達(dá)一種或多種FcR的白細(xì)胞。效應(yīng)子細(xì)胞在小鼠中表達(dá)至少FcγRI、FcγRII、FcγRIII和/或FcγRIV。介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)、自然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。這些細(xì)胞中，用于介導(dǎo)ADCC的原代細(xì)胞是自然殺傷細(xì)胞，其表達(dá)FcγRIII。單核細(xì)胞表達(dá)FcγRI、FcγRII、FcγRIII和/或FcγRIV。FcR在造血細(xì)胞上的表達(dá)概述于拉文奇(Ravetch)和基內(nèi)特(Kinet)，《免疫學(xué)年度評(píng)論》(Annu.Rev.Immunol.)，9：457-92(1991)中。

用于增強(qiáng)抗體的效應(yīng)子功能的一種方法是通過(guò)生產(chǎn)工程化的糖型。工程化的糖型是通過(guò)技術(shù)本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任何方法來(lái)產(chǎn)生，例如，通過(guò)使用工程化的或變體的表達(dá)菌株、通過(guò)與一種或多種酶(例如，DI N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶III(GnTI11))進(jìn)行共表達(dá)、通過(guò)在各種生物體或來(lái)自各種生物體的細(xì)胞系中表達(dá)包含F(xiàn)c區(qū)的分子，或通過(guò)在該包含F(xiàn)c區(qū)的分子被表達(dá)之后修飾一種或多種碳水化合物。產(chǎn)生工程化的糖型的方法是本技術(shù)領(lǐng)域已知的，并且包含但不限于那些被描述在烏馬納(Umana)等人，1999，《自然生物技術(shù)》(Nat.Biotechnol)，17：176-180；戴維斯(Davies)等人，2001，《生物技術(shù)生物工程》(Biotechnol Bioeng)，74：288-294；希爾茲(Shields)等人從，2002，《生物化學(xué)雜志》(J Biol Chem)，277：26733-26740；新川(Shinkawa)等人，2003，《生物化學(xué)雜志》(J Biol Chem)，278：3466-3473；美國(guó)專利號(hào)6,602,684；美國(guó)專利申請(qǐng)出版號(hào)2003/0157108(美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?0/277,370從)；美國(guó)專利申請(qǐng)出版號(hào)2003/0003097(美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?0/113,929)；PCT WO 00/61739 A1；PCT WO 01/292246 A1；PCT WO 02/311140 A1；PCT WO 02/30954 A1；Potillegent.TM.技術(shù)(Biowa公司，新澤西州普林斯頓)；《GlycoMAb.TM.糖基化工程技術(shù)》(GlycoMAb.TM.glycosylation engineering technology)(GLYCART生物技術(shù)公司，瑞士蘇黎世)，其中每一個(gè)以其整體通過(guò)引用結(jié)合在此。參見(jiàn)(例如)WO 00061739；EA 01229125；US 20030115614；岡崎(Okazaki)等人，2004，《分子生物學(xué)雜志》(JMB)，336：1239-49，其中每一個(gè)以其整體通過(guò)引用結(jié)合在此。還可以進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換，氨基酸置換導(dǎo)致存在于Fc區(qū)中的糖基化位點(diǎn)(例如，IgG的天冬酰胺297)的消除。此外，無(wú)糖基化的抗體可以在缺乏必要的糖基化機(jī)器(machinery)的細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生。

還可以制備具有改變的糖基化類型的抗體，如具有減小量的巖藻糖殘基的低巖藻糖基化的抗體或具有增加的等分GlcNAc結(jié)構(gòu)的抗體。已證明，這類改變的糖基化模式增大了抗體的ADCC能力。這類碳水化合物修飾可以通過(guò)，例如在具有改變的糖基化體系的宿主細(xì)胞中表達(dá)抗體來(lái)完成。具有改變的糖基化體系的細(xì)胞已經(jīng)在本領(lǐng)域中予以描述并且可被用作宿主細(xì)胞，在那里以表達(dá)本披露的重組抗體，從而產(chǎn)生具有改變的糖基化的抗體。參見(jiàn)(例如)希爾茲(Shields,R.L.)等人，2002，《生物化學(xué)雜志》Chem.277：26733-26740；烏馬納(Umana)等人，1999，《自然生物技術(shù)》(Nat.Biotech.)，17：176-1；以及美國(guó)專利號(hào)6,946,292；歐洲專利號(hào)：EP 1,176,195；PCT出版物WO 03/035835以及WO 99/54342，其中每一個(gè)以其整體通過(guò)引用結(jié)合在此。

在一個(gè)實(shí)施例中，抗CD19抗體包含變體Fc區(qū)，該區(qū)介導(dǎo)增強(qiáng)的抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)。在一個(gè)實(shí)施例中，抗CD19抗體包含具有連接至Asn297的多個(gè)復(fù)雜的N-糖苷連接的糖鏈的一個(gè)Fc區(qū)，其中巖藻糖未結(jié)合至在還原端中的N-乙酰葡糖胺，其中所述Fc區(qū)介導(dǎo)增強(qiáng)的抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)。

本技術(shù)領(lǐng)域已知的體外試驗(yàn)可以用于確定在本披露的組合物和方法中使用的抗-CD19抗體是否能夠介導(dǎo)ADCC。示例性試驗(yàn)描述在美國(guó)專利號(hào)5,500,362或美國(guó)專利號(hào)5,821,337中。特別地，用于這類測(cè)定的有用的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)和自然殺傷(NK)細(xì)胞?？商娲鼗蛄硗獾?，感興趣的分子的ADCC活性可以例如在如克萊因斯(Clynes)等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，95：652-656(1998)中披露的動(dòng)物模型中進(jìn)行體內(nèi)評(píng)定。該測(cè)定還可以使用可商購(gòu)的試劑盒，例如CytoTox 96TM(普洛麥格公司(Promega))來(lái)進(jìn)行。

B細(xì)胞惡性腫瘤

B細(xì)胞惡性腫瘤的特征是特異性B細(xì)胞亞群的病理性擴(kuò)張，例如，前體B細(xì)胞急性淋巴母細(xì)胞白血病的特征是對(duì)應(yīng)于祖B細(xì)胞/前B細(xì)胞發(fā)育階段的B細(xì)胞異常擴(kuò)張。這些惡性B細(xì)胞維持正常B細(xì)胞標(biāo)志物如CD19的細(xì)胞表面表達(dá)?？笴D19抗體因此可以消耗人受試者中的惡性B細(xì)胞。

在此所述的包括抗-CD19抗體的療法可以用于治療B細(xì)胞疾病，包括B細(xì)胞惡性腫瘤。示例性的B細(xì)胞惡性腫瘤包括但不限于：B細(xì)胞亞型非霍奇金淋巴瘤(NHL)，包括低級(jí)/濾泡性NHL、小淋巴細(xì)胞(SL)NHL、中間級(jí)/濾泡性NHL、中間級(jí)彌漫性NHL、高級(jí)免疫母細(xì)胞NHL、高級(jí)淋巴母細(xì)胞NHL、高級(jí)小無(wú)裂細(xì)胞NHL、套細(xì)胞淋巴瘤、以及大塊疾病NHL；伯基特淋巴瘤；多發(fā)性骨髓瘤；前B急性淋巴母細(xì)胞白血病以及從早期B細(xì)胞前體衍生的其他惡性腫瘤；常見(jiàn)的急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)；慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)，包括免疫球蛋白突變的CLL和免疫球蛋白未突變的CLL；毛細(xì)胞白血??；Null型急性淋巴母細(xì)胞白血?。煌呤暇耷虻鞍籽Y；彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)，包括生發(fā)中心B細(xì)胞樣(GCB)DLBCL、活化的B細(xì)胞樣(ABC)DLBCL、以及3型DLBCL；幼淋巴細(xì)胞白血病(pro-lymphocytic leukemia)；輕鏈??；漿細(xì)胞瘤；骨硬化性骨髓瘤；漿細(xì)胞白血?。灰饬x不明的單克隆丙種球蛋白病(MGUS)；燜燃性多發(fā)性骨髓瘤(SMM)；惰性多發(fā)性骨髓瘤(IMM)；霍奇金淋巴瘤，包括經(jīng)典和結(jié)節(jié)性淋巴細(xì)胞主導(dǎo)型；淋巴漿細(xì)胞性淋巴瘤(LPL)；以及邊緣區(qū)淋巴瘤，包括胃黏膜相關(guān)淋巴樣組織(MALT)淋巴瘤。

還涵蓋對(duì)這些癌癥的復(fù)發(fā)的治療。淋巴細(xì)胞為主型霍奇金病(LPHD)是一個(gè)霍奇金疾病類型，該疾病類型盡管放療或化療治療，還是傾向于頻繁復(fù)發(fā)。慢性淋巴細(xì)胞性白血病是白血病的四種主要類型中的一種。一種成熟B細(xì)胞(叫做淋巴細(xì)胞)的癌癥慢性淋巴細(xì)胞性白血病體現(xiàn)為血液、骨髓以及淋巴組織中的細(xì)胞的漸進(jìn)性累積。惰性淋巴瘤是一種生長(zhǎng)緩慢的、不可治愈的疾病，其中受試者在多個(gè)周期的緩解和復(fù)發(fā)之后平均生存6至10年之間。

B細(xì)胞消耗的所希望的水平將取決于疾病。在一個(gè)實(shí)施例中，作為抗-CD19抗體的靶標(biāo)的B細(xì)胞消耗足以減少或消除疾病的進(jìn)展。疾病進(jìn)展是通過(guò)內(nèi)科醫(yī)師進(jìn)行評(píng)估，例如，通過(guò)監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)(大小)、癌細(xì)胞類型的增生、轉(zhuǎn)移、和/或通過(guò)監(jiān)測(cè)特定癌癥的其他信號(hào)和癥狀。在一個(gè)實(shí)施例中，B細(xì)胞消耗足以減少或消除疾病的進(jìn)展持續(xù)至少2、3、4、5、或6個(gè)月。在其他實(shí)施例中，B細(xì)胞消耗是足以增加緩解時(shí)間至少6、9、或12個(gè)月，甚至約2、3、4、或5年。在其它實(shí)施例中，B細(xì)胞消耗足以治愈該疾病。在某些實(shí)施例中，癌癥受試者的B細(xì)胞消耗減少惡性B細(xì)胞的數(shù)量和水平，該減少是減少治療前基線水平的至少約50％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或甚至100％。

用于評(píng)估對(duì)瘤的治療的功效或成功的參數(shù)將是內(nèi)科醫(yī)師(例如，腫瘤學(xué)家)所已知的。一般情況下，內(nèi)科醫(yī)師將會(huì)尋找疾病進(jìn)展的減少、緩解期的增加、穩(wěn)定性疾病的存在。對(duì)于B細(xì)胞瘤，可測(cè)量的指標(biāo)可以包括，例如疾病進(jìn)展的時(shí)間、總體和/或無(wú)進(jìn)展生存期的持續(xù)時(shí)間的增加。在白血病的情況下，可以進(jìn)行骨髓活檢以確定緩解的程度。完全緩解可被定義為，在治療之后30天，在受試者骨髓中發(fā)現(xiàn)白血病細(xì)胞組成了所有細(xì)胞的不到5％。

以下參考文獻(xiàn)描述了淋巴瘤和慢性淋巴細(xì)胞性白血病、它們的診斷、治療以及用于測(cè)量治療功效的標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)學(xué)程序?？▋?nèi)洛斯(Canellos G P)、李斯特(Lister T A)、斯克拉(Sklar J L)：《淋巴瘤》(The Lymphomas).W.B.Saunders公司，費(fèi)城(Philadelphia)1998；van Besien K和Cabanillas F：《非霍奇金淋巴瘤的臨床表現(xiàn)、階段和治療》(Clinical Manifestations,Staging and Treatment ofNon-Hodgkin's Lymphoma)，第七十章，pp 1293-1338，在：《血液學(xué)：基本原理和實(shí)踐》(Hematology,Basic Principles and Practice)，第三版，霍夫曼(Hoffman)等人(編輯).Churchill Livingstone公司，費(fèi)城(Philadelphia)，2000；以及拉伊(Rai K)和帕特爾(Patel D)：《慢性淋巴細(xì)胞性白血病》(Chronic Lymphocytic Leukemia).第七十二章，pp 1350-1362，在：《血液學(xué)：基本原理和實(shí)踐》(Hematology,Basic Principles and Practice)，第三版，霍夫曼(Hoffman)等人(編輯).Churchill Livingstone公司，費(fèi)城(Philadelphia)，2000。

試劑盒

本發(fā)明提供試劑盒，這些試劑盒用于表征受試者對(duì)抗-CD19抗體治療的響應(yīng)性。

在一個(gè)實(shí)施例中，該試劑盒包含治療性組合物，該組合物包含以單位劑型的、特異性地結(jié)合CD19多肽的、有效量的抗體。

本發(fā)明的診斷試劑盒提供試劑(例如，用于miR-629和管家參考基因的TaqMan引物/探針)用于測(cè)量miR-629的相對(duì)表達(dá)。

在一些實(shí)施例中，該試劑盒包括包含治療性或診斷性組合物的無(wú)菌容器；此類容器可以是盒、安瓿、瓶子、小瓶、管、袋、小袋、泡罩包裝、或其他適合的本領(lǐng)域已知的容器形式。此類容器可以是由塑料、玻璃、層壓紙、金屬箔、或其他適用于容納藥物的材料制成的。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的試劑盒包括測(cè)量miR-629表達(dá)和抗-CD19抗體的試劑。若需要，該試劑盒進(jìn)一步包括測(cè)量miR-629表達(dá)的說(shuō)明和/或向具有B細(xì)胞惡性腫瘤(如選擇作為響應(yīng)抗-CD19抗體治療的惡性腫瘤)的患者給予抗-CD19抗體治療的說(shuō)明書(shū)。在其他實(shí)施例中，這些說(shuō)明書(shū)包括以下各項(xiàng)中的至少一種：治療劑的描述；用于治療或預(yù)防B細(xì)胞惡性腫瘤或其癥狀的劑量日程表和給予；注意事項(xiàng)；警告信息；適應(yīng)癥；禁忌癥；超劑量信息；不良反應(yīng)；動(dòng)物藥理學(xué)；臨床研究；和/或參考文獻(xiàn)。這些說(shuō)明書(shū)可以直接打印在容器(當(dāng)存在時(shí))上，或作為標(biāo)簽應(yīng)用于容器，或作為單獨(dú)的頁(yè)、小冊(cè)子、卡片、或在容器中或一起提供的文件夾。

抑制性核酸

抑制性核酸分子是那些抑制核酸分子或多肽表達(dá)的寡核苷酸。如在下面詳細(xì)報(bào)道，本發(fā)明提供了一種方法，該方法通過(guò)測(cè)量血樣中miR-629表達(dá)來(lái)鑒定響應(yīng)抗-CD19抗體治療的受試者的B細(xì)胞惡性腫瘤，其中對(duì)相對(duì)于參考miR-629表達(dá)降低的檢測(cè)鑒定具有響應(yīng)抗-CD19抗體治療的B細(xì)胞惡性腫瘤的受試者。鑒于這一發(fā)現(xiàn)，很有可能，在受試者中減少miR-629表達(dá)將誘導(dǎo)或增強(qiáng)受試者的抗-CD19抗體響應(yīng)性。

因此，本發(fā)明提供靶向miR-629的單鏈和雙鏈抑制性核酸分子(如DNA、RNA、和其類似物)并且降低其表達(dá)。示例性抑制性核酸分子包括siRNA、shRNA、和反義RNA。

siRNA

短的21至25核苷酸雙鏈RNA對(duì)下調(diào)基因表達(dá)有效(賽摩(Zamore)等人，《細(xì)胞》(Cell)，101：25-33；Elbashir等人，《自然》(Nature)，411：494-498，2001，通過(guò)引用在此結(jié)合)。已證明在哺乳動(dòng)物體中siRNA方法的治療效果，參見(jiàn)麥卡弗里(McCaffrey)等人，《自然》(Nature)，418：38-39，2002。

鑒于miR-629的序列，siRNA可以被設(shè)計(jì)用來(lái)減少miR-629表達(dá)?？梢韵蚴茉囌呦到y(tǒng)地給予這樣的siRNA以減少miR-629表達(dá)。使用靶向miR-629的21至25核苷酸siRNA(例如)作為治療劑以治療B細(xì)胞惡性腫瘤。

本發(fā)明的抑制性核酸分子可被作為雙鏈RNA用于RNA干擾(RNAi)介導(dǎo)的表達(dá)敲抵。RNAi是一種用于降低感興趣的特定蛋白質(zhì)的細(xì)胞表達(dá)的方法(參見(jiàn)圖施(Tusch1)，《化學(xué)與生物化學(xué)》(ChemBioChem)，2：239-245，2001；夏普(Sharp)《基因與發(fā)育》(Genes&Devel.)，15：485-490，2000；胡特瓦格納(Hutvagner)和賽摩(Zamore)，《遺傳學(xué)與發(fā)育新觀點(diǎn)》(Curr.Opin.Genet.Devel.)，12：225-232，2002；以及漢諾(Hannon)，《自然》(Nature)，418：244-251，2002)。通過(guò)dsRNA轉(zhuǎn)染或通過(guò)使用基于質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)siRNA將siRNA引入細(xì)胞已經(jīng)越來(lái)越多地被用來(lái)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中創(chuàng)建功能缺失表型。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，雙鏈RNA(dsRNA)分子被做成包括本發(fā)明的核苷堿基寡聚物的八至十九個(gè)連續(xù)核苷堿基。dsRNA可以是具有兩條不同鏈的雙鏈RNA，或自我雙鏈化的單鏈RNA(小發(fā)夾(sh)RNA)。典型地，dsRNA是大約21或22個(gè)堿基對(duì)，但如果需要可以更長(zhǎng)或更短(達(dá)到大約29個(gè)堿基對(duì))。dsRNA可以使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)(如化學(xué)合成或體外轉(zhuǎn)錄)制得。試劑盒可從(例如)阿姆比恩公司(Ambion)(德克薩斯州奧斯丁)和恩皮森特公司(Epicentre)(威斯康星州麥迪遜)購(gòu)得。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)dsRNA的方法描述在布魯莫卡帕(Brummelkamp)等人，《科學(xué)》(Science)，296：550-553，2002；帕蒂森(Paddison)等人，《基因與發(fā)育》(Genes&Devel.)，16：948-958，2002.保羅(Paul)等人，《自然生物技術(shù)》(Nature Biotechnol.)，20：505-508，2002；Sui等人，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.)，99：5515-5520，2002；于(Yu)等人，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.)，99：6047-6052，2002；宮木(Miyagishi)等人，《自然生物技術(shù)》(Nature Biotechnol.)，20：497-500，2002；以及李(Lee)等人，《自然生物技術(shù)》(Nature Biotechnol.)，20：500-505，2002，其中每一個(gè)通過(guò)引用結(jié)合在此。

小發(fā)夾RNA(shRNA)包括具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA序列?！扒o環(huán)結(jié)構(gòu)”是指具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的核酸，該核酸包括已知或預(yù)測(cè)形成雙鏈或雙鏈體(莖部)的核苷酸區(qū)域，其連接在主要為單鏈的核苷酸(環(huán)部)區(qū)域的一側(cè)。術(shù)語(yǔ)“發(fā)夾”也被用來(lái)指莖環(huán)結(jié)構(gòu)。這樣的結(jié)構(gòu)在技術(shù)領(lǐng)域中是熟知的，并且一致性地使用該術(shù)語(yǔ)在本領(lǐng)域內(nèi)其已知的意義。正如在本領(lǐng)域中所知，二級(jí)結(jié)構(gòu)不需要精確的堿基配對(duì)。因此，莖部可以包括一個(gè)或多個(gè)堿基錯(cuò)配或突起?？商娲兀瑝A基配對(duì)可以是準(zhǔn)確的，即不包括任何錯(cuò)配。多個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)可以通過(guò)接頭相互連接，例如，核酸接頭、miRNA的側(cè)翼序列、其它分子、或它們的某種組合。

如在此使用的術(shù)語(yǔ)“小發(fā)夾RNA”包括常規(guī)的莖環(huán)shRNA前體，其形成前導(dǎo)miRNA(前miRNA)。雖然可以在范圍內(nèi)有一些變化，常規(guī)的莖環(huán)shRNA可包括19至29bp的莖，和4至30bp的環(huán)。shRNA可以從DNA載體表達(dá)以提供持續(xù)的沉默和高產(chǎn)遞送至幾乎所有的細(xì)胞類型中。在一些實(shí)施例中，該載體是病毒載體。示例性病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒，包括慢病毒、腺病毒、桿狀病毒和禽病毒性載體，并且包括允許穩(wěn)定的單拷貝基因組整合的這樣的載體。逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體可以來(lái)源于逆轉(zhuǎn)錄病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒包括但不限于，莫洛尼鼠白血病病毒、脾壞死病毒、勞斯肉瘤病毒、哈維肉瘤病毒、禽白血病病毒、長(zhǎng)臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增生肉瘤病毒、和乳腺腫瘤病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體可以用于轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞系以形成生產(chǎn)細(xì)胞系?？杀晦D(zhuǎn)染包裝細(xì)胞的實(shí)例包括但不限于，PE50l、PA3l7、R-2、R-AM、PA12、T19-14x、VT-19-17-H2、RCRE、RCRIP、GP+E-86、GP+envAm12、和DNA細(xì)胞系，如描述在米勒(Miller)的《人類基因治療》(Human Gene Therapy)1：5-14(1990)，其通過(guò)引用以其整體結(jié)合在此。該載體可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方式轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞。生產(chǎn)細(xì)胞系產(chǎn)生傳染性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒，其包括編碼DNA復(fù)制蛋白的多核苷酸。然后可以使用此類逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細(xì)胞，無(wú)論是在體外或體內(nèi)。轉(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞將表達(dá)DNA復(fù)制蛋白。

包含本發(fā)明的反義序列的催化RNA分子或核酶可用于抑制核酸分子的體內(nèi)表達(dá)。包含核酶序列在反義RNA中賦予它們RNA切割活性，從而增加了構(gòu)建體的活性。靶標(biāo)RNA特異性核酶的設(shè)計(jì)和使用被描述在Haseloff等人，《自然》(Nature)334：585-591，1988，以及美國(guó)專利申請(qǐng)出版號(hào)2003/0003469A1，其中每一個(gè)通過(guò)引用結(jié)合在此。

因此，本發(fā)明的特征是催化性RNA分子，其包括在結(jié)合臂中的含有八至十九個(gè)堿基的反義RNA。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，催化性核酸分子是在錘頭或發(fā)夾基序中形成的。這種錘頭基序的實(shí)例被描述在羅西(Rossi)等人，《艾滋病研究與人類逆轉(zhuǎn)錄酶病毒》(Aids Research and Human Retroviruses)8：183，1992。發(fā)夾基序的實(shí)例被描述在漢佩爾(Hampel)等人于1989年9月20日提交的“用于切割特定的RNA序列的RNA催化劑(RNA Catalyst for Cleaving Specific RNA Sequences)”，這是提交于1988年9月20日的美國(guó)系列號(hào)07/247,100的一個(gè)延續(xù)的部分，佩爾(Hampel)和特里茨(Tritz)，《生物化學(xué)》(Biochemistry)，28：4929，1989，以及漢佩爾(Hampel)等人，《核酸研究》(Nucleic Acids Research)，18：299，1990。這些特定的基序不受本發(fā)明的限制并且本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，所有在本發(fā)明的酶促核酸分子中重要的是，它具有特定的與一個(gè)或多個(gè)靶基因的RNA區(qū)域互補(bǔ)的底物結(jié)合位點(diǎn)，并且在底物結(jié)合位點(diǎn)上或周圍它具有賦予該分子RNA切割活性的核苷酸序列。

本質(zhì)上，可以應(yīng)用任何一種方法用于將核酸構(gòu)建體引入細(xì)胞。引入核酸的物理方法包括注入含有構(gòu)建體的溶液，被構(gòu)建體包被的顆粒的基因槍轉(zhuǎn)化，在核酸溶液中浸泡細(xì)胞、組織樣本或生物體，或在構(gòu)建體存在下電穿孔細(xì)胞膜?？梢允褂冒b成病毒顆粒的病毒構(gòu)建體來(lái)完成將表達(dá)構(gòu)建體有效的引入細(xì)胞和編碼shRNA轉(zhuǎn)錄?？梢允褂闷渌诒炯夹g(shù)領(lǐng)域已知的用于在細(xì)胞中引入核酸的方法，例如脂質(zhì)介導(dǎo)的載體運(yùn)輸、化學(xué)介導(dǎo)的運(yùn)輸如磷酸鈣等。因此，編碼shRNA的核酸構(gòu)建體可以與進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)以下的活動(dòng)的組件一起被引入：增強(qiáng)細(xì)胞吸收RNA，促進(jìn)雙鏈退火，穩(wěn)定退火的鏈，或另外提高靶標(biāo)基因的抑制作用。

對(duì)于細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，可以應(yīng)用DNA載體，例如含有RNA聚合酶Ⅱ或RNA聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體。內(nèi)源性miRNA的表達(dá)由RNA聚合酶II(Pol II)啟動(dòng)子控制并且在某些情況下，相比RNA聚合酶III啟動(dòng)子，shRNA被RNA聚合酶II啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)最有效(迪金斯(Dickins)等人，2005，《自然遺傳學(xué)》(Nat.Genet.)39：914-921)。在一些實(shí)施例中，該shRNA的表達(dá)可以通過(guò)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或條件表達(dá)系統(tǒng)來(lái)控制，包括但不限于，RNA聚合酶II型啟動(dòng)子。在本發(fā)明背景下有用的啟動(dòng)子的實(shí)例是四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(包括TRE密封的)、IPTG誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、四環(huán)素反式激活因子系統(tǒng)、和反面的四環(huán)素反式激活因子(rtTA)系統(tǒng)。也可以使用組成型啟動(dòng)子，如細(xì)胞或組織特異性啟動(dòng)子。許多啟動(dòng)子是普遍存在的以至于它們?cè)谒屑?xì)胞和組織類型中表達(dá)。一個(gè)特定的實(shí)施例使用四環(huán)素響應(yīng)啟動(dòng)子，這是一個(gè)在體外和體內(nèi)研究中最有效的條件型基因表達(dá)系統(tǒng)。參見(jiàn)國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US 2003/030901(出版號(hào)WO 2004-029219A2)以及Fewell等人，2006，《今日藥物發(fā)現(xiàn)》(Drug Discovery Today)11：975-982，其中每個(gè)通過(guò)引用結(jié)合在此，用于說(shuō)明誘導(dǎo)性shRNA。

多核苷酸遞送

裸多核苷酸或其類似物能夠進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞并且抑制感興趣的基因的表達(dá)。然而，理想的是利用配制品來(lái)幫助將寡核苷酸或其它核堿基寡聚物遞送至細(xì)胞(參見(jiàn)(例如)美國(guó)專利號(hào)5,656,611、5,753,613、5,785,992、6,120,798、6,221,959、6,346,613、以及6,353,055，其中每一個(gè)通過(guò)引用結(jié)合在此)。

除非另外指明，本發(fā)明的實(shí)施采用很好地處在熟練業(yè)內(nèi)人士的見(jiàn)識(shí)范圍之內(nèi)的分子生物學(xué)(包含重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)。這樣的技術(shù)在文獻(xiàn)中被充分闡明，例如，“分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)”，第二版(Sambrook,1989)；“寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)”(Gait,1984)；“動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)(Animal Cell Culture)”(Freshney,1987)；“酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)”“實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)(Handbook of Experimental Immunology)”(Weir,1996)；“用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移載體(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)”(Miller and Calos,1987)：“分子生物學(xué)現(xiàn)代方法(Current Protocols in Molecular Biology)”(Ausubel,1987)：“PCR：聚合酶鏈反應(yīng)(PCR:The Polymerase Chain Reaction)”(Mullis,1994)；“免疫學(xué)現(xiàn)代方法(Current Protocols in Immunology)”(Coligan,1991)。這些技術(shù)適用于本發(fā)明的多核苷酸和多肽的生產(chǎn)，并且按照這樣，可以被考慮用于制備和實(shí)施本發(fā)明。對(duì)具體實(shí)施例特別有用的技術(shù)將在下面的部分進(jìn)行討論。

給出以下的實(shí)例是為了給本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供如何準(zhǔn)備和使用測(cè)試、篩選和本發(fā)明的治療方法的一個(gè)完整的公開(kāi)和說(shuō)明，而不是旨在限定諸位發(fā)明人認(rèn)為是自己的發(fā)明的范圍。

實(shí)例

實(shí)例1：miR-629水平在抗-CD19抗體敏感的細(xì)胞系中降低。

使用體外抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)試驗(yàn)，一些人類非霍奇金B(yǎng)細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系被鑒定為對(duì)于抗-CD19抗體治療具有高或低敏感性。特別地，Karpas-422、人B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤、Oci-Ly-19、彌漫性大細(xì)胞淋巴瘤、SUD-HL-6、濾泡性B細(xì)胞淋巴瘤(CRL2959^TM)、和托萊多(Toledo)細(xì)胞系、非霍奇金淋巴瘤模型系統(tǒng)被鑒定為對(duì)于抗-CD19抗體治療具有高敏感性。與此相反，DB(彌漫性大細(xì)胞淋巴瘤)、ARH-77(EBV-轉(zhuǎn)化的B淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系)、和RL(非霍奇金淋巴瘤B細(xì)胞系)被鑒定為對(duì)于抗-CD19抗體治療具有低敏感性。

這些細(xì)胞系通過(guò)分析它們的微小RNA表達(dá)被表征。微小RNA/miRNA是抑制多個(gè)靶標(biāo)mRNA翻譯的小單鏈RNA分子。對(duì)于miRNA的作用在心血管疾病、糖尿病、癌癥和其它疾病中被鑒定。對(duì)于miRNA在預(yù)測(cè)對(duì)各種治療方法的響應(yīng)中的作用還不太了解。

有趣地，鑒定到17個(gè)miRNA在對(duì)于抗-CD19抗體治療具有不同敏感性的彌散性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL或DLBL)細(xì)胞系之間表達(dá)不同。使用多個(gè)平臺(tái)包括Affymetrix miRNA微陣列和TaqMan qPCR觀察到這些差異。

以下微小RNA具有顯著的不同：miR-629；miR-99b；miR-let-7e；miR-15a；和miR-29a。最大的顯著不同是在于miR-629的表達(dá)。對(duì)于抗-CD19抗體治療具有高敏感性的彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系中(圖1A和1B)miR-629表達(dá)水平比對(duì)于抗-CD19抗體具有低敏感性的細(xì)胞系顯著更低。在確定低與高敏感性中，高敏感性細(xì)胞系的EC50在體外ADCC試驗(yàn)中比低敏感性細(xì)胞系至少低100倍(在其他情況下是1000倍或更多)。

總之，對(duì)使用抗-CD19抗體(MED-551)的體外ADCC試驗(yàn)具有高敏感(n＝4)與低敏感(n＝3)的細(xì)胞系之間的miR-629表達(dá)具有顯著差異。這種效應(yīng)似乎對(duì)于抗CD19抗體響應(yīng)性是特異的。miR-629表達(dá)的改變與利妥昔單抗的響應(yīng)性不相關(guān)。

實(shí)例2：miR-629表達(dá)在響應(yīng)抗-CD19抗體治療的彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者中降低。

在基線全血樣品中測(cè)量miR-629表達(dá)水平，這些全血樣品采自彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、以及慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)患者，這些患者在臨床試驗(yàn)號(hào)CP204中使用抗-CD19抗體治療作為單一藥劑進(jìn)行治療，該臨床試驗(yàn)是第1期在具有復(fù)發(fā)性或難治性晚期B細(xì)胞惡性腫瘤的成人患者中進(jìn)行的MEDI-551(直接針對(duì)CD19的人源化單克隆抗體)的劑量遞增研究。

接受抗-CD19抗體治療的患者被分成具有完全或部分響應(yīng)。

·CR/PR(完全或部分響應(yīng))：5個(gè)彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、6個(gè)濾泡性淋巴瘤、3個(gè)慢性淋巴細(xì)胞性白血病

·PD(進(jìn)行性疾病)：10個(gè)彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、2個(gè)濾泡性淋巴瘤、以及3個(gè)慢性淋巴細(xì)胞性白血病

·SD(穩(wěn)定的疾病)：4個(gè)彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、3個(gè)濾泡性淋巴瘤、以及9個(gè)慢性淋巴細(xì)胞性白血病

在接受MEDI-551或利妥昔單抗+苯達(dá)莫司汀(CP-1019)治療的慢性淋巴細(xì)胞性白血病患者中的基線外周血單核細(xì)胞(PBMC)樣品中測(cè)量miR-629表達(dá)水平。

·22個(gè)MEDI-551治療的患者(10CR/PR；3PD；4SD)

·12個(gè)利妥昔單抗治療的患者(6CR/PR；2PD；2SD)

出人意料地，對(duì)于抗-CD19抗體治療完全或部分響應(yīng)(CR/PR)的彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者中的miR-629表達(dá)比非響應(yīng)者(PD)顯著更低(約7倍)(圖2)。在抗-CD19抗體治療前的全血樣品中測(cè)量miR-629表達(dá)?？傊?，第I期臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)證明對(duì)于抗-CD19抗體(MEDI-551)響應(yīng)的彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者中的基線miR-629表達(dá)更低。有趣地，相比從正常的對(duì)照組受試者中獲得的血液樣本中的miR-629水平，在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者的樣品中miR-629表達(dá)顯著增加。

比較了使用抗-CD19抗體(MEDI-551)加ICE/DHAP或者利妥昔單抗加ICE/DHAP治療的患者之間的miR-629表達(dá)水平。相比那些響應(yīng)抗-CD20抗體治療聯(lián)合ICE/DHAP的患者，在響應(yīng)抗-CD19抗體治療聯(lián)合ICE(異環(huán)磷酰胺、卡鉑和依托泊苷)/DHAP給藥的患者中，miR-629水平被表征為增加或降低。相比響應(yīng)利妥昔單抗治療的患者，這些研究也將表征在響應(yīng)抗-CD19抗體的DLBCL患者中特異地降低的miR-629的任何改變。這些研究結(jié)果顯示于圖5中。

實(shí)例3：miR-629表達(dá)在響應(yīng)抗-CD19抗體治療的濾泡性淋巴瘤患者中降低。

在接受抗-CD19抗體治療前的濾泡性淋巴瘤患者中獲得的全血樣品中測(cè)量了miR-629表達(dá)水平。miR-629表達(dá)在濾泡性淋巴瘤血液中明顯高于正常血液。

在響應(yīng)抗-CD19抗體治療(CR/PR)的濾泡性淋巴瘤患者中獲得的全血樣品中miR-629表達(dá)比濾泡性淋巴瘤的非響應(yīng)者(PD)顯著更低(約5倍)在(圖3)中。

實(shí)例4：miR-629表達(dá)在慢性淋巴細(xì)胞性白血病患者中增加

相比從正常對(duì)照組受試者中獲得的血液，在慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)患者中獲得的全血中miR-629表達(dá)增加。初步結(jié)果顯示，miR-629表達(dá)在響應(yīng)抗-CD19抗體治療(CR/PR)的慢性淋巴細(xì)胞性白血病患者中獲得的全血樣品中比慢性淋巴細(xì)胞性白血病非響應(yīng)者更低(圖4)。這些初步的觀察結(jié)果將在另外的患者中得到證實(shí)。

實(shí)例5：初步數(shù)據(jù)顯示miR-629表達(dá)在響應(yīng)抗-CD19抗體-ICE(苯達(dá)莫司汀(bendamustine))治療的慢性淋巴細(xì)胞性白血病患者中降低。

從慢性淋巴細(xì)胞性白血病患者在接受治療前獲得的全血中測(cè)量了miR-629表達(dá)。對(duì)患者對(duì)利妥昔單抗-ICE治療與抗-CD19抗體-ICE治療的響應(yīng)進(jìn)行了表征(圖5A和5B)。盡管樣品量小，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)在接受利妥昔單抗-ICE治療的CR/PR和PD患者之間的miR-629表達(dá)水平之間的關(guān)聯(lián)(圖5B)。與此相反，miR-629表達(dá)水平在抗-CD19抗體-ICE響應(yīng)的慢性淋巴細(xì)胞性白血病患者中更低。

實(shí)例6：miR-629表達(dá)在響應(yīng)抗-CD19抗體治療的彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者中更低

miR-629表達(dá)在對(duì)于抗-CD19抗體(MEDI-551)具有高敏感性的彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系中更低(圖5C)?；谒鼈儗?duì)利妥昔單抗的敏感性在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系中沒(méi)有觀察到這樣的關(guān)聯(lián)(圖5D)。在CP1088試驗(yàn)中的彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者中產(chǎn)生了類似的觀察。(圖5E)

從彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者在接受治療前獲得的全血樣品中測(cè)量了miR-629表達(dá)。19名患者隨后接受了抗-CD19抗體(MEDI-551)和化療(ICE或DHAP)治療。17名患者接受了利妥昔單抗治療。有趣地，miR-629表達(dá)在響應(yīng)抗-CD19抗體(MEDI-551)治療(CR/PR)的患者中相比非響應(yīng)者(SD/PD)顯著更低(約4倍)(圖5E)。這是真實(shí)的，不論患者是否接受2mg/kg或4mg/kg的抗-CD19抗體(MEDI-551)(圖5E和5F)的治療。關(guān)于利妥昔單抗的響應(yīng)性沒(méi)有觀察到這樣的關(guān)聯(lián)(圖5E)。

實(shí)例7：miR-629表達(dá)水平在不響應(yīng)抗-CD19抗體治療的患者中增加。

有趣地，miR-629表達(dá)水平在對(duì)于抗-CD19抗體響應(yīng)的DLBCL受試者中在治療前和治療后相似(圖6A和6B)。與此相比，在具有進(jìn)行性疾病(PD)的患者的治療后，miR-629表達(dá)水平傾向于增加(圖6C)。這些結(jié)果表明miR-629在抗-CD19抗體(MEDI-551)的響應(yīng)性中起到特異性作用，以至于癌癥進(jìn)展與此微小RNA水平相關(guān)聯(lián)。

實(shí)例8：miR-629表達(dá)相比健康的對(duì)照在淋巴瘤患者中更高。

當(dāng)使用TaqMan定量PCR(圖7B)或使用miRNA微陣列分析(圖7A)時(shí)，相比健康的志愿者，miR-629在所有淋巴瘤(彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤與濾泡性淋巴瘤)患者中更高。在實(shí)例1-6中，通過(guò)TaqMan定量PCR測(cè)量了miR-629。

在淋巴瘤血液中的miR-629的來(lái)源不明。然而，不可能在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤或慢性淋巴細(xì)胞性白血病中反應(yīng)B細(xì)胞在數(shù)量上的改變。在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤或慢性淋巴細(xì)胞性白血病患者中沒(méi)有觀察到miR-629水平和基線B細(xì)胞計(jì)數(shù)(CD19或CD20)之間的關(guān)聯(lián)。

相比健康的全血，miR-629在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者的全血中有更大程度的表達(dá)(最小16倍)。相比其它細(xì)胞類型，miR-629水平在正常的單核細(xì)胞和B細(xì)胞中更高。miR-629表達(dá)在CD14⁺和CD19⁺細(xì)胞中更高。相比在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤/濾泡性淋巴瘤患者中觀察到的，這些水平保持非常地更低(圖8)。

實(shí)例9：miR-629過(guò)量表達(dá)防范化療誘發(fā)的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增生損失

使用如圖9A所示的miR-629表達(dá)載體產(chǎn)生miR-629過(guò)量表達(dá)Karpas-422細(xì)胞系。Karpas-422細(xì)胞是具有低水平miR-629的DLBCL細(xì)胞系，并且在體外ADCC試驗(yàn)中對(duì)于抗-CD19抗體(MEDI-551)高度敏感。該細(xì)胞也表達(dá)提供視覺(jué)監(jiān)控miR-629表達(dá)水平的GFP報(bào)道子(圖9B)。使用miR-629表達(dá)載體或不包含miR-629前體插入的對(duì)照載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。然后基于GFP表達(dá)通過(guò)FACS分選這些細(xì)胞為miR-629高和miR-629低表達(dá)群體。表達(dá)miR-629的單細(xì)胞克隆通過(guò)有限稀釋產(chǎn)生。miR-629表達(dá)的相對(duì)水平如圖9C所示。

圖10A和10B顯示在miR-629過(guò)量表達(dá)的Karpas-422淋巴瘤細(xì)胞中的半胱天冬酶激活。有趣地，miR-629過(guò)量表達(dá)保護(hù)Karpas-422淋巴瘤細(xì)胞免受化療(依托泊苷)誘發(fā)的細(xì)胞凋亡(圖10A和10B)。

miR-629過(guò)量表達(dá)也保護(hù)Karpas-422淋巴瘤細(xì)胞免受化療(依托泊苷)誘發(fā)的細(xì)胞增生損失(圖11A和11B)。相應(yīng)地，在B細(xì)胞惡性腫瘤中降低miR-629水平的方法預(yù)期將恢復(fù)細(xì)胞對(duì)化療的敏感性(即化療降低細(xì)胞增生和增加細(xì)胞凋亡的能力)。

實(shí)例10：miR-629過(guò)量表達(dá)增加自發(fā)的乳酸脫氫酶(LDH)釋放

miR-629過(guò)量表達(dá)與體外自發(fā)的LDH釋放的增加和體外ADCC試驗(yàn)中抗-CD19抗體治療的Ec50的稍微改變相關(guān)聯(lián)(圖12A和12B)。

實(shí)例11：基線miR-629表達(dá)預(yù)測(cè)對(duì)MEDI-551和化療的響應(yīng)

圖13提供接受抗-CD19抗體(MEDI-551)或利妥昔單抗治療的患者的響應(yīng)與miRNA簽名表達(dá)(在治療前的PBMC樣品中測(cè)量并且以相對(duì)于健康的志愿者的倍數(shù)變化顯示)的邏輯回歸分析。只有具有miRNA數(shù)據(jù)和≥1的后基線疾病評(píng)估的患者被包括在分析中。圖13中顯示的曲線代表基于回歸模型的跨miRNA簽名水平的響應(yīng)的預(yù)測(cè)概率。2條曲線的交叉(指示治療與生物標(biāo)志物的相互作用)表明miRNA簽名可能是對(duì)于抗-CD19抗體(MEDI-551)在慢性淋巴細(xì)胞性白血病中的響應(yīng)性的一個(gè)預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物?；€miR-629表達(dá)預(yù)測(cè)對(duì)于抗-CD19抗體(MEDI-551)和化療的、但不是利妥昔單抗和化療(ICE-苯達(dá)莫司汀)的響應(yīng)。

實(shí)例12：改變miR-629表達(dá)的效果。

探索了改變miR-629對(duì)于抗-CD19抗體(MEDI551)治療的敏感性的效果。人類白血病和淋巴瘤細(xì)胞系道迪(Daudi)、托萊多(Toledo)和RL是從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得；Karpas 1106P、Karpas 422、OCI-Ly-19、MEC2是從德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)(DSMZ，德國(guó))獲得。使用PrimeFect(龍沙(Lonza))將50uM的miR-629模擬品(Karpas 1106P、Karpas 422、道迪、MEC2、OCI-Ly-19、SU-DHL-6、和托萊多)、miR-629發(fā)夾抑制劑(RL和ARH-77)、或相應(yīng)的陰性對(duì)照寡核苷酸(全部從Dharmacon獲得)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系24小時(shí)。使用它們各自的熒光標(biāo)記的單克隆抗體，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(LSRII，BD生物科學(xué)公司)測(cè)定CD19和CD20表面表達(dá)。表面表達(dá)被報(bào)道為平均熒光強(qiáng)度(MFI)并且對(duì)非轉(zhuǎn)染的以及miR-629和陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行平均。當(dāng)miR-629過(guò)量表達(dá)，MEC-2和道迪細(xì)胞系顯示對(duì)于抗-CD19抗體(MEDI551)15％-25％降低的敏感性(圖14A和14B)，同時(shí)在托萊多和SU-DHL-6細(xì)胞系中觀察到細(xì)胞毒性15％-20％的差異(圖14C和14D)。

在對(duì)于抗-CD19抗體(MEDI551)敏感性不同的九個(gè)細(xì)胞系中分析了在CD19和CD20表面表達(dá)的過(guò)量表達(dá)的miR-629的效果(圖15A和15B)。使用別藻藍(lán)蛋白(APC)共軛的抗體測(cè)量了CD19和CD20表達(dá)。在對(duì)照轉(zhuǎn)染細(xì)胞、miR轉(zhuǎn)染細(xì)胞、和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞中測(cè)量了平均熒光強(qiáng)度(MFI)比值。在響應(yīng)miR-629過(guò)量表達(dá)中觀察到在CD19或CD20表面表達(dá)無(wú)變化。這表明，CD19、CD20的表達(dá)改變不說(shuō)明細(xì)胞對(duì)于抗-CD19抗體(MEDI551)的敏感性差異。

實(shí)例13：在R-CHOP微小RNA簽名和抗CD19抗體(MEDI-551)微小RNA簽名(miR-629表達(dá))之間不存在關(guān)聯(lián)。

顯示miRNA簽名以預(yù)測(cè)使用化學(xué)治療劑組合R-CHOP(其包括利妥昔單抗、環(huán)磷酰胺、羥基柔紅霉素(或阿霉素)、長(zhǎng)春新堿以及潑尼松龍)治療的彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者中增加的生存率(阿倫卡爾(Alencar)等人，《臨床癌癥研究》(Clin.Cancer Res.)2011；17：4125-35)。在從DLBCL患者的基線血液樣品中的這個(gè)簽名表達(dá)與miR-629的表達(dá)之間沒(méi)有觀察到關(guān)聯(lián)性(圖16)。該結(jié)果支持了臨床上觀察到的與MEDI-551響應(yīng)關(guān)聯(lián)的miRNA簽名的特異性。

實(shí)例14：在外排體中觀察到miR-629。

外排體是被大多數(shù)(如果不是全部)細(xì)胞類型、包括腫瘤細(xì)胞釋放到生物體液中的細(xì)胞衍生的囊泡。證據(jù)表明，外排體介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊在涉及腫瘤發(fā)生和發(fā)展的過(guò)程中的關(guān)鍵作用。利用全外排體分離試劑盒(Total Exosome Isolation kit)(英杰公司(Invitrogen)，類別號(hào)#4478359)，從穩(wěn)定地過(guò)量表達(dá)miR-629或miRNA打亂型對(duì)照的Karpas-422細(xì)胞系的上層清夜分離外排體。收獲細(xì)胞培養(yǎng)基并且在2000xg下旋轉(zhuǎn)30分鐘以去除細(xì)胞和碎片。無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至新的管子并且用0.5體積的全外排體分離試劑(Total Exosome Isolation reagent)處理。通過(guò)移液或渦旋來(lái)混合培養(yǎng)基和試劑直到獲得均一的溶液。將樣品在4℃孵育過(guò)夜。孵育后，將樣品在10000xg和4℃下旋轉(zhuǎn)1小時(shí)。上清液吸出并丟棄，并且沉淀的外排體重新懸浮于0.2體積的外排體懸浮緩沖液(Exosome Resuspension Buffer)中(英杰公司，類別號(hào)#4478545)。將重懸的的外排體在室溫下孵育5-10分鐘。將變性溶液預(yù)熱至37℃，并且添加1體積的量至外排體懸浮液。該溶液是在冰上孵育10分鐘，然后使用與開(kāi)始的外排體樣品體積成比例的1體積的酸：苯酚：氯仿進(jìn)行萃取。將樣品渦旋30-60秒并且在13000xg室溫下旋轉(zhuǎn)5分鐘。將水相轉(zhuǎn)移至新的管子并且向每個(gè)樣品添加1.25體積的乙醇。徹底攪拌后，700uL樣品被放置到Zymo柱(Zymo Research公司，ZR RNA MicroPrep，類別號(hào)#R1060/R1061)上并且在10000xg下旋轉(zhuǎn)15秒。重復(fù)此過(guò)程直到所有的裂解液通過(guò)過(guò)濾器。第I次清洗加入700uL，并且旋轉(zhuǎn)如上所述。第II次清洗使用500uL進(jìn)行，旋轉(zhuǎn)如上所述并且重復(fù)1次。最后旋轉(zhuǎn)在10000xg下進(jìn)行1分鐘，以除去殘余液體。將外排體RNA用20uL預(yù)熱的(95℃)無(wú)核酸酶的水在新鮮收集管中洗脫。柱子在10000xg下旋轉(zhuǎn)30秒并且洗脫液重新與另外的5uL無(wú)核酸酶的水一起再次加入相同的柱子，并且在相同的條件下旋轉(zhuǎn)第二次。使用Pico Agilent芯片進(jìn)行樣品定性和半定量。有趣地，miR-629被確定在miR-629過(guò)量表達(dá)細(xì)胞系分泌的外排體中。相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞在這些外排體內(nèi)miR-629過(guò)量表達(dá)了12-20倍(圖17)。

不想被理論束縛，腫瘤衍生的miR-629可通過(guò)外排體遞送至自然殺傷(NK)細(xì)胞，從而降低NK細(xì)胞活化，NK細(xì)胞是產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子并且自然地殺靶細(xì)胞的顆粒淋巴細(xì)胞。在miR-629基線水平高時(shí)，該假說(shuō)認(rèn)為NK細(xì)胞活性很低。因而，抗-CD19抗體(MEDI551)可以通過(guò)NK細(xì)胞介導(dǎo)的抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)降低活性并且導(dǎo)致差的治療響應(yīng)。在基線處的低miR-629預(yù)計(jì)不會(huì)導(dǎo)致增加對(duì)瑞圖宣(Rituxan)(也被稱為利妥昔單抗)的響應(yīng)，因?yàn)槿饒D宣除了NK細(xì)胞介導(dǎo)ADCC作用還通過(guò)其他作用機(jī)制，然而MEDI551不是這樣。

實(shí)例15：miR-629過(guò)量表達(dá)改變NK細(xì)胞功能

miR-629對(duì)NK細(xì)胞功能的影響通過(guò)分析在NK細(xì)胞活化中已知會(huì)改變的基因的表達(dá)來(lái)評(píng)估，包括細(xì)胞溶解通路基因(例如，顆粒酶B(GZMB)、GZMA、GZMM、組織蛋白酶B和D、穿孔素1)，細(xì)胞表面/粘附分子(例如，CD96(TACTILE)、CD63顆粒蛋白(granulophysin))，以及NK細(xì)胞活化受體。NK細(xì)胞功能可以在γ-干擾素或顆粒酶B ELISA中進(jìn)行測(cè)定。顆粒酶是細(xì)胞毒性T細(xì)胞和自然殺傷(NK)細(xì)胞中的細(xì)胞質(zhì)顆粒釋放的絲氨酸蛋白酶。顆粒酶在靶細(xì)胞(包括癌癥細(xì)胞)中誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡。

初步結(jié)果表明了miR-629的過(guò)量表達(dá)改變NK細(xì)胞功能(圖18A和18B)。miR-629核轉(zhuǎn)染后分析了miR-629過(guò)量表達(dá)對(duì)NK細(xì)胞功能的影響。核轉(zhuǎn)染后，miR-629水平增加(圖18A)。并且該增加導(dǎo)致與細(xì)胞溶解通路和NK活化/粘附相關(guān)聯(lián)的基因減少40％-60％。分析的基因包括顆粒酶B、顆粒酶A、顆粒酶M、組織蛋白酶D、穿孔素1、CD63、CD96、和干擾素調(diào)節(jié)因子7(圖18B)。實(shí)施核轉(zhuǎn)染是使用以下的方法：將NK-92細(xì)胞(ATCC公司#CRL-2407)以0.2-1.5e6個(gè)細(xì)胞/mL的密度維持在含有2mM谷氨酰胺、10％FBS和10ng/mL IL-2(派普泰克公司(PeproTech)#200-02)的高級(jí)RPMI(生命技術(shù)公司(LifeTech))培養(yǎng)基中并且每3-4天進(jìn)行傳代培養(yǎng)。使用Amaxa細(xì)胞系核轉(zhuǎn)染試劑盒R和Amaxa核轉(zhuǎn)染II裝置(龍沙)進(jìn)行Nk-92細(xì)胞核轉(zhuǎn)染，如下所示。十二孔組織培養(yǎng)板的準(zhǔn)備是通過(guò)利用1.5mL的培養(yǎng)基填充適當(dāng)數(shù)量的孔并預(yù)培養(yǎng)在濕潤(rùn)的37℃/5％CO2培養(yǎng)箱中。核轉(zhuǎn)染工作溶液是通過(guò)加入0.45mL補(bǔ)充液至2.05mL細(xì)胞系核轉(zhuǎn)染溶液R中來(lái)制備。對(duì)于單個(gè)核轉(zhuǎn)染，5e6細(xì)胞于室溫在90xg下離心10分鐘，再懸浮于100ul室溫的核轉(zhuǎn)染工作溶液中，并與200nM的miR-629模擬品、抑制劑或打亂型對(duì)照進(jìn)行組合。細(xì)胞/RNA懸浮液被轉(zhuǎn)移至小槽，放置于核轉(zhuǎn)染II(Nucleofector II)裝置中，并應(yīng)用U-001NK程序。小槽從裝置移走，并加入500uL預(yù)平衡的培養(yǎng)基。然后將樣品轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備的12孔平板(終體積大約是每孔2mL培養(yǎng)基/細(xì)胞)并且培養(yǎng)在濕潤(rùn)的37℃/5％CO2培養(yǎng)箱中。如上文所報(bào)道，在對(duì)使用抗-CD19抗體(MEDI-551)而不是利妥昔單抗的體外抗體依賴性細(xì)胞毒性具有高敏感性和低敏感性的細(xì)胞系之間miR-629的表達(dá)顯著地不同。預(yù)先指定miR-629(在其它miR之間)用于檢測(cè)臨床試驗(yàn)1期和2期中B細(xì)胞惡性腫瘤以評(píng)估在預(yù)測(cè)患者對(duì)于抗-CD-19抗體(MEDI-551)治療的響應(yīng)方面的臨床實(shí)用性。出人意料地，在對(duì)于抗-CD19抗體(MEDI-551)治療響應(yīng)或不響應(yīng)的彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者之間在基線血液樣品中的miR-629表達(dá)顯著不同。這個(gè)影響在單試劑(1期)和化療聯(lián)合研究(2期)中是可再現(xiàn)的。這個(gè)效果使用利妥昔單抗沒(méi)有觀察到。有趣地，具有低水平miR-629的患者顯示出對(duì)于抗-CD19抗體(MEDI-551)而不是利妥昔單抗的增加的響應(yīng)率。這個(gè)觀察可能是由于(至少部分地)miR-629通過(guò)存在于外排體中或通過(guò)其它的方式改變NK細(xì)胞活化標(biāo)志物的能力。這些結(jié)果支持miR-629在介導(dǎo)響應(yīng)抗-CD19抗體(MEDI-551)、而不是利妥昔單抗中的作用。

RNA分離

利用微小RNA PAX基因血液RNA試劑盒(microRNA PAXgene Blood RNA kit)(凱杰公司(Qiagen)，德國(guó)希爾登)，從淋巴瘤和白血病患者的PAX基因血管提取總RNA。對(duì)于慢性淋巴細(xì)胞性白血病患者的細(xì)胞系和PBMC樣品，使用miRVana miRNA分離試劑盒(miRVana miRNA Isolation Kit)(生命技術(shù)公司(Life Technologies))根據(jù)制造商的說(shuō)明分離樣品。RNA純化和濃度由分光光度計(jì)(260/280>1.9)測(cè)定。RNA質(zhì)量是在Agilent 2100生物分析儀上利用RNA 6000 Nano評(píng)估的。

TaqMan Q-PCR

對(duì)于TaqMan分析，使用Multiscribe RT和miRNA引物池根據(jù)制造商的說(shuō)明將250-300ng總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。在含有12.5μL 2X TaqMan預(yù)擴(kuò)增主要混合物(TaqMan PreAmp Master Mix)、2.5μL 10X Megaplex預(yù)擴(kuò)增引物(Megaplex PreAmp primers)、7.5μL H₂O以及2.5μL RT產(chǎn)物的反應(yīng)中使用TaqMan預(yù)擴(kuò)增主要混合物和miRNA引物池來(lái)預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)生的cDNA。在循環(huán)之后，在DNA懸浮緩沖液(TEKnova，霍利斯特(Hollister)，加利福尼亞州)中按1:4稀釋擴(kuò)增的樣品，并且保持在-20℃或立即用于PCR。使用BioMark實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)利用特異針對(duì)miR-629和管家參考基因RNU44、U6、U47、和RNU24的TaqMan試驗(yàn)(生命技術(shù)公司)對(duì)預(yù)擴(kuò)增的材料進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。大于28的循環(huán)閾值(Ct)被排除在計(jì)算外。使用四個(gè)參考基因(RNU44、U6、U47、和RNU24)的平均值計(jì)算ΔCt值。在ΔCt值被用于比較的情況下，值得注意的是ΔCt值與表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，以至于ΔCt值越高，miR-629表達(dá)越低。利用在健康志愿者的miR-629表達(dá)作為對(duì)照，通過(guò)計(jì)算2^-ΔΔCt來(lái)確定倍數(shù)變化值。

穩(wěn)定的細(xì)胞系產(chǎn)生

使用過(guò)量表達(dá)miR-629或打亂型miRNA對(duì)照(開(kāi)放生物系統(tǒng)公司(Open Biosystems)，阿拉巴馬州漢茨維爾(Huntsville))的慢病毒載體以2-20的MOI轉(zhuǎn)導(dǎo)彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系Karpas-422。轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞擴(kuò)增1-2周。利用RFP，細(xì)胞被熒光激活細(xì)胞分類(FACS)分選高miR-629和低miR-629群體。使用限制性稀釋方法產(chǎn)生克隆。miR-629的過(guò)量表達(dá)由TaqMan QPCR估算。

細(xì)胞生長(zhǎng)與細(xì)胞凋亡試驗(yàn)

過(guò)量表達(dá)miR-629的淋巴瘤細(xì)胞被5μM或10μM依托泊苷處理，然后測(cè)量細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞凋亡。依托泊苷處理24小時(shí)和48小時(shí)后，使用細(xì)胞滴度-Glo發(fā)光細(xì)胞活力檢測(cè)(Cell Titer-Glo Luminescent Cell Viability Assay)(普洛麥格公司(Promega)，威斯康辛州麥迪遜)根據(jù)制造商的說(shuō)明測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)。依托泊苷處理48小時(shí)后，使用半胱天冬酶-Glo 3/7測(cè)定(普洛麥格公司)根據(jù)制造商的說(shuō)明測(cè)定半胱天冬酶活性。在SpectraMax M5平板閱讀器上(分子裝置有限責(zé)任公司(Molecular Devices,LLC.)，加利福尼亞州桑尼維爾)收集所有的發(fā)光數(shù)據(jù)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用韋爾奇的t檢驗(yàn)(Welch’s t-test)或曼-惠特尼U非參數(shù)檢驗(yàn)(Mann-Whitney U non-parametric test)，分析了微小RNA表達(dá)的倍數(shù)變化值，p值<0.05被認(rèn)為顯著。

其他實(shí)施例

從前述說(shuō)明中，將顯而易見(jiàn)的是，可以對(duì)本文所述的發(fā)明作出變更和修改以使其適應(yīng)于各種用途和狀況。這樣的實(shí)施例也在下述權(quán)利要求的范圍內(nèi)。

在變量的任何定義中對(duì)要素清單的引用在本文中包括將所述變量定義為任何單個(gè)要素或所列要素的組合(或次組合)。在此的實(shí)施例的詳述包括作為任何單個(gè)實(shí)施例或與任何其他實(shí)施例或其部分結(jié)合的實(shí)施例。

本說(shuō)明書(shū)中提及的全部專利和出版物通過(guò)引用方式以相同的程度結(jié)合在此，如同每份單獨(dú)的專利和出版物具體地且個(gè)別地指出通過(guò)引用的方式結(jié)合。